Summary
Banebrydende kurver (BPC'er) er effektive værktøjer til at studere transport af bakterier i porøse medier. Her introducerer vi værktøjer baseret på flydende enheder i kombination med mikroskopi og flow cytometrisk optælling for at opnå BPC'er.
Abstract
Forståelse af transport, spredning og deposition af mikroorganismer i porøse medier er en kompleks videnskabelig opgave, der omfatter emner så forskellige som hydrodynamik, økologi og miljøteknik. Modellering bakteriel transport i porøse miljøer på forskellige rumlige skalaer er afgørende for bedre at forudsige konsekvenserne af bakteriel transport, men nuværende modeller ofte undlader at op-skala fra laboratorium til feltbetingelser. Her introducerer vi eksperimentelle værktøjer til at studere bakteriel transport i porøse medier på to rumlige skalaer. Formålet med disse værktøjer er at opnå makroskopiske observerbare stoffer (såsom gennembrud kurver eller deposition profiler) af bakterier injiceres i gennemsigtige porøse matricer. I lille skala (10-1000 μm) kombineres mikrofluidiske enheder med optisk videomikroskopi og billedbehandling for at opnå gennembrudskurver og samtidig spore individuelle bakterieceller i poreskalaen. I større skala kombineres flowcytometri med en selvskabt robotdispenser for at opnå gennembrudskurver. Vi illustrerer nytten af disse værktøjer til bedre at forstå, hvordan bakterier transporteres i komplekse porøse medier såsom hyporheic zone af vandløb. Da disse værktøjer giver samtidige målinger på tværs af skalaer, baner de vejen for mekanismebaserede modeller, hvilket er af afgørende betydning for opskalering. Anvendelsen af disse værktøjer kan ikke kun bidrage til udviklingen af nye bioremedieringsapplikationer, men også kaste nyt lys over mikroorganismers økologiske strategier for kolonisering af porøse substrater.
Introduction
Undersøgelser , der har til formål at forstå transport af mikrober gennem porøse medier , har hovedsagelig været drevet af bekymringerom forurening 1, overførsel af sygdom2 og bioremediering3. I denne forbindelse er bakterier for det meste blevet behandlet som partikler i transportmodeller4, og processer som filtrering, belastning, gravitationel bundfældning eller remobilisering fra biofilm er blevet identificeret som drivkræfter bag retention eller transport af mikrober5. Men at studere transport af bakterier gennem porøse landskaber kan også informere os om de økologiske strategier, der ligger til grund for deres succes i disse komplekse miljøer. Men dette kræver nye eksperimenter og matematiske modeller, der opererer på enkelt celle, befolkning eller mikrobielle samfund niveau.
Naturlige porøse miljøer, som dem, der findes i hyporheic zone af vandløb og floder, er tæt koloniseret af forskellige samfund af biofilm-dannende mikrober6. Biofilm danner strukturer, der ændrer strømmen og dermed transport og spredning af bakterier ivæskefasen 7,8. Transport af bakterier på pore skala afhænger af den begrænsede plads tilgængelighed i porøse matrix og motilitet-relaterede spredning kan være en effektiv måde at øge den individuelle fitness gennem reduceret konkurrence om ressourcer i mindre tæt befolkede områder. På den anden side kan motile bakterier også nå mere isolerede områder af den porøse matrix og den udvidede udforskning af sådanne områder kan give økologiske muligheder for at motile befolkninger10. På større rumlige skalaer, biofilm vækst afleder flow stier også fører til (delvis) tilstopning af porer og dermed til etablering af endnu mere kanaliseret og heterogene flow betingelser11. Dette har konsekvenser for næringsstofforsyningen og spredningskapaciteten, hyppigheden og afstanden. Præferenceflow, for eksempel, kan generere såkaldte "fast-tracks" og motile bakterier kan opnå endnu højere hastigheder end det lokale flow langs disse spor12. Dette er en effektiv måde at øge udforskningen af nye levesteder på.
En række værktøjer benytter sig til undersøgelse af transport af motile og ikke-motile bakterier (og partikler) i porøse medier. Numeriske modeller har stor prædiktiv kapacitet, der er vigtig for anvendelser, men er ofte begrænset af iboende antagelser4. Laboratorieskalaforsøg13,14 kombineretmed btc-modellering (Breakthrough Curve) har givet vigtig indsigt i vigtigheden af bakteriecelleoverfladeegenskaber for at sætte effektivitet15. Typisk opnås BPC'er (dvs. tidsserier af partikelkoncentration på et fast sted) via konstant hastighedsudsætninger og måling af cellenumre ved udstrømningen af forsøgsanordningen. I denne sammenhæng afspejler BFC'erne bakterienes advection-dispersiondynamik i den porøse matrix og kan forlænges med en vask, der tegner sig for vedhæftet fil. Modellering af BFC alene løser imidlertid ikke den rolle, som den porøse substrat eller biofilm spiller for transportprocesser. Andre makroskopiske observerbare som dispersivitet eller deposition profiler har vist sig at give vigtige oplysninger om den rumlige fordeling eller de tilbageholdte partikler eller voksende samfund. Microfluidics er en teknologi, der gør det muligt at studere transport i porøse medier ved mikroskopi undersøgelse9,12,16, og bortset fra en nylig arbejde10, eksperimentelle systemer er typisk begrænset til en enkelt længde skala af opløsning, det vil sige pore skala eller hele flydende enhed skala.
Her introducerer vi en række kombinerede metoder til at studere transport af motile og ikke-motile bakterier i porøse landskaber i forskellige skalaer. Vi kombinerer observationer af bakterietransport i poreskalaen med oplysninger i større skala ved hjælp af BTC-analyse. Mikrofluidiske enheder, der er bygget af blød litografi ved hjælp af polydimethylsiloxan (PDMS), er biokompatible, modstandsdygtige over for en række kemikalier, tillader replicerbarhed med lave omkostninger og giver fremragende optisk gennemsigtighed samt lav autofluorescens, der er kritisk for mikroskopisk observation. Mikrofluidics baseret på PDMS er tidligere blevet brugt til at studere transport af mikrober i simplekanaler 17 eller i mere komplekse geometrier12. Men typisk microfluidcs eksperimenter fokuserer på kortsigtede horisonter og epi-fluorescens mikroskopisk observation af levende celler er almindeligvis begrænset til genetisk modificerede stammer (f.eks GFP-mærkede stammer). Her præsenterer vi værktøjer til at studere bakteriel transport ved hjælp af PDMS-baserede mikrofluidiske enheder i kombination med mikroskopi og større enheder fremstillet af poly (methyl methacrylat) (PMMA, også kendt som plexiglas) i kombination med flowcytometri. PDMS og PMMA adskiller sig med hensyn til gaspermeabilitet og overfladeegenskaber, hvilket giver komplementære muligheder for at studere bakterietransport. Mens den mikrofluidiske enhed giver et mere kontrolleret miljø, giver den større enhed mulighed for eksperimenter over længere tid eller ved hjælp af naturlige bakteriesamfund. Mikroskopitælling ved høj tidsopløsning i et dedikeret område bruges til at opnå BTC i den PDMS-baserede mikrofluidiske enhed. For at opnå celletal for BTC-modellering fra den PMMA-baserede enhed introducerer vi en selvkonstrueret automatiseret væskedispenser i kombination med flowcytometri. I denne opsætning passerer celler den flydende enhed og udleveres fortløbende i 96 brøndplader. Den tidsmæssige opløsning begrænses af den mindste volumen, der præcist kan dispenseres og dermed den mellemstore strømningshastighed gennem den flydende enhed. Fiksativ i brøndene forhindrer vækst og letter DNA farvning for downstream flow-cytometrisk optælling. For at forhindre bakterievækst under transportforsøg bruger vi en minimal medium (termed motility buffer).
Da protokoller til fremstilling af flydende anordninger i forskellige skalaer er let tilgængelige, introducerer vi kun kortvarigt teknikkerne til fremstilling af sådanne anordninger og fokuserer snarere på de eksperimentelle procedurer for registrering af BPC'er. Tilsvarende findes der forskellige rutiner for flow cytometrisk optælling af mikrober, og brugerne kræver ekspertviden til at fortolke resultater opnået ved flowcytometri. Vi rapporterer den nye brug af mikrofluidiske enheder i kombination med mikroskopisk billeddannelse til at registrere BTC'er af fluorescerende mærkede celler. På poreskalaen opnås lokale hastigheder og baner ved hjælp af billedbehandling. Desuden demonstrerer vi brugen af en PMMA-baseret fluidic enhed i kombination med flow-cytometrisk optælling for at observere bakteriel transport af motile og ikke-motile celler i porøse miljøer koloniseret af en indfødt stream biofilm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bakterielle kultur betingelser
- Ved arbejde under laminarflowhætte skal du bruge 100 μL glycerol-beholdning af GFP-mærket Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 ml-1, opbevares ved -80 °C) til at inokulere 5 ml Luria-Bertani (LB) medium. Inkuberes ved 30 °C, mens der rystes ved 250 omdrejningstal natten over.
- Den næste dag, resuspend 100 μL af natten kultur i 5 ml LB medium og inkuberes under de samme betingelser for 5h (eksponentiel fase). Prøve en 1 ml aliquot i en 2 ml rør, lad det køle af til stuetemperatur (~ 15 min) og centrifuge (2300 x g i 5 min).
- Fjern supernatant og tilsæt 1 ml motilitet buffer til pellet. Vortex kort for at homogenisere prøven. Fortyndes for at opnå den ønskede cellekoncentration,f.eks.5
- For forsøg med natursamfund, såsom dem, der stammer fra vandløb, forberede en ikke-selektiv dyrkning medium. For eksempel skal du bruge sterilt filtreret og autoklaveret strømvand eller et kunstigt strømvandsmedium, der er ændret med en kompleks kulstofkilde (LB-medium).
2. Præparat af en mikrofluidisk anordning i polydimethylsiloxan (PDMS)
- Design den ønskede porøse geometri ved hjælp af computer-aided udarbejdelse (CAD) software (CAD) software18, som består af en matrix af cirkler (det er den uigennemtrængelige hindring for flow), beskrevet af radius størrelse og center koordinater.
BEMÆRK: Et eksempel på en porøs geometri med randomiserede korn- og porestørrelser findes i figur 1A. En observationskanal uden hindringer tæt på forretningen gør det lettere at erhverve BPC'er. - Baseret på den valgte geometri, forberede en støbeform ved hjælp af standard SU-8-fotolitografi18.
BEMÆRK: Alternativt kan forme også bestilles fra dedikeret mikrofabrikation facilitet. For at opnå heterogen væskestrøm i det vandrette plan er det vigtigt at designe tykkelsen af mikrofluidicskammeret af samme størrelsesorden som den gennemsnitlige pore throat-størrelse. Sørg dog for, at mikrofluidisk anordnings dimensioner er egnede til observation under mikroskopet (f.eks. arbejde på mikroskopdias). - 50 g PDMS klargøres ved at tilsætte 10 % krydslinker (dimethyl, methylhydrogensixan copolymer) til 90 % af elastomeren efter vægt ved hjælp af en sprøjte uden nåle. Arbejd under rene forhold, og undgå så meget støv som muligt. De to reagenser blandes i en ren engangsbeholder, og der påføres vakuum (100 mbar) i 30 minutter for at fjerne opløst luft og bobler fra de viskøse PDMS..
- Placer formen i en petriskål (100 mm i diameter, 15 mm høj). Hæld PDMS på formen til den ønskede højde (f.eks. 2-5 mm). Dæk petriskålen og hold den ved 60 °C i 4 timer (natten over for tykkere lag) til at helbrede.
BEMÆRK: Af hensyn til visualiseringen bør lys kunne passere gennem PDMS, således at et tyndt lag mellem 2 mm og 5 mm er ønskeligt. Tykkere lag (>5 mm) reducerer enhedens gennemsigtighed, og tyndere lag udsættes for deformationer under påføring. - Fjern formen fra ovnen og lad den mikrofluidiske enhed køle af til stuetemperatur. Når det er afkølet, forsigtigt fjerne den ønskede del af PDMS med en skalpel.
BEMÆRK: Stærkt tryk på formen resulterer i mug frakturer. Rør ikke ved PDMS med bare hænder, da fingeraftryk vil påvirke optisk gennemsigtighed. - Forsegle bunden af PDMS-kanalen midlertidigt (hvor den ønskede geometri er blevet indgraveret) med tape. Med en biopsipunst i diameter på 0,5 mm gennembores mikrofluidickanalen for at skabe et indløb og en udløbsudgang, der passer til 0,5 mm (indvendig diameter) slangen.
BEMÆRK: Pdms bløde natur vil sikre tæthed, når slangen er sat i. Indløbs- og udløbskanaler kan ikke foretages, når PDMS er forseglet til glasset. - Forsegle mikrofluidic kanal via ilt plasma limning ved hjælp af højfrekvent generator (plasma bonder, Tabel af Materialer). Til dette rengøres en silikatglasrutsjebane (25 mm x 75 mm) med ethanol, og lad den tørre. Fjern båndet fra PDMS-kanalen, og placer kanalen med den porøse side opad. Behandl silikatglasskredsen og PDMS-overfladerne med plasma i ca. 45 s ved stuetemperatur.
- PDMS-kanalen sættes på silikatglassliden og opvarmes ved 100 °C i 30 minutter på en kogeplade.
- Fjern mikrofluidisk anordning fra kogepladen og afkøl den til stuetemperatur. Forbind PDMS-kanalindgangen med slangen. Påfør vakuum i 30 min at fjerne luft fra PDMS, som er næsten uigennemtrængelig for væsker, men gennemtrængelig for gas.
- Der klargøres 100 ml motilitetsbuffer (10 mM kaliumphosphat, 0,1 mM EDTA, suppleret med 1% w/v glukose, pH 7.0), og indsprøjt 1 ml af det i mikrofluidic-enheden ved hjælp af en sprøjtepumpe, der betjenes ved 10 μL min-1.
BEMÆRK: Da PDMS er undermættet i gas (på grund af det forrige vakuumtrin), forsvinder boblerne inden for ~30 min.
3. Fremstilling af en flydende anordning i poly (methyl methacrylat)
- Design den ønskede geometri med CAD-softwaren. Hvis det er relevant, skal det sikres, at dimensionerne er egnede til observation under mikroskopet (f.eks. dimensioner af en standard 96-brøndplade i kombination med en passende holder). Den flydende anordning er sammensat af en base (127 × 127 × 12 mm) og et låg (127 × 127 × 12 mm) PMMA.
BEMÆRK: Det anbefales at have ekspertise med CAD-software. Et eksempel på teknisk tegning findes i figur 1A. - For at producere porerummet skal du ved hjælp af mikrofabriker med høj præcision (WF31SA, Mikron) fjerne 0,5 mm fra det nederste PMMA-lag og fræse en rille (1,1 × 1,1 mm) til en O-ring af gummi. Bor 12 gevindhuller (M5). Dette vil tjene som bunden af den flydende enhed.
BEMÆRK: Den flydende enheds dimensioner skal justeres, så den passer til mikroskopstadiet og brændvidden. En teknisk tegning leveres i figur S1. - Bor to gevindhuller (type 1/4-28UNF) for ind- og udløb i den øverste del af den flydende enhed og 12 huller (5,5 mm) til skruerne. Dette vil tjene som låget af den flydende enhed.
BEMÆRK: Ekspertise inden for mikrofræsning er tilrådeligt; forfatterne bruger støtte fra en specialiseret workshop. - For at rengøre og sterilisere den flydende enhed før og efter hver brug sættes i blød i bunden og låget på den flydende enhed i HCl 7% og skylles tre gange med deioniseret vand.
- Skru bund og låg sammen ved hjælp af de 12 gevind huller.
4. Opsætning af automatiseret dispenser
BEMÆRK: Kommercielt tilgængelige væskedispensere er dyre og giver ofte ikke fleksibilitet til at dispensere direkte fra udstrømningen af den flydende enhed. Derfor anbefales det at samle et billigt og fleksibelt robotdispensersystem fra en XY Plotter Robot (Tabel over Materialer).
- For at dispensere udstrømningen fra den flydende enhed i 96 brøndplader monteres robotdispenseren på en PMMA-plade og møllehulrum på 85,8 x 128 mm med en dybde på 1 mm til at rumme flere 96 brøndplader.
- Fastgør udstrømningsrøret på den flydende enhed til dispenserens robotarm.
- For at betjene robot dispenser download bCNC fra github: https://github.com/vlachoudis/bCNC og følg vejledningen for at installere programmet.
- Download dispenser.py fra det understøttende materiale i denne artikel.
BEMÆRK: Denne python kode giver et plugin til bCNC for en simpel robot dispenser layout. - Tilslut robotdispenseren til den computer, der kører bCNC, og identificer den korrekte COM-port.
- I bCNC skal du klikke på startknappen for at returnere robotdispenseren til startpositionen.
BEMÆRK: Homing returnerer robotdispenseren til en kendt position (x=0, y=0) og forbedrer derfor dispenserens nøjagtighed. - Forud for forsøget skal der tilberedes et tilstrækkeligt antal 96 brøndplader med brønde, der indeholder en passende mængde fiksativ (f.eks. slutkoncentration 3,7% formaldehyd).
BEMÆRK: F.eks. dispenseres der med en strømningshastighed på 0,2 ml-1,og der dispenseres 100 μL i hver brønd hver 30. Der tilsættes derfor 10 μL 37 % formaldehyd til hver brønd for at nå en endelig koncentration af Formaldehyd mellem 2 og 4 %. Ved hjælp af otte 96 brøndplader vil gøre det muligt at betjene forsøget i mere end 6 timer med i alt 768 datapunkter. Bemærk desuden, at GFP-mærkede celler kan miste deres fluorescerende signal efter fiksering ved hjælp af formaldehyd.
5. Analysér bakteriel transport ved hjælp af PDMS mikrofluidic-enheder
- Placer den PDMS-mikrofluidiske enhed, der tidligere er mættet med motilitetsbufferen, på mikroskopstadiet. Brug tape til at fastgøre slangen for at minimere forstyrrelser af strømmen under fase bevægelse.
- Flyt mikroskopstadiet til observationskanalen tæt på stikkontakten. Brug lys feltmikroskopi eller fasekontrast, fokuser til midten af observationskanalen, og juster forstørrelsen for at visualisere individuelle bakterieceller.
- Skift lysbaneindstillingerne til fluorescensmikroskopi, og juster kameraets eksponeringstid for at løse individuelle bakterieceller (f.eks. 100 ms), eller således at fluorescenssignaler fra celler er mindst 3 x stærkere end baggrundsstøj.
- Dernæst sættes indløbsslangen i et 2 ml rør, der indeholder bakterieaffjedringen. Bakpumperetningen, og begynd at trække suspensionen tilbage ved en strømningshastighed på 1 μL min-1.
- Scan tværsnittet af hele observationskanalen, der optager et sammensat billede hver 2 min. i hele eksperimentets varighed.
6. Grundlæggende billedbehandling
BEMÆRK: Målet med disse grundlæggende billedbehandling rutiner er at tælle antallet af bakterier i de optagede billeder. Optimale behandlingsprocedurer afhænger af mikroskopets og kameraets tekniske specifikationer samt af fluorescensegenskaberne for den bakteriestamme, der anvendes i forsøget, og skal derfor justeres.
- Eksportér først billeder i .tiff format.
- Importér billeder til en ønsket softwareplatform (f.eks.
- Fjern kamerastøj, som er en tilfældig variation af pixelintensiteten i billeder og korrekt for optisk aberration. Dette kan gøres ved at anvende et gaussisk filter på hvert billede: filterets størrelse afhænger af kvaliteten af kamerasensoren (f.eks. Den optiske afvigelse kan fjernes ved at normalisere hvert billede ved hjælp af et referencebillede, der er indsamlet uden prøven med samme optiske konfiguration.
- Beskære billederne til et område af interesse.
- Identificer en tærskelværdi (pixelintensitet), således at værdier over tærsklen omfatter bakterieceller.
BEMÆRK: Hvis billederne er ujævnt belyst (på grund af optisk afvigelse eller støj), kan det være nyttigt at anvende en adaptiv tærskel, som vælger en tærskelværdi baseret på lokale gennemsnitsintensiteter. - Træk den ovenfor definerede tærskel fra hvert billede.
- Binarize det resulterende billede, således at bakterieceller tage en værdi på 1, mens baggrunden tager en værdi på 0.
- Fjern klynger med et område, der er mindre end den mindste bakteriecellestørrelse.
- Summer det binariserede billede for at hente det samlede antal pixel i de resterende klynger. Divider antallet af pixel med den gennemsnitlige størrelse (i pixel) for en bakteriecelle: Dette giver et estimat over det samlede antal celler.
- Kendskab dybde af opfattelse og undersøgelsesområde, omdanne tæller til koncentration (partikler mL-1).
- Det er afgørende at identificere koncentrationen af den injicerede bakterie suspension. For at gøre dette skal du injicere med en sprøjte 1 ml bakteriekultursuspension i observationskanalen for en ren mikrofluidisk anordning. Optag billedet og beregne indløb bakteriel koncentration (C0) som beskrevet ovenfor (6.1 til 6.10).
- Analysér BPC'er ved at normalisere spildevandsbakteriel koncentration (C) med influentbakteriel koncentration (C0) og plot C/C0 versus tid.
7. Analysér bakterietransport på poreskalaen
- For at analysere lokale hastigheder og baner af bakterier transporteres gennem den porøse matrix, flytte mikroskop fase til regionen af interesse og justere fokus til centrum af den mikrofluidiske enhed.
- Indstil mikroskop til lys felt- eller fasekontrast.
BEMÆRK: Dette kun i tilfælde af fluorescens signal af bakteriecelle ikke tillader optagelse af billeder ved eksponeringstid kortere end den gennemsnitlige bakterietid, ellers bruge fluorescens mikroskopi. - Optag time-lapse billeder, på eksponeringstids tid, der fanger bakterier forskydning (kortere end den gennemsnitlige forskydning over et antal pixels mindre end objektets størrelse), og som optimerer bakteriel celle detektion (f.eks eksponering af 20 ms og billeder optaget hver 50 ms). Optag billeder over en tilstrækkelig tid til at optage nok (til at være statistisk repræsentativ) af de langsomste baner (f.eks. 3 min).
BEMÆRK: Sørg for, at computeren har tilstrækkelig diskplads. - Hvis du vil fjerne baggrundsstøj, skal du trække gennemsnittet af alle optagede billeder fra hvert billede. Det kan du gøre ved at oprette en matrix, hvis resultat er summen af intensiteten af alle billederne for hver pixel, og dividere den med antallet af billeder.
- Fra det behandlede billede (Im) skal du bestemme modulus af det numeriske forløb
og normalisere det med dets maksimale værdi (maks.),som defineret nedenfor.
- Binarize matrix B via intensitet tærskelring, se trin 6.7-6.8.
- For hvert tidspunkt registrerer du bakteriekoordinater (x, y i pixel eller mm) og tidspunktet for erhvervelse af billeder i en fil med tre kolonner.
- Endelig anvende en partikel tracking script til at behandle de registrerede data og beregne baner af bakterier. For eksempel bruge den etablerede protokol19, og frit tilgængelige Matlab Partikel Tracking Code: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
og normalisere det med dets maksimale værdi (maks.),som defineret nedenfor.
8. Undersøgelse bakteriel filtrering ved hjælp af deposition profiler
- For at opnå deposition profiler af GFP-mærkede P. putida KT2440 celler ved fluorescens mikroskopi, optage et sammensat billede af hele porøse kanal før, det er baggrunden, og efter injektion af bakteriel suspension gennem mikrofluidic enhed. Brug en eksponeringstid, der gør det muligt at anskaffe et bakterielyfæmningssignal (f.eks. 100 ms), uden at blege signalet.
- Eksporter billeder og import i den ønskede softwareplatform (se 6.1-6.2).
- Fjern baggrunden fra de billeder, der er optaget efter bakteriel injektion.
- Integrer det samlede fluorescenssignal af tilbageholdte bakterier langs tværgående dele af den porøse kanal.
- For at beregne deposition profil, plot den integrerede florescence signal versus porøse kanal længde.
9. Analysér bakteriel transport ved hjælp af PMMA fluidiske enheder og flow cytometri
- Peristaltisk pumpe forbindes med indløbet med 50 cm (1 mm indvendig diameter) slange og udstrømningen med den automatiske dispenser med samme slange (50 cm, se afsnit 4).
BEMÆRK: Brug pumpen til at dispensere dyrkningsmedier og til at injicere bakterieceller. Brug Luer-lock-stik og trevejsventiler til at skifte mellem medium og bakteriel suspension under den konstante hastighed frigivelse. - Pumpe dyrkningsmedium i den flydende enhed. Bemærk, at medium ankommer til udløbsslangen, der er fastgjort til robotdispenseren.
- Begynde at injicere bakteriesuspensionen gennem PMMA-fluidanordningen med en strømningshastighed på 0,2 mlmin -1,
- Når bakterierne når den flydende enhedsindgang, tændes den automatiske dispenser.
- For at foretage en pulsinjektion skal bakteriesuspensionen for visse porevolumener (f.eks. 30) indsprøjtes, og derefter skifte injektion til dyrkningsmedier, indtil forsøget slutter.
BEMÆRK: porevolumen af den flydende enhed er ca. 0,2 ml, således ved den prosed flow hastighed hvert minut en hel pore volumen udveksles. - Når en 96 brøndplade er færdig, dækkes pladen for at reducere fordampning og opbevares ved 4 °C.
- Analysér bakterietæthed via flowcytometri efter etablerede protokoller20.
BEMÆRK: Der tilsættes for eksempel 25 μL af den grøn-fluorescerende nukleinsyreplet (Materialetabel) ved 0,025 mM (i ultrarent vand) til hver brønd. Det pletter bakteriel DNA, således at kvantificere ved flow cytometri den bakterielle overflod. Inkuber prøver i 15 minutter i mørke og derefter analysere ved hjælp af et flow cytometer udstyret med en 488 nm laser og detektorer på 515 nm. - Før BTC-analysen skal fortyndingen af prøven overvejes som følge af tilsætning af fiksativ og plet. Korrekt bakteriel overflod med en faktor på 1,35 for at tage højde for fiksativ og plet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere funktionaliteten af den præsenterede arbejdsgang udførte vi eksperimenter ved hjælp af genetisk modificerede Pseudomonas putida KT2440, en gram negativ motile bakterie, der er vigtig for bioremediering og bioteknologi. Genetisk modificerede versioner af denne stamme, der udtrykker GFP produktion er kommercielt tilgængelige. En ikke-motile stamme af P. putida KT2440, som mangler de relevante strukturelle og lovgivningsmæssige gener for motilitet er også tilgængelig. Ved hjælp af både motile og ikke-motile GFP mærkede P. putida KT2440 udførte vi sekventielle eksperimenter i PDMS mikrofluidiske enheder med en tilfældig vifte af søjler (Figur 1B) og registrerede BPC'er (Figur 2A). BPC'er er blevet normaliseret til koncentrationen af indsprøjtede celler (C0). Samtidig blev bakterieforløb i poreskalaen visualiseret via billedbehandling og partikelsporing som beskrevet ovenfor (Figur 2B).
Dernæst udførte vi eksperimenter med store flydende enheder sleben fra PMMA (Figur 1A). Motile og ikke-motile P. putida KT2440 (ikke-fluorescerende) blev injiceret i en regelmæssigt fordelt porøs matrix og BPC'er blev fremstillet ved hjælp af flydende dispenser og flow cytometri optælling som beskrevet ovenfor (Figur 3A). Påfaldende, i et porøst miljø blottet for biofilm, motile og ikke-motile P. putida KT2440 viste en markant anderledes transport adfærd. I en porøs matrix koloniseret til 48h med en kompleks strøm biofilm samfund, disse forskelle i BTC mellem motile og ikke-motile P. putida KT2440 forsvandt (Figur 3B.)
Figur 1: Flydende anordninger til undersøgelse af mikrobiel transport i porøse medier (A) Illustration af en flydende anordning fræset fra PMMA. Den porøse matrix er sleben ind i enhedens bundlag, låget lukkes ved hjælp af skruer. Et tværsnit viser placeringen af søjlerne i den flydende enhed. Indsatsen viser en porøs matrix med et almindeligt afstandsgitter af søjler og det respektive hastighedsflowfelt. (B) PDMS-enheden er monteret på en mikroskopiglasslide. Vist er ind- og udstrømningen, der er forbundet til henholdsvis mediumbeholderen og sprøjtepumpen. Observationskammeret til mikroskopisk optælling placeres som et separat kammer uden en porøs matrix på samme mikroskopskreds. Indsatsen viser en porøs matrix med en tilfældig vifte af søjler (i diameter og afstand). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bakteriel transport ved kanal- og poreskala i PDMS-fluiditetsanordningen (A) BTC'er af motile og ikke-motile P. putida KT2440 (GFP mærket) fremstillet med en PDMS-mikrofluidisk anordning og mikroskopisk optælling. bB) Forløb af ikke-motile celler i poreskalaen. Farver er valgt for at forbedre differentiering af baner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Bakteriel transportpå kanal- og poreskala i PMMA-fluidanordningen (A) BTC'er af motile og ikke-motile P. putida KT2440 (ikke-mærket) fremstillet ved hjælp af en PMMA-væskeanordning og flowcytometritælling. (B) Den flydende enhed blev koloniseret af en naturlig strøm samfund i 2 dage. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Tekniske tegninger af PMMA-væskeanordningen. Enheden består af en basisenhed, der indeholder den porøse matrix og en lågenhed med hullerne til indløb og udløb. Enheden forsegles med 12 skruer og en O-ring. Klik her for at downloade dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her foreslår vi to midler til at studere transport af mikrober gennem porøse systemer på encelle- og befolkningsniveau. Mens undersøgelsen af transportfænomener ved hjælp af BTC-modellering har givet værdifuld indsigt i spredningen af patogener eller forurenende stoffer i økosystemskalaerne, er der stadig vanskeligheder med at skalere fra laboratorieforsøg til feltforhold. De værktøjer, der er beskrevet her, gør det muligt for forskere at forsøge at løse de rumlige og tidsmæssige skalaer for bedre at forstå de økologiske strategier for mikrober, der er relevante for transport i porøse miljøer. Eksperimentatorer kan anvende eller ændre disse systemer til at studere andre mikrobielle træk end motilitet, såsom chemotaxis eller quorum sensing eller ændre geometri eller andre habitat karakteristika porøse matrix. Desuden ved hjælp af disse systemer den bakterielle transport adfærd kan let kobles til deposition profiler, som giver vigtig indsigt i kolonisering mønstre og er afgørende for at forstå, hvordan biofilm ændre lokale flow felter. Vi forventer, at en bedre forståelse af mikrobielle strategier til at sprede og kolonisere porøse medier vil forbedre model forudsigelser og dermed bidrage til forvaltningen af patogen spredning eller forurenende indeslutning. Yderligere ændringer af systemet kan også bidrage til udviklingen af nye filtreringsanordninger eller bioteknologiske værktøjer, hvor celler skal adskilles fysisk.
Vi anbefaler PMMA-baserede enheder til store og langsigtede eksperimenter og PDMS-baserede enheder til mindre, kortsigtede eksperimenter, eller når høj tidsmæssig opløsning er kritisk. Det skal huskes, at de to materialer har forskellige egenskaber. For eksempel PDMS er gennemtrængelig for gas som ilt, mens PMMA er gas stram. Denne forskel kan anvendes til at studere gasforbrug i PMMA-scenariet, mens PDMS kan være mere egnet til forsøg, hvor iltbegrænsninger i forbindelse med bakterielt åndedræt er uønskede.
Generelt er de protokoller, der er beskrevet her, let reproducerbare, og data, der er indhentet ved hjælp af disse værktøjer, afslører konsekvent forskelle i transport af motile og ikke-motile bakterier. Den selvfremstillede væskedispenser kan erstattes af et kommercielt tilgængeligt alternativ. Men af hensyn til alsidighed og omkostningseffektivitet anbefaler vi den, der er beskrevet her. Kritiske trin i protokollen vedrører hovedsageligt håndtering af de flydende enheder og erfaring med billedbehandling. Kvaliteten af data, der opnås gennem billedanalyse, afhænger kritisk af billedkvaliteten (hovedsagelig bestemt af fokus- og eksponeringstid) og en passende tærskelstrategi. Datakvalitet opnået ved flow-cytometrisk optælling kritisk afhænger af effektiv fastsættelse og farvning af cellerne og ekspertise i fortolkningen af flow-cytometri resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi anerkender hjælp fra Antoine Wiedmer med opsætningen af robotdispenseren og dispenser.py scriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
