Summary
Las curvas innovadoras (BTC) son herramientas eficientes para estudiar el transporte de bacterias en medios porosos. Aquí introducimos herramientas basadas en dispositivos fluidos en combinación con microscopía y conteo citométrico de flujo para obtener BTC.
Abstract
Comprender el transporte, dispersión y deposición de microorganismos en medios porosos es una tarea científica compleja que comprende temas tan diversos como la hidrodinámica, la ecología y la ingeniería ambiental. Modelar el transporte bacteriano en entornos porosos a diferentes escalas espaciales es fundamental para predecir mejor las consecuencias del transporte bacteriano, pero los modelos actuales a menudo no logran escalar de laboratorio a condiciones de campo. Aquí, introducimos herramientas experimentales para estudiar el transporte bacteriano en medios porosos a dos escalas espaciales. El objetivo de estas herramientas es obtener observables macroscópicos (como curvas de ruptura o perfiles de deposición) de bacterias inyectadas en matrices porosas transparentes. A pequeña escala (10-1000 m), los dispositivos microfluídicos se combinan con video-microscopía óptica y procesamiento de imágenes para obtener curvas de ruptura y, al mismo tiempo, para rastrear células bacterianas individuales a escala de poros. A mayor escala, la citometría de flujo se combina con un dispensador robótico hecho a sí mismo para obtener curvas de ruptura. Ilustramos la utilidad de estas herramientas para entender mejor cómo se transportan las bacterias en medios porosos complejos como la zona hiporheica de los arroyos. Como estas herramientas proporcionan mediciones simultáneas a través de escalas, allanan el camino para modelos basados en mecanismos, de vital importancia para la ampliación. La aplicación de estas herramientas puede no sólo contribuir al desarrollo de nuevas aplicaciones de biorremediación, sino que también arrojar nueva luz sobre las estrategias ecológicas de los microorganismos colonizando sustratos porosos.
Introduction
Los estudios enca de comprender el transporte de microbios a través de medios porosos han sido impulsados principalmente por preocupaciones de contaminación1, la transmisión de la enfermedad2 y la biorremediación3. En este sentido, las bacterias han sido tratadas principalmente como partículas en los modelos de transporte4 y se han identificado procesos como filtración, tensión, sedimentación gravitacional o removilización de biopelículas como conductores de retención o transporte de microbios5. Sin embargo, el estudio del transporte de bacterias a través de paisajes porosos también puede informarnos sobre las estrategias ecológicas que sustentan su éxito en estos entornos complejos. Sin embargo, esto requiere nuevos experimentos y modelos matemáticos que operan a nivel de una sola célula, población o comunidad microbiana.
Los ambientes porosos naturales, como los que se encuentran en la zona hiporreica de arroyos y ríos, son densamente colonizados por diversas comunidades de microbios formadores de biopelículas6. Las biopelículas forman estructuras que modifican el caudal y, por tanto, el transporte y dispersión de bacterias en la fase líquida7,,8. El transporte de bacterias a escala de poros depende de la disponibilidad de espacio restringido en la matriz porosa y la dispersión relacionada con la motilidad puede ser una manera eficaz de aumentar la aptitud individual a través de una menor competencia por recursos en áreas menos densamente pobladas. Por otro lado, las bacterias móviles también pueden llegar a regiones más aisladas de la matriz porosa y la exploración prolongada de estas áreas puede proporcionar oportunidades ecológicas a las poblaciones móviles10. A escalas espaciales más grandes, el crecimiento de la biopelícula desvía las trayectorias de flujo que también conducen a la obstrucción (parcial) de los poros y, por lo tanto, al establecimiento de condiciones de flujo aún más canalizadas y heterogéneas11. Esto tiene consecuencias para el suministro de nutrientes y la capacidad de dispersión, frecuencia y distancia. El flujo preferencial, por ejemplo, puede generar las llamadas "vías rápidas" y las bacterias móviles pueden alcanzar velocidades aún mayores que el flujo local a lo largo de estas pistas12. Esta es una manera eficaz de aumentar la exploración de nuevos hábitats.
Una variedad de herramientas sirven para el estudio del transporte de bacterias (y partículas) móviles y no móviles en medios porosos. Los modelos numéricos tienen grandes capacidades predictivas importantes para las aplicaciones, sin embargo, a menudo están limitados por supuestos inherentes4. Experimentos a escala de laboratorio13,14 combinados con el modelado de curvas de avance (BTC) han proporcionado información importante sobre la importancia de las propiedades de la superficie celular bacteriana para la eficiencia de pegado15. Típicamente, los BTC (es decir, las series de tiempos de concentración de partículas en un lugar fijo) se obtienen mediante liberaciones de velocidad constante y la medición de números de celda en la salida del dispositivo experimental. En este contexto, los BTC reflejan la dinámica de advección-dispersión de bacterias en la matriz porosa y pueden extenderse por un término de sumidero que tenga en cuenta la unión. Sin embargo, el modelado de BTC por sí solo no resuelve el papel de la organización espacial del sustrato poroso o biopelícula para los procesos de transporte. Se ha demostrado que otros observables macroscópicos como la dispersión o los perfiles de deposición proporcionan información importante sobre la distribución espacial o las partículas retenidas o las comunidades en crecimiento. Microfluidics es una tecnología que permite estudiar el transporte en medios porosos mediante la investigación de microscopía9,12,16, y excepto un trabajo reciente10, los sistemas experimentales suelen estar restringidos a una escala de sola longitud de resolución, es decir, la escala de poros o toda la escala de dispositivos fluidos.
Aquí, presentamos un conjunto de métodos combinados para estudiar el transporte de bacterias móviles y no móviles en paisajes porosos a diferentes escalas. Combinamos observaciones de transporte bacteriano a escala de poros con información a mayor escala, mediante análisis BTC. Los dispositivos microfluídicos construidos a partir de litografía blanda con polidimetilsiloxano (PDMS) son biocompetibles, resistentes a una gama de productos químicos, permiten replicabilidad a bajo costo y proporcionan una excelente transparencia óptica, así como baja autofluorescencia crítica para la observación microscópica. Los microfluídicos basados en PDMS se han utilizado previamente para estudiar el transporte de microbios en canales simples17 o en geometrías más complejas12. Sin embargo, los experimentos típicamente microfluídicos se centran en horizontes a corto plazo y la observación microscópica de epifluorescencia de células vivas se limita comúnmente a cepas modificadas genéticamente (por ejemplo, cepas etiquetadas por GFP). Aquí presentamos herramientas para estudiar el transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluídicos basados en PDMS en combinación con microscopía y dispositivos más grandes fabricados a partir de poli(metil metacrilato) (PMMA, también conocido como plexiglás) en combinación con la citometría de flujo. PDMS y PMMA difieren en la permeabilidad al gas y las propiedades superficiales, proporcionando así oportunidades complementarias para estudiar el transporte bacteriano. Mientras que el dispositivo microfluídico proporciona un ambiente más controlado, el dispositivo más grande permite experimentos durante largos períodos de tiempo o el uso de comunidades bacterianas naturales. El recuento de microscopía a alta resolución temporal en un área dedicada se utiliza para obtener BTC en el dispositivo microfluídico basado en PDMS. Para obtener recuentos de células para el modelado BTC a partir del dispositivo basado en PMMA, introducimos un dispensador de líquido automatizado autoconstruido en combinación con la citometría de flujo. En esta configuración, las células pasan el dispositivo fluido y se dispensan consecutivamente en 96 placas de pozo. La resolución temporal está restringida por el volumen mínimo que se puede dispensar con precisión y, por lo tanto, el caudal medio a través del dispositivo fluido. El fijador en los pozos previene el crecimiento y facilita la tinción del ADN para la enumeración citométrica de flujo aguas abajo. Para prevenir el crecimiento bacteriano durante los experimentos de transporte utilizamos un medio mínimo (tampón de motilidad a) a) según el término.
Dado que los protocolos para la preparación de dispositivos fluidos a diferentes escalas están fácilmente disponibles, sólo introducimos brevemente las técnicas para producir tales dispositivos y más bien nos centramos en los procedimientos experimentales para grabar LOS BTC. Del mismo modo, existen varias rutinas para la enumeración citométrica de flujo de microbios y los usuarios requieren conocimientos expertos para interpretar los resultados obtenidos por citometría de flujo. Informamos del nuevo uso de dispositivos microfluídicos en combinación con imágenes microscópicas para registrar los BTC de células con etiquetas fluorescentes. A escala de poros, las velocidades y trayectorias locales se obtienen mediante el procesamiento de imágenes. Además, demostramos el uso de un dispositivo fluido basado en PMMA en combinación con el recuento citométrico de flujo para observar el transporte bacteriano de células móviles y no móviles en ambientes porosos colonizados por una biopelícula de flujo nativo.
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Protocol
1. Condiciones de cultivo bacteriano
- Trabajando bajo una campana de flujo laminar, utilice 100 l de una población de glicerol de Pseudomonas putida KT2440 con etiquetas GFP (1 ×10 7 mL-1,almacenada a -80 oC) para inocular 5 ml de luria-Bertani (LB) medio. Incubar a 30oC mientras se agita a 250 rpm durante la noche.
- Al día siguiente, resuspender 100 l del cultivo nocturno en 5 ml de LB medio e incubar en las mismas condiciones durante 5h (fase exponencial). Muestre una alícuota de 1 ml en un tubo de 2 ml, deje enfriar a temperatura ambiente (15 min) y centrífuga (2300 x g durante 5 min).
- Retire el sobrenadante y agregue 1 mL de tampón de motilidad al pellet. Vortex brevemente para homogeneizar la muestra. Diluir para alcanzar la concentración celular deseada, por ejemplo, 5 x 105 mL-1.
- Para experimentos que involucren comunidades naturales, como las derivadas de arroyos, preparen un medio de cultivo no selectivo. Por ejemplo, utilice agua de corriente filtrada estéril y autoclanada o un medio de agua de arroyo artificial modificado con una fuente de carbono compleja (medio LB).
2. Preparación de un dispositivo microfluídico en polidimetilsiloxano (PDMS)
- Diseñar la geometría porosa deseada mediante el software de dibujo asistido por ordenador (CAD)18,que consiste en una matriz de círculos (que es el obstáculo impermeable al flujo), descrito por el tamaño del radio y las coordenadas centrales.
NOTA: En la Figura 1Ase proporciona un ejemplo de geometría porosa con tamaños aleatorios de grano y poro. Un canal de observación sin obstáculos cerca de la salida facilita la adquisición de BTC. - Basado en la geometría elegida, prepare un molde utilizando la fotolitografía estándar SU-818.
NOTA: Alternativamente, los moldes también se pueden pedir en instalaciones de microfabricación dedicadas. Para obtener flujo de fluido heterogéneo en el plano horizontal, es importante diseñar el espesor de la cámara microfluídica del mismo orden de magnitud que el tamaño medio de la garganta de los poros. Sin embargo, asegúrese de que las dimensiones del dispositivo microfluídico sean adecuadas para la observación bajo el microscopio (por ejemplo, el trabajo en diapositivas de microscopio). - Preparar 50 g de PDMS añadiendo 10% de enlace cruzado (dimetil, copolímero de siloxano de metilamógeno) al 90% de elastómero en peso, utilizando una jeringa sin aguja. Trabaje en condiciones limpias y evite el polvo tanto como sea posible. Mezclar los dos reactivos en un recipiente desechable limpio y aplicar vacío (100 mbar) durante 30 minutos para eliminar el aire disuelto y las burbujas de los PDMS viscosos.
- Coloque el molde en una placa Petri (100 mm de diámetro, 15 mm de alto). Vierta los PDMS en el molde a la altura deseada (por ejemplo, 2-5 mm). Cubrir el plato de petri y mantenerlo a 60 oC durante 4 h (durante la noche para capas más gruesas) para curar.
NOTA: Para fines de visualización, la luz debe ser capaz de pasar a través de PDMS, por lo tanto, una capa delgada entre 2 mm a 5 mm es deseable. Las capas más gruesas (>5 mm) reducen la transparencia del dispositivo y las más delgadas se someten a deformaciones durante la aplicación. - Retire el molde del horno y deje que el dispositivo microfluídico se enfríe a temperatura ambiente. Una vez enfriado, retire cuidadosamente la porción deseada de PDMS con un bisturí.
NOTA: Las fuertes presiones sobre el molde resultan en fracturas de moho. No toque el PDMS con las manos desnudas, ya que las huellas dactilares afectarán a la transparencia óptica. - Selle temporalmente la parte inferior del canal PDMS (donde se ha grabado la geometría deseada) con cinta adhesiva. Con un perforador de biopsia de 0,5 mm de diámetro, perfora el canal microfluídico para crear una entrada y una salida que se ajustan al tubo de 0,5 mm (diámetro interior).
NOTA: La naturaleza suave de PDMS garantizará la estanqueidad una vez que se inserte el tubo. Los canales de entrada y salida no se pueden realizar después de que el PDMS se haya sellado al cristal. - Selle el canal microfluídico a través de la unión por plasma de oxígeno utilizando el generador de alta frecuencia (enlace de plasma, Tabla de materiales). Para ello, limpie un portaobjetos de vidrio de silicato (25 mm x 75 mm) con etanol y déjelo secar. Retire la cinta del canal PDMS y coloque el canal con el lado poroso hacia arriba. Tratar el portaobjetos de vidrio de silicato y las superficies PDMS con plasma durante unos 45 s a temperatura ambiente.
- Coloque el canal PDMS en el portaobjetos de vidrio de silicato y caliente a 100 oC durante 30 minutos en una placa caliente.
- Retire el dispositivo microfluídico de la placa caliente y enfríelo a temperatura ambiente. Conecte la entrada del canal PDMS con el tubo. Aplique vacío durante 30 minutos para eliminar el aire de PDMS, que es casi impermeable a los fluidos pero permeable al gas.
- Preparar 100 ml de tampón de motilidad (10 mM de fosfato de potasio, 0,1 mM EDTA, suplementado con 1% de glucosa p/v, pH 7,0) e inyectar 1 ml de él en el dispositivo microfluídico utilizando una bomba de jeringa accionada a 10 l min-1.
NOTA: Como el PDMS está infrasaturado en gas (debido al paso de vacío anterior), las burbujas desaparecerán en un radio de 30 minutos.
3. Preparación de un dispositivo fluido en poli (metacrilato de metilo)
- Diseñe la geometría deseada con el software CAD. Si procede, asegúrese de que las dimensiones sean adecuadas para la observación bajo el microscopio (por ejemplo, las dimensiones de una placa de 96 pozos estándar en combinación con un soporte adecuado). El dispositivo fluido está compuesto por una base (127 × 127 × 12 mm) y una tapa (127 × 127 × 12 mm) de PMMA.
NOTA: Se recomienda la experiencia con el software CAD. En la Figura 1Ase proporciona un ejemplo de dibujo técnico. - Para producir el compartimiento de poros, mediante micromelaje de alta precisión (WF31SA, Mikron), retire 0,5 mm de la capa PMMA inferior y mije una ranura (1,1 × 1,1 mm) para una junta tórica de goma. Taladre 12 orificios roscados (M5). Esto servirá como base del dispositivo fluido.
NOTA: Las dimensiones del dispositivo fluido deben ajustarse para adaptarse a la etapa del microscopio y a la distancia focal. Se proporciona un dibujo técnico en la Figura S1. - Taladre dos orificios roscados (tipo 1/4-28UNF) para la entrada y salida en la parte superior del dispositivo fluido, y 12 orificios (5,5 mm) para los tornillos. Esto servirá como tapa del dispositivo fluido.
NOTA: Se recomienda la experiencia en micro-fresado; los autores utilizan el apoyo de un taller especializado. - Con el fin de limpiar y esterilizar el dispositivo fluido antes y después de cada uso, remoje la base y la tapa del dispositivo fluido en HCl 7% y enjuague tres veces con agua desionizada.
- Atornille la base y la tapa juntos con los 12 orificios roscados.
4. Configuración del dispensador automatizado
NOTA: Los dispensadores de líquidos disponibles en el comercio son costosos y a menudo no ofrecen la flexibilidad de dispensar directamente desde la salida del dispositivo fluido. Por lo tanto, se recomienda ensamblar un sistema dispensador robótico barato y flexible a partir de un robot trazador XY (Tabla de materiales).
- Para dispensar la salida del dispositivo fluido en placas de 96 pozos, monte el dispensador robótico en una placa PMMA y cavidades de molino de 85,8 x 128 mm con una profundidad de 1 mm para albergar varias placas de 96 pozos.
- Conecte el tubo de salida del dispositivo fluido al brazo robótico del dispensador.
- Para operar el dispensador robótico descargar bCNC desde github: https://github.com/vlachoudis/bCNC y siga las instrucciones para instalar el programa.
- Descargue dispenser.py del material de soporte de este artículo.
NOTA: Este código python proporciona un plugin a bCNC para un diseño de dispensador robótico simple. - Conecte el dispensador robótico al ordenador que ejecuta bCNC e identifique el puerto COM correcto.
- En bCNC, haga clic en el botón de inicio para devolver el dispensador robótico a la posición inicial.
NOTA: Homing devuelve el dispensador robótico a una posición conocida (x -0, y-0) y, por lo tanto, mejora la precisión del dispensador. - Antes del experimento, preparar un número suficiente de 96 placas de pozo, con pozos que contengan una cantidad adecuada de fijador (por ejemplo, concentración final 3,7% de formaldehído).
NOTA: Por ejemplo, a un caudal de 0,2 ml min-1, 100 l se dispensan en cada pozo cada 30 s. Por lo tanto, añadir 10 l de 37% de formaldehído a cada pocóder para alcanzar una concentración final de formaldehído entre 2 y 4%. El uso de ocho placas de pozo 96 permitirá operar el experimento durante más de 6 h con un total de 768 puntos de datos. Además, tenga en cuenta que las células etiquetadas con GFP pueden perder su señal fluorescente después de la fijación mediante formaldehído.
5. Analizar el transporte bacteriano utilizando dispositivos microfluídicos PDMS
- Coloque el dispositivo microfluídico PDMS previamente saturado con el tampón de motilidad en la etapa del microscopio. Utilice cinta adhesiva para fijar el tubo para minimizar la perturbación del flujo durante el movimiento de la etapa.
- Mueva la etapa del microscopio al canal de observación cerca de la salida. Usando microscopía de campo brillante o contraste de fase, enfoque en el centro del canal de observación y ajuste la ampliación para visualizar las células bacterianas individuales.
- Cambie los ajustes de la trayectoria de la luz a la microscopía de fluorescencia y ajuste el tiempo de exposición de la cámara para resolver células bacterianas individuales (por ejemplo, 100 ms), o de modo que las señales de fluorescencia de las células sean al menos 3 veces más fuertes que el ruido de fondo.
- A continuación, inserte el tubo de entrada en un tubo de 2 ml que contenga la suspensión bacteriana. Invertir la dirección de la bomba y empezar a retirar la suspensión a un caudal de 1 l min-1.
- Escanee la sección transversal de todo el canal de observación grabando una imagen compuesta cada 2 minutos, durante toda la duración del experimento.
6. Procesamiento básico de imágenes
NOTA: El objetivo de estas rutinas básicas de procesamiento de imágenes es contar el número de bacterias en las imágenes grabadas. Los procedimientos de procesamiento óptimos dependen de las especificaciones técnicas del microscopio y la cámara, así como de las propiedades de fluorescencia de la cepa bacteriana utilizada en el experimento y, por lo tanto, deben ajustarse.
- Primero exporte imágenes en formato .tiff.
- Importe imágenes a una plataforma de software deseada (por ejemplo, MATLAB, ImageJ, R o Python).
- Elimine el ruido de la cámara, que es una variación aleatoria de la intensidad de píxeles en las imágenes y corregir la aberración óptica. Esto se puede hacer aplicando un filtro gaussiano a cada imagen: el tamaño del filtro depende de la calidad del sensor de la cámara (por ejemplo, CCD o CMOS). La aberración óptica se puede eliminar normalizando cada imagen mediante una imagen de referencia recogida en ausencia de la muestra con la misma configuración óptica.
- Recorte las imágenes a una región de interés.
- Identifique un valor de umbral (intensidad de píxel), de modo que los valores por encima del umbral incluyan celdas bacterianas.
NOTA: En caso de que las imágenes estén iluminadas de manera desigual (debido a la aberración óptica o al ruido), puede ser útil aplicar un umbral adaptativo, que elige un valor de umbral basado en intensidades medias locales. - Restar de cada imagen el umbral definido anteriormente.
- Binarize la imagen resultante, de tal manera que las células bacterianas toman un valor de 1, mientras que el fondo toma un valor de 0.
- Elimine los racimos con un área más pequeña que el tamaño de celda bacteriana más pequeño.
- Sume la imagen binarizada para obtener el número total de píxeles de los clústeres restantes. Divida el número de píxeles por el tamaño medio (en píxeles) de una célula bacteriana: esto proporciona una estimación del número total de celdas.
- Conociendo la profundidad de visión y el área de investigación, transformar los recuentos en concentración (partículas mL-1).
- Es fundamental identificar la concentración de la suspensión de bacterias inyectadas. Para ello, inyecte con una jeringa de 1 ml de suspensión de cultivo de bacterias en el canal de observación de un dispositivo microfluídico limpio. Registre la imagen y calcule la concentración bacteriana influente (C0)como se describió anteriormente (6.1 a 6.10).
- Analizar los BTC normalizando la concentración bacteriana del efluente (C) con la concentración bacteriana de influente (C0)y la gráfica C/C0 frente al tiempo.
7. Analizar el transporte bacteriano a escala de poros
- Para analizar las velocidades y trayectorias locales de las bacterias transportadas a través de la matriz porosa, mueva la etapa del microscopio a la región de interés y ajuste el enfoque al centro del dispositivo microfluídico.
- Ajuste el microscopio a campo brillante o contraste de fase.
NOTA: Esto sólo en caso de que la señal de fluorescencia de la célula bacteriana no permita registrar imágenes en el tiempo de exposición más corto que el tiempo bacteriano promedio, de lo contrario utilice microscopía de fluorescencia. - Grabe imágenes de lapso de tiempo, en el momento de la exposición que captura el desplazamiento de bacterias (más corto que el desplazamiento medio sobre un número de píxeles menor que el tamaño del objeto), y que optimiza la detección de células bacterianas (por ejemplo, exposición de 20 ms e imágenes grabadas cada 50 ms). Registre imágenes durante un período de tiempo suficiente para registrar lo suficiente (para ser estadísticamente representativo) de las trayectorias más lentas (por ejemplo, 3 min).
NOTA: Asegúrese de que el equipo tenga suficiente espacio en disco. - Para eliminar el ruido de fondo, resta de cada imagen el promedio de todas las imágenes grabadas. Para ello, cree una matriz cuyo resultado sea la suma de intensidad de todas las imágenes, para cada píxel, y divídala por el número de imágenes.
- A partir de la imagen procesada (Im), determine el módulo del degradado numérico
y normalícese por su valor máximo (max), como se define a continuación.
- Binarice la matriz B mediante umbrales de intensidad, consulte los pasos 6.7-6.8.
- Para cada punto de tiempo, registre las coordenadas de las bacterias (x, y en píxeles o mm) y el tiempo de adquisición de la imagen en un archivo de tres columnas.
- Por último, aplique un script de seguimiento de partículas para procesar los datos registrados y calcular las trayectorias de las bacterias. Por ejemplo, utilice el protocoloestablecido 19y el código de seguimiento de partículas Matlab disponible libremente: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
y normalícese por su valor máximo (max), como se define a continuación.
8. Estudiar la filtración bacteriana por medio de perfiles de deposición
- Para obtener perfiles de deposición de células P. putida KT2440 etiquetadas por GFP por microscopía de fluorescencia, registre una imagen compuesta de todo el canal poroso antes, que es el fondo, y después de la inyección de suspensión bacteriana a través del dispositivo microfluídico. Utilice un tiempo de exposición que permita adquirir señal fluorescente bacteriana (por ejemplo, 100 ms), sin blanquear la señal.
- Exportar imágenes e importar en la plataforma de software deseada (véase 6.1-6.2).
- Retire el fondo de las imágenes grabadas después de la inyección bacteriana.
- Integrar la señal de fluorescencia total de las bacterias retenidas a lo largo de secciones transversales del canal poroso.
- Para calcular el perfil de deposición, trace la señal de florescencia integrada frente a la longitud del canal poroso.
9. Analizar el transporte bacteriano utilizando dispositivos fluidos de PMMA y citometría de flujo
- Conecte la bomba peristáltica con la entrada utilizando tubos de 50 cm (1 mm de diámetro interior) y la salida con el dispensador automatizado utilizando el mismo tubo (50 cm, ver sección 4).
NOTA: Utilice la bomba para dispensar medios de cultivo e inyectar células bacterianas. Utilice conectores Luer-lock y válvulas trideso para desplazarse entre la suspensión media y bacteriana durante la liberación de velocidad constante. - Medio de cultivo de la bomba en el dispositivo fluido. Tenga en cuenta la llegada del medio en el tubo de salida fijado al dispensador robótico.
- Comience a inyectar la suspensión bacteriana a través del dispositivo fluido PMMA a un caudal de 0,2 ml min-1,
- Cuando las bacterias lleguen a la entrada del dispositivo fluido, encienda el dispensador automatizado.
- Para realizar una inyección de pulso, inyecte la suspensión bacteriana para algunos volúmenes de poros (por ejemplo, 30), y luego cambie la inyección a los medios de cultivo hasta que finalice el experimento.
NOTA: el volumen de poros del dispositivo fluido es de aproximadamente 0,2 ml, por lo que al caudal prosed cada minuto se intercambia un volumen de poro entero. - Una vez que se haya completado una placa de 96 pozos, cubra la placa para reducir la evaporación y guárdela a 4 oC.
- Analizar la abundancia bacteriana a través de la citometría de flujo, siguiendo los protocolos establecidos20.
NOTA: Por ejemplo, añada 25 l de la mancha de ácido nucleico verde-fluorescente (Tabla de materiales) a 0,025 mM (en agua ultrapura) a cada pozo. Mancha el ADN bacteriano, permitiendo así cuantificar por citometría de flujo la abundancia bacteriana. Incubar muestras durante 15 minutos en la oscuridad y luego analizar utilizando un citómetro de flujo equipado con un láser de 488 nm y detectores a 515 nm. - Antes del análisis BTC, considere la dilución de la muestra debido a la adición de fijador y mancha. Corregir la abundancia bacteriana por un factor de 1.35 para tener en cuenta la fijación y la mancha.
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Representative Results
Para ilustrar la funcionalidad del flujo de trabajo presentado, realizamos experimentos utilizando Pseudomonas putida KT2440 modificada genéticamente, una bacteria móvil gram negativa importante para la biorremediación y la biotecnología. Las versiones modificadas genéticamente de esta cepa que expresan la producción de GFP están disponibles comercialmente. También está disponible una cepa no móvil de P. putida KT2440 que carece de los genes estructurales y reguladores pertinentes para la motilidad. Usando tanto Mutilo como no móvil GFP etiquetado P. putida KT2440, realizamos experimentos secuenciales en dispositivos microfluídicos PDMS con una matriz aleatoria de pilares (Figura 1B) y BTC grabados (Figura 2A). Los BTC se han normalizado a la concentración de células inyectadas (C0). Simultáneamente, las trayectorias bacterianas en la escala de poros se visualizaban a través del procesamiento de imágenes y el seguimiento de partículas como se describió anteriormente (Figura 2B).
A continuación, realizamos experimentos con dispositivos fluidos a gran escala fresados a partir de PMMA (Figura 1A). Se inyectaron motiles y no móviles P. putida KT2440 (no fluorescentes) en una matriz porosa espaciada regularmente y se obtuvieron BTC utilizando el dispensador de líquido y el recuento de citometría de flujo como se describió anteriormente (Figura 3A). Sorprendentemente, en un ambiente poroso carente de biopelícula, el móvil y no móvil P. putida KT2440 mostró un comportamiento de transporte marcadamente diferente. En una matriz porosa colonizada durante 48h con una compleja comunidad de biopelículas de flujo, estas diferencias en BTC entre el móvil y no móvil P. putida KT2440 desaparecieron(Figura 3B.)
Figura 1: Dispositivos fluidos para estudiar el transporte microbiano en medios porosos (A) Ilustración de un dispositivo fluido fresado a partir de PMMA. La matriz porosa se fresa en la capa base del dispositivo, la tapa se cierra con tornillos. Una sección transversal muestra la disposición de los pilares dentro del dispositivo fluido. La plaquita muestra una matriz porosa con una cuadrícula regular espaciada de pilares y el campo de flujo de velocidad respectivo. (B) El dispositivo PDMS se monta en una diapositiva de vidrio de microscopía. Se muestran el flujo de entrada y salida, conectado al depósito medio y a la bomba de la jeringa, respectivamente. La cámara de observación para el conteo microscópico se coloca como una cámara separada sin una matriz porosa en la misma diapositiva del microscopio. La plaquita muestra una matriz porosa con una matriz aleatoria de pilares (en diámetro y espaciado). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Transporte bacteriano a escala de canales y poros en el dispositivo fluido PDMS (A) BTCs de Mutilo y no móvil P. putida KT2440 (GFP etiquetado) obtenido con un dispositivo microfluídico PDMS y conteo microscópico. (B) Trayectorias de células no móviles a escala de poros. Los colores se eligen para mejorar la diferenciación de las trayectorias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Transporte bacteriano a escala de canales y poros en el dispositivo fluido PMMA (A) BTC de Mutilo y no móvil P. putida KT2440 (no etiquetado) obtenido utilizando un dispositivo fluido PMMA y conteo de citometría de flujo. (B) El dispositivo fluido fue colonizado por una comunidad de arroyos naturales durante 2 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura complementaria 1: Dibujos técnicos del dispositivo fluido PMMA. El dispositivo se compone de una unidad base que contiene la matriz porosa y una unidad de tapa con los orificios para la entrada y salida. El dispositivo está sellado con 12 tornillos y una junta tórica. Haga clic aquí para descargar esta figura.
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Discussion
Aquí sugerimos dos medios para estudiar el transporte de microbios a través de sistemas porosos a nivel de una sola célula y población. Si bien el estudio de los fenómenos de transporte utilizando el modelado BTC ha proporcionado información valiosa sobre la propagación de patógenos o contaminantes a escalas de ecosistemas, todavía existen dificultades para escalar de experimentos de laboratorio a condiciones de campo. Las herramientas descritas aquí permiten a los investigadores resolver experimentalmente las escalas espaciales y temporales con el fin de comprender mejor las estrategias ecológicas de los microbios relevantes para el transporte en entornos porosos. Los experimentadores pueden utilizar o modificar estos sistemas para estudiar otros rasgos microbianos que no sean la motilidad, como la quimiotaxis o la detección de quórum o modificar la geometría u otras características del hábitat de la matriz porosa. Además, utilizando estos sistemas, el comportamiento de transporte bacteriano se puede acoplar fácilmente a los perfiles de deposición, que proporcionan información importante sobre los patrones de colonización y son fundamentales para entender cómo las biopelículas modifican los campos de flujo locales. Anticipamos que una mejor comprensión de las estrategias microbianas para dispersar y colonizar medios porosos mejorará las predicciones modelo y contribuirá así al manejo de la propagación de patógenos o la contención de contaminantes. Otras modificaciones del sistema también pueden contribuir al desarrollo de nuevos dispositivos de filtración o herramientas biotecnológicas en las que las células deben separarse físicamente.
Recomendamos dispositivos basados en PMMA para experimentos grandes y a largo plazo y dispositivos basados en PDMS para experimentos más pequeños y a corto plazo o cuando la alta resolución temporal es crítica. Hay que tener en cuenta que los dos materiales tienen propiedades diferentes. Por ejemplo PDMS es permeable a gas como el oxígeno, mientras que PMMA es a gas apretado. Esta diferencia se puede utilizar para estudiar el consumo de gas en el escenario de PMMA, mientras que PDMS podría ser más adecuado para experimentos donde las limitaciones de oxígeno relacionadas con la respiración bacteriana no son deseadas.
En general, los protocolos descritos aquí son fácilmente reproducibles y los datos obtenidos utilizando estas herramientas revelan constantemente diferencias en el transporte de bacterias móviles y no móviles. El dispensador de líquidos hecho a sí mismo puede sustituirse por una alternativa disponible comercialmente. Sin embargo, por razones de versatilidad y rentabilidad recomendamos la que se describe aquí. Los pasos críticos en el protocolo se refieren principalmente al manejo de los dispositivos fluidos y a la experiencia con el procesamiento de imágenes. La calidad de los datos obtenidos a través del análisis de imágenes depende críticamente de la calidad de la imagen (principalmente determinada por el enfoque y el tiempo de exposición) y de una estrategia de umbral adecuada. La calidad de los datos obtenida mediante el recuento citométrico de flujo depende críticamente de la fijación y tinción efectivas de las células y de la experiencia en la interpretación de los resultados de la citometría de flujo.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflicto de intereses.
Acknowledgments
Reconocemos la ayuda de Antoine Wiedmer con la configuración del dispensador robótico y el guión dispenser.py.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
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