Summary
עקומות פורצות דרך (BTCs) הן כלים יעילים לחקר הובלת חיידקים במדיה נקבובית. כאן אנו מציגים כלים המבוססים על התקנים נוזליים בשילוב עם מיקרוסקופיה וספירת ציטומטרית זרימה כדי להשיג BTCs.
Abstract
הבנת ההובלה, הפיזור והתצהיר של מיקרואורגניזמים במדיה נקבובית היא משימה מדעית מורכבת הכוללת נושאים מגוונים כמו הידרודינמיקה, אקולוגיה והנדסה סביבתית. מידול תחבורה חיידקית בסביבות נקבוביות בקנה מידה מרחבי שונה הוא קריטי כדי לחזות טוב יותר את ההשלכות של תחבורה חיידקים, עדיין מודלים נוכחיים לעתים קרובות להיכשל בקנה מידה ממעבדה לתנאי שדה. כאן, אנו מציגים כלים ניסיוניים לחקר תחבורה חיידקית במדיה נקבובי בשני קשקשים מרחביים. מטרתם של כלים אלה היא להשיג התבוננות מאקרוסקופית (כגון עקומות פורצות דרך או פרופילי תצהיר) של חיידקים המוזרקים למטריצות נקבוביות שקופות. בקנה מידה קטן (10-1000 μm), התקנים מיקרו-נוזלים משולבים עם וידאו אופטי-מיקרוסקופי ועיבוד תמונה כדי להשיג עקומות פורצות דרך, ו, באותו זמן, כדי לעקוב אחר תאים חיידקיים בודדים בקנה המידה הנקבוביות. בקנה מידה גדול יותר, ציתום זרימה משולב עם מתקן רובוטי מעשה עצמי כדי להשיג עקומות פורצות דרך. אנו ממחישים את התועלת של כלים אלה כדי להבין טוב יותר כיצד חיידקים מועברים במדיה נקבובי מורכבת כגון האזור hyporheic של נחלים. מכיוון שכלים אלה מספקים מדידות בו-זמנית על-פני סולמות, הם סוללים את הדרך למודלים מבוססי מנגנון, החשובים ביותר לצורך upscaling. יישום של כלים אלה עשוי לא רק לתרום לפיתוח יישומים חדשניים לשיקום ביולוגי, אלא גם לשפוך אור חדש על האסטרטגיות האקולוגיות של מיקרואורגניזמים ליישב מצעים נקבוביים.
Introduction
מחקרים שמטרתם להבין את ההובלה של חיידקים באמצעות מדיה נקבובית היו מונעים בעיקר עלידי חששות של זיהום 1, השידור של מחלה2 ותיקון ביולוגי3. בהקשר זה, חיידקים טופלו בעיקר כחלקיקים במודליםתחבורה 4 ותהליכים כגון סינון, מאמץ, יישוב כבידתי או remobilization מ biofilms זוהו כנהגים של שמירה או הובלה של חיידקים5. עם זאת, לימוד התחבורה של חיידקים באמצעות נופים נקבוביים יכול גם ליידע אותנו על האסטרטגיות האקולוגיות שבבסיס הצלחתם בסביבות מורכבות אלה. עם זאת, זה דורש ניסויים חדשניים ומודלים מתמטיים הפועלים ברמת התא היחיד, האוכלוסייה או הקהילה המיקרוביאלית.
סביבות נקבוביות טבעיות, כגון אלה שנמצאו באזור ההיפורי של נחלים ונהרות, מתיישבות בצפיפות על ידי קהילות מגוונות של חיידקים יוצרי ביופילם6. Biofilms יוצרים מבנים המ משנים את הזרימה ולכן הובלה ופיזור של חיידקים בשלבנוזלי 7,8. הובלת חיידקים בקנה מידה נקבוביות תלויה בזמינות החלל מוגבלת במטריקס נקבובי ופיזור הקשורות לתנוניות עשוי להיות דרך יעילה כדי להגדיל את הכושר הפרט באמצעות תחרות מופחתת על משאבים באזורים מאוכלסים פחות בצפיפות. מצד שני, חיידקים מוטיב יכולים גם להגיע לאזורים מבודדים יותר של המטריצה הנקבובית, והחקירה המורחבת של אזורים כאלה עשויה לספק הזדמנויות אקולוגיות לאוכלוסיות10. בקנה מידה מרחבי גדול יותר, צמיחת biofilm מסיט את נתיבי הזרימה גם מוביל (חלקי) סתימת נקבוביות, ובכך, להקמת תנאי זרימה מתועלים והטרוגנייםעוד יותר 11. זה יש השלכות על אספקת חומרים מזינים וקיבולת פיזור, תדירות ומרחק. זרימה מועדף, למשל, יכול ליצור מה שנקרא "מסלולים מהירים" וחיידקים מוטיב יכולים להגיע למהילות גבוהות עוד יותר מאשר הזרימה המקומיתלאורך מסלולים אלה 12. זוהי דרך יעילה להגביר את חקר בתי גידול חדשניים.
מגוון כלים מועילים לחקר הובלת חיידקים צייתנים ולא מוטיבים (וחלקיקים) במדיה נקבובית. מודלים מספריים יש יכולות חיזוי גדול חשוב עבור יישומים, עם זאת מוגבלים לעתים קרובות על ידי הנחות הטבועות4. ניסויים בקנה מידהמעבדה 13,14 בשילוב עם מידול עקומה פריצת דרך (BTC) סיפקו תובנות חשובות בחשיבות של תכונות פני תא חיידקי עבורדבק יעילות 15. בדרך כלל, BTCs (כלומר, סדרת פעמים של ריכוז חלקיקים במיקום קבוע) מתקבלים באמצעות מהדורות קצב קבוע ומדידה של מספרי תאים בזרימה של המכשיר הניסיוני. בהקשר זה, BTCs משקפים את הדינמיקה של אדו-פיזור חיידקים במטריקס הנקבובי ותורחב על ידי מונח כיור חשבונאות עבור קובץ מצורף. עם זאת, מידול של BTCs לבד אינו פותר את התפקיד של ארגון מרחבי של המצע נקבובי או biofilm עבור תהליכי תחבורה. נצפים מאקרוסקופיים אחרים כמו פרופילי פיזור או תצהיר הוכחו כמספקים מידע חשוב על ההתפלגות המרחבית או על החלקיקים השמורים או על הקהילות הגדלות. מיקרו-נוזלים היא טכנולוגיה המאפשרת לימוד תחבורה במדיה נקבובית על ידיחקירת מיקרוסקופ 9,12,16, וחוץמעבודה אחרונה 10, מערכות ניסיוניות מוגבלות בדרך כלל בקנה מידה אורך אחד של רזולוציה, כל כך, סולם הנקבוביות או סולם המכשיר הנוזלי כולו.
כאן, אנו מציגים סוויטה של שיטות משולבות כדי ללמוד את ההובלה של חיידקים מוטיב ולא מוטיב בנופים נקבוביים בקנה מידה שונים. אנו משלבים תצפיות של תחבורה חיידקית בקנה מידה נקבוביות עם מידע בקנה מידה גדול יותר, באמצעות ניתוח BTC. התקנים מיקרו-נוזלים הבנויים מליתוגרפיה רכה באמצעות פולידימטילסילוקסן (PDMS) תואמים ביולוגית, עמידים בפני מגוון כימיקלים, מאפשרים שכפול בעלויות נמוכות ומספקים שקיפות אופטית מצוינת, כמו גם פלואורסצינטי נמוך קריטי לתצפית מיקרוסקופית. מיקרו-נוזלים המבוססים על PDMS שימשו בעבר לחקר ההובלה של חיידקים בערוצים פשוטים17 או בגיאומטריות מורכבות יותר12. עם זאת, בדרך כלל ניסויים מיקרו-נוזלים מתמקדים באופקים לטווח קצר והתבוננות מיקרוסקופית אפינפרין-פלואורסצי של תאים חיים מוגבלת בדרך כלל זנים מהונדסים גנטית (למשל, זנים מתויגים GFP). כאן אנו מציגים כלים לחקר תחבורה חיידקית באמצעות התקנים מיקרו-נוזלים מבוססי PDMS בשילוב עם מיקרוסקופיה והתקנים גדולים יותר מפוברקים מפולי (מתיל methacrylate) (PMMA, המכונה גם פרספקס) בשילוב עם ציתום זרימה. PDMS ו PMMA שונים חחלנות גז ומאפייני פני השטח, ובכך מתן הזדמנויות משלימות ללמוד תחבורה חיידקים. בעוד המכשיר microfluidic מספק סביבה מבוקרת יותר, המכשיר הגדול מאפשר ניסויים על פני פרקי זמן ממושכים או באמצעות קהילות חיידקים טבעיים. ספירת מיקרוסקופים ברזולוציה זמנית גבוהה באזור ייעודי משמשת להשגת BTC בהתקן מיקרו-נוזלים מבוסס PDMS. כדי להשיג ספירות תאים עבור מידול BTC מהתקן מבוסס PMMA, אנו מציגים מתקן נוזלי אוטומטי שנבנה באופן עצמאי בשילוב עם ציתום זרימה. בהתקנה זו, תאים לעבור את המכשיר הנוזלי והם מחולקים ברצף לתוך 96 צלחות באר. רזולוציית הזמן מוגבלת על ידי נפח מינימלי שניתן לחלק במדויק ולכן קצב הזרימה הבינוני דרך המכשיר הנוזלי. קיבעון בארות מונע צמיחה ומקל על כתמי DNA לתפיכת זרימה-ציטומטרית במורד הזרם. כדי למנוע צמיחה חיידקית במהלך ניסויי תחבורה אנו משתמשים במדיום מינימלי (מוזמן מאגר תנועתיות).
מאז פרוטוקולים להכנת התקנים נוזליים בקנה מידה שונים זמינים, אנו רק לזמן קצר להציג את הטכניקות כדי לייצר מכשירים כאלה ולא להתמקד בהליכים ניסיוניים כדי להקליט BTCs. באופן דומה, שגרות שונות קיימות עבור תקרת זרימה ציטוטית של חיידקים ומשתמשים דורשים ידע מומחה כדי לפרש תוצאות שהושגו על ידי ציטומטריית זרימה. אנו מדווחים על השימוש החדשני במכשירים מיקרו-נוזלים בשילוב עם הדמיה מיקרוסקופית כדי להקליט BTCs של תאים מתויגים פלורסנט. בסולם הנקבוביות, מהומות מקומיות ומסלולים מתקבלים באמצעות עיבוד תמונה. יתר על כן, אנו מדגימים את השימוש במכשיר נוזלי מבוסס PMMA בשילוב עם זרימה-ציטומטרית ספירה כדי לצפות הובלה חיידקים של תאים מוטיב ולא מוטיב בסביבות נקבוביות התיישבו על ידי biofilm זרם מקורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תנאי תרבות חיידקים
- עובד תחת מכסה המנוע זרימה למינאר, להשתמש 100 μL של מלאי גליצרול של GFP מתויג פסאודומונס putida KT2440 (1 × 107 mL-1,מאוחסן ב -80 ° C) כדי לחסן 5 מ"ל של לוריה-Bertani (LB) בינוני. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד ב 250 סל"ד לילה.
- למחרת, resuspend 100 μL של תרבות הלילה ב 5 מ"ל LB בינוני דגירה באותם תנאים עבור 5h (שלב אקספוננציאלי). דוגמה 1 מ"ל aliquot לתוך צינור 2 מ"ל, לאפשר להתקרר טמפרטורת החדר (~ 15 דקות) וצנטריפוגה (2300 x גרם עבור 5 דקות).
- הסר את supernatant ולהוסיף מאגר 1 מ"ל תנועתיות לגלולה. מערבולת לזמן קצר כדי homogenize הדגימה. דילול כדי להגיע לריכוז התא הרצוי, למשל, 5 x 105 מ"ל-1.
- לניסויים הקשורים לקהילות טבעיות, כגון אלה הנגזרות מזרמים, הכינו מדיום טיפוח לא סלקטיבי. לדוגמה, השתמשו במים סטריליים מסוננים ועם זרם אוטומטי או במדיום מים מלאכותיים שתוקנו עם מקור פחמן מורכב (LB Medium).
2. הכנת מכשיר מיקרופלואידי בפולידימתילסילוקסן (PDMS)
- עצב את הגיאומטריה הנקבובית הרצויה באמצעות תוכנת ניסוח (CAD) בעזרת מחשב18, המורכבת מטריצה של עיגולים (כלומר המכשול הבלתי חדיר להזרמה), המתוארת על-ידי גודל הרדיוס וקואורדינטות המרכז.
הערה: דוגמה לגיאומטריה נקבובית עם גדלי תבואה נקבוביות אקראיים מסופקת באות 1A. ערוץ תצפית ללא מכשולים קרוב לשקע מאפשר את הרכישה של BTCs. - בהתבסס על הגיאומטריה שנבחרה, הכינו תבנית באמצעות SU-8-photolithographyסטנדרטי 18.
הערה: לחלופין, ניתן גם להזמין תבניות ממתקן מיקרו-פאבריקציה ייעודי. על מנת להשיג זרימת נוזל הטרוגני במישור האופקי, חשוב לעצב את העובי של תא microfluidics באותו סדר גודל כמו גודל הגרון הנקבוביות הממוצע. עם זאת, ודא כי הממדים של המכשיר microfluidic מתאימים להתבוננות תחת המיקרוסקופ (למשל, לעבוד על שקופיות מיקרוסקופ). - להכין 50 גרם של PDMS על ידי הוספת 10% של מקשר צולב (דימתיל, מתילהירוגן siloxane קופולימר) כדי 90% של elastomer לפי משקל, באמצעות מזרק ללא מחט. לעבוד בתנאים נקיים ולהימנע אבק ככל האפשר. מערבבים את שני הריגנטים במיכל חד פעמי נקי ולהחיל ואקום (100 mbar) במשך 30 דקות כדי להסיר אוויר מומס ובועות מה-PDMS צמיגי.
- מניחים את התבנית בצלחת פטרי (בקוטר 100 מ"מ, 15 מ"מ). יוצקים את ה-PDMS על התבנית לגובה הרצוי (לדוגמה, 2-5 מ"מ). מכסים את צלחת הפטרי ולשמור אותו ב 60 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות (לילה לשכבות עבות יותר) כדי לרפא.
הערה: למטרת הדמיה, אור אמור להיות מסוגל לעבור דרך PDMS, ולכן, שכבה דקה בין 2 מ"מ ל 5 מ"מ רצויה. שכבות עבות יותר (>5 מ"מ) מפחיתות את שקיפות ההתקן ושכבות דקות יותר חשופות לעיוותים במהלך היישום. - מוציאים את העובש מהתנור ומאפשרים למכשיר המיקרו-נוזל להתקרר לטמפרטורת החדר. לאחר מקורו, בזהירות להסיר את החלק הרצוי של PDMS עם אזמל.
הערה: לחצים חזקים על התבנית לגרום שברים עובש. אל תיגע ב-PDMS בידיים חשופות, מכיוון שטביעות אצבעות ישפיעו על שקיפות אופטית. - אטום זמני את תחתית ערוץ PDMS (שבו הגיאומטריה הרצויה חרוטה) עם סרט הדבקה. עם אגרוף ביופסיה בקוטר 0.5 מ"מ, לנקב ערוץ microfluidic כדי ליצור מפרצון ושקע מתאים 0.5 מ"מ (קוטר פנימי) צינורות.
הערה: האופי הרך של PDMS יבטיח לחץ לאחר הוספת הצינורות. אין אפשרות לבצע ערוצים פנימה ושקע לאחר PDMS נאטם לזכוכית. - לאטום את הערוץ microfluidic באמצעות מליטה פלזמה חמצן באמצעות מחולל בתדר גבוה (מליטה פלזמה, טבלת חומרים). כך, נקה מגלשת זכוכית סיליפט (25 מ"מ x 75 מ"מ) עם אתנול ותן לה להתייבש. הסר את הקלטת מערוץ PDMS והצב את הערוץ כשהצד הנקבובי פונה כלפי פנים כלפי פנים. טפל בשקופית הזכוכית הסיליצית ומשטחי PDMS עם פלזמה במשך כ-45 שניות בטמפרטורת החדר.
- מניחים את ערוץ PDMS על מגלשת הזכוכית הסיליצית וחום ב-100 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות על פלטה חמה.
- מוציאים את המכשיר המיקרו-נוזל מהצלחת החמה ומצננים אותו לטמפרטורת החדר. חבר את היכנס ערוץ PDMS עם צינורות. למרוח ואקום במשך 30 דקות כדי להסיר אוויר מPDMS, שהוא כמעט חסין לנוזלים אבל חדיר לגז.
- להכין 100 מ"ל של חוצץ תנועית (10 mM אשלגן פוספט, 0.1 mM EDTA, בתוספת 1% w / v גלוקוז, pH 7.0) ולהזריק 1 מ"ל של אותו לתוך המכשיר microfluidic באמצעות משאבת מזרק המופעלת ב 10 μL min-1.
הערה: מכיוון שה- PDMS אינו רווי בגז (עקב שלב הוואקום הקודם), בועות ייעלמו בתוך כ- 30 דקות.
3. הכנת מכשיר נוזלי בפולי (מתיל מתקרילייט)
- עצב את הגיאומטריה הרצויה באמצעות תוכנת CAD. אם הדבר ישים, ודא כי הממדים מתאימים להתבוננות תחת המיקרוסקופ (למשל, ממדים של לוח 96 באר סטנדרטי בשילוב עם בעל מתאים). המכשיר הנוזלי מורכב מבסיס (127 × 127 × 12 מ"מ) ומכסה (127 × 127 × 12 מ"מ) של PMMA.
הערה: מומלץ להתמחות עם תוכנת CAD. ציור טכני לדוגמה מסופק באיור 1A. - כדי לייצר את תא הנקבוביות, באמצעות מיקרומילינג מדויק (WF31SA, Mikron), הסר 0.5 מ"מ מהשכבה התחתונה של PMMA וטחנת גרוב (1.1 × 1.1 מ"מ) עבור טבעת O מגומי. מקדחה 12 חורים משורשרים (M5). זה ישמש כבסיס של המכשיר הנוזלי.
הערה: יש לכוונן את ממדי המכשיר הנוזלי כך שיתאימו לשלב המיקרוסקופ ולרחוק המוקד. ציור טכני מסופק באיור S1. - מקדחה שני חורים משורשרים (סוג 1/4-28UNF) עבור פנימה ושקע לתוך החלק העליון של המכשיר הנוזלי, ו 12 חורים (5.5 מ"מ) עבור הברגים. זה ישמש כמכסה של המכשיר הנוזלי.
הערה: מומחיות במיקרו-כרסום מומלצת; המחברים משתמשים בתמיכה מבית מלאכה מיוחד. - על מנת לנקות ולחטא את המכשיר הנוזלי לפני ואחרי כל שימוש, להשרות את הבסיס והמכסה של המכשיר הנוזלי ב HCl 7% ולשטוף שלוש פעמים עם מים deionized.
- בורג בסיס ומכסה יחד באמצעות 12 חורים משורשרים.
4. הגדרת מתקן אוטומטי
הערה: מתקן נוזלי זמין מסחרית הם יקרים ולעתים קרובות אינם מציעים את הגמישות לחלק ישירות מן הזרימה של המכשיר הנוזלי. לכן, מומלץ להרכיב מערכת מתקן רובוטית זולה וגמישה מרובוט XY Plotter (טבלת חומרים).
- על מנת לחלק את הזרימה מהמכשיר הנוזלי לתוך 96 לוחות גם, הר המתקן הרובוטי על לוח PMMA ועששת טחנה של 85.8 x 128 מ"מ עם עומק של 1 מ"מ להחזיק כמה 96 לוחות גם.
- חבר את צינור הזרימה של המכשיר הנוזלי לזרוע הרובוטית של המתקן.
- כדי להפעיל את המתקן הרובוטי להוריד bCNC מ github: https://github.com/vlachoudis/bCNC ובצע את ההוראות כדי להתקין את התוכנית.
- הורד dispenser.py מהחומר התומך במאמר זה.
הערה: קוד פיתון זה מספק תוסף ל-bCNC עבור פריסת מתקן רובוטית פשוטה. - חבר את המתקן הרובוטי למחשב שבו פועל bCNC וזיהה את יציאת COM הנכונה.
- ב bCNC, לחץ על כפתור הבית כדי להחזיר את המתקן הרובוטי למיקום הבית.
הערה: ביות מחזיר את המתקן הרובוטי למיקום ידוע (x=0, y=0) ולכן משפר את הדיוק של המתקן. - לפני הניסוי, להכין מספר מספיק של 96 צלחות באר, עם בארות המכילות כמות מתאימה של קיבעון (למשל, ריכוז סופי 3.7% פורמלדהיד).
הערה: לדוגמה, בקצב זרימה של 0.2 מ"למינימום -1, 100 μL מחולקים לכל באר כל 30 שניות. לכן, להוסיף 10 μL של 37% פורמלדהיד לכל באר כדי להגיע לריכוז הסופי של פורמלדהיד בין 2 ו 4%. שימוש בשמונה 96 לוחות באר יאפשר להפעיל את הניסוי במשך יותר מ 6 שעות עם סך של 768 נקודות נתונים. יתר על כן, שים לב כי תאים מתויגים GFP עלול לאבד אות פלורסנט שלהם לאחר קיבעון באמצעות פורמלדהיד.
5. לנתח תחבורה חיידקית באמצעות התקנים מיקרופלויד PDMS
- מקם את התקן המיקרו-נוזלים PDMS רווי בעבר במאגר התנוניות בשלב המיקרוסקופ. השתמש בקלטת כדי לתקן את הצינורות כדי למזער את ההפרעה של הזרימה במהלך תנועת השלב.
- הזז את שלב המיקרוסקופ לערוץ התצפית קרוב לשקע. באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או ניגודיות פאזה, להתמקד במרכז ערוץ התצפית ולהתאים את ההגדלה כדי לדמיין תאים חיידקיים בודדים.
- העבר את הגדרות נתיב האור למיקרוסקופ פלואורססנס והתאם את זמן החשיפה למצלמה כדי לפתור תאים חיידקיים בודדים (למשל 100 אלפיות השנייה), או כך שאותות פלואורסססס של תאים חזקים פי 3 לפחות מרעשי הרקע.
- לאחר מכן, הכנס את צינורות ההכניסה לתוך צינור 2 מ"ל המכיל את המתלים החיידקיים. כיוון משאבה הפוכה ולהתחיל למשוך את המתלים בקצב זרימה של 1 μLmin -1.
- סרוק את חתך הרוחב של ערוץ התצפית כולו הקלטת תמונה מורכבת כל 2 דקות, לאורך כל תקופת הניסוי.
6. עיבוד תמונה בסיסי
הערה: המטרה של שגרות עיבוד תמונה בסיסיות אלה היא לספור את מספר החיידקים בתמונות שהוקלטו. הליכי עיבוד אופטימליים תלויים במפרטים הטכניים של המיקרוסקופ והמצלמה, כמו גם במאפייני הפלואורסצנס של הזן החיידקי המשמש בניסוי ולכן יש להתאים אותו.
- ייצוא ראשון תמונות .tiff פורמט.
- יבא תמונות לפלטפורמת תוכנה רצויה (לדוגמה, MATLAB, ImageJ, R או Python).
- הסר את רעש המצלמה, שהוא וריאציה אקראית של עוצמת פיקסלים בתמונות ותקן סטייה אופטית. ניתן לעשות זאת בהחילת מסנן גאוסי על כל תמונה: גודל המסנן תלוי באיכות חיישן המצלמה (לדוגמה CCD או CMOS). ניתן להסיר את סטיית האופטית על-ידי נרמול כל תמונה על-ידי תמונת ייחוס שנאסף בהיעדר הדגימה עם אותה תצורה אופטית.
- חתוך את התמונות לאזור מעניין.
- זהה ערך סף (עוצמת פיקסלים), כך שהערכים מעל הסף כוללים תאים חיידקיים.
הערה: במקרה שתמונות מוארות באופן לא אחיד (עקב סטייה אופטית או רעש) ייתכן שיהיה זה שימושי להחלת סף אדפטיבי, הבוחר ערך סף המבוסס על עוצמות ממוצעות מקומיות. - הפחת מכל תמונה את הסף שהוגדר לעיל.
- בינאריזציה של התמונה שנוצרת, כך תאים חיידקיים לקחת ערך של 1, בעוד הרקע לוקח ערך של 0.
- הסר אשכולות עם אזור קטן יותר מגודל התא החיידקי הקטן ביותר.
- סכם את התמונה ה- binarized כדי להשיג את המספר הכולל של פיקסלים באשכולות הנותרים. חלק את מספר הפיקסלים בגודל הממוצע (בפיקסלים) של תא חיידקי: פעולה זו מספקת הערכה של המספר הכולל של תאים.
- לדעת עומק התצוגה ותחום החקירה, להפוך ספירות לריכוז (חלקיקים mL-1).
- זה בסיסי לזהות את הריכוז של השעיית חיידקים מוזרקים. כדי לעשות זאת, להזריק עם מזרק 1 מ"ל של מתלה תרבות חיידקים לתוך ערוץ התצפית של מכשיר מיקרופלוידיק נקי. להקליט את התמונה ולחשב את ריכוז חיידקים שפעת (C0)כמתואר לעיל (6.1 כדי 6.10).
- לנתח BTCs על ידי נרמול ריכוז חיידקים effluent (C) עם ריכוז חיידקים שפעת (C0)ולתכנן C /C0 לעומת הזמן.
7. לנתח תחבורה חיידקית בקנה מידה נקבוביות
- על מנת לנתח את המהירויות המקומיות ואת המסלולים של חיידקים מועברים דרך המטריצה נקבובי, להעביר את שלב המיקרוסקופ לאזור של עניין ולהתאים את המוקד למרכז המכשיר microfluidic.
- הגדר מיקרוסקופ לניגודיות שדה בהיר או פאזה.
הערה: זה רק במקרה אות פלואורסנס של תא חיידקי אינו מאפשר הקלטה תמונות בזמן חשיפה קצר יותר מאשר הזמן החיידקי הממוצע, אחרת להשתמש מיקרוסקופ פלואורסקציה. - הקלטת תמונות זמן-לשגות, בזמן חשיפה הלוכדת עקירת חיידקים (קצר יותר מהעקירה הממוצעת על פני מספר פיקסלים קטנים יותר מגודל האובייקט), וזה מייעל זיהוי תאים חיידקיים (למשל חשיפה של 20 ms ותמונות שתועדו כל 50 אלפיות השנייה). הקלט תמונות במשך פרק זמן מספיק כדי להקליט מספיק (כדי להיות נציג סטטיסטי) של המסלולים האיטיים ביותר (לדוגמה 3 דקות).
הערה: ודא שלמחשב יש די שטח דיסק. - כדי להסיר רעשי רקע, הפחת מכל תמונה את הממוצע של כל התמונות שהוקלטו. כך, צור מטריצה שהתוצאה שלה היא סכום העוצמה של כל התמונות, עבור כל פיקסל, וחלק אותה במספר התמונות.
- מהתמונה המעובדת (Im), קבע את המודולוס של מעבר הצבע המספרי ונרמל אותו לפי
הערך המרבי שלו (מקסימום), כהגדרתו להלן.
- בינאריזציה של המטריצה B באמצעות סף עוצמה, ראה שלבים 6.7-6.8.
- עבור כל נקודת זמן, הקלט קואורדינטות חיידקים (x, y בפיקסל או במ"מ) וזמן רכישת תמונה לקובץ בן שלוש עמודות.
- לבסוף, להחיל סקריפט מעקב חלקיקים כדי לעבד את הנתונים מוקלטים ולחשב את המסלולים של החיידקים. לדוגמה, השתמשבפרוטוקול 19 שנקבע, ובקוד מעקב אחר חלקיקים של Matlab הזמין בחופשיות: (http://site.physics.georgetown.edu/matlab/).
הערך המרבי שלו (מקסימום), כהגדרתו להלן.
8. לימוד סינון חיידקי באמצעות פרופילי תצהיר
- כדי להשיג פרופילי תצהיר של GFP מתויג P. putida KT2440 תאים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנציה, להקליט תמונה מורכבת של הערוץ נקבובי כולו לפני, כלומר הרקע, ולאחר הזרקת מתלים חיידקיים דרך המכשיר microfluidic. השתמש בזמן חשיפה המאפשר רכישת אות פלואורסצנט חיידקי (למשל 100 ms), מבלי להלבין את האות.
- יצא תמונות וייבוא בפלטפורמת התוכנה הרצויה (ראה 6.1-6.2).
- הסר רקע מהתמונות שתועדו לאחר הזרקת חיידקים.
- שלב את אות הפלואורסצנס הכולל של חיידקים שמורים לאורך חלקים טרנסוורסלים של הערוץ הנקבובי.
- על מנת לחשב את פרופיל התצהיר, התווה את אות הפלורסצנטיות המשולב לעומת אורך ערוץ נקבובי.
9. לנתח תחבורה חיידקית באמצעות התקנים נוזליים PMMA וציתום זרימה
- חבר משאבה פריסלטית עם המפרצון באמצעות צינורות בקוטר פנימי של 50 ס"מ (1 מ"מ) והזרימה עם המתקן האוטומטי באמצעות אותו צינורות (50 ס"מ, ראה סעיף 4).
הערה: השתמש במשאבה כדי לחלק את אמצעי הטיפוח, ולהזריק תאים חיידקיים. השתמש במחברים עם נעילת Luer וכשסתומים משולשים כדי לעבור בין מתלים בינוניים וחיידקיים במהלך ההפצה הקבועה. - משאבת טיפוח בינונית במכשיר הנוזלי. שימו לב להגעתו של מדיום בצינורות העודפים הקבועים למתקן הרובוטי.
- התחל להזריק את המתלים החיידקיים דרך המכשיר הנוזלי PMMA בקצב זרימה של 0.2 מ"למינימום -1,
- כאשר חיידקים מגיעים למתקן הנוזלי תפעיל את המתקן האוטומטי.
- על מנת לבצע הזרקת דופק, להזריק מתלים חיידקיים עבור כמה כרכים נקבוביות (למשל 30), ולאחר מכן לעבור הזרקה למדיה טיפוח עד סוף הניסוי.
הערה: נפח הנקבוביות של המכשיר הנוזלי הוא כ 0.2 מ"ל, ולכן בקצב הזרימה prosed בכל דקה נפח נקבוביות אחד שלם מוחלף. - לאחר השלמת צלחת באר 96, לכסות את הצלחת כדי להפחית את האידוי ולאחסן אותו ב 4 מעלות צלזיוס.
- נתח שפע חיידקים באמצעות ציתום זרימה, בעקבות פרוטוקולים שנקבעו20.
הערה: לדוגמה, להוסיף 25 μL של כתם חומצה ירוקה-פלורסנט (טבלת חומרים) ב 0.025 mM (במים אולטרה-תכליתיים) לכל באר. זה מכתים DNA חיידקי, ובכך מאפשר לכמת על ידי ציתום זרימה השפע החיידקי. דגימות דגירה במשך 15 דקות בחושך ולאחר מכן לנתח באמצעות ציטומטר זרימה מצויד לייזר 488 ננומטר וגלאי ב 515 ננומטר. - לפני ניתוח BTC, לשקול את דילול של המדגם בשל תוספת של קיבעון וכתם. שפע חיידקי נכון על ידי גורם של 1.35 כדי להסביר את קיבעון וכתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להמחיש את הפונקציונליות של זרימת העבודה המוצגת, ביצענו ניסויים באמצעות פסאודומונס putida putida KT2440, חיידק מוטיב שלילי גרם חשוב עבור ביו-מדייה וביוטכנולוגיה. גרסאות מהונדסות גנטית של זן זה המבטאות את ייצור GFP זמינות מסחרית. זן שאינו מוטיב של P. putida KT2440 אשר חסר את הגנים המבניים והרגולטוריים הרלוונטיים עבור תנוענות זמין גם. באמצעות שניהם, מוטיב ולא מוטיב GFP מתויג P. putida KT2440, ביצענו ניסויים רצופים בהתקני מיקרופלואיד PDMS עם מערך אקראי של עמודים (איור 1B) ו BTCs מוקלט (איור 2A). BTCs כבר מנורמל לריכוז של תאים מוזרקים (C0). במקביל, מסלולים חיידקיים בסולם הנקבוביות היו חזותיים באמצעות עיבוד תמונה ומעקב אחר חלקיקים כמתואר לעיל(איור 2B).
לאחר מכן, ביצענו ניסויים עם מכשירים נוזליים בקנה מידה גדול טחינה מ PMMA(איור 1A). Motile ו- non-motile P. putida KT2440 (לא פלורסנט) הוזרקו לתוך מטריצה נקבובי במרווחים קבועים BTCs הושגו באמצעות מתקן נוזלי וספירת ציתומטריה זרימה כמתואר לעיל(איור 3A). למרבה התדהמה, בסביבה נקבובית נטולת biofilm, מוטיב ולא מוטיב P. putida KT2440 הראה התנהגות תחבורה שונה במידה ניכרת. במטריקס נקבובי התיישב במשך 48 שעות עם קהילה ביופילם זרם מורכב, הבדלים אלה BTC בין motile ו לא מוטיב P. putida KT2440 נעלם(איור 3B.)
איור 1: מכשירים נוזליים לחקר תחבורה מיקרוביאלית במדיה נקבובית (A)איור של מכשיר נוזלי טחנה מ PMMA. המטריצה הנקבובית טחנה לתוך שכבת הבסיס של ההתקן, המכסה סגור באמצעות ברגים. חתך רוחב מראה את סידור העמודים בתוך המכשיר הנוזלי. ההוספה מציגה מטריצה נקבובית עם רשת רווחים רגילה של עמודים ושדה זרימת המהירות המתאים. (ב)התקן PDMS מותקן על מגלשת זכוכית מיקרוסקופית. מוצגים הזרימה פנימה והחוצה, המחוברים למאגר הבינוני ולמשאבת המזרק, בהתאמה. תא התצפית לספירה מיקרוסקופית ממוקם כתא נפרד ללא מטריצה נקבובית על אותה מגלשת מיקרוסקופ. ההוספה מציגה מטריצה נקבובית עם מערך אקראי של עמודים (בקוטר ומרווח). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הובלה חיידקית בקנה מידה ערוץ ונקבוביות בהתקן נוזלי PDMS (A) BTCs של מוטיב ולא מוטיב P. putida KT2440 (GFP מתויג) שהושג עם מכשיר מיקרופלואיד PDMS וספירה מיקרוסקופית. (ב)מסלולים של תאים שאינם מוטיבים בסולם הנקבוביות. צבעים נבחרים כדי לשפר את ההבידול של מסלולים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3:הובלה חיידקים בקנה מידהערוץ נקבוביות בהתקן הנוזלי PMMA (A) BTCs של motile ו- non-motile P. putida KT2440 (לא מתויג) שהושג באמצעות התקן נוזלי PMMA וספירת זרימה-ציתומיה. (ב) המכשיר הנוזלי היה מושבה על ידי קהילת זרם טבעי במשך יומיים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור משלים 1: שרטוטים טכניים של ההתקן הנוזלי PMMA. ההתקן מורכב מיחידת בסיס המכילה את המטריצה הנקבובית ויחידת מכסה הכוללת את החורים עבור היכנס ושקע. המכשיר אטום באמצעות 12 ברגים וטבעת O. אנא לחץ כאן כדי להוריד דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מציעים שני אמצעים ללמוד את ההובלה של חיידקים באמצעות מערכות נקבוביות ברמת תא יחיד ואוכלוסייה. בעוד המחקר של תופעות תחבורה באמצעות מידול BTC סיפק תובנות יקרות ערך להתפשטות של פתוגנים או מזהמים בקנה מידה של המערכת האקולוגית, קשיים בקנה מידה מניסויי מעבדה לתנאי שדה עדיין קיימים. הכלים המתוארים כאן מאפשרים לחוקרים לפתור באופן ניסיוני את המאזניים המרחביים והזמניים כדי להבין טוב יותר את האסטרטגיות האקולוגיות של חיידקים הרלוונטיים להובלה בסביבות נקבוביות. ניסויים יכולים להשתמש או לשנות מערכות אלה כדי ללמוד תכונות מיקרוביאליות אחרות מאשר תנועבה, כגון chemotaxis או חישת quorum או לשנות את הגיאומטריה או מאפייני בית גידול אחרים של המטריצה נקבובית. יתר על כן, באמצעות מערכות אלה ניתן לחבור בקלות להתנהגות התחבורה החיידקית לפרופילי תצהיר, המספקים תובנות חשובות על דפוסי הקולוניזציה וקריטיים כדי להבין כיצד ביופילמים משנים שדות זרימה מקומיים. אנו צופים כי הבנה טובה יותר של אסטרטגיות מיקרוביאלית לפזר וליישב מדיה נקבובית תשפר את תחזיות המודל ובכך לתרום לניהול של התפשטות פתוגן או בלימת מזהם. שינויים נוספים של המערכת עשויים גם לתרום לפיתוח של מכשירי סינון חדשניים או כלי ביוטכנולוגיה שבהם תאים צריכים להיות מופרדים פיזית.
אנו ממליצים על התקנים מבוססי PMMA לניסויים גדולים וארוך טווח והתקנים מבוססי PDMS לניסויים קטנים וקצרים יותר או כאשר רזולוציה זמנית גבוהה היא קריטית. יש לזכור כי שני החומרים יש מאפיינים שונים. למשל PDMS הוא חדיר גז כמו חמצן, בעוד PMMA הוא גז הדוק. הבדל זה עשוי לשמש כדי ללמוד את צריכת הגז בתרחיש PMMA, בעוד PDMS עשוי להיות מתאים יותר לניסוי שבו מגבלות חמצן הקשורות הנשימה חיידקים אינם רצויים.
באופן כללי, הפרוטוקולים המתוארים כאן ניתנים לשחזור בקלות ונתונים המתקבלים באמצעות כלים אלה חושפים באופן עקבי הבדלים בהובלה של חיידקים מוטיבים ולא מוטיבים. מתקן נוזלי מעשה עצמי עשוי להיות מוחלף על ידי חלופה מסחרית זמינה. עם זאת, מסיבות של רב-תכליתיות ועלות-תועלת אנו ממליצים על זה המתואר כאן. צעדים קריטיים בפרוטוקול נוגעים בעיקר לטיפול במכשירים הנוזליים ובניסיון בעיבוד תמונה. איכות הנתונים המתקבלים באמצעות ניתוח תמונה תלויה באופן קריטי באיכות התמונה (שנקבעה בעיקר לפי זמן מיקוד וחשיפה) ובאסטרטגיית סף מתאימה. איכות הנתונים המתקבלת על ידי ספירה ציטומטרית זרימה באופן קריטי תלויה בתיקון יעיל והכתמה של התאים ומומחיות בפרשנות של תוצאות זרימה-cytometry.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מכירים את עזרתו של אנטואן וידמר עם ההתקנה של המתקן הרובוטי dispenser.py תסריט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA | Sigma | ||
| Elastomer Sylgard 184 | Dowsil | 101697 | |
| Flow cytometer NovoCyte | Acea | ||
| Glucose | Sigma | https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit | |
| LB broth | BD | ||
| Liquid dispenser, XY Plotter Robot Kit | makeblock | ||
| Microscope Axio Imager | Zeiss | ||
| Microscope AxioZoom v16 | Zeiss | ||
| Microscope slides, 75 mm × 25 mm | Corning | ||
| Minipuls 3 peristaltic pump | Gilson | ||
| Plasma bonder Corona SB | BlackHole Lab | ||
| Potassium phosphate | Sigma | ||
| Syringe pump New Era NE 4000 | New Era | ||
| Syto 13 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain | Molecular Probes, Invitrogen | ||
| Tygon tubing | Ismatec | ||
| WF31SA universal milling machine | Mikron |
References
- Stevik, K., Aa, K., Ausland, G., Fredrik Hanssen, J. Retention and removal of pathogenic bacteria in wastewater percolating through porous media: a review. Water Research. 38 (6), 1355-1367 (2004).
- Ribet, D., Cossart, P. How bacterial pathogens colonize their hosts and invade deeper tissues. Microbes and Infection. 17 (3), 173-183 (2015).
- Ginn, T. R., Wood, B. D., Nelson, K. E., Scheibe, T. D., Murphy, E. M., Clement, T. P. Processes in microbial transport in the natural subsurface. Advances in Water Resources. 25 (8), 1017-1042 (2002).
- Tufenkji, N. Modeling microbial transport in porous media: Traditional approaches and recent developments. Advances in Water Resources. 30 (6-7), 1455-1469 (2007).
- Foppen, J. W., Van, M. H., Schijven, J. Measuring and modelling straining of Escherichia coli in saturated porous media. Journal of contaminant hydrology. 93 (1-4), 236-254 (2007).
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (4), 251-263 (2016).
- Scheidweiler, D., Peter, H., Pramateftaki, P., Anna, P., de Battin, T. J. Unraveling the biophysical underpinnings to the success of multispecies biofilms in porous environments. The ISME Journal. 1, (2019).
- Carrel, M., et al. Biofilms in 3D porous media: Delineating the influence of the pore network geometry, flow and mass transfer on biofilm development. Water Research. 134, 280-291 (2018).
- Bhattacharjee, T., Datta, S. S. Bacterial hopping and trapping in porous media. Nature Communications. 10 (1), 2075 (2019).
- Scheidweiler, D., Miele, F., Peter, H., Battin, T. J., de Anna, P. Trait-specific dispersal of bacteria in heterogeneous porous environments: from pore to porous medium scale. Journal of The Royal Society Interface. 17 (164), 20200046 (2020).
- Morales, V. L., Parlange, J. Y., Steenhuis, T. S. Are preferential flow paths perpetuated by microbial activity in the soil matrix? A review. Journal of Hydrology. 393 (1), 29-36 (2010).
- Creppy, A., Clément, E., Douarche, C., D'Angelo, M. V., Auradou, H. Effect of motility on the transport of bacteria populations through a porous medium. Physical Review Fluids. 4 (1), 013102 (2019).
- Camesano, T. A., Logan, B. E. Influence of Fluid Velocity and Cell Concentration on the Transport of Motile and Nonmotile Bacteria in Porous Media. Environmental Science & Technology. 32 (11), 1699-1708 (1998).
- Lutterodt, G., Basnet, M., Foppen, J. W. A., Uhlenbrook, S. The effect of surface characteristics on the transport of multiple Escherichia coli isolates in large scale columns of quartz sand. Water Research. 43 (3), 595-604 (2009).
- Bozorg, A., Gates, I. D., Sen, A. Impact of biofilm on bacterial transport and deposition in porous media. Journal of Contaminant Hydrology. 183 (Supplement C), 109-120 (2015).
- Long, T., Ford, R. M. Enhanced Transverse Migration of Bacteria by Chemotaxis in a Porous T-Sensor. Environmental Science & Technology. 43 (5), 1546-1552 (2009).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 65-91 (2014).
- Xia, Y., Whitesides, G. M.
- Crocker, J. C., Grier, D. G. Methods of Digital Video Microscopy for Colloidal Studies. Journal of Colloid and Interface Science. 179 (1), 298-310 (1996).
- del Giorgio, P. A., Bird, D. F., Prairie, Y. T., Planas, D. Flow cytometric determination of bacterial abundance in lake plankton with the green nucleic acid stain SYTO 13. Limnology and Oceanography. 41 (4), 783-789 (1996).
