Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Neurobehavioral Effecten van milieuverontreinigende stoffen op zebravissenlarven bestuderen

Published: February 5, 2020 doi: 10.3791/60818
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 2,4, 2,4
1State Key Laboratory of Marine Geology, Tongji University, 2Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, 3Shanghai Collaborative Innovation Centre for WEEE Recycling, WEEE Research Center of 10 Shanghai Polytechnic University, 4Shanghai Institute of Pollution Control and Ecological Security

Summary

Een gedetailleerd experimenteel protocol wordt gepresenteerd in dit document voor de evaluatie van neurobehavioral toxiciteit van milieuverontreinigende stoffen met behulp van een zebravis larven model, met inbegrip van het blootstellingsproces en tests voor neurobehavioral indicatoren.

Abstract

De laatste jaren zijn steeds meer milieuverontreinigende stoffen neurotoxisch gebleken, vooral in de vroege ontwikkelingsstadia van organismen. Zebravislarven zijn een bijuitstek model voor de neurobehavioral studie van milieuverontreinigende stoffen. Hier wordt een gedetailleerd experimenteel protocol verstrekt voor de evaluatie van de neurotoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen met behulp van zebravissenlarven, waaronder het verzamelen van de embryo's, het blootstellingsproces, neurogedragsindicatoren, het testproces en data-analyse. Ook de cultuuromgeving, het blootstellingsproces en de experimentele omstandigheden worden besproken om het succes van de test te garanderen. Het protocol is gebruikt bij de ontwikkeling van psychopathische geneesmiddelen, onderzoek naar milieuneurotoxische verontreinigende stoffen, en kan worden geoptimaliseerd om overeenkomstige studies te maken of nuttig te zijn voor mechanistische studies. Het protocol toont een duidelijk operatieproces voor het bestuderen van neurogedragseffecten op zebravissenlarven en kan de effecten van verschillende neurotoxische stoffen of verontreinigende stoffen onthullen.

Introduction

In de afgelopen jaren zijn steeds meer milieuverontreinigende stoffen neurotoxisch gebleken1,2,3,4. De beoordeling van neurotoxiciteit in vivo na blootstelling aan milieuverontreinigende stoffen is echter niet zo eenvoudig als die van hormoonontregeling of ontwikkelingstoxiciteit. Bovendien heeft vroegtijdige blootstelling aan verontreinigende stoffen, met name bij milieurelevante doses, steeds meer aandacht getrokken in toxiciteitsstudies5,6,7,8.

Zebravissen wordt opgericht als een dier model geschikt voor neurotoxiciteit studies tijdens de vroege ontwikkeling na blootstelling aan milieuverontreinigende stoffen. Zebravissen zijn gewervelde dieren die zich na bevruchting sneller ontwikkelen dan andere soorten. De larven hoeven niet gevoed te worden omdat de voedingsstoffen in het chorion voldoende zijn om ze 7 dagen na bevruchting (dpf) te ondersteunen9. Larven komen uit de chorion op ~ 2 dpf en ontwikkelen gedrag zoals zwemmen en draaien dat kan worden waargenomen, bijgehouden, gekwantificeerd, en geanalyseerd automatisch met behulp van gedragsinstrumenten10,11,12,13 vanaf 3-4 dpf14,15,16,17,18. Daarnaast kunnen high-throughput tests ook worden gerealiseerd door gedragsinstrumenten. Zo zijn zebravissenlarven een uitstekend model voor de neurogedragsstudie van milieuverontreinigende stoffen19. Hier wordt een protocol aangeboden met behulp van hoge doorvoer monitoring om de neurogedragstoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen op zebravissen larven onder lichte stimuli te bestuderen.

Ons lab heeft de neurogedragstoxiciteit bestudeerd van 2,2',4,4'-tetrabromodiphenylether (BDE-47)20,21, 6'-Hydroxy/Methoxy-2,2',4'-tetrabromodiphenylether (6-OH/MeO-BDE-47)22, deca-broomdineerde diphenylether (BDE-209 lood, en commerciële gechloreerde paraffine23 volgens het gepresenteerde protocol. Veel laboratoria gebruiken ook het protocol om de neurogedragseffecten van andere verontreinigende stoffen op larven of volwassen vissen te bestuderen24,25,26,27. Dit neurogedragsprotocol werd gebruikt om mechanistische ondersteuning te bieden waaruit blijkt dat blootstelling met lage dosis aan bisfenol A en vervanging bisfenol S voortijdige hypothalamische neurogenese bij embryonale zebravissen27veroorzaakte. Daarnaast optimaliseerden sommige onderzoekers het protocol om overeenkomstige studies uit te voeren. Een recente studie elimineerde de toxiciteit van amyloïde bèta (Aβ) in een eenvoudig, high-throughput zebravis model met caseïne-gecoate gouden nanodeeltjes (βCas AuNPs). Het toonde aan dat βCas AuNPs in systemische circulatie over de bloed-hersenbarrière van zebravissen larven en sekwestreerde intracerebrale Aβ42, het uitlokken van toxiciteit in een niet-specifieke, chaperonne-achtige manier, die werd ondersteund door gedragspathologie28.

Bewegingsvrijheid, padhoek en sociale activiteit zijn drie neurogedragsindicatoren die worden gebruikt om de neurotoxiciteitseffecten van zebravissenlarven te bestuderen na blootstelling aan verontreinigende stoffen in het gepresenteerde protocol. Bewegingsbeweging wordt gemeten door de zwemafstand van larven en kan worden beschadigd na blootstelling aan verontreinigende stoffen. Padhoek en sociale activiteit zijn nauwer verwant aan de functie van de hersenen en het centrale zenuwstelsel29. De padhoek verwijst naar de hoek van het pad van de dierlijke beweging ten opzichte van de zwemrichting30. Acht hoekklassen van ~-180°-~+180° zijn in het systeem ingesteld. Om de vergelijking te vereenvoudigen, worden zes klassen in het eindresultaat gedefinieerd als routinewendingen (-10° ~0°, 0° ~+10°), gemiddelde bochten (-10° ~-90°, +10° ~+90°), en responsieve bochten (-180° ~-90°, +90° ~+180°) volgens onze eerdere studies21,22. Sociale activiteit van twee vissen is fundamenteel van groepsshoalinggedrag; hier wordt een afstand van < 0,5 cm tussen twee larven geldig gedefinieerd als sociaal contact.

Het hier gepresenteerde protocol toont een duidelijk proces aan voor het bestuderen van neurogedragseffecten op zebravissenlarven en biedt een manier om de neurotoxiciteitseffecten van verschillende stoffen of verontreinigende stoffen te onthullen. Het protocol zal ten goede komen aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het bestuderen van de neurotoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Het protocol is in overeenstemming met richtlijnen goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van Tongji University.

1. Embryocollectie zebravissen

  1. Zet twee paar gezonde volwassen Tubingen zebravissen in de paaibox op de avond voor de blootstelling, het houden van de geslachtsverhouding op 1:1.
  2. Verwijder de volwassen vis terug naar het systeem 30-60 min na daglicht de volgende ochtend.
  3. Verwijder de embryo's uit de paaidoos.
  4. Spoel de embryo's af met systeemwater.
  5. Breng de embryo's over in een glazen petrischaal (9 cm diameter) met voldoende systeemwater.
  6. Observeer de embryo's onder de microscoop en selecteer gezonde embryo's voor latere blootstelling.
    OPMERKING: Gezonde embryo's zijn meestal transparant met lichtgouden kleur onder de microscoop. De ongezonde embryo's zijn meestal bleek en samengeklonterd zoals waargenomen onder de microscoop.

2. Voorbereiding vóór blootstelling

  1. Bereid de oplossing van de Hanks volgens de richtlijnen van het zebravisboek31.
    LET OP: De oplossing van De Hanks omvat 0,137 M NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4en 4,2 mM NaHCO3.
  2. Verdun de oplossing van de Hanks tot 10% Hanks' oplossing met behulp van steriel water.
  3. Voeg 1 mL DMSO toe aan 999 mL van 10% Hanks' oplossing om een besturingsoplossing te maken van 10% Hanks' oplossing inclusief 0,1% DMSO.
    OPMERKING: De volgende stappen gebruiken BDE-47 als voorbeeld van een belichtingsoplossing.
  4. Los 5 mg van de nette BDE-47 op in 1 mL van 100% DMSO om een standaard belichtingsoplossing van 5 mg/mL te maken.
  5. Vortex de 5 mg/mL oplossing voor 1 min om de BDE-47 volledig op te lossen in de DMSO.
  6. Breng 10 μL van de 5 mg/mL oplossing over op een 12 mL bruine glazen fles.
  7. Voeg gesteriliseerd water toe aan een eindvolume van 10 mL om de concentratie bde-47 blootstellingsoplossing 5 mg/L en DMSO-verhouding op 0,1% te maken, vervolgens vortex gedurende 1 min.
  8. Breng respectievelijk 10 μL en 100 μL van de 5 mg/L-oplossing over in twee 100 mL volumetrische kolven.
  9. Voeg 10% Hanks' oplossing toe, inclusief 0,1% DMSO (voorbereid in stap 2,3) tot 100 mL om de uiteindelijke concentraties van de BDE-47 blootstellingsoplossingen 5 μg/L en 50 μg/L te maken, respectievelijk.
  10. Breng de oplossingen over in 100 mL bruine glazen flessen en bewaar ze op 4 °C.

3. Blootstelling van embryo's

  1. Breng ~50 embryo's over in elk van de drie glazen petrischalen (6 cm diameter) 3-5 uur na bevruchting (hpf).
  2. Gebruik een pipettip van 1 mL om het systeemwater rond de embryo's te deprijren.
  3. Gebruik een pipet om de besturing en twee BDE-47 belichtingsoplossingen (besturing, 5 μg/L, 50 μg/L) respectievelijk in de drie glazen petrischalen over te brengen.
  4. Schud de glazen petrischaaltjes een voor een voorzichtig om de embryo's in de bodem van de plaat te verspreiden.
  5. Doe de glazen petrischaaltjes in de lichte couveuse onder 28,5 °C.
  6. Vernieuw de helft van de belichtingsoplossingen om de 24 uur tot 5 dpf.
  7. Controleer de dode embryo's van elke groep op 1 dpf en 2 dpf en bereken het sterftecijfer.
  8. Controleer de geïncubeerde embryo's van elke groep op 2 dpf en 3 dpf en bereken de hatchability.
  9. Controleer de misvorming van de larven elke dag nadat ze uit de chorion komen en bereken de misvormingsgraad van elke groep.
    OPMERKING: De misvormingsindicatoren omvatten pericardiale cyste, spinale kromming, staartkromming, onder andere factoren32.

4. Voorbereiding op de gedragstest

  1. Bereid een 48 put microplate voor de bewegings- en padhoektest en drie 6 well microplates voor de sociale activiteitstest op de ochtend van 5 dpf.
  2. Breng 800 μL belichtingsoplossing over in elke put van de 48 put microplate.
    OPMERKING: Gebruik 16 putten voor elke groep (d.w.z. de besturingsoplossing, 5 μg/L en 50 μg/L-groep).
  3. Gebruik een 1 mL pipet tip om 200 μL belichtingsoplossing met één larve uit de glazen petrischaal over te brengen naar één put van de 48 put microplate.
  4. Breng 4 mL belichtingsoplossing over in elke put van de 6 put microplate.
    LET OP: Gebruik een 6 goed microplate voor elke groep.
  5. Gebruik een 1 mL pipettip om 200 μL blootstellingsoplossing met twee larven in elke put van de 6-bron microplaat over te brengen.
    LET OP: Elke groep heeft zes herhalende groepen.
  6. Zorg ervoor dat de temperatuur van de testruimte 28 °C 2 uur voor de test is.
    OPMERKING: Gedragstests worden meestal uitgevoerd in de middag.

5. Gedragstest

  1. Bewegings- en padhoektest
    1. Klik op het startpictogram op het computerbureau om de software te openen (zie Tabel met materialen)waarmee de bewakingsbehuizing met hoge doorvoer wordt gecontroleerd om het programma te starten.
    2. Kies de module"Tracking, Rotations, Path Angles" om de bedieningsinterface in te voeren.
    3. Breng de 48 goed microplate bereid in stap 4.3 naar het opnameplatform en trek de cover naar beneden.
    4. Klik op de knopBestand"Generate Protocol" op zijn beurt in de software om te beginnen met het genereren van een nieuw protocol.
    5. Invoer "48" in de positie "Locatietelling" en klik op de knop" OK".
    6. Klik op de knop "Parameters"Protocol Parameters"Time" op zijn beurt in de software. Stel de experimentduur in op 1 uur en 10 min en stel de integratieperiode in op 60 s33.
    7. Teken de gedetecteerde gebieden.
      1. Selecteer de elliptische vorm en teken de eerste cirkel rond de eerste linkerbovenhoek.
      2. Selecteer de cirkel, klik op de knop Kopiëren"Kopboventeken" Plakken " " Selecteer "" Selecteer" op zijn beurt, en gebruik de muis om de gekopieerde cirkel naar rechtsboven te slepen.
      3. Selecteer de cirkel, klik op de knopKopiëren "Ondermarkering" Plakken "" Selecteer" Op zijn beurt , en gebruik de muis om de gekopieerde cirkel naar rechtsonder te slepen.
      4. Klik op de knop "Build" "Clear marks" op zijn beurt.
        LET OP: Het systeem zal automatisch tekenen elke andere goed van de plaat. De nieuw gecreëerde gebieden moeten perfect passen bij elk goed tussen de werkelijke vis en de reflectie ervan aan de zijkant van de put.
    8. Klik op de knop "Schaaltekenen", teken een kalibratielijn op het scherm (een diagonaal pad of parallel aan de zijkant van de microplaat), voer de lengte in en stel de "Eenheid" in. Klik vervolgens op de knopToepassen op groep.
    9. Zet de dierlijke kleur op "Zwart" in de software.
    10. Stel de detectiedrempel in op 16-18 om de detectie van de dieren mogelijk te maken.
    11. Inactieve/kleine en kleine/grote snelheid inleveren bij respectievelijk 0,5 cm/s en 2,5 cm/s.
    12. Stel de padhoekklassen in. Input "-90, -30, -10, 0, 10, 30 en 90" om padhoekklassen te maken van -180°-+180°.
    13. Stel de lichtomstandigheden in
      1. Klik op de "Parameters"Light driving" " Gebruikt een van de3 triggering methoden onder" Enhancedstimuli" knop op zijn beurt om de lichtomstandigheden in te stellen.
      2. Kies de"Edge"knop en stel vervolgens een donkere periode van 10 min in, gevolgd door drie cycli van afwisselende 10 min lichte en donkere periodes.
    14. Sla het protocol op en zet het licht van de testruimte uit.
    15. Acclimatiseer de larven in het systeem gedurende 10 min en klik op de knop "Experiment" Uitvoeren "Ophun beurt, kies vervolgens de map waar de experimentbestanden worden opgeslagen en voer de resultaatnaam in.
    16. Klik op de knop'Achtergrond'Start' om de test te starten.
    17. Klik op de knop"Experiment"" Stoppen" om het experiment te stoppen wanneer de test eindigt.
      OPMERKING: Het systeem toont de geteste gegevens wanneer het systeem stopt. De gegevens omvatten de bijgehouden afstand bij drie snelheidsklassen en padhoeknummers op acht hoekklassen van elke minuut. Voor de bewegingstest in het gepresenteerde voorbeeld wordt de totale afstand in elke lichtperiode (10 min) berekend en wordt het verschil tussen de controlegroep en de vergeleken behandelingsgroepen berekend.
    18. Breng de 48 put microplate terug naar de lichte incubator voor andere experimenten.
  2. Sociale activiteitstest
    1. Klik op het launcher-pictogram op het computerbureau om de software te openen die de bewakingsbehuizing met hoge doorvoer regelt om het programma te starten.
    2. Kies de module"Sociale interacties" om de bedieningsinterface in te voeren.
    3. Breng de voorbereide 6 goed microplate (controlegroep) in stap 4.4 over op het opnameplatform en trek de cover naar beneden.
    4. Klik op de knopBestand"Generate Protocol" op zijn beurt in de software om te beginnen met het genereren van een nieuw protocol.
    5. Invoer "6" in de positie "Locatietelling" en klik op de knop" OK".
    6. Klik op de knop "Parameters"Protocol Parameters"Time" op zijn beurt in de software. Stel de experimentduur in op 1 uur en 10 minuten en stel de integratieperiode in op 60 s.
    7. Teken de gedetecteerde gebieden.
      1. Selecteer de elliptische vorm en teken de eerste cirkel rond de eerste linkerbovenhoek.
      2. Selecteer de cirkel, klik op de knop Kopiëren"Kopboventeken" Plakken " " Selecteer "" Selecteer" op zijn beurt, en gebruik de muis om de gekopieerde cirkel naar de rechterbovenhoek te slepen.
      3. Selecteer de cirkel, klik op de knopKopiëren "Ondermarkering" Plakken "" Selecteer" Op zijn beurt , en gebruik de muis om de gekopieerde cirkel naar rechtsonder te slepen.
      4. Klik op de knop "Build" "Clear marks" op zijn beurt.
        OPMERKING: De nieuw gecreëerde gebieden moeten elk perfect passen en tussen de werkelijke larven en de reflectie ervan aan de zijkant van de put.
    8. Klik op de knop "Schaaltekenen", teken een kalibratielijn in het scherm (een diagonaal pad of parallel aan de zijkant van de microplaat), voer de lengte in en stel de "Eenheid" in. Klik vervolgens op de knopToepassen op groep.
    9. Stel de detectiedrempel in op 16-18 om de detectie van de dieren mogelijk te maken.
    10. Klik op de knop "Zwart dier" in de software.
    11. Kies de knop"Afstandsdrempel" en invoer "5" in de software.
    12. Stel de lichtomstandigheden in.
      1. Klik op de "Parameters"Light driving" " Gebruikt een van de3 triggering methoden onder" Enhancedstimuli" knop op zijn beurt om de lichtomstandigheden in te stellen.
      2. Kies de"Edge"knop en stel vervolgens een donkere periode van 10 min in, gevolgd door drie cycli van afwisselende 10 min lichte en donkere periodes.
    13. Sla het protocol op en zet het licht van de kamer uit.
    14. Acclimatiseer de larven in het systeem gedurende 10 min en klik op de knop "Experiment" Uitvoeren "Ophun beurt, kies vervolgens de map waar de experimentbestanden worden opgeslagen en voer de resultaatnaam in.
    15. Klik op de knop'Achtergrond'Start' om de test te starten.
    16. Klik op de knop"Experiment"" Stop" om het experiment in de software te stoppen wanneer de test eindigt.
      OPMERKING: Het systeem toont de geteste gegevens wanneer het systeem stopt.
    17. Breng de 6 well microplate (controlegroep) terug naar de lichte incubator voor andere experimenten.
    18. Breng de 6 put microplates (5 μg/L en 50 μg/L-groepen) op hun beurt over naar het opnameplatform en herhaal de stappen van 5.2.4 naar 5.2.17 bij ordinal.

6. Gegevensanalyse

  1. Open het spreadsheetbestand in de resultaten van de bewegings- en padhoek.
  2. Selecteer de drie afstandskolommen(inadist, smldist, reuzel)en voeg ze op.
    OPMERKING: De gegevens van inadist, smldisten reuzel betekenen verschillende afstanden die door het systeem zijn geregistreerd in verschillende snelheidsklassen (respectievelijk inactief/klein/groot).
  3. Voor elke lichtperiode van 10 minuten somt u de afstand van elke put op, bereken de gemiddelde afstand van 16 putten en vergelijk u de gegevens van de drie groepen onder lichte stimuli.
  4. Voor elke lichtperiode van 10 minuten somt u het hoekaantal van elke put in elke lichtduur op, van cl01 tot cl08 op zijn beurt, en vergelijk de gegevens van de drie groepen onder lichte stimuli.
    OPMERKING: De gegevens van kolommen van cl01 tot cl08 betekenen verschillende padhoeknummers die door het systeem in verschillende padhoeken zijn geregistreerd, respectievelijk.
  5. Open het spreadsheetbestand in de resultaten van sociale activiteit.
  6. Selecteer de contct en contdur kolommen, en voor elke 10 min lichtperiode somt de sociale tijden en de duur ervan voor elke put.
  7. Bereken de gemiddelde sociale tijden en duur van één groep in elke lichtduur en vergelijk de gegevens van de drie groepen onder lichte stimuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier beschrijven we een protocol voor het bestuderen van de neurogedragseffecten van milieuverontreinigende stoffen met behulp van zebravissenlarven onder lichte stimuli. De bewegings-, padhoek- en sociale activiteitstests worden gedefinieerd in de inleiding. De opstelling van de microplaten in de bewegings- en padhoektests en de beelden van de software worden hieronder weergegeven. Daarnaast worden onze eigen onderzoeksresultaten gepresenteerd als voorbeelden. Twee studies presenteren de bewegings- en padhoekeffecten na blootstelling aan BDE-47 en 6-OH/MeO-BDE-47. De derde studie presenteert de effecten van vier commerciële gechloreerde paraffine op sociaal gedrag.

De opstelling van de 48 well microplate en de bewegingslocus van de larven in de bewegings- en padhoektest.
In het protocol werden drie groepen, waaronder één controlegroep en twee behandelingsgroepen, gebruikt. Omdat elke groep 16 dieren kan hebben, kan het systeem worden gebruikt om high-throughput tests van bewegings- en padhoek in één microplaat uit te voeren. Figuur 1 toont één larve die is behandeld met de besturingsoplossing, 5 μg/L-oplossing en 50 μg/L-oplossing in elke put van respectievelijk de eerste, middelste en laatste twee rijen.

Figuur 1 toont ook alle bewegingsloci van de larven in de bewegings- en padhoektests. Het systeem volgde de bewegingsvrijheid van de larven en berekende de zwemafstand bij verschillende snelheidsklassen. Het systeem berekende de padhoeknummers van larven bij verschillende padhoekklassen. Onderzoekers kunnen de gegevens die door het systeem worden geregistreerd op hun eigen manier analyseren.

Figure 1
Figuur 1: De opstelling van de 48 put microplate en de bewegingsloci van de larven in de bewegings- en padhoektest. A1-A8, B1-B8 = de controlegroep; C1-C8, D1-D8 = de groep 5 μg/L; E1-E8, F1-F8 = de groep 50 μg/L. De zwarte kleurtrackinglijn betekent inactiviteit of kleine bewegingen; de groene kleurtrackinglijn betekent normale bewegingen; en de rode kleur tracking lijn betekent grote bewegingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De 6 goed microplate in de sociale activiteit test.
Figuur 2 toont een 6 goed microplate in het testproces voor sociale activiteiten. Elke put had twee larven, en het systeem registreerde de afstand tussen de twee larven tijdens het hele testproces. Het systeem registreerde de aantallen sociale activiteit en de duur in de ingestelde testtijd (1 min in dit protocol).

Figure 2
Figuur 2: De 6 goed microplate in de sociale activiteit test. Elke put had twee larven. De gele lijn betekent dat de afstand tussen twee dieren < 0,5 cm is; de rode lijn betekent dat de afstand tussen twee dieren is > 0,5 cm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

BDE-47 blootstelling beïnvloed bewegingsvrijheid bij zebravissen larven op 5 dpf.
Zoals blijkt uit figuur 3,produceerde de hoogste concentratiegroep BDE-47 uitgesproken hypoactiviteit tijdens de donkere periode. Er waren echter geen waargenomen veranderingen als gevolg van blootstelling aan BDE-47 tijdens de lichtperioden.

Figure 3
Figuur 3: Effecten van blootstelling bde-47 op bewegingsbeweging van larve zebravissen bij 5 dpf. Bewegingsvrijheid (afstand verplaatst gemeten in cm) werd geregistreerd in afwisselende perioden van duisternis en licht voor een totale duur van 70 min. Vaste en open balken aan de onderkant geven respectievelijk donkere en lichte perioden aan. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (*p < 0,05 in vergelijking met de controlegroep). Dit cijfer is gewijzigd van Zhao et al.17 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

6-OH/MeO-BDE-47 blootstelling beïnvloed de padhoeken van zebravissen larven op 5 dpf.
Zoals blijkt uit figuur 4, voerde de hoge concentratiegroep van 6-OH-BDE-47 minder routinematige bochten en gemiddelde bochten uit op 5 dpf. Echter, meer responsieve bochten werden geïnduceerd door 6-MeO-BDE-47 blootstelling groepen.

Figure 4
Figuur 4: Effecten van 6-OH/MeO-BDE-47 op de padhoek van larve zebravissen tijdens de donkere periode. Gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM (*p < 0,05 in vergelijking met controle). Dit cijfer is gewijzigd van Zhang et al.18 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

CPs blootstelling beïnvloed sociale activiteit van zebravissen larven op 5 dpf.
Zoals blijkt uit figuur 5,werd het sociale gedrag van zebravissenlarven beïnvloed door drie CP-producten. De sociale activiteit werd gestimuleerd door CP-70 en de korte keten CP-52b. De lange keten CP-52a verkortte de duur per contact van de larven.

Figure 5
Figuur 5: Effecten van CPs op de gemiddelde sociale duur per contact in verschillende licht/donkere perioden. (A) CP-42, (B) CP-52a,( C) CP-52b, (D) CP-70. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM (*p < 0,05 in vergelijking met de controle). Dit cijfer is gewijzigd van Yang et al.19 met toestemming. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit werk biedt een gedetailleerd experimenteel protocol om de neurotoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen met behulp van zebravissenlarven te evalueren. Zebravissen gaan tijdens de blootstellingsperiode door het proces van embryo's tot larven, wat betekent dat goede verzorging van de embryo's en larven essentieel is. Alles wat de ontwikkeling van de embryo's en larven beïnvloedt, kan het eindresultaat beïnvloeden. Hier worden de cultuuromgeving, het blootstellingsproces en de experimentele omstandigheden besproken om het succes van de hele test te garanderen.

Voor de kweekomgeving leven zebravisembryo's en larven onder een stabiele temperatuur van ~28 °C. In dit werk wordt een lichte couveuse gebruikt die de lichtomstandigheden automatisch kan instellen en de temperatuur stabiel kan houden om de embryo's en larven te huisvesten. De embryo's komen niet uit het chorion bij 1 dpf en 2 dpf, dus er moet voor worden gezorgd dat de niet-uitgebroede embryo's niet worden beschadigd bij het vernieuwen van de blootstellingsoplossing. Ook moet de verhouding van DMSO in de oplossing lager zijn dan 0,1%34,35, en moet de nieuwe blootstellingsoplossing op 28 °C liggen voordat deze wordt gebruikt voor vernieuwing.

Het proces van het selecteren van embryo's voor blootstelling is ook een belangrijke factor voor het succes van het experiment. Het kiezen van gezonde embryo's die zich gelijktijdig ontwikkelen voor elke groep garandeert de nauwkeurigheid van toxiciteitsbeoordeling. Zebravissen kunnen leven zonder voedsel tijdens de eerste 7 dagen na de bevruchting, dus het is het beste om de embryo's of larven niet te voeden tijdens de gehele blootstellingsperiode, omdat voedsel het eindresultaat kan beïnvloeden. Ook is het het beste om de belichtingsoplossing fris voor te bereiden wanneer dat nodig is.

Tijdens de gedragstest is het essentieel om de larven voldoende tijd te bieden om zich aan te passen aan de omgeving van de high-throughput monitoring behuizing. Vóór de test moet elke stap van het geteste protocol zorgvuldig worden gecontroleerd, inclusief de lichtconditie, testtijd, enz. De testruimte moet volledig stil en donker worden gehouden om de dieren niet te storen.

Het gepresenteerde protocol biedt een fundamenteel kader om de neurogedragstoxiciteit van milieuverontreinigende stoffen te bestuderen. Er zijn ook andere soorten gedrag gebruikt bij het bestuderen van neurobehavioral effecten, zoals kleur-voorkeur tests36,bodem woning tests37,licht / donker voorkeur tests38,39, enz. Deze tests maken echter voornamelijk gebruik van volwassen zebravissen, die niet geschikt zijn voor tests met een hoge doorvoer. Bovendien, Weichert et al. gefilmd om het gedrag van spontane staart bewegingen die kunnen worden gekwantificeerd net na 24 uur blootstelling40. De evaluatie van neurobehavioral toxiciteit omvat ook mechanisme studies over de functie van de hersenen en het centrale zenuwstelsel. De fundamentele neurobehavioral indicatoren worden hier geïntroduceerd en kunnen de basis vormen voor complexere indicatoren met behulp van andere gedragsinstrumenten. Uiteindelijk kan de ontwikkeling van nieuwe neurogedragsindicatoren die gepaard gaan met dit studiemechanisme worden gebruikt in toekomstige studies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (21876135 en 21876136), het National Major Science and Technology Project of China (2017ZX07502003-03, 2018ZX07701001-22), de Stichting van MOE-Shanghai Key Laboratory of Children's Environmental Health (CEH201807-5) en Swedish Research Council (nr. 639-2013-6913).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
48-well-microplate Corning 3548 Embyros housing
6-well-microplate Corning 3471 Embyros housing
BDE-47 AccuStandard 5436-43-1 Pollutant
DMSO Sigma 67-68-5 Cosolvent
Microscope Olympus SZX 16 Observation instrument
Pipette Eppendorf 3120000267 Transfer solution
Zebrabox Viewpoint ZebraBox Behavior instrument
Zebrafish Shanghai FishBio Co., Ltd. Tubingen Zebrafish supplier
ZebraLab Viewpoint ZebraLab Behavior software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, L., et al. Developmental neurotoxicity of organophosphate flame retardants in early life stages of Japanese medaka (Oryzias latipes). Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (12), 2931-2940 (2016).
  2. Tian, L., et al. Neurotoxicity induced by zinc oxide nanoparticles: age-related differences and interaction. Scientific Reports. 5, 16117 (2015).
  3. Rauh, V. A., Margolis, A. E. Research review: environmental exposures, neurodevelopment, and child mental health-new paradigms for the study of brain and behavioral effects. Journal of Child Psychology and Psychiatry. 57 (7), 775-793 (2016).
  4. Ye, B. S., Leung, A. O. W., Wong, M. H. The association of environmental toxicants and autism spectrum disorders in children. Environmental Pollution. 227, 234-242 (2017).
  5. Schwarzenbach, R. P., Gschwend, P. M., Imboden, D. M. Environmental Organic Chemistry. , John Wiley & Sons. (2016).
  6. Akortia, E., et al. A review of sources, levels, and toxicity of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) and their transformation and transport in various environmental compartments. Environmental Reviews. 24 (3), 253-273 (2016).
  7. Shaw, B. J., Liddle, C. C., Windeatt, K. M., Handy, R. D. A critical evaluation of the fish early-life stage toxicity test for engineered nanomaterials: experimental modifications and recommendations. Archives of Toxicology. 90 (9), 2077-2107 (2016).
  8. Landrigan, P. J., et al. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1230-1233 (2005).
  9. Xu, T., Yin, D. The unlocking neurobehavioral effects of environmental endocrine disrupting chemicals. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 7, 9-13 (2019).
  10. Panula, P., et al. Modulatory neurotransmitter systems and behavior: towards zebrafish models of neurodegenerative diseases. Zebrafish. 3 (2), 235-247 (2006).
  11. Félix, L. M., Antunes, L. M., Coimbra, A. M., Valentim, A. M. Behavioral alterations of zebrafish larvae after early embryonic exposure to ketamine. Psychopharmacology. 234 (4), 549-558 (2017).
  12. Bailey, J. M., et al. Persistent behavioral effects following early life exposure to retinoic acid or valproic acid in zebrafish. Neurotoxicology. 52, 23-33 (2016).
  13. Richendrfer, H., Créton, R. Automated High-throughput Behavioral Analyses in Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (77), e50622 (2013).
  14. Best, J. D., Alderton, W. K. Zebrafish: An in vivo model for the study of neurological diseases. Neuropsychiatric Disease & Treatment. 4 (3), 567-576 (2008).
  15. Yuhei, N., et al. Zebrafish as a systems toxicology model for developmental neurotoxicity testing. Congenital Anomalies. 55 (1), 1-16 (2015).
  16. Wu, S., et al. TBBPA induces developmental toxicity, oxidative stress, and apoptosis in embryos and zebrafish larvae (Danio rerio). Environmental Toxicology. 31 (10), 1241-1249 (2016).
  17. Chakraborty, C., Sharma, A. R., Sharma, G., Lee, S. S. Zebrafish: A complete animal model to enumerate the nanoparticle toxicity. Journal of Nanobiotechnology. 14 (1), 65 (2016).
  18. Wehmas, L. C., et al. Comparative metal oxide nanoparticle toxicity using embryonic zebrafish. Toxicology Reports. 2, 702-715 (2015).
  19. Cavalieri, V., Spinelli, G. Environmental epigenetics in zebrafish. Epigenetics & Chromatin. 10 (1), 46 (2017).
  20. Zhang, B., et al. Effects of three different embryonic exposure modes of 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether on the path angle and social activity of zebrafish larvae. Chemosphere. 169, 542-549 (2017).
  21. Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Q. Locomotor activity changes on zebrafish larvae with different 2, 2?, 4, 4?-tetrabromodiphenyl ether (PBDE-47) embryonic exposure modes. Chemosphere. 94, 53-61 (2014).
  22. Zhang, B., et al. Neurobehavioral effects of two metabolites of BDE-47 (6-OH-BDE-47 and 6-MeO-BDE-47) on zebrafish larvae. Chemosphere. 200, 30-35 (2018).
  23. Yang, X., et al. The chlorine contents and chain lengths influence the neurobehavioral effects of commercial chlorinated paraffins on zebrafish larvae. Journal of Hazardous Materials. 377, 172-178 (2019).
  24. Schmitt, C., McManus, M., Kumar, N., Awoyemi, O., Crago, J. Comparative analyses of the neurobehavioral, molecular, and enzymatic effects of organophosphates on embryo-larval zebrafish (Danio rerio). Neurotoxicology and Teratology. 73, 67-75 (2019).
  25. Li, X., Kong, H., Ji, X., Gao, Y., Jin, M. Zebrafish behavioral phenomics applied for phenotyping aquatic neurotoxicity induced by lead contaminants of environmentally relevant level. Chemosphere. 224, 445-454 (2019).
  26. Leuthold, D., Klüver, N., Altenburger, R., Busch, W. Can environmentally relevant neuroactive chemicals specifically be detected with the locomotor response test in zebrafish embryos? Environmental Science & Technology. 53 (1), 482-493 (2018).
  27. Kinch, C. D., Ibhazehiebo, K., Jeong, J. H., Habibi, H. R., Kurrasch, D. M. Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (5), 1475-1480 (2015).
  28. Javed, I., et al. Inhibition of amyloid beta toxicity in zebrafish with a chaperone-gold nanoparticle dual strategy. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
  29. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  30. Tytell, E. D. The hydrodynamics of eel swimming II. Effect of swimming speed. Journal of Experimental Biology. 207 (19), 3265-3279 (2004).
  31. Westerfield, M. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). The Zebrafish Book. 4, (2000).
  32. Ying, L., Jiang, L., Bo, P., Yong, L. Teratogenic effects of embryonic exposure to pretilachlor on the larvae of zebrafish. Journal of Agro-Environment Science. 36 (3), 481-486 (2017).
  33. Macphail, R. C., et al. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
  34. Kais, B., et al. DMSO modifies the permeability of the zebrafish (Danio rerio) chorion-implications for the fish embryo test (FET). Aquatic Toxicology. 140, 229-238 (2013).
  35. Truong, L., Harper, S. L., Tanguay, R. L. Drug Safety Evaluation. , Springer. 271-279 (2011).
  36. Peeters, B. W., Moeskops, M., Veenvliet, A. R. Color preference in Danio rerio: effects of age and anxiolytic treatments. Zebrafish. 13 (4), 330-334 (2016).
  37. Barba-Escobedo, P. A., Gould, G. G. Visual social preferences of lone zebrafish in a novel environment: strain and anxiolytic effects. Genes, Brain and Behavior. 11 (3), 366-373 (2012).
  38. Blaser, R., Penalosa, Y. Stimuli affecting zebrafish (Danio rerio) behavior in the light/dark preference test. Physiology & Behavior. 104 (5), 831-837 (2011).
  39. Blaser, R. E., Rosemberg, D. B. Measures of anxiety in zebrafish (Danio rerio): dissociation of black/white preference and novel tank test. PloS One. 7 (5), e36931 (2012).
  40. Weichert, F. G., Floeter, C., Artmann, A. S. M., Kammann, U. Assessing the ecotoxicity of potentially neurotoxic substances-Evaluation of a behavioural parameter in the embryogenesis of Danio rerio. Chemosphere. 186, 43-50 (2017).

Tags

Milieuwetenschappen Kwestie 156 neurobehavioral effecten milieuverontreinigende stoffen zebravissenlarven neurotoxiciteit lichte stimuli gedragstest
Neurobehavioral Effecten van milieuverontreinigende stoffen op zebravissenlarven bestuderen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu,… More

Zhang, B., Yang, X., Zhao, J., Xu, T., Yin, D. Studying Neurobehavioral Effects of Environmental Pollutants on Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (156), e60818, doi:10.3791/60818 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter