Summary
نحن نقدم قياس RT-LAMP للكشف عن TiLV في أسماك البلطي باستخدام أدوات بسيطة على مدى فترة قصيرة نسبيًا من الزمن مقارنة بتقنيات RT-PCR التقليدية. وقد يساعد هذا البروتوكول في مكافحة انتشار وباء الـ TiLVD، ولا سيما في البلدان النامية.
Abstract
يمثل مرض فيروس بحيرة البلطي (TiLVD)، وهو مرض فيروسي ناشئ في البلطي بسبب فيروس بحيرة البلطي (TiLV)، تحدياً مستمراً في صناعة تربية الأحياء المائية أدى إلى الاعتلال والوفيات الجماعية للبلطي في أجزاء كثيرة من العالم. ولذلك فإن الفحص التشخيصي الفعال والسريع والدقيق لعدوى التيلفي ضروري للكشف عن العدوى الأولية ومنع انتشار المرض في تربية الأحياء المائية. في هذه الدراسة، يتم تقديم طريقة التضخيم اللابدي (RT-LAMP) الحساسة للغاية والعملية للنسخ العكسي (RT-LAMP) للكشف عن فيروس بحيرة البلطي في أنسجة الأسماك. وكشفت مقارنة بين العينات المصابة بـ RT-qPCR وRT-LAMP عن نتائج إيجابية في 63 (100%) و51 (80.95%) عينات، على التوالي. وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل للعينات غير المصابة أن جميع الأنسجة غير المصابة البالغ عددها 63 أنسجة أسفرت عن نتائج سلبية لكل من المقالات RT-qPCR و RT-LAMP. تم تقييم التفاعل المتبادل مع خمسة مسببات الأمراض في البلطي باستخدام RT-LAMP ، وأظهرت جميع الاختبارات نتائج سلبية. وأظهرت كل من عينات الكبد والمخاط التي تم الحصول عليها من الأسماك المصابة نتائج مماثلة باستخدام طريقة RT-LAMP، مما يشير إلى أنه يمكن استخدام المخاط في RT-LAMP كفحص غير قاتل لتجنب قتل الأسماك. وفي الختام، أظهرت النتائج أن فحص RT-LAMP المقدم يوفر طريقة فعالة للكشف عن TiLV في أنسجة البلطي في غضون ساعة واحدة. ولذلك يوصى بهذه الطريقة كأداة فحص في المزارع للتشخيص السريع لـ TiLV.
Introduction
مرض فيروس بحيرة البلطي (TiLVD) هو مرض فيروسي في البلطي(Oreochromis spp.) الذي يتسبب في وفيات البلطي في العديد من مناطق العالم، بما في ذلك آسيا1،,2،أفريقيا، وأمريكا. وقد تم التعرف على المرض لأول مرة خلال الوفيات الجماعية للبلطي في عام 2009 في إسرائيل، حيث انخفض عدد البلطي البري في بحيرة كنريت بشكل كبير من 257 إلى 8 أطنان في السنة2. ويتسبب هذا المرض من فيروس بحيرة البلطي (TiLV), التي تم تعيينها للأسرة Amnoonviridae كجنس جديد فيروس البلطي والأنواع الجديدة البلطي فيروس3. التوصيف الجيني لTiLV أظهرت أن الفيروس هو رواية مغلفة، المعنى السلبي، فيروس الحمض النووي الريبي واحد الذين تقطعت بهم السبل التي لديها 10 شرائح ترميز 10 البروتينات1،,2،,4. وقد ثبت أنواع مختلفة من البلطي في جنس Sarotherodon، Oreochromis، وTilapine وغيرها من أسماك المياه الدافئة (على سبيل المثال ، gourami العملاقة(Osphronemus goramy))لتكون عرضة لTiLV2،5. حاليا، يستمر هذا الفيروس في الانتشار عالميا، ربما من خلال حركة الأسماك الحية المصابة6،7، في حين أن خطر انتقال الفيروس عبر البلطي المجمد أو منتجه محدود8. وقد يكون للوفيات الكبيرة الناجمة عن عدوى التيلفيل أثر اقتصادي ضار إلى حد كبير على صناعة البلطي. على سبيل المثال، تم حساب الأثر الاقتصادي لمتلازمة الوفيات الصيفية في مصر المرتبطة بعدوى TiLV بمبلغ 100 مليون دولار أمريكي9. وبناء على ذلك، من المهم تطوير طريقة تشخيصية سريعة ومناسبة لتسهيل مكافحة هذا المرض في المزارع السمكية.
حتى الآن ، كان تشخيص TiLVD يستند إلى المقالات الجزيئية ، والعزلة الفيروسية ، وعلم الأمراض الهستي. وقد وضعت بروتوكولات PCR مختلفة والتمهيديات لتشخيص TiLV10,11. على سبيل المثال، تم تطوير والتحقق من صحة طريقة SYBR المستندة إلى النسخ العكسي الكمي PCR (RT-qPCR) مع حساسية للكشف عن نسختين/ميكرولتر من الفيروس والتحقق من صحتها للكشف عن TiLV10. وتشمل أساليب PCR الأخرى للكشف عن TiLV TaqMan الكمية PCR11،RT-PCR2،RT-PCR12متداخلة، وشبه متداخلة RT-PCR13. غير أن هذه الأساليب تتطلب معدات مختبرية متطورة وفترات زمنية ممتدة نسبياً لتحقيق نتائج بسبب تعقيد ردود الفعل، مما يجعلها غير مناسبة للتطبيق الميداني.
التضخيم isothermal حلقة بوساطة (مصباح) والقول هو سريع وبسيط وعملي لتطبيق الميدان14،15. هذه التقنية توظف مبدأ رد فعل الإزاحة حبلا، في حين أن رد فعل التضخيم يعمل تحت ظروف isothermal دون cycler الحرارية متطورة ومكلفة14،,15. وبالتالي، يتم تحليل منتجات مصباح تضخيم أو منتجات RT-LAMP في عصابات تشبه السلم باستخدام الجيل الكهربائي agarose مع بقعة الفلورسنت إما للتصور الآمن للحمض النووي أو الحمض النووي الريبي14 أو المراقبة بالعين المجردة لوجود التعكر أو عجلت بيضاء16،17،18. لهذه الأسباب، وقد استخدمت هذه التقنية للكشف في الموقع من مسببات الأمراض الأسماك المختلفة17،,18،,19،,20،,21،,22،23،,24،,25،,26،,27., كان الغرض من هذه الدراسة هو إنشاء تصريح سريع وحساس ودقيق لـ RT-LAMP للكشف عن TiLV. يوفر فحص RT-LAMP فحص ًا لـ TiLV في عينات الأسماك في غضون 30 دقيقة. ويمكن تطبيق هذه التقنية لتشخيص ومراقبة TiLVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة كاسيسارت، بانكوك، تايلند على هذه التجربة، التي شملت استخدام الأنسجة الحيوانية(
1. جمع الأنسجة
- القتل الرحيم سمك البلطي باستخدام جرعة زائدة من زيت القرنفل (أي أكثر من 3 مل / لتر). يمكن استخدام الميثانسولفونات التريكين كبديل لزيت القرنفل.
- استخدام مقص مايو المعقم والملقط لقطع فتح البطن من البلطي بعد الوفاة والمكوس ما يقرب من 30-50 ملغ من أنسجة الكبد، أو باستخدام المجهر غطاء الزجاج، وجمع 100 ميكرولتر من المخاط عن طريق كشط طبقة جلد السمك طولي (من الأمامي إلى الخلفي) إلى 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيقة.
- انتقل إلى خطوة استخراج الحمض النووي الريبي على الفور أو الاحتفاظ بالعينة التي تم جمعها عند -80 درجة مئوية حتى التجربة. كما الحمض النووي الريبي سليمة أكثر حساسية من الحمض النووي، واستخدام المواد الخالية من RNase والكواشف أثناء استخراج الحمض النووي الريبي.
2. استخراج الحمض النووي الريبي
- لاستخراج الحمض النووي الريبي من أنسجة الكبد، أضف 30-50 ملغ من أنسجة البلطي إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بـ 1.5 مل يحتوي على 600-1000 ميكرولتر من كاشف استخراج guanidinium-acid-phenol(جدول المواد)،وقلب العينة حتى التجانس باستخدام متجانس الأنسجة اليدوية. عينات الأنسجة تتطلب ما يقرب من 10٪ من كاشف استخراج guanidinium-acid-phenol. بالنسبة لعينات المخاط، استخدم 300 ميكرولتر فقط من كاشف استخراج guanidinium-acid-phenol (3:1).
تنبيه: كاشف استخراج guanidinium-acid-phenol سام. وبالتالي ، يجب التعامل مع بعناية. يجب ارتداء معدات الحماية، مثل نظارات السلامة وثوب المختبر وقفازات السلامة. - طرد مركزي العينة المتجانسة في 10،000 × ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة، ونقل supernatant إلى أنبوب جديد معقم 1.5 مل microالطرد المركزي.
- إضافة حجم يساوي 95٪ الإيثانول إلى الأنبوب وتخلط جيدا.
- نقل الحل إلى عمود تدور(جدول المواد)وضعت في أنبوب جمع والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة. تجاهل التدفق من خلال، ونقل العمود تدور إلى أنبوب مجموعة جديدة.
- أضف 400 ميكرولتر من كاشف الحمض النووي الريبي قبل الغسيل(جدول المواد)إلى العمود والطرد المركزي عند 10,000 × ز لمدة 30 ق في درجة حرارة الغرفة قبل التخلص من التدفق من خلال. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
ملاحظة: لإعداد الحمض النووي الريبي قبل غسل، إضافة 10 مل من الإيثانول 95٪ إلى 40 مل من تركيز الحمض النووي الريبي قبل غسل. - إضافة 700 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي غسل المخزن المؤقت(جدول المواد)إلى العمود والطرد المركزي في 10،000 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل العمود إلى أنبوب مُكفيم مُعقم على بعد 1.5 مل.
ملاحظة: لإعداد مخزن الغسيل الحمض النووي، إضافة 52 مل من الإيثانول 95٪ إلى 12 مل من تركيز المخزن المؤقت غسل الحمض النووي. - تم التقاط عينة الحمض النووي الريبي في مصفوفة العمود الدوراني مع 100 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكلين والطرد المركزي عند 10,000 × ز لمدة 30 s في درجة حرارة الغرفة.
- قياس تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مطياف microvolume وتمييع الحمض النووي الريبي إلى التركيز المطلوب باستخدام المياه الخالية من nuclease.
ملاحظة: تتراوح قيمة الامتصاص المؤهلة من OD260/OD280 من 1.6 إلى 1.9، مما يشير إلى نقاء الحمض النووي الريبي المقبول لأسابة RT-LAMP. - انتقل إلى الخطوة التالية على الفور، أو احتفظ بالعينة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3. تصميم التمهيدي
- استخدم الإصدار 4 من Primer Explorer لتصميم الالتمهيديات المحددة لـ RT-LAMP. انتقل إلى موقع الويب ، https://primerexplorer.jp/e/ ، وانقر على زر PrimerExplorer V4.
- حدد الملف الذي يحتوي على تسلسلات الجزء 3 من TiLV بتنسيق FASTA ثم انقر فوق زر تصميم التمهيدي.
ملاحظة: استرداد التسلسلات بتنسيق FASTA من رقم انضمام GenBank KX631923، والذي يمثل فيروس بحيرة البلطي TV1 الجزء 31. - لتصميم الالتمهيديات، قم بإدخال المعلمات الأساسية التالية:
- محتوى GC من 40٪-60٪
- أمبيريزون من أزواج قاعدة ≥ 280 (bp)
- درجة حرارة ذوبان مماثلة (Tm) بين الالتمهيديات مع فارق أقصى قدره 5 درجات مئوية
ملاحظة: يجب أن لا يكمل التمهيديون بعضهم البعض- تجنب مناطق التسلسل المعرضة لتشكيل الهياكل الثانوية.
- حدد تحليل التمهيدي الخافت بحد أدنى -3.5 للحصول على تصميم مثالي لأكبر مجموعة دولية، وحدد نهايات التصاميم بحد أقصى −4 للحصول على تصميم مثالي لـ ΟG الأصغر.
- انقر فوق الزر إنشاء.
ملاحظة: بعد انتهاء البرنامج من معالجة بيانات الإدخال، سيتم عرض نتائج التمهيدي(الشكل 1).
4. RT-LAMP القول
- إعداد مزيج رئيسي RT-LAMP يحتوي على 2.5 ميكرولتر من 1x SD II رد فعل المخزن المؤقت، 3 ميكرولتر من 6 mM MgSO4،1.4 ميكرولتر من مجموعة 1.4 mM dNTP، 4 ميكرولتر من 0.8 M بيتاين، 1.3 ميكرولتر من 0.052 mM خليط الكالسين، 1 ميكرولتر من 1.6 ميكرون تي في- F3 primer، 1 ميكرولتر من 1.6 ميكرون تيفيل-B3 التمهيدي، 1 ميكرولتر من 0.2 ميكرون تيف-BIP التمهيدي، 1 ميكرولتر من 0.2 ميكرون تيف-FIP التمهيدي، 1 ميكرولتر من 0.3 U Bst DNA polymerase، 1 ميكرولتر من 0.1 U AMV النسخ العكسي، و 3.8 ميكرولتر من المياه خالية من nuclease لكل رد فعل.
ملاحظة: قم بإعداد المزيج الرئيسي الزائد الذي يتكون من 10% على الأقل من إجمالي حجم التفاعل. - الاستغناء عن 22 ميكرولتر من مزيج RT-LAMP الرئيسي في أنبوب طارد مركزي 1.5 ميكروكفيمع.
- أضف 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستخرج إلى أنبوب التفاعل، واخلط يُخلط العينة بالدوامة. للتحكم السلبي، استخدم الماء المقطر بدلاً من مواد الحمض النووي الريبي.
- احتضان رد الفعل في 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، تليها 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإنهاء رد الفعل.
- بعد الحضانة، لاحظ بصريا التغيرات اللونية بالعين المجردة. ستظهر نتيجة إيجابية كلون أخضر فلوري.
5. أغاروز هلام electrophoresis
- إعداد 1.5٪ ث / ضد هلام agarose عن طريق تعليق 0.6 غرام من مسحوق agarose في 40 مل من 1x TAE المخزن المؤقت. تذوب الخليط عن طريق تسخينه في الميكروويف لمدة 3-5 دقيقة حتى يذوب agarose تماما، ودوامة لخلط.
- السماح للagarose لتهدئة حتى تصل درجة الحرارة إلى 65 درجة مئوية. صب 40 مل من محلول agarose على صينية هلام وإضافة مشط إلى قالب هلام.
- اسمح لجل الاغاروز بالضبط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة حتى يتم تقويه تمامًا. ثم إزالة المشط ووضع هلام في خزان هلام.
- إضافة المخزن المؤقت قيد التشغيل لتغطية سطح هلام في خزان هلام.
- أضف 10 ميكرولتر من عينة RT-LAMP و2 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحميل 6x هلام لكل بئر. أضف 5 ميكرولتر من سلم الحمض النووي 1 كيلوبايت إلى الممر المرجعي.
- قم بتوصيل الغطاء المرفق بالكاثود والأنود المتصل بمصدر الطاقة. بدوره على إمدادات الطاقة، وتعيينها إلى ثابت 100 V، وتشغيل لمدة 40 دقيقة.
- بعد الانتهاء من فصل هلام، وإزالة هلام من علبة هلام. ثم وصمة عار هلام استنزفت باستخدام بروميد الإيثيدييوم (EtBr) بتركيز 10 ملغ / مل لمدة 7 دقيقة وrestain ذلك في الماء المقطر لمدة 5 دقيقة.
تنبيه: EtBr سامة وتعتبر مادة مسرطنة. لذلك، كن حذراً عند استخدام هذا العامل. - اعرض الجل على ضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام نظام توثيق هلامي حيث تظهر النطاقات، وخذ صورة للجل.
6- توليف الحمض النووي التكميلي (cDNA)
- إعداد مزيج رئيسي توليف cDNA تحتوي على 2 ميكرولتر من المخزن المؤقت RT 5x، 0.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي، 0.5 ميكرولتر من إنزيم RT، و 2 ميكرولتر من المياه الخالية من nuclease لكل رد فعل.
ملاحظة: إعداد المزيج الرئيسي الزائد الذي يتكون من 1x رد الفعل بسبب الخسارة المحتملة أثناء الأنابيب. - الاستغناء عن 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي في أنبوب ميكروالطرد المركزي 1.5 مل معقم.
- إضافة 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي المخفف المستخرج (التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.8) إلى أنبوب رد الفعل، ومزيج وتدور إلى أسفل لنقل جميع الخليط إلى الجزء السفلي من السفينة.
- احتضان ردود الفعل في 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة، تليها 98 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة في جهاز PCR. تخزين cDNA في −20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
7. RT-qPCR
- قم بإعداد مزيج رئيسي من TiLV qPCR يحتوي على 0.3 ميكرولتر من التمهيدي العكسي 10 ميكرومتر، و0.3 ميكرولتر من التمهيدي الأمامي 10 ميكرومتر، و5 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي الأخضر SYBR 2x، و 0.4 ميكرولتر من المياه الخالية من النوكليس لكل رد فعل. استخدم الأدوات التمهيدية وعناصر التحكم التالية:
التمهيدي الأمامي (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGAGAGAATATG-3'
التمهيدي العكسي (TiLV-112R): 5'-CGTGCACTCGTTTCAGTATAAGTTCT-3' - الاستغناء عن 6 ميكرولتر من مزيج QPCR الرئيسي TiLV في كل بئر من شريط qPCR متوافق مع cycler الحرارية في الوقت الحقيقي المستخدمة.
- إضافة 4 μL من قالب cDNA، والتحكم السلبي (المياه خالية من nuclease)، والتحكم الإيجابي (10 pg/μL)، وpTiLV (plasmid)10 أو خففت بشكل متسلسل TiLV plasmid إلى البئر، وخلط كل عينة عن طريق النقر. إجراء كل عينة في ثلاثة توائم.
- ضع تفاعلات qPCR في الدورالحراري الحراري المبرمج في الوقت الحقيقي. قم بتعيين برنامج qPCR لتنفيذ الحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 s و 60 درجة مئوية لمدة 30 ق قبل خطوة منحنى الذوبان التي تحتاج إلى زيادة درجة الحرارة من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية عند زيادات 0.5 درجة مئوية / 5.
- إجراء تحليل البيانات عن طريق تقييم منحنيات التضخيم والذوبان، ثم حساب عدد نسخ TiLV باستخدام المنحنى القياسي الذي تم الحصول عليه من البيانات باستخدام البلازميدات المخففة بشكل متسلسل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In this study, an RT-LAMP assay was developed to detect TiLV infection in tilapia. تم جمع العينات المختبرة من 14 مزرعة تقع في أجزاء مختلفة من تايلاند بين عامي 2015 و 2016. تم تجميع الأسماك المصابة وغير المصابة في المقام الأول على أساس التشخيص البدني وظهور أعراض TiLVD. وقد تأكدت عدوى TiLV في وقت لاحق باستخدام RT-PCR بعد عملية الجمع. تم اختيار الجيل الكهربي Agarose والكشف عن اللون الأخضر الإنارة كطرق التقييم من amplicons مصباح(الشكل 2). يتميز الكبد والمخاط من الأسماك البلطي المصابة وغير المصابة من خلال المظهر السريري لأعراض مرض تيفيل، بما في ذلك تآكل الجلد، واحمرار الجلد، وexophthalmos، وتورم البطن. وقد أظهرت التقارير السابقة استخدام عينات الكبد في المقالات التشخيصية الجزيئية لتحديد وجود TiLV35. بدلا من ذلك، قد يكون المخاط مفيدة في القول لأنه قد يساعد على تجنب قتل الحيوانات. وأظهرت النتائج نمط نطاق الحمض النووي مثل السلم ولون أخضر الفلورسنت في الكبد المصاب وعينات المخاط من الأسماك المصابة(الشكل 2),في حين لم يلاحظ أي نطاق الحمض النووي واللون الأصفر من الكالسين في خلائط RT-LAMP في أنسجة الحيوانات غير المصابة(الشكل 2). ومن المثير للاهتمام أن عينة البلطي المصابة بـ TiLV التي تم جمعها من مزرعة في ماليزيا تم تشخيصها أيضًا على أنها إيجابية باستخدام هذا المنزع RT-LAMP. ومع ذلك ، لوحظ اختلافات في حجم منتج PCR مقارنة بالعينات التي تم جمعها من المزارع التايلاندية المحلية(الشكل 2).
للتحقق من حساسية وخصوصية فحص RT-LAMP، تم تحليل ما مجموعه 63 أنسجة مصابة بـ TiLV و 63 أنسجة غير مصابة باستخدام كل من مجدولي RT-LAMP و RT-qPCR(الجدول 1). وكشفت مقارنة بين العينات المصابة بـ RT-qPCR وRT-LAMP عن نتيجة إيجابية في 63 (100%) و51 (80.95%) من العينات، على التوالي. وعلاوة على ذلك، أظهر تحليل للعينات غير المصابة أن جميع الأنسجة غير المصابة البالغ عددها 63 أنسجة أسفرت عن نتائج سلبية باستخدام كل من المقالات RT-qPCR و RT-LAMP(الجدول 1). أظهر هذا التحليل موثوقية من الـ RT-LAMP للكشف الأولي عن TiLV. لاختبار خصوصية فحص RT-LAMP، استخدمت الأنسجة من الأسماك المصابة بالبكتيريا والفيروسات المسببة للأمراض الأخرى، بما في ذلك العقدية المكورات العنقودية agalactiae، فرانسيسيلا noatunensis، فلافواتيرات الأعمدة، Aeromonas hydrophila، وIridovirus كقوالب لتحاليل RT-LAMP و RT-qPCR. وأسفرت كل من أجهزة الطباعة والمواد التمهيدية RT-LAMP و RT-qPCR عن نتائج سلبية مع عدم وجود تغييرات في قياس الألوان وعدم وجود إشارات فلورية في أي من العينات المختبرة(الجدول 2). بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم حساسية من الارتاق مصباح باستخدام تسلسل 10 أضعاف تخفيف قوالب الحمض النووي الريبي المستخرجة من الأسماك التي مصابة بـ TiLV. نسبيا، كان القول RT-qPCR أكثر حساسية من القول RT-LAMP كما كان للاحساس RT-qPCR حد الكشف من10-8 في حين أن طريقة RT-LAMP تتطلب تخفيف10-7أضعاف للكشف عن الجينوم TiLV(الجدول 2).
الشكل 1 - ما إذا كانت هناك نسبة تسلسل النيوكليوتيدات من ستة التمهيديات RT-LAMP المستخدمة في هذه الدراسة التي كانت محددة للكشف عن TiLV. تم محاذاة موقف كل التمهيدي على الجزء 3 من جينوم TiLV (رقم الانضمام KX631923). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 - ما إذا كانت هناك نسبة تحليل الأمبلات RT-LAMP التي تم الحصول عليها من العينات المصابة بـ TiLV وغير المصابة (A) في 1.5٪ من هلام الأغروز electrophoresis و (B) عن طريق التصور الفلوري. ( M = 1 كيلوبايت سلم الحمض النووي، 1-2 = الحمض النووي الريبي من كبد الأسماك المصابة بـ TiLV، 3-4 = cDNA من الأسماك المصابة بـ TiLV، 5-6 = الحمض النووي الريبي من مخاط الأسماك المصابة بـ TiLV، 7-8 = خطوط الخلايا من الأسماك المصابة بـ TiLV، 9 = الحمض النووي الريبي من أكباد الأسماك المصابة بـ TiLV (ماليزيا)، 10 = الحمض النووي الريبي من كبد الأسماك غير المصابة بـ TiLV، 11 = cDNA من الأسماك غير المصابة بـ TiLV، 12 = RNA من مخاط الأسماك غير المصابة بـ TiLV، 13 = لا يوجد تحكم في القالب يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| أنواع العينات | عدد العينات | صحة الكشف (٪ ) | |
| RT-qPCR | RT-مصباح | ||
| عينات مصابة | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| عينات غير مصابة | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
الجدول 1 - ما إذا كانت هناك التحقق من RT-LAMP للكشف عن TiLV في عينات الأسماك المصابة وغير المصابة باستخدام RT-qPCR و RT-LAMP
| خصوصيه | س. أ. | ف. ن. | نادي. | ه. | I.v. | |||||
| QPCR | مصباح | QPCR | مصباح | QPCR | مصباح | QPCR | مصباح | QPCR | مصباح | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| حساسيه | طريقة / | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| التخفيف | ||||||||||
| QPCR | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| مصباح | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
الجدول 2 - ما إذا كانت هناك خصوصية وحساسية قياس RT-LAMP مقارنة بـ RT-qPCR. لتقييم التحديد، تم الحصول على الحمض النووي الريبي من أنسجة الأسماك المصابة ببكتيريا أو فيروسات أخرى، بما في ذلك بكتيريا المكورات العقدية agalactiae (S.a.)، ويفرانسيسلا noatunensis (F.n.)، فلافوباكتريا عمودي (F.c.)، Aeromonas hydrophila (A.h.)، وIdovirus (I.v.)، واستخدمت كقوالب لRT-qPCR وRT-LAMP. لتقييم الحساسية، كان الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه من الأسماك المصابة بـ TiLV مخففًا بشكل متسلسل 10 أضعاف من 100 نانوغرام إلى 1 fg ويستخدم كقوالب لـ RT-qPCR و RT-LAMP. + و - علامات يعني نتائج إيجابية وسلبية، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تتعرض صناعة الاستزراع المائي باستمرار للتهديد من قبل العدوى الفيروسية التي تسبب خسائر اقتصادية كبيرة9,23,28. على سبيل المثال ، يمثل TiLV الناشئ تهديدًا كبيرًا للبلدان المنتجة للبلطي في أجزاء كثيرة من العالم1،6،9. حتى الآن، لم تكن هناك علاجات محددة متاحة لمنع TiLVD. وفي حين أن تطوير اللقاح مستمر، فإن اللقاح الفعال سيتطلب وقتاً كبيراً قبل أن يكون متاحاً للأغراض التجارية. وبالنظر إلى هذه الظروف، فإن قياسات الأمن البيولوجي الصارمة، مثل تطبيق المطهرات، ضرورية في المزارع السمكية لمنع انتشار TiLVD29،30. حاليا، واحدة من أكثر تدابير الرقابة كفاءة للحد من انتقال TiLV هو فحص الأسماك والأحداث والكبار لوجود أو عدم وجود TiLV31. ولأغراض الفحص، يجب أن تكون أداة التشخيص سريعة وحساسة ومحددة حتى تتمكن من المساعدة في القضاء على السكان المصابين ومنع المزيد من انتشار الأمراض. ومع ذلك، يصعب تنفيذ المقالات الجزيئية الحالية لـ TiLV في الموقع. في المقام الأول ، فإنها تتطلب باحثين ماهرين ومعدات باهظة الثمن. ثانياً، قد يستغرق الحصول على النتائج المختبرية عدة أيام، مما يجعل من الصعب السيطرة على المرض ومنعه من انتشارالمرض فوراً15،16.
وللتغلب على هذه المشاكل، أنشأ نوتومي وآخرون14 نسخة جديدة من التضخيم الحمضي النووي تسمى تضخيم التضخيم اللااسمي بوساطة حلقة (LAMP) في عام 2000. ومنذ ذلك الحين تم تطبيق رد فعل المصباح بنجاح للكشف عن فيروسات الأسماك المختلفة16،17،18،19،20،21،22،23، 24،25،,26،32،33،2534. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير بروتوكول RT-LAMP للكشف عن TiLV في عينات أسماك البلطي. على الرغم من أن حساسية طريقة RT-LAMP أقل كفاءة بعشر مرات من حساسية RT-qPCR ، يمكن أن يكتشف فحص RT-LAMP وجود جينوم من نوع TiLV RNA منخفض يصل إلى 100 fg ، وهو ما يكفي للكشف عن TiLV في الأسماك المريضة سريريًا34. وتجدر الإشارة إلى أن فحص RT-LAMP ينتج نتيجة في غضون 60 دقيقة ويتطلب فقط حمام مائي بسيط أو أدوات كتلة حرارية34، في حين أن فحص RT-qPCR يستغرق المزيد من الوقت ويتطلب معدات PCR أكثر تكلفة في الوقت الحقيقي للتحليل15،34. وعلاوة على ذلك، لوحظ المنتج النهائي للمصباح RT من خلال تغيير في لون صبغة الفلورسنت من الضوء الأصفر إلى الأخضر الفلورسنت، مما يجعلها مرئية للعين المجردة دون أي شرط للمعدات المتطورة34. هذه المزايا تجعل RT-LAMP مناسبة للتشخيص الميداني. وعلاوة على ذلك، أشارت نتائج الدراسة إلى أنه يمكن استخدام كل من الكبد والمخاط للكشف عن TiLV باستخدام RT-LAMP. على غرار الدراسات السابقة، سمحت عينة غير قاتلة باستخدام المخاط بتشخيص TiLV دون قتل الأسماك أو الحضن ة قيمة35. في الآونة الأخيرة، تم تطوير جهاز تحديد RT-LAMP للكشف عن العزلات الصينية والتايلاندية لتسلسلات النيوكليوتيدات TiLV في الجزء 1 (منطقة S1) باستخدام مجموعة من ستة أجهزةتمهيدية 36. أظهرت هذه الدراسة أن قياس RT-LAMP المطور شخص إشارة سلبية كاذبة من عدوى TiLV بنسبة 27.78٪ مقارنة بـ RT-PCR عند استخدام نفس مجموعة التمهيدي. وعلى مزيد من المقارنة، كانت النتيجة السلبية الزائفة أقل نسبياً عند 19.05% عند الكشف عن الجزء 3 من TiLV مقارنة بـ RT-PCR. عند مقارنة كفاءة طريقة الكشف الفيروسي مع تقارير أخرى ، تمكنا من اكتشاف عدوى TiLV بنسبة 80.95 ٪ ، في حين كشفت أعمال أخرى عن الفيروس بنسبة 72.22٪36 و 82.89٪37. بالإجمال، قد يكون الافتراض أن المكونات المختلفة لـ RT-LAMP، على سبيل المثال، مجموعات التمهيدي المختلفة والأجزاء المستهدفة المختلفة من جينوم TiLV هي عوامل مهمة تؤثر على صحة الفرضية.
على الرغم من أن فحص RT-LAMP هو أداة قوية لفحص الأمراض وله العديد من الفوائد الواضحة ، لم تكن هذه الدراسة دون قيود. واحدة من النقاط الحرجة للحصول على الضبط RT-LAMP كان تصميم مجموعة التمهيدي المناسب تتألف من أربعة إلى ستة التمهيديات. لتعزيز تشكيل هياكل حلقة الجذعية من منتجات PCR، وأطوال مناسبة من الجينات المستهدفة أو تسلسل النيوكليوتيدات يجب أن تكون أطول من حوالي 500 bp، في حين أن الجينات المستهدفة من اساي RT-PCR يجب أن تكون قصيرة نسبيا، في حدود 50-150 bp14،38،39.
في الختام ، فإن القول المتقدم لـ RT-LAMP سريع وفعال من حيث التكلفة وحساس ومحدد للكشف عن TiLV. يمكن الانتهاء من التحليل في غضون ساعة واحدة مقارنة مع 4-5 ساعة للفحص RT-qPCR. وتجدر الإشارة إلى أن فحص RT-LAMP عملي للظروف الميدانية حيث يمكن ملاحظة نتائج إيجابية بالعين المجردة دون الحاجة إلى استخدام معدات متطورة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
يتم تمويل المشروع ماليا من قبل صندوق البحوث التايلاندية (TRF) رقم منحة RDG6050078 ومركز الدراسات المتقدمة للزراعة والأغذية، معهد الدراسات المتقدمة، جامعة كاسيسارت، بانكوك، تايلاند في إطار مشروع تعزيز بحوث التعليم العالي وجامعة البحوث الوطنية في تايلاند، مكتب لجنة التعليم العالي، وزارة التعليم، تايلاند. يتم دعم البحث جزئيًا من خلال منحة برنامج الدراسات العليا من كلية الدراسات العليا، جامعة كاسيسارت. ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتور كوانراوي سيريكانشانا على السرد الذي تحدث عن الفيديو وبياوسارا سيكارين لتحرير الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
