Summary
Nous présentons un essai RT-LAMP pour la détection de TiLV chez le poisson tilapia à l’aide d’instruments simples sur une période de temps relativement courte par rapport aux techniques RT-PCR conventionnelles. Ce protocole peut aider à contrôler la propagation épidémique de TiLVD, en particulier dans les pays en développement.
Abstract
La maladie du virus du lac de Tilapia (TiLVD), une maladie virale émergente du tilapia causée par le virus du lac tilapia (TiLV), est un défi persistant dans l’industrie aquacole qui a entraîné la morbidité et la mortalité massives du tilapia dans de nombreuses régions du monde. Un essai diagnostique efficace, rapide et précis pour l’infection de TiLV est donc nécessaire pour détecter l’infection initiale et pour empêcher la propagation de la maladie dans l’agriculture aquacole. Dans cette étude, une méthode très sensible et pratique d’amplification isothermale (RT-LAMP) de transcription inverse très sensible et pratique est présentée pour détecter le virus du lac de tilapia dans les tissus du poisson. Une comparaison des essais RT-qPCR et RT-LAMP d’échantillons infectés a révélé des résultats positifs dans 63 (100%) et 51 (80,95%) échantillons, respectivement. En outre, une analyse des échantillons non infectés a montré que les 63 tissus non infectés ont donné des résultats négatifs pour les essais RT-qPCR et RT-LAMP. La réactivité croisée avec cinq agents pathogènes dans le tilapia a été évaluée à l’aide de RT-LAMP, et tous les tests ont montré des résultats négatifs. Les échantillons de foie et de mucus obtenus à partir de poissons infectés ont montré des résultats comparables en utilisant la méthode RT-LAMP, suggérant que le mucus peut être utilisé dans RT-LAMP comme un essai non létal pour éviter de tuer des poissons. En conclusion, les résultats ont démontré que l’essai RT-LAMP présenté fournit une méthode efficace pour la détection de TiLV dans le tissu de tilapia dans un rayon de 1 h. La méthode est donc recommandée comme outil de dépistage sur les fermes pour le diagnostic rapide de TiLV.
Introduction
La maladie par le virus du lac de Tilapia (TiLVD) est une maladie virale dans le tilapia(Oreochromis spp.) qui causerait des décès de tilapia dans de nombreuses régions du monde, y compris l’Asie1,2, l’Afrique et l’Amérique. La maladie a été identifiée pour la première fois lors de la mortalité massive du tilapia en 2009 en Israel, où le nombre de tilapia sauvage dans le lac Kinneret a chuté de façon spectaculaire, passant de 257 à 8 tonnes par an2. La maladie est causée par le virus du lac de tilapia (TiLV), qui a été attribué à la famille Amnoonviridae comme un nouveau genre Tilapinevirus et une nouvelle espèce Tilapia tilapinevirus3. La caractérisation génétique de TiLV a montré que le virus est un nouveau, négatif-sens, virus de l’ARN à brin unique qui a 10 segments codant 10 protéines1,2,4. Diverses espèces de tilapia dans le genre Sarotherodon, Oreochromis, et Tilapine et d’autres poissons d’eau chaude (par exemple, gourami géant (Osphronemus goramy))ont été montrés pour être sensibles à TiLV2,5. Actuellement, ce virus continue de se propager à l’échelle mondiale, peut-être par le mouvement de poissons vivants infectés6,7, tandis que le risque de transmission virale via le tilapia congelé ou son produit est limité8. La mortalité importante due à l’infection tiLV a le potentiel d’avoir un impact économique considérablement préjudiciable sur l’industrie du tilapia. Par exemple, l’impact économique du syndrome de mortalité estivale en Égypte associé à l’infection par tiLV a été estimé à 100 millions de dollarsEU 9. Par conséquent, il est important de mettre au point une méthode diagnostique rapide et appropriée pour faciliter le contrôle de cette maladie dans les exploitations piscicoles.
Jusqu’à présent, le diagnostic de TiLVD a été basé sur les essais moléculaires, l’isolement viral, et l’histopathologie. Différents protocoles PCR et amorces ont été développés pour le diagnostic TiLV10,11. Par exemple, une méthode quantitative PCR (RT-QPCR) basée sur le vert SYBR avec la sensibilité de détecter aussi peu que deux copies/L du virus a été développée et validée pour la détection TiLV10. D’autres méthodes PCR pour la détection TiLV comprennent TaqMan quantitative PCR11, RT-PCR2, imbriqué RT-PCR12, et semi-niché RT-PCR13. Cependant, ces méthodes nécessitent un équipement de laboratoire sophistiqué et des périodes de temps relativement prolongées pour donner des résultats en raison de la complexité des réactions, ce qui les rend impropres à l’application sur le terrain.
L’essai d’amplification isothermale à médiation en boucle (LAMP) est une application rapide, simple et pratique pour le champ14,15. La technique utilise le principe d’une réaction de déplacement de brin, tandis que la réaction d’amplification fonctionne dans des conditions isothermales sans un cycleur thermique sophistiqué et coûteux14,15. Par conséquent, les produits LAMP amplifiés ou les produits RT-LAMP sont analysés dans des bandes en valeur d’échelle à l’aide d’électrophoresis gel agarose avec une tache fluorescente pour la visualisation sûre de l’ADN ou de l’ARN14 ou l’observation à l’œil nu pour la présence de turbidité ou d’un précipité blanc16,17,18. Pour ces raisons, cette technique a été utilisée pour la détection sur place de différents pathogènes du poisson17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Le but de cette étude était d’établir un essai rapide, sensible et précis de RT-LAMP pour la détection de TiLV. L’essai RT-LAMP offre un dépistage du TiLV dans des échantillons de poissons dans un délai de 30 min. La technique peut être appliquée pour le diagnostic et la surveillance de TiLVD.
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Protocol
Cette expérience, qui portait sur l’utilisation de tissus animaux, a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Kasetsart, Bangkok, Thaïlande (numéro de protocole ACKU61-VET-009).
1. Collection de tissus
- Euthanasier les poissons tilapia à l’aide d’une surdose d’huile de clou de girofle (c.-à-d. plus de 3 ml/L). Le méthane tricaine peut être utilisé comme alternative à l’huile de clou de girofle.
- Utilisez des ciseaux et des forceps stériles pour ouvrir l’abdomen du tilapia post mortem et accisez environ 30 à 50 mg de tissu hépatique, ou à l’aide d’un verre de couverture de microscope, recueillir 100 l de mucus en grattant la couche de peau de poisson longitudinally (de l’antérieur au postérieur) dans un tube de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Passez immédiatement à l’étape d’extraction de l’ARN ou maintenez l’échantillon recueilli à 80 oC jusqu’à l’expérience. Comme l’ARN intact est plus sensible que l’ADN, utilisez des matériaux et des réactifs sans RNase pendant l’extraction de l’ARN.
2. Extraction d’ARN
- Pour extraire l’ARN du tissu hépatique, ajoutez 30 à 50 mg du tissu tilapia à un tube de microcentrifuge de 1,5 mL contenant 600 à 1 000 lil de réagent d’extraction de phénoïx guanidinium-acide-phénol(tableau des matériaux), et pulvérisez l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit homogène à l’aide d’un homogénéisant de tissus à la main. Les échantillons de tissus nécessitent environ 10 % du réactif d’extraction de phénoïne-acide-acide. Pour les échantillons de mucus, n’utilisez que 300 lil du réactif d’extraction de guanidinium-acide-phénol (3:1).
CAUTION : Le réactif d’extraction de guanidinium-acide-phénol est toxique ; par conséquent, la manipulation doit être entreprise avec soin. L’équipement de protection, comme les lunettes de sécurité, une robe de laboratoire et des gants de sécurité, doit être porté. - Centrifuge l’échantillon homogénéisé à 10.000 x g pour 30 s à température ambiante, et transférer le supernatant dans un nouveau tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Ajouter un volume égal d’éthanol à 95 % au tube et bien mélanger.
- Transférer la solution dans une colonne de spin (Tableau des matériaux) placée dans un tube de collecte et une centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s à température ambiante. Jetez le flux-through, et transférez la colonne de spin dans un nouveau tube de collecte.
- Ajouter 400 ll de réactif pré-lavage de l’ARN(tableau des matériaux)à la colonne et la centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s à température ambiante avant de jeter le débit. Répétez cette étape une fois de plus.
REMARQUE : Pour préparer l’ARN Pré-Wash, ajouter 10 ml d’éthanol de 95 % à 40 ml de concentré pré-lavage de l’ARN. - Ajoutez 700 L de tampon de lavage d’ARN(tableau des matériaux) à la colonne et la centrifugeuse à 10 000 x g pendant 2 minutes à température ambiante. Transférer la colonne dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL.
REMARQUE : Pour préparer le tampon de lavage d’ARN, ajouter 52 ml d’éthanol de 95 % à 12 ml de concentré tampon de lavage d’ARN. - Elute l’échantillon d’ARN capturé dans la matrice de colonne de spin avec 100 L d’eau sans nucléase et centrifugeuse à 10.000 x g pour 30 s à température ambiante.
- Mesurer la concentration de l’ARN extrait à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume et diluer l’ARN à une concentration désirée à l’aide d’eau sans nucléase.
REMARQUE : La valeur d’absorption qualifiée de OD260/OD280 varie de 1,6 à 1,9, ce qui indique la pureté acceptable de l’ARN pour l’essai RT-LAMP. - Passez immédiatement à l’étape suivante, ou gardez l’échantillon à 80 oC jusqu’à l’utilisation.
3. Conception d’apprêt
- Utilisez la version 4 d’Primer Explorer pour concevoir les amorces spécifiques pour le RT-LAMP. Rendez-vous sur le site Web, https://primerexplorer.jp/e/ et cliquez sur le bouton V4 PrimerExplorer.
- Sélectionnez le fichier contenant les séquences du segment 3 de TiLV en format FASTA, puis cliquez sur le bouton Primer Design.
REMARQUE: Récupérer les séquences en format FASTA à partir de GenBank numéro d’adhésion KX631923, qui représente tilapia lac virus TV1 segment 31. - Pour concevoir les amorces, entrez les paramètres de base suivants :
- Une teneur en GC de 40% à 60%
- Un amplicon de paires de base de 280 euros (bp)
- Une température de fonte similaire (Tm) chez les amorces avec une différence maximale de 5 oC
REMARQUE : Les amorces ne doivent pas se compléter les unes les autres- Évitez les régions séquences sujettes à la formation de structures secondaires.
- Sélectionnez l’analyse dimer l’amorce avec un minimum de 3,5 euros pour une conception optimale pour le plus grand G, et sélectionnez les extrémités des amorces avec un maximum de 4 euros pour une conception optimale pour les plus petits.
- Cliquez sur le bouton Générer.
REMARQUE : Une fois que le logiciel aura terminé le traitement des données d’entrée, les résultats de l’amorce seront affichés(figure 1).
4. Essai RT-LAMP
- Préparer un mélange de maître RT-LAMP contenant 2,5 L de tampon de réaction SD II de 1x, 3 L de MgSO4de 6 mM, 1,4 L de 1,4 mM dNTP ensemble, 4 L de 0,8 M de bétaïne, 1,3 L de mélange de calcéine de 0,052 mM, 1 l de 1,6 M d’amorce TiLV-F3, 1 ll de 1,6 M TiLV-B3 amorce, 1 L de l’apprêt TiLV-FIP de 0,2 M, 1 ll de l’amorce TiLV-FIP de 0,2 M, 1 l de polymérase d’ADN de 0,3 U Bst, 1 l de 0,1 U AMV reverse transcriptase, et 3,8 l d’eau sans nucléase par réaction.
REMARQUE : Préparer un mélange de maître excédentaire comprenant au moins 10 % du volume total de réaction. - Dispenser 22 L du mélange principal RT-LAMP dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5.
- Ajouter 3 L de l’ARN extrait au tube de réaction et mélanger l’échantillon par vortexing. Pour le contrôle négatif, utilisez de l’eau distillée au lieu de matériaux d’ARN.
- Incuber la réaction à 65 oC pendant 60 min, suivie de 80 oC pendant 10 minutes pour mettre fin à la réaction.
- Après l’incubation, observez visuellement les changements colorimétriques à l’œil nu. Un résultat positif apparaîtra comme une couleur vert fluorescent.
5. Électrophoresis gel Agarose
- Préparer un gel agarose de 1,5 % en suspendant 0,6 g de poudre d’agarose dans 40 ml de tampon TAE de 1x. Faire fondre le mélange en le chauffant au micro-ondes pendant 3 à 5 minutes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute et que le tourbillonnement pour mélanger.
- Laisser refroidir l’agarose jusqu’à ce que la température atteigne 65 oC. Verser 40 ml de la solution agarose sur un plateau de gel et ajouter un peigne au moule de gel.
- Laisser le gel d’agarose fixer à température ambiante pendant 20-30 min jusqu’à ce qu’il soit complètement solidifié. Ensuite, retirer le peigne et placer le gel dans le réservoir de gel.
- Ajouter un tampon en cours d’exécution pour couvrir la surface du gel dans le réservoir de gel.
- Ajouter 10 L de l’échantillon RT-LAMP et 2 L de tampon de chargement de gel 6x à chaque puits. Ajouter 5 L d’une échelle d’ADN de 1 kb à la voie de référence.
- Branchez le couvercle attaché à la cathode et à l’anode reliée à une alimentation. Allumez l’alimentation, réglez-la à une constante de 100 V et courez pendant 40 min.
- Après avoir terminé la séparation du gel, retirer le gel du plateau de gel. Ensuite, tachez le gel égoutté à l’aide de bromure d’éthidium (EtBr) à une concentration de 10 mg/mL pendant 7 min et restain dans l’eau distillée pendant 5 min.
CAUTION: EtBr est toxique et considéré comme cancérogène; par conséquent, soyez prudent lors de l’utilisation de cet agent. - Exposez le gel à la lumière UV à l’aide d’un système de documentation de gel où les bandes apparaissent, et prenez une photo du gel.
6. synthèse complémentaire de l’ADN (ADNC)
- Préparer un mélange principal de synthèse de l’ANC contenant 2 L de tampon RT de 5x, 0,5 l de mélange d’amorce, 0,5 l d’enzyme RT et 2 L d’eau sans nucléase par réaction.
REMARQUE : Préparer le mélange de maître excédentaire comprenant 1x la réaction due à la perte potentielle pendant le tuyauterie. - Dispenser 5 L du mélange principal dans un tube stérile de microcentrifuge de 1,5 mL.
- Ajouter 100 ng de l’ARN extrait dilué (obtenu de l’étape 2.8) au tube de réaction, mélanger et tourner vers le bas pour déplacer tout le mélange au fond du récipient.
- Incuber les réactions à 42 oC pendant 60 min, suivie de 98 oC pendant 5 minutes dans une machine PCR. Conserver l’ADN à 20 oC jusqu’à l’utilisation.
7. RT-qPCR
- Préparer un mélange de maître TiLV qPCR contenant 0,3 L d’amorce inversée de 10 M, 0,3 L d’apprêt avant de 10 M, 5 L de polymérase à ADN vert SYBR de 2x et 0,4 L d’eau sans nucléa par réaction. Utilisez les amorces et les contrôles suivants :
Apprêt avant (TiLV-112F): 5'-CTGAGCTAAAGAGGCAATATGGATT-3'
Apprêt inversé (TiLV-112R): 5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAAGTTCT-3' - Dispenser 6 L du mélange principal TiLV qPCR dans chaque puits de la bande QPCR compatible avec le cycleur thermique en temps réel utilisé.
- Ajoutez 4 L du modèle de l’ADNC, contrôle négatif (eau sans nucléase), contrôle positif (10 pg/L) et pTiLV (plasmide)10 ou plasmide dilué en série au puits, et mélangez chaque échantillon en clignotant. Effectuez chaque échantillon en triplicate.
- Placez les réactions qPCR dans le cycle thermique en temps réel programmé. Définissez le programme qPCR pour effectuer l’incubation à 95 oC pendant 3 minutes, suivi de 40 cycles de 95 oC pour 10 s et 60 oC pour 30 s avant l’étape de la courbe de fusion dans laquelle la température doit passer de 65 à 95 oC à 0,5 oC/5 screments.
- Effectuez l’analyse des données en évaluant les courbes d’amplification et de fusion, puis calculez le nombre de copies TiLV à l’aide de la courbe standard obtenue à partir des données à l’aide des plasmides dilués en série.
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Representative Results
Dans cette étude, un essai DE RT-LAMP a été développé pour détecter l’infection de TiLV dans le tilapia. Les échantillons testés ont été prélevés dans 14 fermes situées dans différentes parties de la Thaïlande entre 2015 et 2016. Les poissons infectés et non infectés ont été principalement regroupés en fonction des diagnostics physiques et des apparences de TiLVD symptomatique. L’infection de TiLV a été plus tard confirmée utilisant RT-PCR après le processus de collecte. L’électrophoresis du gel agarose et la détection d’une couleur verte luminescente ont été sélectionnées comme méthodes d’évaluation des amplicons LAMP(figure 2). Le foie et le mucus du poisson tilapia infecté et non infecté ont été caractérisés par l’aspect clinique des symptômes de la maladie de TiLV, y compris l’érosion de peau, la rougeur de peau, les exophthalmos, et le gonflement abdominal. Des rapports précédents ont démontré l’utilisation d’échantillons de foie dans les essais de diagnostic moléculaire pour déterminer la présence de TiLV35. Alternativement, le mucus peut être bénéfique dans l’essai car il peut aider à éviter de tuer les animaux. Les résultats ont montré un modèle de bande d’ADN en type d’échelle et une couleur vert fluorescente dans les échantillons infectés de foie et de mucus de poissons infectés(figure 2), alors qu’aucune bande d’ADN et la couleur jaune de la calcéine ont été observées dans les mélanges RT-LAMP dans les tissus animaux non infectés(figure 2). Fait intéressant, un échantillon de tilapia infecté par TiLV prélevé dans une ferme en Malaisie a également été diagnostiqué comme positif à l’aide de cet essai RT-LAMP; toutefois, des variations de la taille du produit PCR par rapport aux échantillons prélevés dans des fermes thaïlandaises locales ont été observées(figure 2).
Pour vérifier la sensibilité et la spécificité de l’analyse RT-LAMP, un total de 63 tissus infectés par TiLV et 63 tissus non infectés ont été analysés à l’aide des essais RT-LAMP et RT-qPCR(tableau 1). Une comparaison des essais RT-qPCR et RT-LAMP des échantillons infectés a révélé un résultat positif dans 63 (100%) et 51 (80,95%) échantillons, respectivement. De plus, une analyse des échantillons non infectés a montré que les 63 tissus non infectés ont donné des résultats négatifs à l’aide des essais RT-qPCR et RT-LAMP(tableau 1). Cette analyse a démontré la fiabilité de l’essai RT-LAMP pour la détection tiLV primaire. Pour tester la spécificité de l’analyse RT-LAMP, les tissus des poissons infectés par d’autres bactéries pathogènes et les virus, y compris Streptococcus agalactiae, Francisella noatunensis, Flavobacterium columnare, Aeromonas hydrophila, et Iridovirus ont été utilisés comme modèles pour les analyses RT-LAMP et RT-QPCR. Les amorces RT-LAMP et RT-qPCR ont donné des résultats négatifs sans modification colorimétrique et sans signaux fluorescents dans aucun des échantillons testés (tableau 2). En outre, la sensibilité de l’essai RT-LAMP a été évaluée à l’aide d’une dilution en série 10 fois des modèles d’ARN extraits de poissons infectés par TiLV. En comparaison, l’essai RT-qPCR était plus sensible que l’essai RT-LAMP car l’essai RT-qPCR avait une limite de détection de10-8 tandis que la méthode RT-LAMP nécessitait une dilution de10-7fois pour détecter le génome de TiLV(tableau 2).
Figure 1. Les séquences nucléotides des six amorces RT-LAMP utilisées dans cette étude qui étaient spécifiques à la détection de TiLV. La position de chaque amorce était alignée sur le segment 3 du génome de TiLV (numéro d’adhésion KX631923). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Analyse des amplicons RT-LAMP obtenus à partir des échantillons infectés par TiLV et non infectés (A) dans 1,5% d’électrophoresis de gel agarose et (B) par visualisation fluorescente. ( M - 1 kb échelle d’ADN, 1-2 - ARN des foies des poissons infectés par TiLV, 3-4 - l’ADP des poissons infectés par TiLV, 5-6 - ARN du mucus de poissons infectés par TiLV, 7-8 - lignées cellulaires de poissons infectés par TiLV, 9 - ARN des foies des poissons infectés par TiLV (Malaisie), 10 ARN des foies de poissons non infectés par TiLV, 11 - l’ADP des poissons non infectés par TiLV, 12 - ARN du mucus de poissons non infectés par TiLV, 13 - pas de contrôle de modèle S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Types d’échantillons | Nombre d’échantillons | Validité de détection (%) | |
| RT-qPCR | RT-LAMP | ||
| Échantillons infectés | 63 | 100.00 (63/63) | 80.95 (51/63) |
| Échantillons non infectés | 63 | 0 (0/63) | 0 (0/63) |
Tableau 1. Vérification de RT-LAMP pour la détection tiLV dans des échantillons de poissons infectés et non infectés à l’aide de RT-qPCR et RT-LAMP
| Spécificité | S.a. | F.n. | C.f. | A.h. | I.v. | |||||
| qPCR (en) | Lampe | qPCR (en) | Lampe | qPCR (en) | Lampe | qPCR (en) | Lampe | qPCR (en) | Lampe | |
| – | – | – | – | – | – | – | – | – | – | |
| Sensibilité | méthode/ | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 | 10-8 | 10-9 |
| Dilution | ||||||||||
| qPCR (en) | + | + | + | + | + | + | + | + | – | |
| Lampe | + | + | + | + | + | + | + | – | – | |
Tableau 2. Spécificité et sensibilité de l’essai RT-LAMP par rapport à RT-qPCR. Pour l’évaluation de spécificité, l’ARN obtenu à partir de tissus de poissons infectés par d’autres bactéries ou virus, y compris Streptococcus agalactiae (S.a.), Francisella noatunensis (F.n.), Flavobacterium columnare (F.c.), Aeromonas hydrophila (A.h.), et Iridovirus (I.v.), a été utilisé comme modèles pour RT-qPCR et RT-LAMP. Pour l’évaluation de sensibilité, l’ARN obtenu à partir de poissons infectés par TiLV a été dilué en série de 100 ng à 1 fg et utilisé comme modèles pour RT-qPCR et RT-LAMP. Les signes signifient des résultats positifs et négatifs, respectivement.
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Discussion
L’industrie aquacole est continuellement menacée par des infections virales qui causent des pertes économiques importantes9,23,28. Par exemple, le TiLV émergent représente une menace majeure pour les pays producteurs de tilapia dans de nombreuses parties du monde1,6,9. Jusqu’à présent, il n’y avait pas de thérapeutique spécifique disponible pour prévenir TiLVD. Bien que la mise au point d’un vaccin soit en cours, un vaccin efficace nécessitera beaucoup de temps avant d’être disponible à des fins commerciales. Compte tenu de ces circonstances, des mesures strictes de biosécurité, telles que l’application de désinfectants, sont nécessaires dans les exploitations piscicoles pour empêcher la propagation de TiLVD29,30. Actuellement, l’une des mesures de lutte les plus efficaces pour réduire la transmission TiLV est le dépistage des poissons juvéniles et des adultes pour la présence ou l’absence de TiLV31. À des fins de dépistage, l’outil de diagnostic doit être rapide, sensible et spécifique afin qu’il puisse aider à éliminer les populations infectées et prévenir la propagation de la maladie. Cependant, les essais moléculaires actuels pour TiLV sont difficiles à mettre en œuvre sur place. Dans un premier temps, ils ont besoin de chercheurs habiles et d’équipement coûteux. Deuxièmement, il peut prendre plusieurs jours pour obtenir les résultats de laboratoire, ce qui rend difficile de contrôler et de prévenir la propagation de la maladie rapidement15,16.
Pour surmonter ces problèmes, Notomi et coll.14 ont établi un nouvel essai d’amplification à base d’acide nucléique appelé amplification isothermale à médiation boucle (LAMP) en 2000. La réaction LAMP a depuis été appliquée avec succès pour détecter divers virus du poisson16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,32,33,34. Dans cette étude, nous avons développé un protocole RT-LAMP pour détecter le TiLV dans des échantillons de poissons tilapia. Bien que la sensibilité de la méthode RT-LAMP soit 10 fois moins efficace que celle du RT-qPCR, l’analyse RT-LAMP peut détecter la présence d’un génome d’ARN TiLV aussi bas que 100 fg, ce qui est suffisant pour la détection tiLV chez les poissons cliniquement malades34. Notamment, l’essai RT-LAMP donne un résultat dans un rayon de 60 min et ne nécessite qu’un simple bain d’eau ou des instruments de bloc thermique34, tandis que l’essai RT-qPCR prend plus de temps et nécessite plus cher en temps réel des équipements PCR pour l’analyse15,34. En outre, le produit final de la RT-LAMP a été observé à travers un changement de couleur de la teinture fluorescente du jaune clair au vert fluorescent, le rendant visible à l’œil nu sans aucune exigence pour l’équipement sophistiqué34. Ces avantages rendent RT-LAMP adapté au diagnostic sur le terrain. En outre, les résultats de l’étude ont suggéré que le foie et le mucus peuvent être utilisés pour la détection tiLV à l’aide de RT-LAMP. Semblable aux études précédentes, un échantillon non létal utilisant le mucus a permis le diagnostic de TiLV sans tuer des poissons ou des géniteurs précieux35. Récemment, un essai RT-LAMP a été développé pour détecter les isolats chinois et thaïlandais des séquences de nucléotide TiLV dans le segment 1 (région S1) en utilisant un ensemble de six amorces36. La présente étude a démontré que l’essai développé de RT-LAMP a diagnostiqué un signal faussement négatif de l’infection de TiLV à 27.78% comparé à RT-PCR en utilisant le même ensemble d’amorce. À titre de comparaison, le résultat faussement négatif a été relativement inférieur à 19,05 % lors de la détection du segment 3 de TiLV par rapport à RT-PCR. En comparant l’efficacité de la méthode de détection virale avec d’autres rapports, nous avons pu détecter l’infection tiLV à 80,95%, tandis que d’autres travaux ont détecté le virus à 72,22%36 et 82,89%37. Au total, on peut supposer que les différents composants de l’analyse RT-LAMP, par exemple, les différents ensembles d’amorce et les différents segments ciblés du génome tiLV sont des facteurs importants influençant la validité de l’essai.
Bien que l’essai RT-LAMP soit un outil puissant pour le dépistage de la maladie et présente plusieurs avantages démontrables, cette étude n’était pas sans limites. L’un des points critiques pour l’essai RT-LAMP a été la conception d’un ensemble d’apprêt approprié comprenant quatre à six amorces. Pour favoriser la formation des structures de la boucle de tige des produits PCR, les longueurs appropriées des gènes ciblés ou des séquences de nucléotide devaient être plus longues qu’environ 500 bp, tandis que les gènes ciblés de l’essai RT-PCR devaient être relativement courts, dans la fourchette de 50-150 bp14,38,39.
En conclusion, l’analyse rt-LAMP développée est rapide, rentable, sensible et spécifique pour la détection TiLV. L’analyse peut être complétée dans un rayon de 1 h par rapport à 4 à 5 h pour l’essai RT-qPCR. Notamment, l’essai RT-LAMP est pratique pour les conditions de terrain que des résultats positifs peuvent être observés à l’œil nu sans exiger l’utilisation d’équipement sophistiqué.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le projet est financé financièrement par le numéro de subvention du Fonds de recherche thaïlandais (TRF) RDG6050078 et le Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under the Higher Education Research Promotion et National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. La recherche est appuyée en partie par la bourse d’études supérieures de l’École supérieure de l’Université Kasetsart. Les auteurs tiens à remercier le Dr Kwanrawee Sirikanchana pour le récit parlant de la vidéo et Piyawatchara Sikarin pour l’édition de la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue collection: | |||
| Clove oil | Better Pharma | N/A | |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | An alternative option to clove oil |
| RNA extraction: | |||
| Acid guanidinium-phenol based reagent (TRIzol reagent) | ThermoFisher Scientific Corp. | 15596026 | |
| Acid guanidinium-phenol based reagent (GENEzol reagent) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol RNA Kit: | Zymo Research | R2071 | |
| - Direct-zol RNA PreWash | |||
| - RNA Wash Buffer | |||
| - DNase/RNase-free water | |||
| - Zymo-spin IIICG columns | |||
| - Collection Tubes | |||
| RT-LAMP: | |||
| 1x SD II reaction buffer | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Calcein mixture | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst DNA polymerase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV reverse transcriptase | Promega | M510A | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite dry bath incubator, single unit | Major Science | EL-01-220 | |
| Gel electrophoresis: | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tris-borate-EDTA (TBE) buffer | Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) buffer: | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acetic acid (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen | NeoScience Co., Ltd. | GR107 | |
| DNA gel loading dye (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| DNA ladder and markers | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system) | Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC power supply | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| UV sample tray | Bio-Rad | 1708271 | |
| NαBI imager | Neogene Science | ||
| cDNA synthesis: | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA Synthesis Kit | Vivantis Technologies | cDSK01 | An alternative option for cDNA synthesis |
| NanoDrop2000 (microvolume spectrophotometer) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR: | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Nuclease-free water, sterile water | MultiCell | 809-115-CL | |
| 8-tube PCR strips, white | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Flat PCR tube 8-cap strips, optical | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad | 1855196 | |
| General equipment and materials: | |||
| Mayo scissors | N/A | ||
| Forceps | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (vortex mixer) | Scientific Industries | ||
| Microcentrifuge LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifuge | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS | |
| QSP filtered pipette tips | Quality Scientific Plastics | TF series | |
| Corning Isotip filtered tips | Merck | CLS series | |
| Nuclease-free 1.5 mL microcentrifuge tubes, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
References
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinical Microbiology. 52 (12), 4137-4146 (2014).
- Adams, M. J., et al. Changes to taxonomy and the International Code of Virus Classification and Nomenclature ratified by the International Committee on Taxonomy of Viruses (2017). Archives of Virology. 162 (8), 2505-2538 (2017).
- Bacharach, E., et al. Characterization of a Novel Orthomyxo-like Virus Causing Mass Die-Offs of Tilapia. MBio. 7 (2), 00431 (2016).
- Jaemwimol, P., et al. Susceptibility of important warm water fish species to tilapia lake virus (TiLV) infection. Aquaculture. 497, 462-468 (2018).
- Giews, F. Global Information and Early Warning System On Food And Agriculture. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Rome, Italy. (2017).
- Al-Hussinee, L., Subramaniam, K., Ahasan, M. S., Keleher, B., Waltzek, T. B. Complete Genome Sequence of a Tilapia Lake Virus Isolate Obtained from Nile Tilapia (Oreochromis niloticus). Genome Announcements. 6 (26), (2018).
- Thammatorn, W., Rawiwan, P., Surachetpong, W. Minimal risk of tilapia lake virus transmission via frozen tilapia fillets. Journal of Fish Diseases. 42 (1), 3-9 (2019).
- Fathi, M., et al. Identification of Tilapia Lake Virus in Egypt in Nile tilapia affected by 'summer mortality' syndrome. Aquaculture. 473, 430-432 (2017).
- Tattiyapong, P., Sirikanchana, K., Surachetpong, W. Development and validation of a reverse transcription quantitative polymerase chain reaction for tilapia lake virus detection in clinical samples and experimentally challenged fish. Journal of Fish Diseases. 41 (2), 255-261 (2018).
- Waiyamitra, P., et al. A TaqMan RT-qPCR assay for tilapia lake virus (TiLV) detection in tilapia. Aquaculture. 497, 184-188 (2018).
- Kembou Tsofack, J. E., et al. Detection of Tilapia Lake Virus in Clinical Samples by Culturing and Nested Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology. 55 (3), 759-767 (2017).
- Dong, H. T., et al. Emergence of tilapia lake virus in Thailand and an alternative semi-nested RT-PCR for detection. Aquaculture. 476, 111-118 (2017).
- Notomi, T., et al.
- Mori, Y., Notomi, T. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).
- Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).
- Caipang, C. M., Haraguchi, I., Ohira, T., Hirono, I., Aoki, T. Rapid detection of a fish iridovirus using loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Journal of Virological Methods. 121 (2), 155-161 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus (KHV) infection by loop-mediated isothermal amplification. Virology Journal. 2, 83 (2005).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Venugopal, M. N., Sakai, M. Detection of koi herpesvirus in common carp, Cyprinus carpio L., by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Fish Diseases. 27 (10), 583-589 (2004).
- Gunimaladevi, I., Kono, T., Lapatra, S. E., Sakai, M. A loop mediated isothermal amplification (LAMP) method for detection of infectious hematopoietic necrosis virus (IHNV) in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Archives of Virology. 150 (5), 899-909 (2005).
- Kono, T., Savan, R., Sakai, M., Itami, T. Detection of white spot syndrome virus in shrimp by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 115 (1), 59-65 (2004).
- Soliman, H., El-Matbouli, M. Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of viral hemorrhagic septicaemia virus (VHS). Veterinary Microbiology. 114 (3-4), 205-213 (2006).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of channel catfish Ictalurus punctatus important bacterial pathogen Edwardsiella ictaluri. Journal of Microbiological Methods. 63 (1), 36-44 (2005).
- Yeh, H. Y., Shoemaker, C. A., Klesius, P. H. Sensitive and rapid detection of Flavobacterium columnare in channel catfish Ictalurus punctatus by a loop-mediated isothermal amplification method. Journal of Applied Microbiology. 100 (5), 919-925 (2006).
- Sun, Z. F., Hu, C. Q., Ren, C. H., Shen, Q. Sensitive and rapid detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in shrimps by loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods. 131 (1), 41-46 (2006).
- Shivappa, R. B., et al. Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L. Journal of Fish Diseases. 31 (4), 249-258 (2004).
- Wei, X. N., Zheng, Z. J., Zhang, L. H., Qu, F., Huang, X. Sensitive and rapid detection of Aeromonas caviae in stool samples by loop-mediated isothermal amplification. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 60 (1), 113-116 (2008).
- Chinabut, S., Puttinaowarat, S. The choice of disease control strategies to secure international market access for aquaculture products. Developmental Biology. 121, 255-261 (2005).
- Soto, E., Yun, S., Surachetpong, W. Susceptibility of Tilapia Lake Virus to buffered Povidone-iodine complex and chlorine. Aquaculture. 512, 734342 (2019).
- Jaemwimol, P., Sirikanchana, K., Tattiyapong, P., Mongkolsuk, S., Surachetpong, W. Virucidal effects of common disinfectants against tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (10), 1383-1389 (2019).
- Jansen, M. D., Dong, H. T., Mohan, C. V. Tilapia lake virus: a threat to the global tilapia industry. Reviews in Aquaculture. 11 (3), 725-739 (2019).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Savan, R., Kono, T., Itami, T., Sakai, M. Loop-mediated isothermal amplification: an emerging technology for detection of fish and shellfish pathogens. Journal of Fish Diseases. 28 (10), 573-581 (2005).
- Phusantisampan, T., Tattiyapong, P., Mutrakulcharoen, P., Sriariyanun, M., Surachetpong, W. Rapid detection of tilapia lake virus using a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Aquaculture. 507, 35-39 (2019).
- Liamnimitr, P., Thammatorn, W., U-thoomporn, S., Tattiyapong, P., Surachetpong, W. Non-lethal sampling for Tilapia Lake Virus detection by RT-qPCR and cell culture. Aquaculture. 486, 75-80 (2018).
- Yin, J., et al. Development of a simple and rapid reverse transcription-loopmediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay for sensitive detection of tilapia lake virus. Journal of Fish Diseases. 42 (6), 817-824 (2019).
- Khan, R. S. A., et al. Rapid detection of infectious bursal disease by loop-mediated isothermal amplification for field analysis. Iranian Journal of Veterinary Research. 19 (2), 101-107 (2018).
- Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).
- Debode, F., Marien, A., Janssen, E., Bragard, C., Berben, G. The influence of amplicon length on real-time PCR results. Biotechnology, Agronomy, Society and Environment. 21 (1), 3-11 (2017).
