거대 분자 군중을 사용하여 인간의 절단 비대 흉터의 시험관 내 모델

요약

이 프로토콜은 생체 외 조건에서 유사한 시험관 내 인간 비대 흉터 조직 모델을 만들기 위해 거대 분자 crowding의 사용을 설명합니다. 혼잡한 거대 분자 환경에서 재배될 때, 인간의 피부 섬유아세포는 흉터 조직을 닮은 표현형, 생화학, 생리학 및 기능적 특성을 나타낸다.

초록

생체 내 조직은 단백질, 핵산, 리보뉴클레오 단백질, 다당류 등에 의해 매우 혼잡한 것으로 나타났습니다. 다음 프로토콜은 시험관 내 세포 배양에 중성 중합체(crowders)를 첨가하여 이러한 생리적 군중을 모방하기 위해 거대 분자 crowding(MMC) 기술을 적용한다. 크라우드로 Ficoll 또는 dextran을 사용하여 이전 연구는 WI38 및 WS-1 세포주에서 콜라겐 I과 섬유넥틴의 발현이 MMC 기술을 사용하여 현저하게 향상된다는 것을 보여줍니다. 그러나, 이 기술은 1 차적인 비대 흉터 유래 인간 피부 섬유아세포 (hHSFs)에서 검증되지 않았습니다. 콜라겐의 과도한 증착로 인해 비대성 흉터가 발생함에 따라, 이 프로토콜은 hHSFs로 MMC 기술을 적용하여 시험관 내 비대 흉터 모델이 풍부한 콜라겐을 구성하는 것을 목표로 합니다. 이 최적화된 MMC 모델은 기존의 2차원(2-D) 세포 배양 시스템에 비해 생체 내 흉터 조직과 더 많은 유사성을 갖는다는 것을 보여주었다. 또한 동물 모델에 비해 비용 효율적이고 시간 효율적이며 윤리적으로 바람직합니다. 따라서 여기에 보고된 최적화된 모델은 비대 성 흉터 관련 연구를 위한 고급 "생체 내"모델을 제공합니다.

서론

흉터 조직은 조직 복구의 종점을 나타냅니다. 그러나, 많은 개인에서, 특히 화상이나 외상으로 고통받는 사람들^1,흉터는 과도 할 수 있으며 치유 된 피부의 형태와 기능에 바람직하지 않은 영향을 미칠 수 있습니다. 병리학적(비대 흉터 및 켈로이드) 흉터 형성의 정확한 메커니즘은 완전히 이해되지 않지만, 상처 치유 시 콜라겐의 과도한 침착은 필수적인 기여로 입증되었다^2.

성장 인자 베타 1 (TGF-β1)과 알파 평활근 액틴 (αSMA)을 변형시키는 것이 비대 흉터의 형성에 중요한 역할을한다는 것은 잘 확립되어 있습니다. 증거는 높은 TGF-β1이 SMAD 신호 통로를 조절해서 콜라겐의 과도한 침착을 직접 자극한다는 것을 시사한다^3. 또한, αSMA는 상처 치유 과정에서 세포 수축 및 재피상화를 조절함으로써 비대성 흉터 형성에 기여하는 것으로 밝혀졌다^4. 시험관 내 및 생체 내 모델의 부족은 흉터 치료에 대한 내정간섭 및 치료법을 개발하고 평가하는 데 큰 장애가 됩니다. 이 연구의 목적은 기존의 MMC 기술을 활용하여 신규 및 신흥 흉터 관련 개입을 평가하는 데 적합한 "생체 내 와 같은" 비대 흉터 모델을 구축하는 것입니다.

신체 외부의 살아있는 조직을 재현하는 것은 과학 계에서 수년 동안 목표였습니다. 20 세기 초에 체외 기술의 발달은 부분적으로 이 목표를 달성했습니다. 현재 시험관내 기술은 배아 세포가 따뜻한 식염수^5에서며칠 동안 생체 내에서 살아남을 수 있다는 루의 원래 데모에서 약간 진화했다. 그러나, 시험관내 방법론은 대부분 2-D에서 재배된 단일 세포 유형으로 제한되며 생체 내에서 조직을 정확하게 재봉화하지 는 않는다. 세포 생화학, 생리학 및 유전학을 검사하는 데 유용하지만, 네이티브 조직은 3-D이며 여러 세포 유형을 통합합니다. 간단한 2-D 체외 시스템에서는 포유동물 세포를 고도로 인공적인 환경으로 적용하여 원어민 조직 특이적 아키텍처가 손실되는^6. 차례로, 이것은 비정상적인 세포 형태, 생리학 및 행동^7의결과로 세포 내 및 세포 외 사건에 영향을 미칩니다.

이 프로토콜뒤에 관심은 비대 흉터 및 켈로이드의 발달 그리고 임상 관리에 있습니다. 진피 섬유아세포가 흉터 조직에 존재하는 콜라겐의 풍부한 생산에 크게 책임이 있다는 것은 잘 확립되어 있지만, 생체내 2-D 시스템을 이용한 진피 섬유아세포 배양은 생체 내에서 관찰된 콜라겐의 회전율을 재현하지 못한다^8. 현대 체외 방법은 여전히 본질적으로 "따뜻한 식염수"를 사용, 살아있는 조직에서 완전히 다른 환경. 생체 내 조직은 단백질, 핵산, 리보뉴클레오 단백질 및 다당류로 매우 혼잡하여 전체 부피의 5 %-40 %를 차지합니다. 두 분자가 동시에 동일한 공간을 차지할 수 없기 때문에 사용 가능한 공간이 거의 없으며 자유 물^9이거의 완전하지 않습니다.

MMC 기술은 시토솔 및 간질 유체의 열역학적 특성에 영향을 미치는 제약 조건을 부과합니다. 분자 상호 작용, 수용체 -리간드 신호 복합체, 효소 및 세포기관은 자유롭게 상호 작용에서 제한됩니다^9. pericellular 환경 내의 상호 작용 (즉, interstitium) 또한 제한됩니다. 최근의 증거는 혼잡한 용액에서 불활성 거대분자의 고농도가 확산, 물리적 연관, 점도 및 유체역학적^{성질(10)을}확인한다.

흥미롭게도, 몇몇 대중적인 군집 에이전트 (즉, Ficoll, dextran, 폴리비닐피롤리돈 [PVP], 및 나트륨 4-스티렌설포네이트 [PSS])는 다른 세포 유형 및 다른 설정에 적용될 때 동등하지 않다. 한 이전 연구에서, Ficoll PVP에 비해 중간 엽 줄기 세포에 대 한 덜 세포 독성 것으로 보고 되었다. 이러한 결과는 중전하 및 상대적으로 작은 유체역학적^{반경(11)의}결과로 해석되었다. 대조적으로, 두 번째 연구는 dextran이 Ficoll^12에비해 인간 폐 섬유아세포에 의한 콜라겐 I 증착을 자극하는 데 더 효과적이라는 것을 발견했습니다. 우리 자신의 연구에서 데이터는 Ficoll이 비대 흉터 파생 섬유 아세포에 의한 콜라겐 침착을 향상시키는 반면 PVP는 이 세포에 독성이 있음을^{시사합니다 13.}

프로콜라겐에서 콜라겐으로의 전환이 생체 내^{환경(14)에서}더 빠르다는 것이 입증되었으며, 생물학적 반응의 속도는 희석된 2-D 배양^{시스템(15)에서}지연된다. 우리는 여기에서 시험관 내 프로토콜을 최적화했습니다, 진피 섬유아세포의 경작을 보여주기 위하여 MMC를 통합하는 것은 진피 섬유증과 흉터 대형을 위한 더 "생체내" 모형으로 봉사하는. 일반적인 2-D 배양 시스템과는 달리, MMC를 사용하여 hHSFs를 배양하면 콜라겐의 생합성 및 침착을 현저하게^{자극하는 13.} 특히, 섬유증의 다른 특성(즉, 매트릭스 금속종단백체족제[MMPs] 및 전염증성 사이토카인의 증가된 발현)도 이 최적화된 MMC^{프로토콜(13)에}따라 명백하다. 이 방법을 사용하여 경작하면, 진피 세포가 생체 내에서 측정된 생리적, 생화학적 및 기능적 파라미터를 재환기시키는 것으로 나타났다.

최적화된 MMC 체외 프로토콜은 비대성 흉터 진피 및 관련되지 않은 인접 진피로부터 분리된 진피 섬유아세포에 의한 콜라겐 및 기타 ECM 단백질의 발현을 평가하는 데 사용되어 왔다. 시험관내 MMC 환경에서 재배될 때, hHSFs는 생체 내에서 진피 비후성 흉터 조직과 유사한 특정 특성(즉, mRNA, 생화학, 생리학 및 표현형)을 발현하는 것으로 관찰되었다. 증거는 군중을 선택하고 시험관에서 재배를위한 MMC 조건을 최적화 할 때 물리적 및 화학적 특성이 중요한 고려 사항임을 나타냅니다.

원리 증명을 위해, MMC 프로토콜은 세포 자멸을 유도하는 Shikonin 및 그것의 유사체의 능력을 질적으로 그리고 정량적으로 평가하기 위하여 여기에서 적용됩니다. 이것은 진피 흉터 를 관리하기위한 이러한 자연적으로 파생 된 중국 의학 (한의학) 화합물의 잠재적 인 응용 프로그램의 평가를 허용^13. 그럼에도 불구하고, 이 시험관 내 MMC 프로토콜의 단순성, 비용 효율성 및 적시성은 EU 지침 2010/63/EU 및 미국 환경 보호국(EPA)에 의한 포유류 실험을 제거하기 위한 최근의 규정을 만족시고 있습니다.

프로토콜

1. 세포 배양

1. Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)에서 비 병리학 조직 (hNSFs)에서 파생 된 hHSFs 및 정상 진피 섬유 아세포유지 10% 태아 송아지 혈청 (FCS) 및 1 % v / v / v 페니실린 / 스트렙₂토마이신 용액 (P / S) 37 ° C 인쿠베토 에서 27 ° C 인쿠베2
2. 해당 회사에서 Ficoll 70, Ficoll 400 및 아스코르브산을 구입하십시오.

2. MMC 비대 흉터 모델의 건설

1. hHSFs 또는 hNSFs (50,000 /well)를 각 웰에 1 mL의 미디어를 포함하는 24 개의 웰 플레이트에 시드합니다.
2. 37°C 인큐베이터에 5%_CO2로 놓고 밤새 둡니다.
3. MMC 미디어를 준비합니다. 실험에 필요한 총 부피를 기준으로 Ficoll 70(18.75 mg/mL), 피콜 400(12.5 mg/mL), 아스코르브산(100μM)을 혼합하여 10% FCS/DMEM 용지를 생성합니다.
4. 혼합물을 37°C 수조에 1시간 동안 넣고 군중을 용액으로 분산한 다음 0.2 μm 필터를 사용하여 MMC 매체를 살균합니다.
5. 소비된 미디어를 흡인하고 갓 만든 MMC 미디어로 교체합니다.
6. 37°C 및 5%_CO2에서6일 동안 세포를 배양하고 3일마다 미디어를 변경합니다.

3. 콜라겐의 총량의 발현

1. 시리우스 레드 용액을 준비합니다(0.1% w/v). 증류수 탈이온수(ddH 2O)의 200 mL에 1 mL의₂아세트산으로 직접 적색 80 분말 0.2 g을 용해합니다.
2. MMC 미디어를 흡인하고 각 웰에 300 μL의 시리우스 레드 용액을 추가합니다. 90 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
3. 시리우스 레드 용액을 수돗물로 부드럽게 헹구고 접시가 밤새 공기 건조되도록 하십시오.
4. 시리우스 레드 얼룩을 각 우물에 200 μL의 수산화 나트륨 (0.1 M)을 첨가하여 추출합니다. 플레이트를 궤도 셰이커에 5-10분 간 놓고 시리우스 붉은 얼룩을 완전히 추출합니다.
5. 추출된 시리우스 레드 얼룩의 100 μL을 96개의 잘 투명한 플레이트로 옮기고 마이크로플레이트 리더를 이용하여 620 nm에서 흡광도를 측정한다.

4. 콜라겐 I의 발현 (면역 염색)

1. 200 μL의 인산완충 식염수(PBS, pH = 7.35)를 사용하여 우물을 세척합니다.
2. 메탄올(500 μL/well)을 사용하여 세포를 4°C에서 10분 동안 고정합니다.
3. 실온(RT)에서 30분 동안 3% 소 혈청 알부민과 비특이적 상호 작용을 차단합니다.
4. 차단 용액을 흡인하고 RT에서 90 분 동안 항 콜라겐 I 항체 (10 μg / mL)의 200 μL로 배양합니다.
5. 1차 항체를 흡인하고 각각 5분 동안 PBS로 3x세척한다.
6. 염소 안티 토끼-FITC 보조 항체 (1:400 희석) 및 4',6-디아미디노-2-페닐린들레 (DAPI; 1 : 2000 희석)의 200 μL로 인큐베이션 RT에서 30 분 동안 알루미늄 호일로 플레이트를 덮습니다.
7. 이차 항체와 DAPI를 모두 버리고 PBS로 각각 5분 동안 3x를 세척합니다.
8. 현미경으로 직접 형광 염색을 시각화합니다.

5. 서양 블로팅

1. PBS로 세포를 2배 씻습니다.
2. 40 μL의 라시스 버퍼를 각 우물에 넣고 파이펫 팁으로 세포 층을 긁어냅니다. 용해 완충제에는 RIPA 완충제, 프로테아제 억제제 칵테일(PIC), 2 mM 나트륨 바나다테, 및 10 mM 불소 나트륨이 포함되어 있습니다.
3. 단백질 용해액을 마이크로원심지 튜브로 옮기고 제조사의 지침에 따라 단백질 분석기를 사용하여 단백질 농도를^{측정한다 16.}
4. 각 그룹의 단백질 10 μg를 4%-12% 비스-트리스 단백질 젤의 우물에 넣습니다. 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)을 200V에서 30분 동안 수행합니다.
5. 90V에서 90V로 서쪽 얼룩을 실행하여 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 젤과 니트로셀룰로오스 막 사이에 기포가 형성되는 것을 피하십시오.
6. 블로킹 버퍼의 10 mL로 멤브레인을 차단합니다.
7. 하룻밤 4 °C에서 기본 항체와 배양. 1차 항체는 항콜라겐 I, 항콜라겐 III, 항콜라겐 IV, 항αSMA, 항MMP-1, 항MMP-9, 항MMP-13 및 항-인산염 탈수소효소(GAPDH)이다.
8. 0.1 % TBS-Tween 20 (각각 5 분 동안 5 x)로 멤브레인을 씻으소서. TBS/트웬 20(1L)에는 1M Tris 50 mL(pH = 7.4), 염화나트륨 5m 의 30 mL, 트웬 20의 1 mL 및 ddH₂O의 920 mL이 포함됩니다.
9. 1 시간 동안 RT에서 적절한 이차 항체를 종으로 배양합니다.
10. 5.8단계를 반복하고 이미징 시스템을 사용하여 형광을 시각화합니다.

6. RT-PCR

1. RNA 추출 분석 키트에 포함된 2-메르카포에탄올과 혼합된 용해 완충액을 이용하여 총 RNA를 수집한다.
2. 제조사의 지침에 따라 RNA를 정화¹⁷.
3. 마이크로볼륨 분광광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정합니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 cDNA 합성 키트를 사용하여 첫 번째 가닥 cDNA 합성을 수행합니다.
5. RT-PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머는 맞춤형 96웰 플레이트에 제공된다(프리코팅). cDNA 샘플 100 ng를 SYBR 그린 슈퍼믹스 10 μL과 혼합하여 맞춤형 플레이트에 넣습니다.
6. ddH₂O를 사용하여 총 부피를 20 μL/웰로 늘립니다.
7. 제조업체의 지침에 따라 열 사이클러를 사용하여 RT-PCR을 실행하십시오: 98°C에서 변성하는 40사이클, 15초에 대해 변조, 60초에 60°C에서 어닐링/확장. RT-PCR에서 시험된 유전자는 다음을 포함합니다: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 및 VEGF.

결과

삼중항 샘플을 각 실험에서 수행하였고, 각 실험은 3명의 개별 환자로부터 세포를 사용하여 3배 반복하였다. 데이터는 대조군의 백분율로 표현됩니다. 단방향 ANOVA 및 Tukey의 사후 테스트는 통계적 차이를 분석하기 위해 적용되었습니다(*p °F 0.05).

9% FVO(분수부 체적 점유율)에서 Ficoll을 사용하는 MMC는 hHSF^13에서콜라겐 및 콜라겐 I 증착의 총량을 향상시킵니다. 도 1A에도시된 바와 같이, hHSFs의 세포 밀도는 PVP를 이용한 대조군 및 MMC에 비해 9% 및 18% FVO에서 Ficoll으로 배양한 후 현저히 증가하였다. 도 1B, C는 Ficoll(9% FVO에서)이 다른 MMC 제형에 비해 콜라겐(콜라겐 I 포함)의 침착을 현저하게 향상시켰음을 나...

토론

이 프로토콜은 인간 절단 흉터 조직에 대한 시험관 내 모델에서 개선 된 :scar-in-a-jar"을 최적화하고 인증하는 것을 목표로합니다. 이전 연구는 인간 폐^{섬유아세포(12)}및 인간 골수 중간엽^{줄기세포(23)에}MMC 기법을 적용한 것으로 보고하였고, 인간 진피^{섬유아세포(23)는} 덱스트렌^12,Ficoll^12,및 PVP^23을 크라우드로 사용하였다. 여기에서 보고된 연구결과에서는, 비대 흉터 유래 인간 피부 섬유아세포에 대한 이전에 발표된 프로토콜은 군중으로서 Ficoll 또는 PVP로 최적화되었다.

거대 분자 군중의 선택과 농도는 동등한 결과를 산출하지 않기 때문에 중요한 매개 변수입니다. 이전 연구는 PVP40 (18% FV...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.2 &무; m 필터	Sartorius	16534
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	P36962
Alexa Fluor 680	Thermo Fisher Scientific	A-21076
Alexa Fluor 800	Thermo Fisher Scientific	A-11371
알파 평활근 액틴 (αSMA) 1차 항체	Abcam	ab5694
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler)	Thermo Fisher Scientific	4351106
Ascorbic acid	Wako	#013-12061
소 혈청 알부민	Sigma-Aldrich	#A2153
Bradford protein assay	Bio-Rad	500-0006
콜라겐 I 1차 항체(면역염색용)	Abcam	6308
콜라겐 I 1차 항체(웨스턴 블롯용)	Abcam	ab21286
콜라겐 III 1차 항체	Abcam	ab7778
콜라겐 IV 1차 항체	Abcam	ab6586
Direct Red 80	Sigma-Aldrich	2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11996-065
태아 송아지 혈청 (FCS)	Life Technologies	6000-044
Ficoll 400	GE HealthCare	#17-0300-10
Ficoll 70	GE HealthCare	#17-0310-10
GAPDH 1차 항체	Sigma-Aldrich	G8795
Goat Anti-Rabbit 2차 항체	Abcam	ab97050
Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF)	Cell Research Corporation	106, 107, 108
iScript cDNA Synthesis Kit	Bio-Rad	#1708890
MMP-1 primary antibody	Abcam	ab38929
MMP-13 primary antibody	Abcam	ab39012
MMP-2 1차 항체	Abcam	ab37150
MMP-9 1차 항체	Abcam	ab38898
NanoDrop 미량 분광 광도계	Thermo Fisher Scientific	N/A
니트로셀룰로오스 멤브레인	Bio-Rad	10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris 단백질 겔	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX
오디세이 차단 버퍼	LI-COR Biosciences	927– 40000
Odyssey Fc 이미징 시스템	LI-COR Biosciences	N/A
Olympus IX-81 HCS 현미경(면역 염색용)	Olympus	N/A
페니실린/스트렙토마이신 용액(P/S)	Life Technologies	15140-122
PrimePCR Assays	Bio-Rad		요구 사항에
따라 96웰 플레이트에 사전 코팅된 맞춤형 프라이머프로테아제 억제제 칵테일 (PIC)	Sigma-Aldrich	11697498001
PVP 360	Sigma	#PVP360
PVP 40	Sigma	#PVP40
RIPA 버퍼	Merck	R0278
RNeasy Plus Mini Kit	QIAGEN	#74134
바나	나트륨 Sigma-Aldrich	450022
Sodium vanadate	Sigma-Aldrich	450243
SpectraMax M5 다중 모드 마이크로플레이트 리더	분자 장치	N/A
SsoAdvanced 범용 SYBR 녹색 슈퍼믹스	Bio-Rad	#172-5270
트윈 20	Sigma-Aldrich	P9416