Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

في النموذج الفيترو من الإنسان التشعب التشعبي تندب باستخدام الزحام الجزيئي الكلي

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/61037
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2, 1, 1,3, 1
1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام الزحام الجزيئي الكلي لإنشاء نموذج ندبة تضخمية في المختبر يشبه في ظروف الجسم الحي. عندما تزرع في بيئة جزيئات ية كبيرة مزدحمة، الخلايا الليفية الجلد الإنسان عرض الأنماط الظاهرية، والكيمياء الحيوية، وعلم وظائف الأعضاء، وخصائص وظيفية تشبه ندبا.

Abstract

وقد ثبت أن في أنسجة الجسم الحي مزدحمة للغاية من البروتينات والأحماض النووية، والبروتينات الريبونوكليو، السكريات، الخ. البروتوكول التالي يطبق تقنية الزحام الجزيئي الكلي (MMC) لمحاكاة هذا الازدحام الفسيولوجي من خلال إضافة البوليمرات المحايدة (الزاحمة) إلى ثقافات الخلايا في المختبر. الدراسات السابقة باستخدام Ficoll أو dextran كما crowders تثبت أن التعبير عن الكولاجين الأول وfibronectin في خطوط الخلايا WI38 و WS-1 يتم تعزيزها بشكل كبير باستخدام تقنية MMC. ومع ذلك، لم يتم التحقق من صحة هذه التقنية في الخلايا الليفية البشرية المشتقة من الندبة الأولية المشتقة من الندبة (hHSFs). كما تندب تضخم ينشأ من الترسب المفرط للكولاجين, يهدف هذا البروتوكول إلى بناء الكولاجين الغنية في نموذج ندبة فرط الترو عن طريق تطبيق تقنية MMC مع hHSFs. وقد ثبت هذا النموذج الأمثل MMC لامتلاك المزيد من أوجه التشابه مع في ندبا في الجسم الحي مقارنة مع التقليدية 2 الأبعاد (2-D) أنظمة زراعة الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه فعال من حيث التكلفة، وموفر للوقت، ومرغوب فيه أخلاقيا ً مقارنة بالنماذج الحيوانية. ولذلك, النموذج الأمثل ذكرت هنا يقدم متقدمة "في الجسم الحي مثل" نموذج للدراسات ذات الصلة ندبة تضخم.

Introduction

الأنسجة ندبة يمثل نقطة النهاية لإصلاح الأنسجة. ومع ذلك ، في العديد من الأفراد ، وخاصة أولئك الذين يعانون من حروق أو صدمة1، يمكن أن تكون الندوب مفرطة وتفرض آثارًا غير مرغوب فيها على مورفولوجيا وعمل الجلد الشفاء. على الرغم من أن الآليات الدقيقة للإصابة المرضية (الندوب الضخامية والقناق) هي تشكيل ندبة غير مفهومة تماما، وقد ثبت ترسب مفرط من الكولاجين أثناء التئام الجروح لتكون مساهمة أساسية2.

ومن الثابت أن تحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-α1) وألفا العضلات الملساء actin (αSMA) تلعب أدوارا رئيسية في تشكيل ندوب تضخمي. تشير الأدلة إلى أن ارتفاع TGF-α1 يحفز مباشرة الترسب المفرط للكولاجين عن طريق تنظيم مسار إشارة SMAD3. بالإضافة إلى ذلك ، تم العثور على αSMA للمساهمة في تكوين ندبة تضخمية من خلال تنظيم تقلص الخلايا وreepithelialization في عملية التئام الجروح4. عدم وجود مناسبة في المختبر وفي نماذج على الجسم الحي هو عائق رئيسي أمام تطوير وتقييم التدخلات والعلاجات لمعالجة ندبة. والهدف من هذه الدراسة هو استخدام تقنية MMC القائمة لبناء نموذج ندبة تضخمية "تشبه الجسم الحي" مناسبة لتقييم التدخلات الجديدة والناشئة المتعلقة بالندبة.

كان استنساخ الأنسجة الحية خارج الجسم هدفًا لسنوات في المجتمع العلمي. وقد حقق تطوير التقنيات المختبرية في أوائل القرن العشرين هذا الهدف جزئياً. وقد تطورت حاليا في تقنيات المختبر قليلا من عرض رو الأصلي أن الخلايا الجنينية يمكن البقاء على قيد الحياة على قيد الحياة على سبيل الكيفو لعدة أيام في الملاخطالدافئ5. ومع ذلك ، تقتصر في المنهجيات المختبرية في الغالب على أنواع الخلايا المفردة المزروعة في 2-D ولا تُلخص الأنسجة بدقة في الجسم الحي. في حين مفيدة لفحص الكيمياء الحيوية للخلايا، وعلم وظائف الأعضاء، وعلم الوراثة، والأنسجة الأصلية هي 3-D ودمج أنواع متعددة من الخلايا. بسيطة 2-D في أنظمة المختبر تخضع خلايا الثدييات لبيئات اصطناعية للغاية حيث يتم فقدان العمارة الخاصة بالأنسجة الأصلية6. بدوره، وهذا يؤثر على الأحداث داخل الخلايا وخارج الخلية، مما أدى إلى مورفولوجيا الخلايا غير طبيعية، علم وظائف الأعضاء، والسلوك7.

يكمن الاهتمام وراء هذا البروتوكول في تطوير وإدارة السريرية للندوب الضخامية والنُكُر. في حين أنه من الثابت أن الخلايا الليفية الجلدية هي المسؤولة إلى حد كبير عن إنتاج وفيرة من الكولاجين الموجودة في الأنسجة ندبا، وزراعة الخلايا الليفية الجلدية باستخدام 2-D في النظم المختبرية فشل في استنساخ دوران الكولاجين لوحظ في الجسم الحي8. المعاصرة في أساليب المختبر لا تزال تستخدم أساسا "المالحة الدافئة"، بيئة مختلفة تماما عن تلك الموجودة في الأنسجة الحية. الأنسجة في الجسم الحي مزدحمة للغاية، مع البروتينات والأحماض النووية، والبروتينات الريبونوكليو، والسكريات، وتحتل 5٪-40٪ من الحجم الإجمالي. كما لا يوجد جزيئين يمكن أن تشغل نفس المساحة في نفس الوقت، وهناك مساحة حرة قليلة المتاحة وغياب كامل تقريبا من الماء الحر9.

تفرض تقنية MMC قيودًا تؤثر على الخصائص الحرارية للسيتوسول والسوائل الخلالية. التفاعلات الجزيئية، مستقبلات ligand إشارات المجمعات، والإنزيمات، والعضيات تقتصر على التفاعل بحرية9. كما أن التفاعلات داخل البيئة المحيطة بالخلية (أي الإنترستيوم) مقيدة أيضاً. تؤكد الأدلة الحديثة أن التركيزات العالية من الجزيئات الكلية الخاملة في حلول مزدحمة تعكر الانتشار، والارتباط المادي، واللزوجة والخصائص الهيدروديناميكية10.

ومن المثير للاهتمام، العديد من وكلاء الحشد شعبية (أي فيكول، dextran، polyvinylpyrrolidone [PVP]، والصوديوم 4-styrenesulfonate [PSS]) ليست متساوية عند تطبيقها على أنواع مختلفة من الخلايا وفي إعدادات مختلفة. في دراسة سابقة واحدة، أفيد فيكول أن تكون أقل سمية للخلايا الخلايا الجذعية mesenchymal بالمقارنة مع PVP. وقد فسرت هذه النتائج على أنها نتيجة لشحنتها المحايدة ونصف قطرها الهيدروديناميكي الصغيرنسبياً 11. في المقابل، وجدت دراسة ثانية أن dextran هو أكثر فعالية في تحفيز الكولاجين الأول ترسب من الخلايا الليفية الرئة البشرية مقارنة مع فيكول12. تشير البيانات الواردة من دراستنا الخاصة إلى أن فيكول يعزز ترسب الكولاجين بواسطة الخلايا الليفية المشتقة من الندبة الضخامية ، في حين أن PVP سام لهذه الخلايا13.

وقد ثبت أن تحويل procollagen إلى الكولاجين هو أسرع في بيئة مزدحمة للغاية في الجسم الحي14، في حين يتم تأخير معدل التفاعلات البيولوجية في نظام الثقافة المخفف 2 -D15. لقد قمنا بتحسين بروتوكول المختبر هنا ، ودمج MMC لإظهار زراعة الخلايا الليفية الجلدية بمثابة نموذج أكثر "في الجسم الحي" للتليف الجلدي وتشكيل الندبة. على النقيض من نظام الثقافة المشتركة 2-D، زراعة hHSFs مع MMC يحفز التمثيل الحيوي وترسب الكولاجين بشكل ملحوظ13. وتجدر الإشارة إلى أن الخصائص الأخرى للتليف (أي زيادة التعبير عن مصفوفة المعادن [MMPs] والسيتوكينات البرولية) واضحة أيضاً في إطار هذا البروتوكول الأمثل MMC13. عند زراعتها باستخدام هذه الطريقة ، يظهر أن الخلايا الجلدية تُلخص المعلمات الفسيولوجية والبيوكيميائية والوظيفية التي تقاس في الجسم الحي.

وقد استخدمت MMC الأمثل في بروتوكول المختبر لتقييم التعبير عن الكولاجين والبروتينات ECM الأخرى بواسطة الخلايا الليفية الجلدية معزولة عن الأدمة ندبة تضخم يفرط في التأثر والأدمة المجاورة غير المعنية. عندما تزرع في بيئات MMC في المختبر، وقد لوحظ أن hHSFs التعبير عن خصائص معينة (مثل، مرنا، الكيمياء الحيوية، علم وظائف الأعضاء، والنمط الظاهري) مماثلة لأنسجة ندبة فرط التغذية الجلدية في الجسم الحي. وتشير الأدلة إلى أن الخصائص الفيزيائية والكيميائية هي اعتبارات هامة عند اختيار الزحام وتحسين ظروف MMC للزراعة في المختبر.

لإثبات المبدأ ، يتم تطبيق بروتوكول MMC هنا لتقييم نوعي وكمي لقدرة شيكونين ونظائرها على الحث على الخلايا المبرمجة. وهذا يسمح بتقييم التطبيقات المحتملة لهذه المركبات الطبية الصينية التقليدية المشتقة بشكل طبيعي (TCM) لإدارة ندبات الجلد13. وعلى الرغم من ذلك، فإن بساطة هذا البروتوكول في المختبر وفعاليته من حيث التكلفة وحسن توقيته يفي أيضاً باللوائح الحديثة للقضاء على التجارب في الثدييات بموجب توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/EU ووكالة حماية البيئة الأمريكية( EPA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ثقافة الخلية

  1. الحفاظ على hHSFs والخلايا الليفية الجلدية العادية المستمدة من الأنسجة غير المرضية (hNSFs) في المتوسط جلبكو تعديل (DMEM) التي تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 1٪ v / v البنسلين / محلول العقديات (P / S) في 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO2/ 95٪ الهواء.
  2. شراء فيكول 70، فيكول 400، وحمض الأسكوربيك من الشركات المناسبة.

2. بناء نموذج ندبة الضخامة MMC

  1. البذور hHSFs أو hNSFs (50،000/well) في لوحة بئر 24 تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام في كل بئر.
  2. مكان في حاضنة 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 وترك بين عشية وضحاها.
  3. إعداد وسائل الإعلام MMC. استناداً إلى الحجم الإجمالي المطلوب للتجربة، وإنتاج 10٪ FCS/DMEM وسائل الإعلام عن طريق خلط فيكول 70 (18.75 ملغ / مل)، فيكول 400 (12.5 ملغ / مل)، وحمض الأسكوربيك (100 ميكرومتر).
  4. ضع الخليط في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لتفريق الحشود في المحلول ، ثم قم بتعقيم وسائط MMC باستخدام فلتر 0.2 ميكرومتر.
  5. يُستنسخ الوسائط المستهلكة واستبدلها بوسائط MMC المصنوعة حديثًا.
  6. احتضان الخلايا لمدة 6 أيام في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2،وتغيير وسائل الإعلام كل 3 أيام.

3. التعبير عن الكمية الإجمالية للكولاجين

  1. إعداد حل سيريوس الأحمر (0.1٪ ث / في). حل 0.2 غرام من مسحوق الأحمر المباشر 80 في 200 مل من الماء المقطر اللاين (ddH2O) مع 1 مل من حمض الخليك.
  2. يُستعُر الوسائط MMC وأضف 300 ميكرولتر من محلول Sirius Red إلى كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  3. شطف بلطف الحل الأحمر سيريوس مع مياه الصنبور والسماح للصفيحة لتجف الهواء بين عشية وضحاها.
  4. استخراج وصمة عار سيريوس الأحمر عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم (0.1 M) في كل بئر. ضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 5-10 دقيقة لاستخراج وصمة عار سيريوس الحمراء بالكامل.
  5. نقل 100 ميكرولتر من البقعة الحمراء سيريوس المستخرجة إلى لوحة 96 شفافة جيدا وقياس امتصاص في 620 نانومتر باستخدام قارئ microplate.

4. التعبير عن الكولاجين الأول (مناعة)

  1. غسل الآبار باستخدام 200 ميكرولتر من المالحة المخزنة مؤقتا الفوسفات (PBS، درجة الحموضة = 7.35).
  2. إصلاح الخلايا باستخدام الميثانول (500 ميكرولتر / بئر) في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  3. منع التفاعلات غير المحددة مع 3٪ من الزلّف الأبقاري للحصول على 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. يستنشق محلول الحجب ويحتضن بـ 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة للكولاجين I (10 ميكروغرام/مل) لمدة 90 دقيقة في RT.
  5. يستنشق الأجسام المضادة الأولية ويغسل 3x مع PBS لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
  6. احتضان مع 200 ميكرولتر من الماعز المضادة للأرنب-FITC الأجسام المضادة الثانوية (1:400 تخفيف) و 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 2000 تخفيف) لمدة 30 دقيقة في RT. تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم.
  7. تجاهل كل من الأجسام المضادة الثانوية وDAPI وغسل 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة لكل منهما.
  8. تصور تلطيخ الفلورسينس مباشرة تحت المجهر.

5- النشاف الغربي

  1. غسل الخلايا 2x مع برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 40 ميكرولتر من العازلة اللايس في كل بئر وكشط طبقة الخلية مع تلميح ماصة. المخزن المؤقت المحلول يحتوي على العازلة RIPA، كوكتيل مثبطات البروتياز (الموافقة المسبقة عن علم)، 2 mM فانات الصوديوم، و10 mM فلوريد الصوديوم.
  3. نقل البروتين إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وقياس تركيز البروتين باستخدام قياس البروتين وفقا لتعليمات الشركة المصنعة16.
  4. تحميل 10 ميكروغرام من البروتين من كل مجموعة في الآبار من 4٪-12٪ بيس تريس بروتين المواد الهلامية. تنفيذ كبريتات الصوديوم dodecyl polyacrylamide هلام electrophoresis (SDS-PAGE) في 200 V لمدة 30 دقيقة.
  5. نقل البروتين إلى غشاء النيتروسيللوز عن طريق تشغيل لطخة غربية في 90 V لمدة 90 دقيقة. تجنب تشكيل فقاعات الهواء بين هلام وغشاء النيتروسيلولوز.
  6. منع الغشاء مع 10 مل من حظر المخزن المؤقت.
  7. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية في 4°C بين عشية وضحاها. الأجسام المضادة الأولية هي: المضادة للكولاجين الأول، المضادة للكولاجين الثالث، المضادة للكولاجين الرابع، المضادة αSMA، المضادة MMP-1، المضادة MMP-2، المضادة MMP-9، المضادة MMP-13، ومكافحة الجلسر الديكونيد 3-الفوسفات ديهيدروجيناز (GAPDH).
  8. غسل الغشاء مع 0.1٪ TBS-Tween 20 (5x لمدة 5 دقيقة لكل منهما). TBS/Tween 20 (1 L) يحتوي على ما يلي: 50 مل من 1 M Tris (درجة الحموضة = 7.4) ، 30 مل من كلوريد الصوديوم 5 M ، 1 مل من Tween 20 ، و 920 مل من ddH2O.
  9. احتضان مع الأنواع المناسبة الأجسام المضادة الثانوية في RT لمدة 1 ساعة.
  10. كرر الخطوة 5.8 وتصور الفلورسينس باستخدام نظام التصوير.

6- RT-PCR

  1. جمع إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام المخزن المؤقت lysis مختلطة مع 2-mercaptoethanol المدرجة في طقم فحص استخراج الحمض النووي الريبي.
  2. تنقية الجيش الملكي النيبالي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة17.
  3. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الحجم الصغير.
  4. تنفيذ أول حبلا cDNA توليف باستخدام طقم توليف cDNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  5. يتم توفير أجهزة العرض الأولية RT-PCR oligonucleotide (مسبقة) في لوحات بئر مخصصة 96. مزيج 100 نانوغرام من عينات cDNA مع 10 ميكرولتر من سوبرميكس الأخضر SYBR في لوحة مخصصة.
  6. زيادة الحجم الإجمالي إلى 20 ميكرولتر/بئر باستخدام ddH2O.
  7. تشغيل RT-PCR باستخدام الدراجات الحرارية بعد تعليمات الشركة المصنعة: 40 دورات من denaturing في 98 درجة مئوية لمدة 15 s وannealing / التمديد في 60 درجة مئوية لمدة 60 s. الجينات التي تم اختبارها في RT-PCR تشمل: COL1A1، COL3A1، ACTA2، SMAD2، SMAD3، SMAD4، SMAD7، IL1A، IL1B، IL6، IL8، MMP1، MMP2، MMP3، TGFB1، وVEGF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم إجراء عينات ثلاثية في كل تجربة ، وتكررت كل تجربة 3x باستخدام خلايا من ثلاثة مرضى فرديين. يتم التعبير عن البيانات كنسب مئوية من مجموعة التحكم. تم تطبيق اختبار ANOVA وTukey في اتجاه واحد لتحليل الاختلافات الإحصائية (*p - 0.05).

MMC باستخدام Ficoll في 9٪ FVO (إشغال حجم كسور) يعزز الكمية الإجمالية من الكولاجين والكولاجين الأول ترسب في hHSF13. كما هو موضح في الشكل 1A، زادت كثافة الخلايا من hHSFs بشكل كبير بعد التبذير مع Ficoll بنسبة 9٪ و 18٪ FVO مقارنة بعنصر التحكم وMMC باستخدام PVP. يشير الشكل 1B, C إلى أن Ficoll (عند 9٪ FVO) عزز بشكل كبير ترسب الكولاجين (بما في ذلك الكولاجين I) مقارنة بتركيبات MMC الأخرى. التحليل الكمي(الشكل 1D, E)أظهرت كذلك أن فيكول (في 9% FVO) على نحو أكثر فعالية في تحسين ترسب الكولاجين.

تم العثور على hHSFs وhNSFs المزروعة في بيئات MMC لتنظيم التعبير عن أنواع ECM بالإضافة إلى الكولاجين13. وتشير البيانات الواردة في الشكل 2 إلى أنه عندما كانت تزرع الـ hHSFs وhNSFs مع MMC، زاد التعبير عن الكولاجين الرابع بشكل كبير. مصفوفة metalloproteinases (MMPs) تلعب دورا هاما خلال التئام الجروح وتشكيل ندبة، وتنظيم الجمعية ECM، وإعادة تشكيل18. MMPs تسهم أيضا في انتشار الخلايا، وهجرة الخلايا، تولد الأوعية وموت الخلايا19. وتجدر الإشارة إلى أن التعبير المرتفع عن MMPs يتراكم في أنسجة ندبة تضخمية مقارنة بالأنسجة المحلية20. ولوحظ أن التعبير عن MMP-2 و-9 و-13 كان منظماً إلى حد كبير في كل من ثقافات قوات الأمن الوطنية الأفغانية وثقافات HHSF المزروعة في بيئات MMC.

كما قمنا بالبحث عن تركيب إنترلوكين-6 (IL-6) وعامل نمو الانبوية الوعائية (VEGF)؛ ومع ذلك ، كانت هذه لا يمكن الكشف عنها في لطخة الغربية. وعلى النقيض من ذلك، كشف تحليل RT-PCR(الشكل 3)أن تعبير IL6 كان منظمًا بشكل كبير ، في حين تم تقليل تعبير VEGF في hNSFs وhHHSFs المزروعة في ظروف MMC. وقد ثبت زيادة التعبير عن IL-6 للمساهمة في تشكيل ندبة تضخم21. ومن المفارقات، كما أفيد أن تكوين الندوب الضخامية يرتبط مع تعبير مرتفع من VEGF22. وأشار تحليل RT-PCR الذي تم إجراؤه هنا إلى أن تعبير VEGF تم تخفيفه إلى حد كبير في hNSFs وhHHSFs المزروعة في ظل ظروف MMC.

وأخيرا، أظهرت النتائج على حد سواء 1) زيادة التوليفات من الكولاجين، الكولاجين الأول، الكولاجين الرابع، MMP-2، MMP-9، وMMP-13 دي نوفو و 2) زيادة التعبير عن IL6 مرنا في hHSFs وhNSFs. تشير هذه البيانات مجتمعة إلى أن زراعة hHSFs الأولية وhNSFs في تركيبات الوسائط التي تشمل نتائج MMC في الاحتفاظ بالتعبير الجيني المميز والكيمياء الحيوية والأنماط الظاهرية التي لوحظت في الأنسجة ندبة فرط التروبية الأصلية في الجسم الحي ، مما يؤدي إلى نموذج قوي "ندبة في جرة".

Figure 1
الشكل 1: MMC يعزز الكمية الإجمالية من الكولاجين والكولاجين الأول ترسب في hHSFs. (أ) مورفولوجيا الخلايا، (B) الكولاجين الكلي، ملطخة سيريوس الأحمر، (C) الكولاجين الأول التعبير، التي أظهرتها immunofluorescence، (D) التحليل الكمي للكولاجين الكلي، و (E) التحليل الكمي للكولاجين الأول ترسب. تم استزراع hHSFs في وسائل الإعلام المكملة مع Ficoll (9٪ و 18٪ FVO)، PVP40 (18٪ FVO)، أو PVP360 (54٪ و 72٪ FVO)، لمدة 6 أيام. تم اختيار الصور التمثيلية. تم تنفيذ كمية الصورة باستخدام ImageJ ويتم التعبير عنها كنسبة مئوية متوسطة لعنصر التحكم. وتكررت جميع التجارب 3x باستخدام خلايا معزولة عن ثلاثة مانحين لا علاقة لهم. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار توكي اللاحق (*p < 0.05 مقابل مجموعة التحكم ، تشير أشرطة الخطأ إلى SEM). أشرطة المقياس = (A) 0.5 مم و (B) 2 مم و (C) 0.5 مم. تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة13. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: آثار MMC على التعبير عن بروتين الخلية. تم استزراع hHSFs وhNSFs تحت ظروف MMC لمدة 6 أيام. تم إعداد الخلايا الكاملة مع عازل RIPA يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز ، فانات الصوديوم ، وفلوريد الصوديوم. تم قياس تركيز البروتين باستخدام قياس البروتين. يتم تقديم الصور التمثيلية. وللتحليل الكمي، تم قياس كثافة نطاقات البروتين الفردية بقياس الكثافة، وتطبيعها إلى GAPDH، وتحويلها إلى نسبة مئوية من hNSF في المتوسط العادي باستخدام برنامج ImageJ. أجريت جميع التجارب 3x باستخدام خلايا من ثلاثة متبرعين لا علاقة لهم. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار توكي اللاحق (*p < 0.05 ، تشير أشرطة الخطأ إلى SEM). تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة13. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: آثار MMC على التعبير الجيني للخلايا. تم زراعة hHSFs وhNSFs في ظل ظروف MMC لمدة 6 أيام. تم حصاد مجموع الحمض النووي الريبي باستخدام عدة فحص ، وأول خيوط cDNA تم تصنيعها باستخدام طقم توليف cDNA. تم تطبيع التعبير الجيني المستهدف إلى GAPDH وتحويله إلى النسبة المئوية لـ hNSF في الوسط العادي. وتكررت جميع التجارب 3x باستخدام خلايا من ثلاثة مانحين لا علاقة لهم. تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA في اتجاه واحد مع اختبار توكي اللاحق (*p < 0.05 ، تشير أشرطة الخطأ إلى SEM). تم تعديل هذا الرقم من دراسة سابقة13. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يهدف هذا البروتوكول إلى تحسين وتوثيق الندبة في جرة محسنة" في نموذج المختبر للأنسجة الندبة الجلدية البشرية. وقد ذكرت الدراسات السابقة تطبيق تقنية MMC على الخلايا الليفية الرئة البشرية12,الخلايا الجذعية نخاع العظم البشري mesenchymal23,والخلايا الليفية الجلد الإنسان23 باستخدام dextran12,فيكول12,وPVP23 كما crowders. في الدراسة التي ذكرت هنا ، تم تحسين البروتوكول المنشور سابقًا للخلايا الليفية البشرية المشتقة من الندبة الضخامية مع Ficoll أو PVP كcrowders.

اختيار وتركيز الزحمة الجزيئية الماكروهية هي المعلمات الحاسمة، لأنها لا تسفر عن نتائج مماثلة. وقد ذكرت دراسة سابقة أن PVP40 (18٪ FVO) و PVP360 (54٪ FVO) تعزيز ترسب الكولاجين وانتشار الخلايا في الخلايا الليفية الجلدية23 (آثار PVP في FVOs > 54٪ غير مجربة). ومع ذلك، لا يعمل هذان الشرطان بشكل متسق لـ hHSFs باستخدام هذا البروتوكول.

كما هو مبين في الشكل 1, Ficoll يعزز بشكل كبير الكولاجين الأول الترسيب بالمقارنة مع عنصر التحكم, في حين PVP ليس له آثار كبيرة. Ficoll في 9٪ FVO يزيد بشكل كبير من إجمالي كمية الكولاجين ونوع الكولاجين الأول مقارنة مع Ficoll في 18٪ FVO. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الأهمية بمكان لاستخدام خلايا مرور منخفضة، والخلايا الليفية الجلدية الأولية لها عمر محدود في الثقافة24. تم اختياره لاستخدام hHSFs معزولة حديثا فقط للاحتفاظ في النمط الظاهري في الجسم الحي. بعد زراعة طويلة، hHSFs الأولية تظهر مورفولوجيا غير عادية والاستجابات الوظيفية غير نمطية. ومن المستحسن أيضا أن يتم استكمال المتوسطة MMC مع حمض الأسكوربيك, محفز رئيسي من تخليق الكولاجين في hHSF25. وعلاوة على ذلك، يقترح باحثون آخرون استخدام نفس الأجسام المضادة المدرجة في جدول المواد للدراسات المتعلقة بـ HHSF؛ ومع ذلك، يجب التحقق من صحة الأجسام المضادة إذا تطبيق هذا البروتوكول على أنواع الخلايا الأخرى.

كما ورد في النتائج التمثيلية، تم العثور على إدراج الزحمة الجزيئية الكبيرة لتحفيز التعبير عن الكولاجين (أي الكولاجين الأول، الكولاجين الرابع، MMPs، وIL6) في hHSFs بالمقارنة مع hHSFs التي تم زراعتها باستخدام الظروف الكلاسيكية غير MMC. ويقال إن النموذج الأمثل MMC يحتفظ جوانب من hHSFs 'في النمط الظاهري في الجسم الحي, خلاصة مورفولوجيا مميزة, الكيمياء الحيوية, علم وظائف الأعضاء, ومصفوفة خارج الخلية وفيرة من الأنسجة ندبا الجلد في الجسم الحي (على النقيض من النهج القائمة الثقافة 2-D). نحن لسنا قادرين على تحديد أي نموذج مماثل في المختبر قادر على تلخيص خصائص مماثلة "في الجسم الحي". بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الموجودة ، فإن بروتوكول MMC هذا أسرع وأكثر سهولة في الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة وفعالة من حيث الوقت. أنشأت Cuttle وآخرون نموذج ندبة تضخمية بورسين باستخدام الإصابة الحرارية، والتي يبدو أن لها خصائص مماثلة لتلك التي من الندوب الضخامية البشرية26. ومع ذلك ، بالإضافة إلى التكاليف والوقت اللازم للحفاظ على الحيوانات ، تتطلب التجربة أكثر من 3 أشهر لإكمال26. يتطلب هذا النموذج الأمثل MMC حوالي أسبوع واحد من التحضير قبل الاستعداد للاستخدام.

يقدم البروتوكول نموذجًا متقدمًا في المختبر لفحص العلاجات الجديدة المضادة للندبات. وقد استخدم نموذج MMC لتقييم شيكونين, جزيء ذكرت سابقا لمنع تشكيل دي نوفو من الندوب, لإصلاح الندوب الناضجة تضخم27,,28. إن التقييم المماثل للمركبات والتدخلات الجديدة باستخدام النُهج الكلاسيكية لاكتشاف المخدرات وإثبات المفهوم سوف يتطلب موارد وأموالاً ووقتاً كبيراً. تطلبت هذه الدراسة الحد الأدنى من التمويل ويمكن الانتهاء منها في غضون عدة أشهر. البروتوكول مرن وقابل للتكيف بسهولة للتطبيقات في تطوير وتقييم علاجات ندبة تضخمية جديدة قبل الدراسات الحيوانية.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل هذا البروتوكول لتطوير المزيد من الخصائص "في الجسم الحي". على سبيل المثال ، وجود أكثر وفرة TGF -α1 هو نتيجة متسقة في أنسجة ندبة تضخمي ، والتطفل تشكيل ندبة عن طريق تحفيز تخليق الكولاجين وترسب28. TGF-α1 يمكن دمجها بسهولة في بروتوكول MMC ومواصلة تحسين تلخيص في علم الأمراض الحي. لم نستكشف بعد الإمكانات الكاملة للنموذج ، والتي قد تكون مفيدة للأمراض الأخرى المتعلقة بالكولاجين وECM (أي تصلب الجلد ، التليف الرئوي ، التليف الإنروميوكاريل ، إلخ). وعلاوة على ذلك، سيكون من المثير للاهتمام ملاحظة آثار MMC على الخلايا على مدى فترة ثقافية أطول، مثل 2 أو 3 أسابيع. ومن المفيد أيضا لمواصلة تقييم آثار MMC على الخلية وECM الهندسة المعمارية الهرمية والمحاذاة، ولا سيما اتجاه الكولاجين، وهذه التوصيفات ضرورية لتشكيل الأنسجة ندبة في الجسم الحي.

أحد القيود الرئيسية لهذا البروتوكول هو تقييد أنواع الخلايا. تشكيل ندبة تضخم ينطوي على مشاركة مجموعات مختلفة من الخلايا، والتفاعلات بين أنواع الخلايا المختلفة يلعب دورا أساسيا في تشكيل ندبة. على سبيل المثال، تلعب الكرياتينوcytes أيضا دورا هاما في شفاء الجروح الجلدية وتشكيل ندبة29. إن دمج مجموعات خلايا إضافية في هذا النموذج سيحسن أهميته بشكل كبير في الأبحاث المستقبلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد تضارب في المصالح بين أصحاب البلاغ.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل بتمويل من وكالة سنغافورة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث "SPF 2013/004: بحوث بيولوجيا الجلد الأساسية" و "ابتكار رعاية الجروح للمناطق المدارية" IAF-PP/2017 H17/01/a0/009. ويعرب المؤلفان عن امتنانهما للمشورة والمساعدة المقدمة من الدكتورة بولا بيني والدكتور مايكل راغوناث.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 μm filter Sartorius 16534
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific P36962
Alexa Fluor 680 Thermo Fisher Scientific A-21076
Alexa Fluor 800 Thermo Fisher Scientific A-11371
alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody Abcam ab5694
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) Thermo Fisher Scientific 4351106
Ascorbic acid Wako #013-12061
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich #A2153
Bradford protein assay Bio-Rad 500-0006
Collagen I primary antibody (for immunostaining) Abcam 6308
Collagen I primary antibody (for western blot) Abcam ab21286
Collagen III primary antibody Abcam ab7778
Collagen IV primary antibody Abcam ab6586
Direct Red 80 Sigma-Aldrich 2610108
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Life Technologies 11996-065
Fetal calf serum (FCS) Life Technologies 6000-044
Ficoll 400 GE HealthCare #17-0300-10
Ficoll 70 GE HealthCare #17-0310-10
GAPDH primary antibody Sigma-Aldrich G8795
Goat Anti-Rabbit secondary antibody Abcam ab97050
Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) Cell Research Corporation 106, 107, 108
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad #1708890
MMP-1 primary antibody Abcam ab38929
MMP-13 primary antibody Abcam ab39012
MMP-2 primary antibody Abcam ab37150
MMP-9 primary antibody Abcam ab38898
NanoDrop Microvolume Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific N/A
Nitrocellulose membrane Bio-Rad 10484060
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NP0321BOX
Odyssey blocking buffer LI-COR Biosciences 927–40000
Odyssey Fc Imaging System LI-COR Biosciences N/A
Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) Olympus N/A
Penicillin/streptomycin solution (P/S) Life Technologies 15140-122
PrimePCR Assays Bio-Rad Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement
Protease inhibitor cocktail (PIC) Sigma-Aldrich 11697498001
PVP 360 Sigma #PVP360
PVP 40 Sigma #PVP40
RIPA buffer Merck R0278
RNeasy Plus Mini Kit QIAGEN #74134
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 450022
Sodium vanadate Sigma-Aldrich 450243
SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader Molecular Devices N/A
SsoAdvanced universal SYBR green supermix Bio-Rad #172-5270
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
  2. Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
  3. Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
  4. Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
  5. Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  7. Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
  8. Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
  9. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  10. Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
  11. Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
  12. Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
  13. Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
  14. Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
  15. Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
  16. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010).
  17. Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
  18. Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
  19. Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
  20. Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
  21. Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
  22. Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
  23. Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
  24. Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
  25. Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
  26. Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
  27. Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
  28. Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
  29. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 159، ندبة تضخمية، الخلايا الليفية، الازدحام الجزيئي الكلي، الكولاجين، مصفوفة خارج الخلية، متوسطة الانحدار الكثافة، البولي فينيلبيريرولدون
في النموذج الفيترو من الإنسان التشعب التشعبي تندب باستخدام الزحام الجزيئي الكلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fan, C., Lim, L. K. P., Wu, Z.,… More

Fan, C., Lim, L. K. P., Wu, Z., Sharma, B., Gan, S. Q., Liang, K., Upton, Z., Leavesley, D. In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding. J. Vis. Exp. (159), e61037, doi:10.3791/61037 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter