Summary
Este protocolo descreve o uso de aglomeração macromolecular para criar um modelo de tecido de cicatrizes hipertróficas hipertróficas in vitro humano que se assemelha a condições in vivo. Quando cultivados em um ambiente macromolecular lotado, os fibroblastos da pele humana exibem fenótipos, bioquímica, fisiologia e características funcionais semelhantes ao tecido cicatricial.
Abstract
Foi demonstrado que os tecidos in vivo são altamente lotados por proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas, polissacarídeos, etc. O protocolo a seguir aplica uma técnica de aglomeração macromolecular (MMC) para imitar essa aglomeração fisiológica através da adição de polímeros neutros (crowders) às culturas celulares in vitro. Estudos anteriores usando Ficoll ou dextran como crowders demonstram que a expressão de colágeno I e fibronectina em linhas celulares WI38 e WS-1 são significativamente melhoradas usando a técnica MMC. No entanto, essa técnica não foi validada em fibroblastos de pele humana derivados de cicatrizes hipertróficas primárias (hHSFs). Como a cicatriz hipertrófica surge da deposição excessiva de colágeno, este protocolo visa construir um modelo de cicatriz hipertrófica in vitro rico em colágeno, aplicando a técnica mmc com hHSFs. Este modelo otimizado de MMC tem mostrado possuir mais semelhanças com o tecido in vivo cicatriz em comparação com os sistemas tradicionais de cultura celular bidimensional (2-D). Além disso, é econômico, econômico e eticamente desejável em comparação com modelos animais. Portanto, o modelo otimizado aqui relatado oferece um modelo avançado "in vivo" para estudos hipertróficos relacionados à cicatriz.
Introduction
O tecido cicatricial representa o ponto final da reparação tecidual. No entanto, em muitos indivíduos, especialmente aqueles que sofrem de queimaduras outraumas 1, cicatrizes podem ser excessivas e impor efeitos indesejáveis sobre a morfologia e o funcionamento da pele curada. Embora os mecanismos exatos da formação de cicatrizes patológicas (hipertróficas e quelóides) não sejam totalmente compreendidos, a deposição excessiva de colágeno durante a cicatrização de feridas tem sido demonstrada como uma contribuição essencial2.
Está bem estabelecido que a transformação do fator de crescimento beta 1 (TGF-β1) e a actina muscular alfa lisa (αSMA) desempenham papéis-chave na formação de cicatrizes hipertróficas. As evidências sugerem que o TGF-β1 elevado estimula diretamente a deposição excessiva de colágeno através da regulação da via de sinalização SMAD3. Além disso, verificou-se que αSMA contribui para a formação de cicatrizes hipertróficas, regulando a contração celular e a reepitelalização no processo de cicatrização da ferida4. A falta de modelos in vitro e in vivo adequados é um grande impedimento para o desenvolvimento e avaliação de intervenções e terapias para remediação de cicatrizes. O objetivo deste estudo é utilizar a técnica existente de MMC para construir um modelo de cicatriz hipertrófica "in vivo" adequado para avaliar intervenções novas e emergentes relacionadas à cicatriz.
Reproduzir tecido vivo fora do corpo tem sido uma meta há anos na comunidade científica. O desenvolvimento de técnicas in vitro no início do século XX atingiu parcialmente esse objetivo. As técnicas in vitro atuais evoluíram ligeiramente da demonstração original de Roux de que as células embrionárias podem sobreviver ex vivo por vários dias em soro quente5. No entanto, as metodologias in vitro são limitadas principalmente a tipos de células únicas cultivadas em 2-D e não recapitularem tecidos in vivo com precisão. Embora úteis para examinar a bioquímica celular, fisiologia e genética, os tecidos nativos são 3D e incorporam vários tipos de células. Sistemas in vitro simples 2-D submetem células mamíferas a ambientes altamente artificiais nos quais a arquitetura nativa específica do tecido é perdida6. Por sua vez, isso afeta eventos intracelulares e extracelulares, resultando em morfologia celular anormal, fisiologia e comportamento7.
O interesse por trás desse protocolo está no desenvolvimento e manejo clínico de cicatrizes hipertróficas e quelóides. Embora esteja bem estabelecido que os fibroblastos dérmicos são em grande parte responsáveis pela produção abundante de colágenos presentes no tecido cicatricial, o cultivo de fibroblastos dérmicos utilizando sistemas in vitro 2-D não consegue reproduzir o volume de negócios de colágeno observado in vivo8. Métodos in vitro contemporâneos ainda usam essencialmente "soro fisiológico quente", um ambiente completamente diferente daquele dos tecidos vivos. Os tecidos in vivo são extremamente aglomerados, com proteínas, ácidos nucleicos, ribonucleoproteínas e polissacarídeos, ocupando 5%-40% do volume total. Como nenhuma molécula pode ocupar o mesmo espaço ao mesmo tempo, há pouco espaço livre disponível e uma ausência quase completa de água livre9.
A técnica mmc impõe restrições que afetam as propriedades termodinâmicas de citostes e fluidos intersticiais. Interações moleculares, complexos de sinalização receptor-ligantes, enzimas e organelas estão confinadas e restritas de interagir livremente9. As interações dentro do ambiente pericelular (ou seja, interstício) também são restritas. Evidências recentes confirmam que altas concentrações de macromoléculas inertes em soluções lotadas perturbam a difusão, associação física, viscosidade e propriedades hidrodinâmicas10.
Curiosamente, vários agentes populares de aglomeração (ou seja, Ficoll, dextran, polivinilpirrorolido [PVP], e sódio 4-estirenosulfonato [PSS]) não são equivalentes quando aplicados a diferentes tipos de células e em diferentes configurações. Em um estudo anterior, Ficoll foi relatado como menos citotóxico para células-tronco mesenquimais em comparação com PVP. Esses resultados foram interpretados como conseqüência de sua carga neutra e do raio hidrodinâmico relativamente pequeno11. Em contraste, um segundo estudo descobriu que dextran é mais eficaz em estimular a deposição de colágeno I por fibroblastos pulmonares humanos em comparação com Ficoll12. Dados de nosso próprio estudo sugerem que Ficoll aumenta a deposição de colágeno por fibroblastos hipertróficos derivados de cicatrizes, enquanto pvp é tóxico para essas células13.
Foi demonstrado que a conversão de procolágeno para colágeno é mais rápida em um ambiente in vivo altamente lotado14, enquanto a taxa de reações biológicas é retardada em um sistema de cultura 2D diluído15. Otimizamos o protocolo in vitro aqui, incorporando o MMC para mostrar o cultivo de fibroblastos dérmicos servindo como um modelo mais "in vivo" para fibrose dérmica e formação de cicatrizes. Em contraste com o sistema de cultura 2D comum, cultivar hHSFs com MMC estimula significativamente a biossíntese e a deposição do colágeno13. Notavelmente, outras características da fibrose (ou seja, aumento da expressão das metaloproteinases matriciais [MMPs] e citocinas proinflamatórias) também são evidentes sob este protocolo otimizado de McMc13. Quando cultivadas usando este método, mostra-se que as células dérmicas recapitulam os parâmetros fisiológicos, bioquímicos e funcionais medidos in vivo.
O protocolo in vitro otimizado do MMC tem sido utilizado para avaliar a expressão de colágeno e outras proteínas de ECM por fibroblastos dérmicos isolados da derme de cicatriz hipertrófica e derme adjacente não envolvido. Quando cultivados em ambientes de MMC in vitro, observou-se que os HHSFs expressam certas características (ou seja, mRNA, bioquímica, fisiologia e fenótipo) semelhantes ao tecido cicatrizhipertrófico dérmico in vivo. As evidências indicam que propriedades físicas e químicas são considerações importantes ao selecionar crowders e otimizar as condições de MMC para cultivo in vitro.
Para a prova de princípio, o protocolo MMC é aplicado aqui para avaliar qualitativamente e quantitativamente a capacidade de Shikonin e seus análogos para induzir a apoptose. Isso permite avaliar as aplicações potenciais desses compostos de Medicina Tradicional Chinesa (TCM) naturalmente derivados para o gerenciamento de cicatrizes dérmicas13. Não obstante, a simplicidade, a eficácia e a pontualidade deste protocolo In vitro MMC também satisfaz regulamentos recentes para eliminar a experimentação em mamíferos pela Diretiva DA UE 2010/63/UE e pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA).
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Protocol
1. Cultura celular
- Manter hHSFs e fibroblastos dérmicos normais derivados de tecido não patológico (hNSFs) no meio de Águia modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro de bezerro fetal (FCS) e 1% v/v solução de penicilina/estreptomicina (P/S) a 37°C em uma incubadora com 5% de CO2/95% de ar.
- Compre Ficoll 70, Ficoll 400, e ácido ascórbico das empresas apropriadas.
2. Construção do modelo de cicatriz hipertrófica MMC
- Semeie os hHSFs ou hNSFs (50.000/well) em uma placa de 24 poços contendo 1 mL de mídia em cada poço.
- Coloque em uma incubadora de 37°C a 5% de CO2 e deixe durante a noite.
- Prepare a mídia da MMC. Com base no volume total necessário para o experimento, produza 10% de mídia FCS/DMEM misturando Ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) e ácido ascórbico (100 μM).
- Coloque a mistura em um banho de água de 37°C por 1 h para dispersar os aglomeradores na solução e, em seguida, esterilize a mídia MMC usando um filtro de 0,2 μm.
- Apirate a mídia gasta e substitua com a mídia Recém-Feita MMC.
- Incubar as células durante 6 dias a 37°C e 5% CO2,mudando a mídia a cada 3 dias.
3. Expressão da quantidade total de colágeno
- Prepare a solução vermelha Sirius (0,1% c/v). Dissolver 0,2 g de vermelho direto 80 em pó em 200 mL de água destilada deionizada (ddH2O) com 1 mL de ácido acético.
- Apirate a mídia MMC e adicione 300 μL de solução Sirius Red em cada poço. Incubar a 37 °C por 90 min.
- Enxágüe suavemente a solução Sirius Red com água da torneira e deixe a placa secar ao ar durante a noite.
- Extrair a mancha vermelha sirius adicionando 200 μL de hidróxido de sódio (0,1 M) em cada poço. Coloque a placa em um agitador orbital por 5-10 min para extrair totalmente a mancha vermelha sirius.
- Transfira 100 μL da mancha vermelha sirius extraída em uma placa 96 bem transparente e meça a absorvância a 620 nm usando um leitor de microplaca.
4. Expressão de colágeno I (imunocoloração)
- Lave os poços utilizando 200 μL de solução salina tamponada por fosfato (PBS, pH = 7,35).
- Fixar as células usando metanol (500 μL/poço) a 4 °C por 10 min.
- Bloqueie interações não específicas com albumina de soro bovino de 3% por 30 min à temperatura ambiente (RT).
- Apiratee a solução de bloqueio e incubacom 200 μL de anticorpo anti-colágeno I (10 μg/mL) por 90 min no RT.
- Apiratee o anticorpo primário e lave 3x com PBS por 5 min cada.
- Incubar com 200 μL de anticorpo secundário anti-coelho-FITC de cabra (1:400 diluição) e 4',6-diamidino-2-fenilindole (DAPI; 1: 2000 diluição) por 30 min em RT. Cubra a placa com papel alumínio.
- Descarte o anticorpo secundário e o DAPI e lave 3x com PBS por 5 min cada.
- Visualize a coloração de fluorescência diretamente sob um microscópio.
5. Mancha ocidental
- Lave as células 2x com PBS.
- Adicione 40 μL de tampão de lyse em cada poço e raspe a camada celular com uma ponta de pipeta. O tampão de lyse contém tampão RIPA, coquetel inibidor de protease (PIC), vanadate de sódio de 2 mM e flúor de sódio de 10 mM.
- Transfira o lysato de proteína em tubos de microcentrífuga e meça a concentração de proteínas usando um ensaio proteico de acordo com as instruções do fabricante16.
- Carregue 10 μg de proteína de cada grupo nos poços de 4%-12% de géis protéicos Bis-Tris. Realize a eletroforese dodecil sulfato de poliacrilamida em gel (SDS-PAGE) a 200 V por 30 min.
- Transfira a proteína para a membrana de nitrocelulose executando uma mancha ocidental a 90 V por 90 min. Evite a formação de bolhas de ar entre o gel e a membrana de nitrocelulose.
- Bloqueie a membrana com 10 mL de tampão de bloqueio.
- Incubar com anticorpos primários a 4°C durante a noite. Os anticorpos primários são: anti-colágeno I, anti-colágeno III, anti-colágeno IV, anti-αSMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13 e anti-glicerldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH).
- Lave a membrana com 0,1% TBS-Tween 20 (5x para 5 min cada). TBS/Tween 20 (1 L) contém os seguintes: 50 mL de 1 M Tris (pH = 7,4), 30 mL de 5 M cloreto de sódio, 1 mL de Tween 20 e 920 mL de ddH2O.
- Incubar com uma espécie de anticorpo secundário apropriado em RT por 1h.
- Repita o passo 5.8 e visualize a fluorescência usando um sistema de imagem.
6. RT-PCR
- Coletar o RNA total utilizando o tampão de lysis misturado com 2-mercaptoetanol incluído no kit de ensaio de extração de RNA.
- Purifique o RNA de acordo com as instruções do fabricante17.
- Meça a concentração de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume.
- Execute a primeira síntese de CDNA da cadeia usando um kit de síntese de CDNA de acordo com as instruções do fabricante.
- Os primers de oligonucleotídeos RT-PCR são fornecidos (pré-revestidos) em placas de poço personalizadas de 96. Misture 100 ng das amostras de cDNA com 10 μL de supermix verde SYBR na placa personalizada.
- Aumente o volume total para 20 μL/poço usando ddH2O.
- Execute RT-PCR usando um ciclotérmico seguindo as instruções do fabricante: 40 ciclos de desnaturação a 98°C para 15 s e recozimento/extensão a 60 °C para 60 s. Os genes testados no RT-PCR incluem: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1 e VEGF.
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Representative Results
Amostras triplicadas foram realizadas em cada experimento, e cada experimento foi repetido 3x usando células de três pacientes individuais. Os dados são expressos como percentuais do grupo controle. O teste pós-hoc de ANOVA e Tukey foi aplicado para analisar diferenças estatísticas (*p. 0,05).
O MMC utilizando Ficoll a 9% FVO (ocupação de volume fracionado) aumenta a quantidade total de colágeno e colágeno I deposição em hHSF13. Conforme ilustrado na Figura 1A,a densidade celular dos hHSFs aumentou significativamente após a cultura com Ficoll em 9% e 18% de FVO em comparação com o controle e MMC usando PVP. A Figura 1B,C indica que Ficoll (a 9% FVO) melhorou significativamente a deposição de colágeno (incluindo colágeno I) em comparação com outras formulações de MMC. A análise quantitativa (Figura 1D,E) demonstrou ainda que Ficoll (a 9% FVO) melhorou mais efetivamente a deposição do colágeno.
os hHSFs e hNSFs cultivados em ambientes MMC foram encontrados para regular a expressão das espécies de ECM, além do colágeno13. Os dados relatados na Figura 2 indicam que quando os hHSFs e os hNSFs foram cultivados com MMC, a expressão do colágeno IV também aumentou significativamente. As metaloproteinases matriciais (MMPs) desempenham um papel importante durante a cicatrização de feridas e a formação de cicatrizes, regulando a montagem do ECM e remodelando18. Os MMPs também contribuem para a proliferação celular, migração celular, angiogênese e apoptose19. Notavelmente, verificou-se que uma expressão elevada de MmPs se acumulava em tecidos cicatrizados hipertróficos em comparação com tecidos nativos20. Observou-se que a expressão de MMP-2, -9 e -13 foi significativamente regulada tanto nas culturas hNSF quanto hHSF cultivadas em ambientes de MMC.
Também foram sondados para a síntese de interleucina-6 (IL-6) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); no entanto, estes eram indetectáveis em uma mancha ocidental. Em contrapartida, a análise RT-PCR (Figura 3) revelou que a expressão de IL6 foi significativamente regulada, enquanto a expressão do VEGF foi desregulada em hNSFs e hHSFs cultivados em condições de MMC. Demonstrou-se um aumento da expressão do IL-6 para contribuir para a formação de cicatrizes hipertróficas21. Paradoxalmente, também é relatado que a formação de cicatrizes hipertróficas está associada a uma expressão elevada de VEGF22. A análise RT-PCR aqui realizada indicou que a expressão do VEGF foi muito atenuada em hNSFs e hHSFs cultivados em condições de MMC.
Por fim, os resultados demonstraram ambos 1) aumento das sinestes de colágenos, colágeno I, colágeno IV, MMP-2, MMP-9 e MMP-13 de novo e 2) aumento da expressão de IL6 mRNA em hHSFs e hNSFs. Juntos, esses dados indicam que o cultivo de hHSFs primários e hNSFs em formulações de mídia que incluem resultados de McM na retenção da expressão genética característica, bioquímica e fenótipos observados no tecido cicatriz hipertrófico nativo in vivo, levando a um modelo robusto de "cicatriz-em-um-jar".
Figura 1: O MMC aumenta a quantidade total de colágeno e colágeno I deposição em hHSFs. (A) Morfologia celular, (B) colágenos totais, manchados com Sirius Red, (C) expressão de colágeno I, demonstradas pela imunofluorescência, (D) análise quantitativa do colágeno total e (E) análise quantitativa da deposição de colágeno I. os hHSFs foram cultivados em mídia complementada com Ficoll (9% e 18% FVO), PVP40 (18% FVO) ou PVP360 (54% e 72% FVO), durante 6 dias. Foram selecionadas imagens representativas. A quantificação da imagem foi realizada utilizando-se imageJ e é expressa como a porcentagem média do controle. Todos os experimentos foram repetidos 3x usando células isoladas de três doadores não relacionados. A análise estatística foi realizada utilizando-se a ANOVA unidirecional com o pós-teste de Tukey (*p < 0,05 vs. grupo de controle, barras de erro indicam SEM). Barras de escala = (A) 0,5 mm, (B) 2 mm e (C) 0,5 mm. Este número foi modificado de um estudo anterior13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Efeitos do MMC na expressão da proteína celular. hHSFs e hNSFs foram cultivados em condições de MMC por 6 dias. Foram preparados lysates celulares inteiros com tampão RIPA contendo coquetel inibidor de protease, vanadato de sódio e flúor de sódio. A concentração proteica foi medida pelo ensaio proteico. Imagens representativas são apresentadas. Para análise quantitativa, as intensidades das bandas proteicas individuais foram medidas com densitometria, normalizadas para GAPDH, e convertidas em percentual do hNSF em meio normal usando o software ImageJ. Todos os experimentos foram realizados 3x utilizando células de três doadores não relacionados. A análise estatística foi realizada utilizando-se a ANOVA unidirecional com o pós-teste de Tukey (*p < 0,05, as barras de erro indicam SEM). Este número foi modificado de um estudo anterior13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Efeitos do MMC na expressão genética celular. hHSFs e hNSFs foram cultivados em condições de MMC por 6 dias. O RNA total foi colhido usando um kit de ensaio, e o cDNA da primeira vertente foi sintetizado usando o kit de síntese de CDNA. A expressão genética alvo foi normalizada para GAPDH e convertida para a porcentagem do hNSF em meio normal. Todos os experimentos foram repetidos 3x usando células de três doadores não relacionados. A análise estatística foi realizada utilizando-se a ANOVA unidirecional com o pós-teste de Tukey (*p < 0,05, as barras de erro indicam SEM). Este número foi modificado de um estudo anterior13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo visa otimizar e autenticar um modelo in vitro melhorado de "cicatriz-em-um-frasco" para tecido cicatrizado humano. Estudos anteriores relataram a aplicação da técnica MMC aos fibroblastos pulmonares humanos12, células-tronco mesenquimais de medula óssea humana23, e fibroblastos dérmicos humanos23 usando dextran12, Ficoll12, e PVP23 como crowders. No estudo aqui relatado, o protocolo publicado anteriormente para fibroblastos de pele humana derivados de cicatrizes hipertróficas foi otimizado com Ficoll ou PVP como crowders.
A seleção e a concentração de aglomeradores macromoleculares são parâmetros críticos, pois não produzem resultados equivalentes. Um estudo anterior relatou que PVP40 (18% FVO) e PVP360 (54% FVO) melhoram significativamente a deposição de colágeno e a proliferação celular em fibroblastos dérmicos23 (efeitos de PVP em FVOs >54% não são testados). No entanto, essas duas condições não funcionam consistentemente para hHSFs usando este protocolo.
Como mostrado na Figura 1,Ficoll melhora significativamente a deposição de colágeno I em comparação com o controle, enquanto pvp não tem efeitos significativos. Ficoll em 9% FVO aumenta significativamente a quantidade total de colágeno e colágeno tipo I em comparação com Ficoll em 18% FVO. Além disso, é fundamental usar células de baixa passagem, pois os fibroblastos dérmicos primários têm uma vida útil limitada na cultura24. Optou-se por utilizar apenas hHSFs recém-isolados para reter o fenótipo in vivo. Após o cultivo prolongado, os hHSFs primários apresentam morfologia incomum e respostas funcionais atípicas. Recomenda-se também que o meio MMC seja suplementado com ácido ascórbico, um indutor chave da síntese de colágeno em hHSF25. Além disso, sugere-se que outros pesquisadores utilizem os mesmos anticorpos listados na Tabela de Materiais para estudos relacionados ao HHSF; no entanto, os anticorpos precisam ser validados se aplicar este protocolo a outros tipos de células.
Conforme relatado nos resultados representativos, verificou-se a inclusão de aglomeradores macromoleculares para estimular a expressão de colágeno (ou seja, colágeno I, colágeno IV, MMPs e IL6) em hHSFs quando comparados aos HHSFs que foram cultivados utilizando condições clássicas não-MMC. Argumenta-se que o modelo otimizado de MMC retém aspectos do fenótipo in vivo dos HHSFs, recapitulando sua morfologia característica, bioquímica, fisiologia e matriz extracelular abundante de tecido cicatricial cutâneo in vivo (em contraste com as abordagens de cultura 2D existentes). Não somos capazes de identificar qualquer modelo in vitro similar que seja capaz de recapitular propriedades semelhantes "in vivo-like". Quando comparado aos modelos animais existentes, este protocolo MMC é mais rápido, bem como mais fácil de usar, econômico e econômico. Cuttle et al. estabeleceram um modelo de cicatriz hipertrófica porcina usando lesão térmica, que parece ter características semelhantes às das cicatrizes hipertróficas humanas26. No entanto, além dos custos e tempo necessários para a manutenção dos animais, o experimento requer mais de 3 meses para completar26. Este modelo MMC otimizado requer cerca de 1 semana de preparação antes de pronto para uso.
O protocolo oferece um modelo in vitro avançado para o exame de novas terapias anti-cicatrizes. O modelo MMC tem sido utilizado para avaliar a Shikonin, molécula previamente relatada para inibir a formação de cicatrizes de novo, para remediação de cicatrizes hipertróficas maduras27,28. Avaliação semelhante de novos compostos e intervenções usando abordagens clássicas para a descoberta de drogas e prova de conceito exigiria recursos, fundos e tempo consideráveis. Este estudo exigiu finanças mínimas e pode ser concluído dentro de vários meses. O protocolo é flexível e facilmente adaptável para aplicações no desenvolvimento e avaliação de novos tratamentos de cicatrizes hipertróficas antes de estudos em animais.
Além disso, este protocolo pode ser ainda modificado para desenvolver mais propriedades "in vivo". Por exemplo, a presença de TGF-β1 superabundante é um achado consistente em tecidos cicatrizados hipertróficos, mediando a formação de cicatrizes estimulando a síntese e a deposição do colágeno28. TGF-β1 poderia ser facilmente incorporado ao protocolo MMC e melhorar ainda mais a recapitulação da patologia in vivo. Ainda não exploramos todo o potencial do modelo, o que pode ser útil para outras patologias relacionadas ao colágeno e ECM (ou seja, esclerodermia, fibrose pulmonar, fibrose endomiocárdica, etc. Além disso, seria interessante observar os efeitos do MMC nas células durante um período de cultura mais longo, como 2 ou 3 semanas. Também vale a pena avaliar ainda mais os efeitos do MMC na arquitetura e alinhamento hierárquico do MMC, particularmente na orientação do colágeno, pois essas caracterizações são essenciais para a formação de tecido cicatricial in vivo.
Uma das principais limitações deste protocolo é a restrição dos tipos celulares. A formação de cicatrizes hipertróficas envolve a participação de várias populações celulares, e as interações entre diferentes tipos de células desempenham um papel essencial na formação de cicatrizes. Por exemplo, os queratinócitos também desempenham um papel importante na cicatrização cutânea da ferida e na formação da cicatriz29. A incorporação de populações celulares adicionais nesse modelo melhorará muito sua significância em pesquisas futuras.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa de Cingapura "SPF 2013/004: Pesquisa Básica em Biologia da Pele" e do "Wound Care Innovation for the Tropics" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Os autores agradecem conselhos e assistência da Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
| Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
| Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
| alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
| Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
| Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
| Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
| Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
| Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
| Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
| Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
| Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
| GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
| Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
| Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
| MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
| MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
| MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
| MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
| NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
| Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
| Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
| Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
| PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
| Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
| PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
| RIPA buffer | Merck | R0278 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
| Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
| SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
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