Summary
Этот протокол описывает использование макромолекулярной скученности для создания в пробирке человеческой гипертрофической модели рубцовой ткани, которая напоминает условия in vivo. При выращивании в переполненной макромолекулярной среде фибробласты кожи человека демонстрируют фенотипы, биохимию, физиологию и функциональные характеристики, напоминающие рубцовую ткань.
Abstract
Было показано, что ткани in vivo очень переполнены белками, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеопротеитами, полисахаридами и т.д. Следующий протокол применяет макромолекулярную методика скученности (MMC), чтобы имитировать эту физиологическую скученность через добавление нейтральных полимеров (краудеров) к клеточным культурам in vitro. Предыдущие исследования с использованием Ficoll или dextran в качестве краудтеров показывают, что выражение коллагена I и фибронектина в линиях клеток WI38 и WS-1 значительно усиливается с помощью метода MMC. Тем не менее, этот метод не был проверен в первичных гипертрофических рубцов полученных человеческих фибробластов кожи (hHSFs). Как гипертрофические рубцы возникает из-за чрезмерного осаждения коллагена, этот протокол направлен на создание коллагена богатых в пробирке гипертрофической модели рубца, применяя технику MMC с hHSFs. Эта оптимизированная модель MMC, как было показано, обладает большим сходством с рубцовой тканью in vivo по сравнению с традиционными 2-мерными (2-D) системами клеточной культуры. Кроме того, это экономически эффективным, экономичным и этически желательным по сравнению с животными моделями. Таким образом, оптимизированная модель сообщила здесь предлагает передовые "виво-как" модель для гипертрофических рубцов, связанных исследований.
Introduction
Рубцовая ткань представляет собой конечную точку восстановления тканей. Тем не менее, у многих людей, особенно тех, кто страдает от ожогов или травм1, рубцы могут быть чрезмерными и налагать нежелательное воздействие на морфологию и функционирование исцелил кожи. Хотя точные механизмы патологических (гипертрофические рубцы и келоиды) образование рубцов не до конца изучены, чрезмерное осаждение коллагена во время заживления ран было продемонстрировано, чтобы быть существенным вкладом2.
Хорошо известно, что преобразование фактора роста бета 1 (TGF-No1) и альфа-гладкий мышечный актин (ЗСМА) играют ключевую роль в формировании гипертрофированного рубцов. Фактические данные свидетельствуют о том, что повышенный TGF-No1 непосредственно стимулирует чрезмерное осаждение коллагена через регулирование сигнального пути SMAD3. Кроме того, было установлено, что ЗСМА способствует гипертрофическому образованию рубцов, регулируя сокращение клеток и репиттелилиализацию в процессе заживления ран4. Отсутствие подходящих моделей in vitro и in vivo является основным препятствием на пути разработки и оценки мероприятий и методов лечения рубцов. Цель этого исследования заключается в использовании существующей техники MMC для создания "виво-как" гипертрофические рубцовая модель, которая подходит для оценки новых и возникающих рубцов, связанных с вмешательствами.
Воспроизводство живой ткани вне тела было целью в течение многих лет в научном сообществе. Развитие методов in vitro в начале ХХ века частично достигло этой цели. Текущие методы in vitro слегка эволюционировали от первоначальной демонстрации Ру, что эмбриональные клетки могут выжить ex vivo в течение нескольких дней в теплом сольнике5. Тем не менее, методологии in vitro в основном ограничиваются одноклеточными типами, культивируемыми в 2-D, и не точно переизглажают ткани in vivo. Хотя полезно для изучения биохимии клеток, физиологии и генетики, родные ткани 3-D и включают несколько типов клеток. Простые 2-D системы in vitro подвергают клетки млекопитающих высокоискусственной среде, в которой родная ткань-специфическая архитектура теряется6. В свою очередь, это влияет на внутриклеточные и внеклеточные события, в результате чего аномальные морфологии клеток, физиологии и поведения7.
Интерес к этому протоколу лежит в разработке и клиническом ведении гипертрофированными рубцов и келоидов. Хотя хорошо установлено, что дермальные фибробласты в значительной степени ответственны за обильное производство коллагенов, присутствующих в рубцовой ткани, культивирование кожных фибробластов с использованием 2-D в пробирке систем не может воспроизвести оборот коллагена наблюдается в vivo8. Современные методы in vitro по-прежнему по существу используют "теплый солин", среду, полностью отличающаяся от среды в живых тканях. Ткани in vivo чрезвычайно переполнены, с белками, нуклеиновыми кислотами, рибонуклеопротеитами и полисахаридами, занимающими 5%-40% от общего объема. Поскольку ни одна из двух молекул не может занимать одно и то же пространство одновременно, свободного пространства мало и почти полное отсутствие свободной воды9.
Метод MMC налагает ограничения, влияющие на термодинамические свойства цитозола и интерстициальных жидкостей. Молекулярные взаимодействия, рецептор-лиганд сигнальные комплексы, ферменты и органеллы ограничены и ограничены от свободного взаимодействия9. Взаимодействия в периклеарной среде (т.е. интерститиум) также ограничены. Последние данные подтверждают, что высокие концентрации инертных макромолекулов в переполненных растворах возмущения диффузии, физической ассоциации, вязкости и гидродинамических свойств10.
Интересно, что несколько популярных агентов скученности (нат., Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone »PVP» и натрий 4-styrenesulfonate »PSS») не эквивалентны при применении к различным типам клеток и в различных условиях. В одном предыдущем исследовании, Фиколл, как сообщается, менее цитотоксических для мезенхимальных стволовых клеток по сравнению с PVP. Эти результаты были интерпретированы как следствие его нейтрального заряда и относительно небольшого гидродинамического радиуса11. В отличие от этого, второе исследование показало, что декектин является более эффективным в стимулировании коллагена Я осаждения человека фибробластов легких по сравнению с Ficoll12. Данные нашего собственного исследования показывают, что Фиколл усиливает осаждение коллагена гипертрофированными рубцовами фибробластов, в то время как PVP является токсичным для этих клеток13.
Было продемонстрировано, что преобразование проколлагена в коллаген быстрее в очень переполненном in vivo окружающей среды14, в то время как скорость биологических реакций задерживается в разбавленной 2-D культуры системы15. Мы оптимизировали протокол in vitro здесь, включая MMC, чтобы показать выращивание кожных фибробластов, служащих в качестве более "виво-подобной" модели дермального фиброза и образования рубцов. В отличие от общей 2-D культуры системы, культивирование hHSFs с MMC стимулирует биосинтез и осаждение коллагена значительно13. Примечательно, что в этом оптимизированном протоколе MMC13проявляются и другие характеристики фиброза (т.е. повышенная экспрессия матричных металлопротеиназ и провоспалительных цитокинов). При выращивании с помощью этого метода, показано, что дермальные клетки резюмируют физиологические, биохимические и функциональные параметры, измеренные в vivo.
Оптимизированный протокол MMC in vitro был использован для оценки экспрессии коллагена и других белков ECM дермическими фибробластами, изолированными от гипертрофических рубцовой дермы и невовлеченной смежной дермы. При выращивании в средах MMC in vitro было отмечено, что hHSFs выражают определенные характеристики (т.е. мРНК, биохимия, физиология и фенотип), похожие на дермальные гипертрофические рубцовые ткани in vivo. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что физические и химические свойства являются важными соображениями при выборе сеулеров и оптимизации условий MMC для выращивания в пробирке.
Для доказательства принципа здесь применяется протокол MMC для качественной и количественной оценки способности Шиконина и его аналогов вызывать апоптоз. Это позволяет оценить потенциальные применения этих естественно полученных традиционной китайской медицины (TCM) соединений для управления кожные рубцы13. Несмотря на это, простота, рентабельность и своевременность этого протокола in vitro MMC также удовлетворяет недавние правила по ликвидации экспериментов на млекопитающих директивой ЕС 2010/63/EU и Агентством по охране окружающей среды США (EPA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура клеток
- Поддержание hHSFs и нормальных кожных фибробластов, полученных из непатологических тканей (hNSFs) в модифицированной среде Орла Dulbecco (DMEM), содержащей 10% фетальной икроножной сыворотки (FCS) и21% v/v пенициллин/стрептомицин раствор (P/S) при 37-C в инторе с 5%
- Купить Ficoll 70, Ficoll 400, и аскорбиновой кислоты от соответствующих компаний.
2. Конструкция гипертрофической модели шрама MMC
- Семя hHSFs или hNSFs (50,000/well) в 24 хорошо пластины, содержащие 1 мл носителей в каждой скважине.
- Поместите в инкубатор 37 градусов по Цельсию при 5% CO2 и оставьте на ночь.
- Подготовьте средства массовой информации MMC. Основываясь на общем объеме, необходимом для эксперимента, производят 10% FCS/DMEM-носителей, смешивая Ficoll 70 (18,75 мг/мл), Ficoll 400 (12,5 мг/мл) и аскорбиновую кислоту (100 мкм).
- Поместите смесь в водяную ванну 37 градусов по Цельсию в течение 1 ч, чтобы разогнать сеулеров в раствор, затем стерилизовать MMC-носители с помощью фильтра 0,2 мкм.
- Аспирируйте отработанные средства массовой информации и заменяете свежеприготовленными MMC-сми.
- Инкубировать клетки в течение 6 дней при 37 и 5% CO2, меняя средства массовой информации каждые 3 дня.
3. Выражение общего количества коллагена
- Подготовка красного раствора Sirius (0,1% ж/в). Растворите 0,2 г порошка Direct Red 80 в 200 мл дистиллированной деионированной воды (ddH2O) с 1 мл уксусной кислоты.
- Аспирировать MMC средств массовой информации и добавить 300 Зл Сириус Красный раствор в каждой скважине. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 90 мин.
- Аккуратно промыть раствор Sirius Red водопроводной водой и дать пластине высохнуть на ночь.
- Извлеките пятно Sirius Red, добавив в каждую скважину 200 л гидроксида натрия (0,1 М). Поместите пластину на орбитальный шейкер в течение 5-10 минут, чтобы полностью извлечь пятно Sirius Red.
- Передача 100 л извлеченного красного пятна Sirius Red в прозрачную пластину 96 скважин и измерьте абсорбцию на уровне 620 нм с помощью микроплитного считывателя.
4. Выражение коллагена I (иммуностоидинг)
- Вымойте скважины с помощью 200 л фосфатно-буферного сосудистого раствора (PBS, рН 7,35).
- Исправьте клетки с помощью метанола (500 л/ну) при 4 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
- Блок неспецифических взаимодействий с 3% бычьей сыворотки альбумина в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).
- Аспирировать блокирующий раствор и инкубировать с 200 зл антиколлагена I антитела (10 мкг/мл) в течение 90 минут на RT.
- Аспирируй первичное антитело и мойте 3x с PBS в течение 5 мин каждый.
- Инкубировать с 200 зл козла анти-Rabbit-FITC вторичных антител (1:400 разбавления) и 4',6-диамидино-2-фенилинол (DAPI; 1: 2000 разбавления) в течение 30 мин на RT. Обложка пластины с алюминиевой фольгой.
- Откажитесь от вторичных антител и DAPI и промыть 3x с PBS в течение 5 минут каждый.
- Визуализируйте флуоресценцию окрашивания непосредственно под микроскопом.
5. Западный blotting
- Вымойте клетки 2x с PBS.
- Добавьте 40 qL буфера lysis в каждую скважину и соскребите слой клетки кончиком пипетки. Буфер лисиса содержит буфер RIPA, коктейль-ингибитор протеазы (PIC), ванадат натрия 2 мМ и фтор натрия 10 мМ.
- Передача белка лизат в микроцентрифуговых трубах и измерения концентрации белка с помощью протеинового анализа в соответствии с инструкциями производителя16.
- Загрузите 10 мкг белка каждой группы в скважины 4%-12% белковых гелей Bis-Tris. Выполните натрия dodecyl сульфат полиакриламид гель электрофоресис (SDS-PAGE) при 200 В в течение 30 мин.
- Перенесите белок в мембрану нитроцеллюлозы, запустив вестернную подувку при 90 В в течение 90 мин. Избегайте образования пузырьков воздуха между гельом и мембраной нитроцеллюлозы.
- Заблокируйте мембрану 10 мл блокирующего буфера.
- Инкубировать с первичными антителами при 4'C ночь. Первичными антителами являются: антиколлаген I, антиколлаген III, антиколлаген IV, анти-ЗСМА, анти-ММП-1, анти-ММП-2, анти-ММП-9, анти-ММП-13 и анти-глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH).
- Вымойте мембрану с 0,1% TBS-Tween 20 (5x на 5 мин каждый). TBS/Tween 20 (1 Л) содержит следующее: 50 мл 1 М Трис (рН 7,4), 30 мл 5 М хлорида натрия, 1 мл Tween 20, и 920 мл ddH2O.
- Инкубировать с видом соответствующих вторичных антител на RT в течение 1 ч.
- Повторите шаг 5.8 и визуализировать флуоресценцию с помощью системы визуализации.
6. РТ-ПЦР
- Соберите общую РНК с помощью буфера лизиса, смешанного с 2-меркаптоэтанолом, включенным в набор асссеа для удаления РНК.
- Очистите РНК в рамках инструкций производителя17.
- Измерьте концентрацию РНК с помощью микротомного спектрофотометра.
- Выполните первый синтез пряди cDNA с помощью комплекта синтеза кДНК в рамках инструкций производителя.
- RT-PCR олигонуклеотид ные обеспечиваются (предварительно) в пользовательских 96 скважинных пластин. Смешайте 100 нг образцов кДНК с 10 зл и зеленым супермиксом SYBR в настраиваемую пластину.
- Увеличьте общий объем до 20 л/хорошо с помощью ddH2O.
- Запустите RT-PCR с помощью теплового велосипеда в соответствии с инструкциями производителя: 40 циклов денатурирования при 98 градусах по Цельсию на 15 с и аннулировании/расширении при 60 градусах по Цельсию за 60 с. Гены, протестированные в RT-PCR включают в себя: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1, и VEGF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Трипликатные образцы были выполнены в каждом эксперименте, и каждый эксперимент был повторен 3x с использованием клеток из трех отдельных пациентов. Данные выражаются в процентах контрольной группы. Для анализа статистических различий были применены односторонние ANOVA и пост-специальный тест Tukey(п. 0,05).
MMC с использованием Ficoll на 9% FVO (фракционная заполняемость объема) повышает общее количество коллагена и коллагена I осаждения в hHSF13. Как показано на рисунке 1A, плотность клеток hHSFs значительно увеличилась после культивирования с Ficoll на 9% и 18% FVO по сравнению с контролем и MMC с помощью PVP. Рисунок 1B,C указывает на то, что Фиколл (на 9% FVO) значительно улучшил осаждение коллагена (в ключая коллаген i) по сравнению с другими формулировками MMC. Количественный анализ(рисунок 1D,E) далее показал, что Фиколл (на 9% FVO) наиболее эффективно улучшил осаждение коллагена.
hHSFs и hNSFs, культивируемые в средах MMC, были найдены для регулирования экспрессии видов ECM в дополнение к коллагену13. Данные, представленные на рисунке 2, свидетельствуют о том, что, когда hHSFs и hNSFs культивировались с помощью MMC, экспрессия коллагена IV также значительно возросла. Матрица металлопротеиназы (ММП) играют важную роль во время заживления ран и образования рубцов, регулируя eCM сборки, и ремоделирования18. ММП также способствуют пролиферации клеток, миграции клеток, ангиогенеза и апоптоза19. Примечательно, что повышенное выражение ММП было обнаружено, чтобы накопить в гипертрофических рубцовых тканей по сравнению с родной ткани20. Было отмечено, что выражение MMP-2, -9 и -13 было значительно upregulated в обоих hNSF и hHSF культур культивируется в средах MMC.
Мы также исследовали синтез интерлейкина-6 (IL-6) и сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF); однако, они были необнаружимы в западной погревить. В отличие от этого, rt-PCR анализ(рисунок 3) показал, что выражение IL6 был значительно upregulated, в то время как выражение VEGF был downregulated в hNSFs и hHSFs культивируется в условиях MMC. Увеличенное выражение IL-6 было продемонстрировано для того чтобы способствовать к гипертрофическому образованиюшрама 21. Парадоксально, но также сообщается, что образование гипертрофических рубцов связано с повышенным выражением VEGF22. Анализ РТ-ПЦР, проведенный здесь, показал, что выражение VEGF значительно ослаблено в hNSF и hHSFs, культивируемых в условиях MMC.
Наконец, результаты продемонстрировали как 1) увеличение синтеза коллагенов, коллагена I, коллагена IV, MMP-2, MMP-9, и MMP-13 de novo и 2) повышенной экспрессии IL6 mRNA в HHSFs и hNSFs. Взятые вместе, эти данные показывают, что выращивание первичных hHSFs и hNSFs в средствах массовой информации формулировки, которые включают результаты MMC в удержании характерной экспрессии генов, биохимии и фенотипов наблюдается в родной гипертрофической рубцовой ткани in vivo, что приводит к надежной "шрам-в-банк" модель.
Рисунок 1: MMC увеличивает общее количество коллагена и коллагена I осаждения в hHSFs. (A) Клеточная морфология, (B) тотальные коллагены, окрашенные Сириус омичем, (С) коллаген I выражением, продемонстрированная иммунофлуоресценцией, (D) количественный анализ общего коллагена и (Е) количественный анализ осаждения коллагена I. hHSFs были культивированы в средствах массовой информации, дополненных Ficoll (9% и 18% FVO), PVP40 (18% FVO), или PVP360 (54% и 72% FVO), в течение 6 дней. Были выбраны репрезентативные изображения. Количественная оценка изображения была выполнена с помощью ImageJ и выражается как средний процент управления. Все эксперименты были повторены 3x с использованием клеток, изолированных от трех неродственных доноров. Статистический анализ был проведен с использованием односторонней ANOVA с пост-тестTu(p qlt; 0.05 против контрольной группы, бары ошибок указывают SEM). Шкала баров (A) 0,5 мм, (B) 2 мм, и (C) 0,5 мм. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Влияние MMC на экспрессию клеточного белка. hHSFs и hNSFs культивировались в условиях MMC в течение 6 дней. Целые клеточные лисаты были подготовлены с буфером RIPA, содержащим коктейль-ингибитор протеазы, ванадат натрия и фтор натрия. Концентрация белка была измерена с помощью протеинового анализа. Представлены репрезентативные изображения. Для количественного анализа интенсивность отдельных белковых полос была измерена с помощью денситометрии, нормализована в GAPDH и преобразована в процент от hNSF в обычной среде с использованием программного обеспечения ImageJ. Все эксперименты были проведены в 3x с использованием клеток из трех неродственных доноров. Статистический анализ был проведен с использованием односторонней ANOVA с пост-тестTu(p slt; 0.05, бары ошибок указывают SEM). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Влияние MMC на экспрессию генов клеток. hHSFs и hNSFs культивировались в условиях MMC в течение 6 дней. Общая РНК была собрана с помощью набора ассеа, а первая прядь cDNA была синтезирована с помощью набора синтеза кДНК. Целевое выражение гена было нормализовано до GAPDH и преобразовано в процент hNSF в нормальной среде. Все эксперименты были повторены 3x с использованием клеток из трех неродственных доноров. Статистический анализ был проведен с использованием односторонней ANOVA с пост-тестTu(p slt; 0.05, бары ошибок указывают SEM). Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущим исследованием13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол направлен на оптимизацию и аутентификации улучшенной модели in-scar-in-a-jar для человеческой кожной рубцовой ткани. Предыдущие исследования сообщили о применении метода MMC для человека фибробластов легких12, человеческий костный мозг мезенхимальных стволовых клеток23, и человека дермальных фибробластов23 с использованием dextran12, Ficoll12, и PVP23 как толпы. В исследовании, опубликованном здесь, ранее опубликованный протокол для гипертрофированный шрам полученных человеческих фибробластов кожи была оптимизирована с Ficoll или PVP как crowders.
Отбор и концентрация макромолекулярных краудеров являются критическими параметрами, так как они не дают эквивалентных результатов. Предыдущее исследование сообщило, что PVP40 (18% FVO) и PVP360 (54% FVO) значительно повысить осаждение коллагена и пролиферации клеток в дермальных фибробластов23 (эффекты ПВП на FVOs;54% непроверены). Тем не менее, эти два условия не работают последовательно для hHSFs с помощью этого протокола.
Как показано на рисунке 1, Фиколл значительно повышает осаждение коллагена I по сравнению с контролем, в то время как PVP не имеет значительных эффектов. Фиколл на 9% FVO значительно увеличивает общее количество коллагена и коллагена типа I по сравнению с Ficoll на 18% FVO. Кроме того, очень важно использовать клетки низкого прохода, так как первичные кожные фибробласты имеют ограниченный срок службы в культуре24. Было выбрано использовать только только только изолированные hHSF для того чтобы сохранить phenotype in vivo. После длительного культивирования первичные HHSFs демонстрируют необычную морфологию и нетипичные функциональные реакции. Также рекомендуется, чтобы среда MMC была дополнена аскорбиновой кислотой, ключевым индуктором синтеза коллагена в hHSF25. Кроме того, другие исследователи предлагают использовать те же антитела, перечисленные в таблице материалов, для исследований, связанных с hHSF; однако, антитела должны быть проверены, если применение этого протокола к другим типам клеток.
Как сообщается в репрезентативных результатах, включение макромолекулярных краудеров было установлено, чтобы стимулировать экспрессию коллагена I, коллагена I, ММП и IL6) в hHSFs по сравнению с hHSFs, которые культивировались с использованием классических условий, не связанных с ММК. Утверждается, что оптимизированная модель MMC сохраняет аспекты hHSFs' in vivo phenotype, повторяя их характерную морфологию, биохимию, физиологию и обильную внеклеточную матрицу кожной рубцовой ткани in vivo (в отличие от существующих подходов к культуре 2-D). Мы не в состоянии определить какой-либо аналогичной модели in vitro, которая способна резюмировать аналогичные "виво-подобные" свойства. По сравнению с существующими моделями животных, этот протокол MMC является более быстрым, а также более удобным, экономичным и экономичным. Cuttle et al. установили свиную гипертрофическую модель рубца с использованием термальных повреждений, которые, как представляется, имеют сходные характеристики с человеческими гипертрофическими шрамами26. Однако, в дополнение к затратам и времени, необходимых для содержания животных, эксперимент требует более 3 месяцев, чтобы завершить26. Эта оптимизированная модель MMC требует около 1 недели подготовки перед готовимостью к использованию.
Протокол предлагает передовую модель in vitro для изучения новых анти-рубцов терапии. Модель MMC была использована для оценки Шиконина, молекулы, ранее сообщалось, чтобы ингибировать де Ново образование рубцов, для восстановления зрелых гипертрофических рубцов27,28. Аналогичная оценка новых соединений и мероприятий с использованием классических подходов к обнаружению наркотиков и доказательства концепции потребует значительных ресурсов, средств и времени. Это исследование требовало минимальных финансовых средств и может быть завершено в течение нескольких месяцев. Протокол является гибким и легко адаптируемым для применения в разработке и оценке новых гипертрофических рубцов лечения до изучения на животных.
Кроме того, этот протокол может быть дополнительно изменен, чтобы развивать более "виво-подобные" свойства. Например, наличие чрезмерного TGF-No1 является последовательным выводом в гипертрофических рубцовых тканях, посредника образования рубцов, стимулируя синтез коллагена и осаждение28. ТГФ-З1 можно было бы легко включить в протокол MMC и еще больше улучшить повторение патологии in vivo. Мы еще не изучили весь потенциал модели, который может быть полезен для других коллагеновых и ECM связанных патологий (т.е. склеродермия, легочный фиброз, эндомиокардиальный фиброз и т.д.). Кроме того, было бы интересно наблюдать за воздействием MMC на клетки в течение более длительного периода культуры, например, 2 или 3 недели. Также стоит дополнительно оценить влияние MMC на клеточную и eCM иерархическую архитектуру и выравнивание, в частности ориентацию коллагена, так как эти характеристики необходимы для формирования рубцовой ткани in vivo.
Одним из основных ограничений этого протокола является ограничение типов клеток. Гипертрофированное образование рубцов включает в себя участие различных популяций клеток, и взаимодействие между различными типами клеток играет важную роль в образовании рубцов. Например, кератиноциты также играют важную роль в кожное заживление ран и образование рубцов29. Включение дополнительных популяций клеток в эту модель значительно повысит ее значимость в будущих исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана финансированием из Сингапура Агентство по науке, технологиям и исследованиям "SPF 2013/004: Биология кожи Основные исследования" и "Wound Care Инновации для тропиков" IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Авторы с благодарностью признают советы и помощь д-ра Паулы Бенни и д-ра Майкла Рагхунатха.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm filter | Sartorius | 16534 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | P36962 | |
Alexa Fluor 680 | Thermo Fisher Scientific | A-21076 | |
Alexa Fluor 800 | Thermo Fisher Scientific | A-11371 | |
alpha smooth muscle actin (αSMA) primary antibody | Abcam | ab5694 | |
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler ) | Thermo Fisher Scientific | 4351106 | |
Ascorbic acid | Wako | #013-12061 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | #A2153 | |
Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | |
Collagen I primary antibody (for immunostaining) | Abcam | 6308 | |
Collagen I primary antibody (for western blot) | Abcam | ab21286 | |
Collagen III primary antibody | Abcam | ab7778 | |
Collagen IV primary antibody | Abcam | ab6586 | |
Direct Red 80 | Sigma-Aldrich | 2610108 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Life Technologies | 11996-065 | |
Fetal calf serum (FCS) | Life Technologies | 6000-044 | |
Ficoll 400 | GE HealthCare | #17-0300-10 | |
Ficoll 70 | GE HealthCare | #17-0310-10 | |
GAPDH primary antibody | Sigma-Aldrich | G8795 | |
Goat Anti-Rabbit secondary antibody | Abcam | ab97050 | |
Human hypertrophic scar/normal fibroblasts (hHSF/hNSF) | Cell Research Corporation | 106, 107, 108 | |
iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | #1708890 | |
MMP-1 primary antibody | Abcam | ab38929 | |
MMP-13 primary antibody | Abcam | ab39012 | |
MMP-2 primary antibody | Abcam | ab37150 | |
MMP-9 primary antibody | Abcam | ab38898 | |
NanoDrop Microvolume Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
Nitrocellulose membrane | Bio-Rad | 10484060 | |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Thermo Fisher Scientific | NP0321BOX | |
Odyssey blocking buffer | LI-COR Biosciences | 927–40000 | |
Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A | |
Olympus IX-81 HCS microscope (for immunostaining) | Olympus | N/A | |
Penicillin/streptomycin solution (P/S) | Life Technologies | 15140-122 | |
PrimePCR Assays | Bio-Rad | Customized primers pre-coated in 96-well plates based on requirement | |
Protease inhibitor cocktail (PIC) | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
PVP 360 | Sigma | #PVP360 | |
PVP 40 | Sigma | #PVP40 | |
RIPA buffer | Merck | R0278 | |
RNeasy Plus Mini Kit | QIAGEN | #74134 | |
Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450022 | |
Sodium vanadate | Sigma-Aldrich | 450243 | |
SpectraMax M5 Multi-Mode microplate reader | Molecular Devices | N/A | |
SsoAdvanced universal SYBR green supermix | Bio-Rad | #172-5270 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- vander Veer, W. M., et al. Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation. Burns. 35 (1), 15-29 (2009).
- Linge, C., et al. Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase. Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).
- Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review. International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).
- Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression. Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).
- Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373 (2015).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study. Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).
- Zeiger, A. S., Loe, F. C., Li, R., Raghunath, M., Van Vliet, K. J. Macromolecular Crowding Directs Extracellular Matrix Organization and Mesenchymal Stem Cell Behavior. PloS one. 7 (5), 37904 (2012).
- Chen, C. Z., et al. The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well. British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).
- Fan, C., et al. Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars. Chemico-Biological Interactions. 310, 108747 (2019).
- Canty, E. G., Kadler, K. E. Procollagen trafficking, processing and fibrillogenesis. Journal of Cell Science. 118, Pt 7 1341-1353 (2005).
- Minton, A. P. Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited. Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).
- Ernst, O., Zor, T.
Linearization of the bradford protein assay. Journal of Visualized Experiments. (38), e1918 (2010). - Beltrame, C. O., Cortes, M. F., Bandeira, P. T., Figueiredo, A. M. Optimization of the RNeasy Mini Kit to obtain high-quality total RNA from sessile cells of Staphylococcus aureus. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 48 (12), 1071-1076 (2015).
- Xue, M., Jackson, C. J. Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring. Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).
- Rohani, M. G., Parks, W. C. Matrix remodeling by MMPs during wound repair. Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).
- Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).
- Ghazizadeh, M., Tosa, M., Shimizu, H., Hyakusoku, H., Kawanami, O. Functional Implications of the IL-6 Signaling Pathway in Keloid Pathogenesis. Journal of Investigative Dermatology. 127 (1), 98-105 (2007).
- Wilgus, T. A., Ferreira, A. M., Oberyszyn, T. M., Bergdall, V. K., Dipietro, L. A. Regulation of scar formation by vascular endothelial growth factor. Laboratory Investigation. 88 (6), 579-590 (2008).
- Rashid, R., et al. Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).
- Lago, J. C., Puzzi, M. B. The effect of aging in primary human dermal fibroblasts. PloS one. 14 (7), 0219165 (2019).
- Cigognini, D., et al. Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis. Scientific Reports. 6, 30746 (2016).
- Cuttle, L., et al. A porcine deep dermal partial thickness burn model with hypertrophic scarring. Burns. 32 (7), 806-820 (2006).
- Fan, C., Xie, Y., Dong, Y., Su, Y., Upton, Z. Investigating the potential of Shikonin as a novel hypertrophic scar treatment. Journal of Biomedical Science. 22, 70 (2015).
- Fan, C., et al. Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts. International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).
- Werner, S., Krieg, T., Smola, H.
Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing. Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).