Summary
Presenteras här är ett kemiskt definierat protokoll för härledning av mänskliga njure podocyter från inducerad pluripotenta stamceller med hög effektivitet (>90%) och oberoende av genetiska manipuleringar eller subpopulation urval. Detta protokoll producerar önskad celltyp inom 26 dagar och kan vara användbart för nefrotoxicitet testning och sjukdom modellering.
Abstract
Njursjukdom påverkar mer än 10% av den globala befolkningen och kostar miljarder dollar i federala utgifter. De allvarligaste formerna av njursjukdom och eventuell njursvikt i slutstadiet orsakas ofta av skadorna på de glomerulära podocyterna, som är de högspecialiserade epitelcellerna som fungerar tillsammans med endotelceller och det glomerulära källarmembranet för att bilda njurens filtreringsbarriär. Framsteg inom njurmedicin har hindrats av den begränsade tillgången på primärvävnader och bristen på robusta metoder för härledning av funktionella mänskliga njurceller, såsom podocyter. Förmågan att härleda podocyter från förnybara källor, såsom stamceller, kan bidra till att främja nuvarande förståelse för mekanismerna för mänsklig njurutveckling och sjukdom, samt ge nya verktyg för terapeutisk upptäckt. Målet med detta protokoll var att utveckla en metod för att härleda mogna, post-mitotic podocyter från mänskliga inducerad pluripotent stam (hiPS) celler med hög effektivitet och specificitet, och under kemiskt definierade villkor. HiPS cell-härledda podocyter produceras av denna metod uttrycklig härstamning-specifika markörer (inklusive nephrin, podocin och Wilms tumör 1) och uppvisar de specialiserade morfologiska egenskaperna (inklusive primära och sekundära fot processer) som är associerade med mogna och funktionella podocyter. Intressant nog är dessa specialiserade funktioner särskilt frånvarande i den odödliga podocyt cellinjen som används ofta i fältet, vilket tyder på att protokollet som beskrivs häri producerar mänskliga njure podocyter som har en utvecklingsmässigt mer mogen fenotyp än de befintliga podocyt cellinjer som vanligtvis används för att studera mänskliga njure biologi.
Introduction
Framsteg inom människans pluripotenta stamcellskultur är redo att revolutionera regenerativ medicin, sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening genom att ge forskare en förnybar, skalbar källa till biologiskt material som kan konstrueras för att erhålla nästan vilken celltyp som helst i människokroppen1. Denna strategi är särskilt användbar för härleda specialiserade och funktionella celltyper som annars skulle vara svåra att få. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller(hiPS) 2,3,4,5 är särskilt attraktiva på grund av deras somatiska cellursprung och den potential de representerar för personlig medicin. Att utveckla metoder för att härleda andra celstammar från hiPS-celler är dock fortfarande utmanande på grund av frekvent användning av dåligt definierade odlingsförhållanden som leder till låg effektivitet och icke-specifik generering av heterogenacellpopulationer 6,7.
Presenteras här är en metod för härledning av mogna njure podocyter från hiPS celler med specificitet och hög effektivitet under kemiskt definierade villkor. Genom att överväga rollerna för flera faktorer inom cellulär mikromiljö utvecklades en stamcells differentieringsstrategi som involverade optimering av lösliga faktorer som presenteras i cellkulturmediet samt olösliga faktorer, såsom extracellulära matriskomponenter eller självhäftande substrat. Med tanke på vikten av integrin signalering i podocyte utveckling och funktion, undersöktes uttrycket av integrin receptorer på cell ytan inledningsvis. β1 integrins uttrycktes högt inte bara i hiPS-celler, men också i deras derivat inklusive mesoderm och mellanliggande mesodermceller8,9,10. Senare experiment bekräftade att ligander som binder till β1 integrins (inklusive laminin 511 eller laminin 511-E8 fragment) stöder vidhäftning och differentiering av hiPS-celler i podocyter när de används tillsammans med de lösliga induktiva medier som beskrivs nedan.
Induktion av cell härstamning åtagande initierades genom att först bekräfta att hiPS celler odlas på lamininbelagda ytor i två dagar i närvaro av ett medium som innehåller Activin A, CHIR99021 och Y27632 Rock inhibitor kan skilja sig åt i celler som uttrycker de tidiga mesoderm markörer HAND1, goosecoid och brachyury8,11. Behandling av mesodermcellerna i 14 dagar med ett medium kompletterat med benmorfogenetiskt protein 7 (BMP-7) och CHIR99021 möjliggjorde härledning av mellanliggande mesodermceller som uttryckte nefro avkomma cellmarkörer Wilms tumör 1 (WT1), udda-skipped relaterade protein 1 (OSR1)8,11, och parat box gen 2 protein (PAX2)12. För att härleda de mogna njur glomerular podocytes behandlades de mellanliggande mesoderm cellerna i 4-5 dagar med ett nytt medium bestående av BMP-7, Activin A, Vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), alla-trans retinoic syra och CHIR99021. Flöde cytometri och immunostaining användes för att bekräfta att >90% av de resulterande cellerna uppvisade molekylära, morfologiska och funktionella egenskaper hos den mogna njuren podocyt8,11,13. Dessa egenskaper inkluderar utvecklingen av primära och sekundära fotprocesser; Uttryck av podocyt härstamning-specifika gener inklusive SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28 och uttryck av proteiner inklusive podocin, nephrin och WT114,15,16. Dessutom konstaterades det att hiPS-cell-härledda podocyter kan upprätthållas i kultur i upp till fyra veckor in vitro genom att använda ett kommersiellt tillgängligt medium8,11 som ger en ytterligare flexibilitet i tidpunkten för nedströmsexperiment. För mer information om flödescytometripanelerna som används för att bestämma renheten hos hiPS-podocyterna, se vår tidigare publikation11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagenser
- Utspädd tinade 5x hiPS cell kultur media (CCM) tillägg i hiPS cell kultur basal medium för att få en 1x lösning av hiPS CCM.
OBS: Fryst 5x hiPS CCM tillägg kräver en långsam upptiningsprocess, helst i 4 °C för över natten. Alikvoter av 1x hiPS CCM kan lagras i upp till 6 månader vid -20 °C. - Förberedelse av källarmembran (BM) matris 1-belagda plattor för hiPS cellkultur: Tina BM matris 1 över natten på is vid 4 °C. När upptinad, förbered alikvoter med lämpliga utspädningsfaktorer som föreslås av tillverkaren.
OBS: Vanligtvis bereds alikvoter för efterföljande utspädning i 25 ml kall DMEM/F12 i ett koniskt rör på 50 ml följt av noggrann blandning för att helt lösa upp BM-matrisen 1 och undvika bildandet av kvarvarande kristaller. - Överför 1 ml BM-matris 1-lösning till varje brunn på en 6 brunnsplatta och inkubera vid 37 °C i 1-2 timmar eller vid 4 °C i minst 24 timmar, insvept i paraffinfilm. BM-matrisen 1-belagda plattor kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor.
- Beredning av källarmembranmatris (BM) 2 - belagda plattor: Späd lämpliga mängder BM-matris 2 i 9 ml sterilt destillerat vatten för att förbereda en slutlig koncentration på 5 μg/ml. Tillsätt 700 μL BM-matris 2-lösningen till varje brunn på en 12 brunnsplatta och inkubera plattan vid rumstemperatur i 2 timmar eller över natten vid 4 °C.
- Bered 100 μg/ml stamlösningar var och en av BMP7, Activin A och VEGF enligt följande: reconstitute BMP7 i sterilt destillerat vatten som innehåller 0,1% (wt/vol) BSA och rekonstituerad Activin A och VEGF separat i steril PBS som innehåller 0,1% (wt/vol) BSA. För att undvika frekventa frys-tina cykler, förbered 100 μL alikvoter från varje lagerlösning och lagra vid -20 °C i upp till 6 månader.
- Förbered en 10 mM stamlösning av Y27632 genom att lösa upp 10 mg Y27632 i 3,079 ml sterilt destillerat vatten. Aliquot 100 μL från lagret och förvaras vid -20 °C i upp till 6 månader.
- Lös upp 2 mg CHIR99021 i 143,4 μL steril DMSO för att förbereda en 30 mM stamlösning. Förbered 5 μL alikvoter och förvara vid -20 °C i upp till 1 månad (eller enligt tillverkarens rekommendation).
- Lös upp 10 mgall- trans retinsyra i 3,33 ml steril DMSO. Förbered 500 μL alikvoter och förvara vid -20 °C i upp till 6 månader.
2. Förberedelse av kulturmedier
- Förbered mesoderm differentieringsmediet genom att rekonstituera motsvarande stamlösningar till en slutlig koncentration på 100 ng/mL Activin A, 3 μM CHIR99021, 10 μM Y27632 och 1x B27 serumfritt tillägg i en lämplig volym DMEM/12 med glutamintillskott.
OBS: Mesoderm differentieringsmediet bör beredas ny före differentieringssteg och med en volym som är lämplig för experimentskalan (vanligtvis är 50 ml medium tillräckligt för två 12 brunnsplattor). - Förbereda mellanliggande mesoderm differentiering medium genom att rekonstituera motsvarande lagerlösningar till en slutlig koncentration av 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 och 1x B27 serum-fri tillägg i DMEM/F12 med en glutamin tillägg.
OBS: Vid behov kan mediet kompletteras med 1% (vol/vol) Penicillin-Streptomycin. Justera mediets volym med dmem/F12 med glutamintillskott. Detta medium kan beredas i stora partier; Det rekommenderas dock att lagra i mindre alikvoter (t.ex. 45 ml i 50 ml koniska rör) för att undvika upprepade frys-tina cykler. Detta medium kan förvaras vid -20 °C i upp till 3 månader och kan tinas vid 4 °C över natten före användning. - Bered podocytinduktionsmediet genom att rekonstituera till en slutlig koncentration 100 ng/ml BMP7. 100 ng/mL aktivin A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 serumfritt tillägg och 0,1 μM all-trans retinsyra i DMEM/F12 med glutamin tillägg. Skydda mediet mot ljus (t.ex. genom att slå in behållaren med foliepapper).
OBS: Detta medium kan beredas i stora partier och förvaras i mörker vid -20 °C i upp till 3 månader. Frysta alikvoter bör tinas över natten vid 4 °C före användning. - Förbered 25 ml trypsinneutraliserande lösning genom att tillsätta 10 % (vol/vol) värmeaktiverad FBS i DMEM/F12 och filtrera under sterila förhållanden.
- För underhåll efter differentiering av stamcellsbaserade podocyter, förbered Complete Medium med podocytunderhållsmedium genom att tillsätta tillägget till basalmediet enligt tillverkarens riktlinjer och lagra vid 4 °C i upp till två veckor.
3. Feeder-fri hiPS-cellkultur med hiPS-cellkulturmedium
- Aspirera restlösningen av BM matris 1 från de förbelagda plattorna och tvätta brunnarna 3 gånger med 1 till 2 ml uppvärmd DMEM/F12.
- Aspirera spenderade hiPS CCM från hiPS-cellerna och skölj cellerna 3 gånger med uppvärmd DMEM / F12. Tillsätt 1 ml lösning för varm cellavlossning och inkubera i 1 min vid 37 °C för att hjälpa till att skilja cellerna åt. Utför visuell inspektion av celler under ett vävnadskulturmikroskop och se till att cellkoloniernas kanter ser rundade ut och aspirera sedan snabbt cellavlossningslösningen från cellerna (se till att cellkolonierna fortfarande är fästa vid plattan, om än löst). Skölj försiktigt cellerna en gång med DMEM/F12 för att ta bort cellavlossningslösningen.
- Tillsätt 3 ml hiPS CCM till hiPS-cellerna (i varje brunn på en 6-brunnsplatta) som behandlades med cellavlossningslösningen. Skrapa kolonier med hjälp av en celllyftare och försiktigt pipettcellsupphängning upp och ner för att lossa de löst vidhäftade cellerna. Tvätta plattan noggrant för att säkerställa att alla celler skördas.
OBS: Användning av en 5 ml pipett rekommenderas för att undvika överskott av sajuvning på cellerna. - Överför 0,5 ml av cellfjädringen till varje brunn i en ny BM-matris 1-belagd 6-brunnsplatta som innehåller 2 ml hiPS CCM per brunn. Flytta plattan på figur åtta-sätt för att distribuera cellkolonier i brunnar och inkubera vid 37 °C i en 5 % CO 2-inkubator. Uppdatera mediet dagligen tills cellerna är redo att passages eller användas för differentieringsexperimentet (cirka 70 % konfluens).
OBS: Den idealiska kolonistorleken för rutinmässig växling av iPSCs är mellan 200-500 μm under matarfria förhållanden med hiPS CCM (utan ROCK-hämmare). Om celler individualiseras under behandling med dissociationsenzymer eller buffertar kan hiPS CCM kompletteras med ROCK-hämmare (t.ex. 10 μM Y27632) för att förbättra cellens livskraft.
4. Differentiering av hiPS-celler i mesodermceller (dag 0-2)
- Medan hiPS-cellkulturerna är i den exponentiella tillväxtfasen (ungefär inom 4 dagar efter odling efter passaging och cirka 70% sammanflöde), inspekterar visuellt för närvaron av spontant differentierade celler inom och runt koloniernas kanter. Vid behov, aseptiskt skrapa bort områden av differentiering.
- Aspirera hiPS CCM från hiPS-celler och skölj cellerna 3 gånger med varm DMEM/F12. Inkubera cellerna med 1 ml enzymfri celldisociationsbuffert i 10 min vid 37 °C och kontrollera dissociationen under ett mikroskop. På grund av inneboende skillnader mellan olika hiPS-cellinjer måste den faktiska inkubationstiden för celldifferensbufferten bestämmas för en viss cellinje.
- Skrapa försiktigt brunnen med en celllyftare för att lossa löst vidhäftade celler och överföra cellupphängningen till ett 15 ml koniskt rör, följt av pipetting upp och ner flera gånger för att individualisera hiPS-cellerna.
- För cellfjädringen till 15 ml-volymen med varm DMEM/F12 och centrifugera i 5 minuter vid 290 x g vid rumstemperatur.
- Aspirera försiktigt supernatanten och återanvänd cellerna med varm DMEM/F12 för ytterligare en omgång centrifugering för att ta bort kvarvarande BM-matris 1 och dissociationsbuffertkomponenter.
- Aspirera supernatant och återanvända celler i 1 ml mesoderm induktion medium som beskrivs i ovan. Räkna det totala antalet celler som använder en hemocytometer eller koulterräknare för att bestämma lämplig volym av mesoderm differentieringsmedium som krävs för att uppnå en koncentration på 1 x 105 celler/ml.
- Aspirera ECM-lösningen från BM-matrisen 2-belagda plattor och skölj plattorna två gånger med varm DMEM/F12. Blanda hiPS-cellfjädringen försiktigt genom att pipetting några gånger. Överför 1 ml av cellfjädringen till varje brunn i BM-matrisen 2-belagda 12-brunnsplattor och skaka sedan försiktigt plattorna för att fördela cellerna jämnare.
- Inkubera plattan vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator. Uppdatera mesoderm induktionsmediet nästa dag.
OBS: Efter 2 dagar, hiPS cell-härledda mesoderm celler skulle vara redo för mellanliggande mesoderm induktion.
5. Differentiering av hiPS-cell-härledda mesoderm celler till mellanliggande mesoderm (dagar 2-16)
- På dag 2 av differentiering protokollet, aspirera mesoderm induktion medium och fylla på med 1 mL per väl mellanliggande mesoderm induktion medium.
- Uppdatera medium varje dag för att upprätthålla en exakt tröskel för tillväxtfaktorer och små molekyler för de metaboliskt aktiva cellerna. Om det finns betydande celltillväxt och snabb utarmning av medienäringsämnen (indikeras av gulfärgningen av mediet), kan volymen av det mellanliggande mesoderm differentieringsmediet ökas till 1,3 ml per brunn av 12 brunnsplattorna.
- Odling celler i ytterligare 14 dagar för att erhålla mellanliggande mesoderm celler. Dag 16 kan dessa celler kryopreserveras för senare användning.
6. Differentiering av hiPS-cell-härledda mellanliggande mesodermceller till podocyter (dag 16 till 21)
- Skölj de mellanliggande mesodermcellerna med varm DMEM/F12 följt av inkubation av cellerna med 0,5 ml per brunn på 0,05 % trypsin-EDTA i 3 min vid 37 °C. Utför visuell inspektion för att säkerställa att cellerna börjar ta avstånd.
- Skrapa celler med hjälp av en celllyftare och pipett cellupphängningen flera gånger med en 1 000 μL pipettspets för att erhålla individualiserade (eller små klumpar av) celler.
OBS: I detta skede, se till att cellerna är helt dissocierade som aggregerade celler kan misslyckas med att förvärva en terminalt differentierad fenotyp inom protokollets tidslinje. - Tillsätt ca 2 ml per brunn trypsinneutraliserande lösning för att stoppa trypsins aktivitet.
- Överför celler till ett koniskt rör på 50 ml och för upp volymen till 50 ml med DMEM/F12 och centrifuga sedan cellfjädringen i 5 minuter vid 201 x g vid rumstemperatur.
- Aspirera supernatant och återanvända celler i podocyt induktion medium. För optimala resultat, säkerställ en slutlig såddtäthet på cirka 100 000 celler/brunn på en 12 brunnsplatta. Tillsätt cellupphängningen i BM-matrisen 2-belagda plattor och skaka försiktigt plattan för att fördela cellerna jämnare.
- Inkubera celler vid 37 °C och 5 % CO2 och uppdatera medium dagligen i upp till 5 dagar för att få podocyter dag 21.
OBS: De resulterande hiPS cell-härledda podocyter kan bibehållas i kultur i 2-4 ytterligare veckor genom att använda komplett medium med podocyt underhållsmedier. En gång i podocyt underhållsmedier, cellerna kan matas varannan dag och kan användas för efterföljande studier eller nedströms analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Målet med detta protokoll var att visa att mogna mänskliga podocyter kan härledas från hiPS celler under kemiskt definierade villkor. De data som presenteras i detta manuskript genererades med hjälp av DU11 hiPS cellinje17, som först testades för, och befanns vara fri från mykoplasma. Kromosomal analys utfördes också, och cellerna konstaterades vara karyotypically normala. Börja med de odifferentierade DU11 hiPS-cellerna, Differentieringsstrategin (figur 1) som beskrivs i denna rapport användes för att först differentiera stamcellerna (figur 2A) till mesodermcell som uttrycker Brachyury (T) (figur 1B och figur 2B), följt av differentiering till PAX2-positiva mellanliggande mesodermceller (figur 2C), och slutligen till mogna njurgloberulära podocyter (figur 1B, Figur 2D, figur 3Doch figur 4). Mesoderm celler erhölls dag 2 i differentiering protokollet, mellanliggande mesoderm celler genererades av dag 16 och de mogna podocyter erhölls dag 21 i differentiering protokollet. De resulterande podocyterna var cirka 150-200 μm i storlek när de fastnade på en platt vävnadskulturyta, såsom de lamininbelagda plattorna som användes i detta experiment. HiPS cell-härledda podocyter uppvisar många fot processliknande tillägg som visualiserades med hjälp av flera kompletterande tekniker inklusive fas-kontrast mikroskopi (Figur 1), immunofluorescent mikroskopi (Figur 4) och scanning elektronmikroskopi8,11. De stamcellsbaserade podocyterna färgades också positivt för WT115 (figur 2D) samt härstamningidentifieringsmarkören nephrin14 (figur 4). Intressant nog var den subcellulära lokaliseringen av nephrin främst i podocyt fot processer och cell cytoplasma, överensstämmer med en mogen podocyte fenotyp (figur 2D och figur 4A,B). Under utveckling och i podocytfysiologi transporteras proteinet nephrin mellan cellkärnan och cytoplasman, men nephrin blir övervägande uttryckt i cytoplasma- och fotprocesserna när podocyter mognar och förvärvar en funktionell fenotyp18. Således understryker observationen att de podocyter som produceras med hjälp av differentiering protokollet beskrivs häri express nephrin till stor del i cytoplasma och fot process-liknande strukturer nyttan av detta protokoll för generering av mer mogna eller specialiserade podocyter. Scanning elektron mikrografer av hiPS cell-härledda podocyter belyser förgrening av primära och sekundära fot processer i hiPS cell-härledda podocyter som tidigare rapporterats av vår grupp8,11. Eftersom WT1 inte i sig är en definitiv markör för njure podocyter, rekommenderas det starkt att forskare också karakteriserar sina celler för samtidig uttryck av podocytspecifika markörer som podocin och nephrin. Det visades tidigare att terminalt differentierade podocyter härledda med hjälp av denna metod immunostain positiva för podocin, nephrin och WT1, med en motsvarande minskning av uttryck av stamceller markör PAX28,11. Tillsammans visar dessa resultat att podocyter som härleds med detta protokoll är utvecklingsmässigt mogna eller specialiserade, som krävs för en funktionell mänskliga njure glomerular podocyt.
Vid optimering villkor för differentiering metoden observerades fall där mellanliggande mesoderm celler var otillräckligt dissociated. Celler som såts med densiteter som signifikant överskred den rekommenderade densiteten på 100 000 celler/brunn av en 12 brunnsplatta (före det slutliga podocytinduktionssteget) resulterade i stora kluster av celler som saknade den förväntade morfologiska fenotypen av mogna podocyter inom protokollets standardtidslinje (figur 3A, B). Av dessa skäl rekommenderas att forskare använder de såddtätheter som rekommenderas i detta protokoll (figur 3C,D) innan de experimenterar med andra villkor som kan önskas för specifika nedströmstillämpningar. Tillsammans representerar dessa resultat den riktade differentiering av hiPS celler i njure glomerular podocyter inom tre veckor med hjälp av kemiskt definierade medier beskrivs ovan.
Figur 1: Differentiering av hiPS-celler till podocyter.
A)Schematisk representation av metoden för riktad differentiering av hiPS-celler till podocyter. BMP7, benmorfogenetiskt protein 7; RA, retinsyra; VEGF, Vaskulär endotel tillväxtfaktor. Denna siffra har ändrats från ref.11. B)Representativa bilder av hiPS-celler i varje differentieringsstadium. Från vänster till höger visar bilder de karakteristiska mänskliga iPS-cellkolonierna före dissociation för differentiering dag 0, följt av mesodermceller efter 2 dagars differentiering, sedan mellanliggande mesodermceller vid cirka 10 dagars differentiering och slutligen de terminalt differentierade podocyterna vid dag 22. Skalstreck, 100 μm för alla bilder (i panel B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Immunofluorescerande bilder av hiPS-celler och deras differentierade derivat som visar uttryck för härstamningsspecifika markörer och kärnmotsättning under differentieringstidslinjen.
A)Mänskliga iPS-celler som uttrycker pluripotencymarkören Oct4. B)Mesodermceller som uttrycker brachyury (T). C)Mellanliggande mesodermceller som uttrycker PAX2. och (D) de hiPS cell-härledda podocyter som uttrycker härstamning-identifiering markör, nephrin och tillhörande markör, WT1. Skalbar, 100 μm för alla bilder. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Effekter av suboptimal såddtäthet på differentieringspotentialen hos mellanliggande mesodermceller som härrör från DU11 hiPS-cellinjen.
A) När den ursprungliga cellfrötätheten är för hög (cirka 500 000 celler/brunn på en 12 brunnsplatta) kan cellerna bilda täta aggregat(B)under podocytinduktionsstadiet. C)Rekommenderad såddtäthet för att förhindra klumpar (100 000 celler/brunn på en 12 brunnsplatta) och för att mikroskopiskt observera(D)förlängningen av fotprocessliknande strukturer under podocytdirigeringsfasen (inset). Skalstång, 200 μm för A-D; och 100 μm för inset i D. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: HiPS cell-härledda podocyter uppvisar morfologiskt mogna fenotyp in vitro.
(A) Immunostaining av hiPS cell-härledda podocyter för nephrin och (B) högre förstoring bild av podocyte fot processer som visar primära och sekundära processer (vita pilar) samt uttryck av nephrin i dessa specialiserade cell strukturer. Skalstång, 100 μm (A); 50 μm (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport beskriver vi ett protokoll för generering av njur glomerular podocyter från hiPS celler. HiPS cell-härledda podocyter uppvisar morfologiska och molekylära funktioner som är associerade med den mogna njure podocyte fenotyp13. I tidigare publikationer visade vi att hiPS cell-härledda podocyter kan efterlikna strukturen och selektiv filtrering funktion av njure glomerulus när co-cultured med glomerular microvascular endotel celler i en perfusable microfluidic organ-on-a-chipenhet 8,11.
Följande kritiska steg bör övervägas av forskare som är intresserade av att anpassa detta protokoll. För det första är sådd av hiPS-celler på lamininbelagda plattor för induktion av mesodermceller ett avgörande steg. Medan en såddtäthet på 100 000 celler/brunn rekommenderas, kan forskare justera den ursprungliga cellfrötätheten beroende på replikeringshastigheten för stamcellslinjen som används för studien. Vid behov säkerställer denna optimering tillräcklig celltäthet under mesoderminduktionsstadiet och förhindrar bildandet av cellaggregat eller mycket stora klumpar som potentiellt kan äventyra kvaliteten på mesoderm, mellanliggande mesoderm eller podocyt fenotyp (figur 3). Det är också viktigt att notera att skillnader i tillverkarens specifikationer för vissa reagenser som CHIR99021 kan påverka kvaliteten på differentierade celler. Det är därför lämpligt att testa reagenser från olika partinummer eller leverantörer och leverantörer för deras biologiska aktivitet och överensstämmelse mellan oberoende experiment. Det är också viktigt att undvika överdriven exponering av hiPS-celler för dissociationsenzymer eftersom detta kan leda till oönskad avskildhet från limmatrisen och eventuell förlust av celler under medelhög aspiration. Ett annat viktigt steg som är värt att notera är att se till att podocytinduktionsmediet skyddas från ljus för att förhindra fotoinducerad inaktivering av retinsyra.
I jämförelse med tidigare metoder för differentiering av mänskliga njure podocyter använder metoden som beskrivs här kemiskt definierade faktorer (inklusive små molekyler, tillväxtfaktorer och specifika isoformer av källarmembranproteiner, vid önskade koncentrationer) som behövs för att reglera specifika cellsignaleringsvägar som är involverade i njurutveckling och podocytfunktion. Specifikt involverade genereringen av mesodermceller från hiPS-celler aktiveringen av den kanoniska Wnt-signalvägen som påverkades med hjälp av den lilla molekylen CHIR9902119. Den kanoniska Wnt-signalvägen är känd för att reglera transkriptionsaktiviteten hos gener som är involverade i vävnadsutveckling och mönstring in vivo, liksom cellproliferation och migration20,21. Cellinduktionsmediet som används i detta protokoll möjliggör härledning av podocyter från iPS cell-härledda mellanliggande mesoderm celler. Detta podocytinduktionsmedium består av Activin A, BMP7, VEGF, retinsyra och CHIR99021. Detta podocytinduktionsmedium kräver inte odefinierade serumkomponenter såsom fetala nötkreatursserum, vilket kan skymma bidragen från specifika faktorer och begränsa tillämpningarna av andra celldistanseringsmetoder för mekanistiska studier av vävnadsutveckling och sjukdom, vilket gör det skilt från dem som använts i tidigare försök att generera njurcellstyper22. Dessutom observerades att FGF2 och FGF9 inte krävs för differentiering av njure podocyter från hiPS celler6,7,22. Medan tidigare metoder som är beroende av bildandet av multicellulära aggregat som embryoidkroppar och organoider, producerar den metod som beskrivs här celler som uppvisar en mogen fenotyp, både morfologiskt och genom uttryck av härstamningsspecifika markörer inklusive nephrin och podocin, och nedreglering av stamcellsmarkörer som PAX2. Det förväntas att kunskapen om de kemiska komponenter som används i detta protokoll kan underlätta mekanistiska studier av mänsklig njurvävnad utveckling, podocyte härstamning specifikation och sjukdom patogenes i framtiden.
Denna metod för hiPS cell differentiering möjliggör också generering av mogna, postmitotic och funktionella podocyter med mer än 90% effektivitet, utan subpopulation urval, genetiska manipuleringar eller xenotransplantation. Detta skiljer sig särskilt från tidigare försök där höga nivåer av cellulärheterogenitet 6,7,23 begränsade användningen av stamcellsdidelningsmetoderna för translationella medicinapplikationer. Denna metod utgör också ett betydande framsteg för fältet med tanke på de utmaningar som är förknippade med den extremt begränsade tillgången på mänskliga njure podocyter från andra källor såsom primära vävnader eller organoider. Några av utmaningarna inkluderar låg härledningseffektivitet på mindre än 1% när man använder metoder som förlitar sig på bildandet av embryoida kroppar eller organoider6,7.
En begränsning av detta protokoll är den relativt höga kostnaden för de reagenser som krävs för stamcellskulturen och differentieringsstegen, vilket kan hindra dess genomförande i vissa laboratorier eller forskargrupper. Eftersom det också var mycket optimering för flera faktorer i cellens mikromiljö (dvs. både lösliga och olösliga eller självhäftande signaler) som var inblandade, rekommenderar vi att protokollet följs enligt beskrivningen. Ett vanligt misstag som noterades från andra som var intresserade av att använda denna podocyte differentieringsmetod inkluderade användning av olämpliga cell vidhäftning matriser såsom BM matriser som BM matriser 1 eller andra dåligt definierade animaliskt härledda proteiner. När protokollet har följts enligt beskrivningen kan ytterligare experiment utföras för att undersöka effektiviteten hos andra ändringar av protokollet. På grund av de inneboende skillnaderna mellan olika mänskliga stamcellslinjer är det dessutom värt att notera att vissa aspekter av differentieringsmetoden, t.ex. Dessa villkor ändrades dock inte för de hiPS-cellinjer och embryonala stamcellslinjer som hittills testats. Denna podocyte differentieringsmetod fungerar över flera hiPS-cellinjer inklusive PGP1, IMR-90-1 och IISH3i-CB6 samt H9 embryonala stamcellslinjen8,11. I detta betänkande visar vi också en framgångsrik differentiering av HIPS-cellinjen DU11 med samma protokoll (figur 1 och figur 2). Med tanke på konsekvensen i denna metod över olika cellinjer, inklusive resultat från opublicerat arbete från andra oberoende forskningslaboratorier (före publicering), förväntar vi oss därför att detta differentieringsprotokoll kommer att vara användbart för härledning av njur podocyter från en mängd olika hiPS-cellinjer och därför inte begränsat till det som används i detta protokoll.
Med tanke på hiPS-cellernas förmåga att förnya sig själv på obestämd tid kan denna differentieringsmetod användas för att ge forskare en lättillgänglig källa till mänskliga njurpodocyter. Detta kan bidra till att främja den nuvarande förståelsen av mänsklig njurbiologi ochsjukdom 24 samt möjliggöra utvecklingen av nya in vitro njursystem för modellering av mänsklig njurfunktion och svar på terapier. Till exempel användes protokollet som beskrivs häri nyligen och integrerades med ett mikrofluidiskt organ-på-ett-chip-system för att utveckla en funktionell in vitro-modell av den mänskliga njurgloberulära kapillärväggen. Detta glomerulära chip filtrerade selektivt cirkulerande molekyler och rekapitulerad läkemedelsinducerad nefrotoxicitet när det exponerades för kemoterapiläkemedlet Adriamycin8. I framtiden kan dessa resultat potentiellt integreras med 3D-bioprintingteknik för att konstruera mer komplexa in vitro-modeller av den mänskliga njuren. Sådana framsteg skulle kunna ge nya plattformar för utvärdering av läkemedelskandidater, särskilt de som riktar sig till de former av njursjukdomar som uppstår till följd av dysfunktion av glomerulära podocyter. Detta är särskilt viktigt eftersom de artspecifika skillnaderna mellan djurmodeller och brist på organfunktioner som vanligtvis observeras i standard vävnadskulturmetoder kan hindra utvecklingen av riktade terapier för olika former av mänskliga njursjukdomar25. Detta protokoll skulle således en dag kunna ge möjligheter att riva upp de signalvägar som är involverade i utvecklingen av den mänskliga njuren, liksom patogenesen vid sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
S.M. är författare till ett patent som väntar på metoder för generering av njurkapslar från pluripotenta stamceller (amerikansk patentansökan 14/950859). De återstående författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Pratt School of Engineering vid Duke University, Avdelningen för nefrologi vid Duke Medical School, A Chair's Research Award från Institutionen för medicin vid Duke University och en Burroughs Wellcome Fund PDEP Career Transition Ad Hoc Award till S.M.. M.B stöddes av National Science Foundations Graduate Research Fellowship Program. Vi tackar Bursac Lab för att generöst förse oss med DU11 stamcellslinjen och Varghese Lab vid Duke University för att tillfälligt dela sin vävnadskulturanläggning med vår grupp. Denna publikation är tillägnad prof. Laura L. Kiessling, Novartis professor i kemi vid Massachusetts Institute of Technology, för att firahennes 60-årsdag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | |||
| DU11 human iPS cells | The DU11(Duke University clone #11) iPS cell line was generated at the Duke University iPSC Core Facility and provided to us by the Bursac Lab at Duke University. This line has been tested for mycoplasma and was last karyotyped in July 2019 by our lab, and found to be karyotypically normal. | ||
| Growth Factors and Media Supplements | |||
| All-trans retinoic acid (500 mg) | 72262 | Stem Cell Technologies | |
| B27 serum-free supplement | 17504044 | Thermo/Life Technologies | |
| CHIR99021 | 04-0004 | Stemgent | May show lot-to-lot variation |
| Complete Medium Kit with CultureBoost-R | 4Z0-500-R | Cell Systems | Podocyte maintenance media |
| DMEM/F12 | 12634028 | Thermo/Life Technologies | |
| DMEM/F12 with GlutaMAX supplement | 10565042 | Thermo/Life Technologies | DMEM/F12 with glutamine supplement |
| Heat-inactivated FBS | 10082147 | Thermo/Life Technologies | |
| Human activin A | PHC9564 | Thermo/Life Technologies | |
| Human BMP7 | PHC9544 | Thermo/Life Technologies | |
| Human VEGF | PHC9394 | Thermo/Life Technologies | |
| mTeSR1 medium | 05850 | Stem Cell Technologies | hiPS cell culture media (CCM) |
| Penicillin–streptomycin, liquid (100×) | 15140-163 | Thermo/Life Technologies | |
| Y27632 ROCK inhibitor | 1254 | Tocris | |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488– and Alexa Fluor 594–conjugated secondary antibodies | A32744; A32754; A-11076; A32790 | Thermo/Life Technologies | |
| Brachyury(T) | ab20680 | Abcam | |
| Nephrin | GP-N2 | Progen | |
| OCT4 | AF1759 | R&D Systems | |
| PAX2 | 71-6000 | Invitrogen | |
| WT1 | MAB4234 | Millipore | |
| ECM Molecules | |||
| iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment | N-892012 | Iwai North America | Basement membrane (BM) matrix 2 |
| Matrigel hESC-qualified matrix, 5-mL vial | 354277 | BD Biosciences | Basement membrane (BM) matrix 1. May show lot-to-lot variation |
| Enzymes and Other Reagents | |||
| Accutase | A1110501 | Thermo/Life Technologies | Cell detachment solution |
| BSA | A9418 | Sigma-Aldrich | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | D2438 | Sigma-Aldrich | DMSO is toxic. Should be handled in chemical safety hood |
| Enzyme-free cell dissociation buffer, Hank’s balanced salt | 13150016 | Thermo/Life Technologies | |
| Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade | 97065-058 | VWR | Ethanol is flammable and toxic |
| FBS | 431097 | Corning | |
| Paraformaldehyde (PFA) | 28906 | Thermo/Life Technologies | PFA should be handled in a chemical fume hood with proper personal protection equipment, including gloves, lab coat, and safety eye glasses. Avoid inhalation and contact with skin. |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | 14190-250 | Thermo/Life Technologies | |
| Sterile Distilled Water | 15230162 | Thermo/Life Technologies | |
| Triton X-100 | 97062-208 | VWR | |
| Trypsin-EDTA, 0.05% | 25300-120 | Thermo/Life Technologies | |
| Equipment | |||
| Aspirating pipettes, individually wrapped | 29442-462 | Corning | |
| Avanti J-15R Centrifuge | B99516 | Beckman Coulter | |
| Conical centrifuge tube, 15 mL | 352097 | Corning | |
| Conical centrifuge tube, 50 mL | 352098 | Corning | |
| Cryoboxes | 3395465 | Thermo/Life Technologies | For storing frozen aliquots |
| EVOS M7000 | AMF7000 | Thermo/Life Technologies | Flourescent microscope used to acquire images of fixed and stained iPS cells and their derivatives |
| Hemocytometer | 100503-092 | VWR | |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | 51030403 | Thermo/Life Technologies | For the routine culture and maintenace of iPS cells and their derivatives |
| Inverted Zeiss Axio Observer equipped with AxioCam 503 camera | 491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera) | Carl Zeiss Microscopy | Used to acquire phase contrast images of live iPS cells and their derivatives at each stage of podocyte differentiation |
| Kimberly-Clark nitrile gloves | 40101-346 | VWR | |
| Kimwipes, large | 21905-049 | VWR | |
| Kimwipes, small | 21905-026 | VWR | |
| P10 precision barrier pipette tips | P1096-FR | Denville Scientific | |
| P100 barrier pipette tips | P1125 | Denville Scientific | |
| P1000 barrier pipette tips | P1126 | Denville Scientific | |
| P20 barrier pipette tips | P1121 | Denville Scientific | |
| P200 barrier pipette tips | P1122 | Denville Scientific | |
| Serological pipette, 10 mL, individually wrapped | 356551 | Corning | |
| Serological pipette, 25 mL, individually wrapped | 356525 | Corning | |
| Serological pipette, 5 mL, individually wrapped | 356543 | Corning | |
| Steriflip, 0.22 μm, PES | SCGP00525 | EMD Millipore | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes | 1138W14 | Thomas Scientific | For aliquoting growth factors |
| Tissue culture–treated 12-well plates | 353043 | Corning | |
| Tissue culture–treated six-well plates | 353046 | Corning | |
| VWR white techuni lab coat | 10141-342 | VWR | |
| Wide-beveled cell lifter | 3008 | Corning |
References
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16, 3-32 (2020).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282, 1145 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526, 564-568 (2015).
- Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33, 1193-1200 (2015).
- Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip. Nature Protocols. 13, 1662-1685 (2018).
- Pozzi, A., et al. Beta1 integrin expression by podocytes is required to maintain glomerular structural integrity. Developmental Biology. 316, 288-301 (2008).
- Kanasaki, K., et al. Integrin beta1-mediated matrix assembly and signaling are critical for the normal development and function of the kidney glomerulus. Developmental Biology. 313, 584-593 (2008).
- Musah, S., et al. Mature induced-pluripotent-stem-cell-derived human podocytes reconstitute kidney glomerular-capillary-wall function on a chip. Nature Biomedical Engineering. 1, 0069 (2017).
- Torban, E., et al. PAX2 Activates WNT4 Expression during Mammalian Kidney Development. Journal of Biological Chemistry. 281, 12705-12712 (2006).
- Reiser, J., Sever, S. Podocyte biology and pathogenesis of kidney disease. Annual Review of Medicine. 64, 357-366 (2013).
- Kuusniemi, A. M., et al. Tissue Expression of Nephrin in Human and Pig. Pediatric Research. 55, 774-781 (2004).
- Guo, J. K., et al. WT1 is a key regulator of podocyte function: reduced expression levels cause crescentic glomerulonephritis and mesangial sclerosis. Human Molecular Genetics. 11, 651-659 (2002).
- Roselli, S., et al. Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area. American Journal of Pathology. 160, 131-139 (2002).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Satoh, D., et al. aPKCλ maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. The Journal of Biochemistry. 156, 115-128 (2014).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Reya, T., Clevers, H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature. 434, 843-850 (2005).
- Clevers, H., Nusse, R.
- Ciampi, O., et al. Generation of functional podocytes from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 17, 130-139 (2016).
- Fuente Mora, C., et al. Differentiation of Podocyte and Proximal Tubule-Like Cells from a Mouse Kidney-Derived Stem Cell Line. Stem Cells and Development. 21, 296-307 (2011).
- Chuah, J. K. C., Zink, D. Stem cell-derived kidney cells and organoids: Recent breakthroughs and emerging applications. Biotechnology Advances. 35, 150-167 (2017).
- Becker, G. J., Hewitson, T. D. Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect. Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).
