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Neuroscience

Double injection directe de sang dans la Cisterna Magna comme modèle d’hémorragie subarachnoïde

Published: August 30, 2020 doi: 10.3791/61322
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1University of Rouen Normandy, INSERM U1239, DC2N, Institute for Research and Innovation in Biomedicine (IRIB), Rouen, France, 2Department of Anesthesiology and Critical Care, Rouen University Hospital, Rouen, France

Summary

Nous avons décrit dans ce protocole un modèle normalisé d’hémorragie sous-rachnoïde (SAH) de souris par une double injection de sang entier autologue dans la magna de cisterna. Le degré élevé de normalisation de la procédure de double injection représente un modèle moyen à aigu de SAH avec une sécurité relative en ce qui concerne la mortalité.

Abstract

Parmi les accidents vasculaires cérébraux, l’hémorragie subarachnoïde (SAH) consécutive à la rupture d’un anévrisme artériel cérébral représente 5-9% mais est responsable d’environ 30% de la mortalité totale liée à l’AVC avec une morbidité importante en termes de résultats neurologiques. Un vasospasme cérébral retardé (CVS) peut se produire le plus souvent en association avec une ischémie cérébrale retardée. Différents modèles animaux de SAH sont maintenant utilisés, y compris la perforation endovasculaire et l’injection directe de sang dans la cisterna magna ou même la citerne préchiasmatique, chacun présentant des avantages et des inconvénients distincts. Dans cet article, un modèle normalisé de souris de SAH par double injection directe de volumes déterminés de sang entier autologue dans le cisterna magna est présenté. En bref, les souris ont été pesées puis anesthésiées par inhalation d’isoflurane. Ensuite, l’animal a été placé en position inclinable sur une couverture chauffée maintenant une température rectale de 37 °C et placé dans un cadre stéréotaxique avec un virage cervical d’environ 30°. Une fois en place, la pointe d’une micropipette en verre allongé remplie du sang artériel homologue prélevé sur l’artère carotide d’une autre souris du même âge et du même sexe (C57Bl/6J) a été placée à un angle droit en contact avec la membrane atlanto-occipitale au moyen d’un micromanipulateur. Puis 60 μL de sang a été injecté dans la magna de cisterna suivie d’une inclinaison vers le bas de 30° de l’animal pendant 2 minutes. La deuxième perfusion de 30 μL de sang dans le cisterna magna a été effectuée 24 h après la première. Le suivi individuel de chaque animal est effectué quotidiennement (évaluation minutieuse du poids et du bien-être). Cette procédure permet une distribution prévisible et hautement reproductible du sang, probablement accompagnée d’élévation de la pression intracrânienne qui peut être imitée par une injection équivalente d’un liquide céphalo-rachidien artificiel (CSF), et représente un modèle aigu à doux de SAH induisant une faible mortalité.

Introduction

L’hémorragie subarachnoïde (SAH) représente jusqu’à 5% de tous les cas d’AVC et constitue une pathologie relativement commune avec une incidence de 7,2 à 9 patients pour 100.000 par an, avec un taux de mortalité de 20%-60% selon l’étude1,2,3. Dans la phase aiguë, la mortalité est attribuable à la gravité des saignements, des rebleedings, du vasospasme cérébral (CVS) et/ou des complications médicales4. Chez les survivants, les lésions cérébrales précoces (EBI) sont associées à l’extension parenchymale de l’hémorragie et à l’augmentation abrupte de la pression intracrânienne, qui peut entraîner l’ischémie cérébrale primaire5 et la mort immédiate dans environ 10%-15% des cas6. Après le stade initial « aigu » de la SAH, le pronostic dépend de l’apparition de l’ischémie cérébrale « secondaire » ou retardée (DCI), détectée chez près de 40 % des patients par tomographie calculée cérébrale, et chez jusqu’à 80 % des patients après imagerie par résonance magnétique (IRM)7,8. En plus du CVS se produisant entre 4 à 21 jours après la rupture d’anévrisme dans une majorité de patients de SAH, DCI9 peut résulter des lésions diffuses multifactorielles de cerveau secondaire à la formation de microthrombosis, la perfusion cérébrale réduite, la neuroinflammation, et la dépression corticale de propagation (CSD)10,11,12,13. Cela affecte 30% des survivants de SAH et affecte les fonctions cognitives, y compris la mémoire visuelle, la mémoire verbale, le temps de réaction, et les fonctions exécutives, visuospatiales et de langage14 altérant la vie quotidienne15. Les thérapies standard actuelles pour prévenir cvs et/ou les mauvais résultats cognitifs chez les patients sah sont basées sur le blocage de ca2+ signalisation et vasoconstriction en utilisant les inhibiteurs du canal Ca2 + comme Nimodipine. Cependant, des essais cliniques plus récents ciblant la vasoconstriction ont indiqué la dissociation entre les résultats neurologiques du patient et la prévention du CVS16, suggérant des mécanismes pathophysiologiques plus complexes impliqués dans les conséquences à long terme de SAH. Par conséquent, il est nécessaire de mieux comprendre le nombre d’événements pathologiques accompagnant la SAH et l’élaboration de modèles animaux valides et normalisés pour tester les interventions thérapeutiques originales.

La rupture d’un anévrisme intracrânien principalement responsable de sah chez l’homme est probablement difficile à imiter dans les modèles animaux précliniques. Actuellement, la rupture de l’anévrisme et la situation sah peuvent provisoirement être testés par la perforation de l’artère cérébrale moyenne (modèle de perforation endovasculaire) responsable des dysfonctionnements CVS et sensitivomoteurs chez les souris17,18. En raison de l’absence de tout contrôle possible sur l’apparition du saignement et la diffusion du sang dans ce modèle, d’autres méthodes ont été développées chez les rongeurs pour générer des modèles sah sans rupture endovasculaire. Plus précisément, ils consistent en l’administration directe du sang artériel dans l’espace sous-arachnoïd par une seule ou une double injection dans le magna cisterna19 ou une seule injection dans la citerne préchiasmatique20. Le principal avantage de ces modèles de souris sans rupture endovasculaire est la possibilité de maîtriser reproductiblement la procédure chirurgicale et la qualité et la quantité de l’échantillon de sang injecté. Un autre avantage de ce modèle par perforation endovasculaire en particulier est la préservation du bien-être général de l’animal. En fait, cette chirurgie est moins invasive et techniquement moins difficile que celle nécessaire pour générer une rupture de mur carotide. Dans ce dernier modèle, l’animal doit être intubé et ventilé mécaniquement, tandis qu’un monofilament est inséré dans l’artère carotide externe, et avancé dans l’artère carotide interne. Cela conduit probablement à l’ischémie transitoire due à l’obstruction du navire par la trajectoire de fil. Par conséquent, la comorbidité (état moribond, douleur et mort importantes) associée à la chirurgie est moins importante dans le modèle d’injection double par rapport au modèle de perforation endovasculaire. En plus d’être une SAH plus cohérente, la méthode d’injection double directe est conforme au bien-être des animaux dans la recherche et les tests (réduction du temps sous anesthésie, douleur de perturbation tissulaire dans la chirurgie et la détresse) et conduit à un nombre total minimum d’animaux utilisés pour l’étude du protocole et la formation du personnel.

En outre, cela permet la mise en œuvre du même protocole aux souris transgéniques, conduisant à une compréhension pathologique optimisée de la SAH et la possibilité d’essais comparatifs de composés thérapeutiques potentiels. Ici, nous présentons un modèle normalisé de souris de l’hémorragie sous-arachnoïde (SAH) par une double injection quotidienne consécutive de sang artériel autologue dans le cisterna magna dans 6-8 semaines-vieux mâles C57Bl/6J souris. Le principal avantage de ce modèle est le contrôle du volume de saignement par rapport au modèle de perforation endovasculaire, et le renforcement de l’événement de saignement sans une augmentation drastique de la pression intracrânienne21. Récemment, la double injection directe de sang dans la cisterna magna a été bien décrite sur les questions expérimentales et physiopathologiques chez les souris. En effet, nous avons récemment démontré cvs de grandes artères cérébrales (basilar (BA), milieu (MCA) et antérieur (ACA) artères cérébrales), le dépôt de fibrine céphalo-vasculaire et l’apoptose cellulaire du jour 3 (D3) à 10 (D10), les défauts de circulation du liquide céphalospine paravasculaire accompagné de sensitivomoteur altéré et des fonctions cognitives chez les souris, 10 jours post-SAH dans ce modèle22. Ainsi, il rend ce modèle maîtrisé, validé et caractérisé pour les événements à court terme et à long terme post-SAH. Il devrait être idéalement adapté pour l’identification prospective de nouvelles cibles et pour des études sur des stratégies thérapeutiques puissantes et efficaces contre les complications associées à la SAH.

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Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées sous la supervision de H. Castel conformément au comité d’éthique Français et aux lignes directrices de la directive 2010/63/UE du Parlement européen et du Conseil pour la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Ce projet a été approuvé par la CENOMEXA locale et les comités nationaux d’éthique sur la recherche et l’expérimentation animales. Les souris mâles C57Bl/6J Rj (Janvier), âgées de 8 à 12 semaines, étaient logées dans des conditions environnementales standard contrôlées : 22 °C ± 1 °C, 12 heures/12 heures cycle clair/foncé, et eau et nourriture disponibles ad libitum.

1. Installation de la chirurgie sah et préparation pour l’injection

  1. Avant le début de la chirurgie, tirez un nombre suffisant de capillaires en verre à l’aide d’un puller micropipette. La pipette d’injection doit présenter un diamètre intérieur de 0,86 mm et un diamètre extérieur de 1,5 mm.
  2. Préparer le liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) pour l’état factice.
    1. Préparer une solution avec 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH2PO4, 1,3 mM MgCl2, 10 mM de glucose, 26,2 mM NaHCO3 en H2O, pH 7,4.
    2. Gaz aCSF avec 95% O2 et 5% CO2 pendant 15 min, puis ajouter 2,5 mM CaCl2.
    3. Stériliser l’aCSF oxygéné avec un appareil filtrant de 0,22 μm. La solution aCSF peut être stable pendant 3-4 semaines à 4 °C. Si la contamination (solution devient trouble) ou une formation de dépôt est apparue, jeter et faire aCSF frais.
  3. Collecte de sang d’un donneur de souris homologue
    1. Isoler l’artère carotide le long de la trachée et recueillir la quantité maximale de sang par perforation de l’artère carotide.
    2. Dans la pratique, placez la souris dans une chambre d’anesthésie et chargez la chambre avec 5% d’isoflurane jusqu’à ce que l’animal perde connaissance.
    3. Vérifiez l’absence de réflexes en serrant l’un des deux membres postérieurs pour permettre le réglage de la procédure expérimentale chirurgicale.
    4. Enrober une seringue de 1 mL d’une solution d’héparine à l’aide d’une aiguille de 26 G (héparine sodium). Cela permettra d’éviter la coagulation du sang au cours des prochaines étapes.
    5. Installez l’animal placé dans le decubitus dorsal avec les jambes écartées, et le nez dans un masque d’anesthésie (entretien d’anesthésie avec 2 à 2,5% isoflurane).
    6. Isoler l’artère carotide le long de la trachée en disséquant le muscle omohyoïde longitudinalement. Une fois l’artère isolée, insérez l’aiguille vers le cœur à l’aide du crochet et des forceps microdissecteurs et collectez le maximum de sang par perforation de l’artère carotide (60 μL est nécessaire par souris SAH).
    7. Sacrifiez la souris donneur anesthésiée immédiatement après la collecte de sang en utilisant la dislocation cervicale.

2. Préparation animale (souris mâles C57BL/6J de 8 à 10 semaines)

  1. Peser chaque souris précisément à l’aide d’un équilibre électronique. Dans la présente étude, les souris auraient un poids corporel de l’ordre de 20 à 25 grammes juste avant la chirurgie.
  2. Comme expliqué précédemment (voir les étapes 1.3.2 et 1.3.3), induire l’anesthésie des souris à opérer.
  3. Raser le cou et l’espace entre les oreilles avec une tondeuse électrique appropriée.
  4. Installez l’animal positionné dans le decubitus ventral avec les jambes écartées et le nez dans un masque d’anesthésie (entretien d’anesthésie avec 2 et 2,5% isoflurane) sur un cadre stéréotaxique.
  5. Vérifiez que la souris dort et que sa tête est correctement bloquée.
  6. Injecter sous-cutanéement 100 μL de buprénorphine (0,1 mg/kg) avec une aiguille de 26 G dans le bas du dos, pour éviter la douleur après le réveil.
  7. Prévenir les yeux secs en utilisant du gel liquide protecteur et maintenir une température intrarectale de 37 °C à l’aide d’une couverture électrique autorégulée.
  8. Traiter la zone rasée du cou postérieur avec une solution antiseptique (povidone-iode ou chlorhexidine à l’aide d’une route de coton stérile).
  9. Pré-stériliser tous les instruments touchant la peau préparée/tissu sous-cutané (chauffage à 200 °C pendant 2 heures) et manipuler aseptiquement.

3. Induction sah

  1. Le premier jour (D-1)
    1. Couper une incision de 1 cm avec de minces ciseaux dans le cou postérieur, suivie de la séparation des muscles le long de la ligne médiane pour accéder à la glycine cisterna.
    2. Couper la pointe de la pipette en verre vide avec de minces ciseaux. Ensuite, adaptez-vous à une seringue reliée à un connecteur en silicone flexible.
    3. Transférer 60 μL de sang ou d’aCSF (pour sah ou état de feinte, respectivement) dans un tube de 0,5 mL à l’aide d’une micropiplette de précision.
    4. Aspirez dans la pipette en verre les 60 μL de sang pour l’état sah ou 60 μL d’aCSF pour l’état factice.
    5. Pour l’injection, installez la pipette sur le cadre stéréotaxique à l’aide d’un anneau ou d’un blue-tack et apportez lentement la pointe de la pipette à la membrane à l’interface avec la cisterna magna.
    6. Insérez lentement la pointe de la pipette à travers la membrane atlanto-occipitale dans la cisterna magna, à l’aide d’un micro-manipulateur du cadre stéréotaxique.
    7. Connectez la pipette préalablement remplie de sang ou d’aCSF à la seringue prête pour l’induction sous pression.
    8. Injectez en appuyant sur le piston à un taux faible autour de 10 μL/min, afin d’éviter la pression intracrânienne aiguë.
    9. Pendant l’injection, surveillez de près la fréquence respiratoire et la température rectale.
    10. À la fin de l’injection, retirez soigneusement la pipette par le micro-manipulateur et assurez-vous visuellement qu’il n’y a pas de fuite pendant le retrait.
    11. Atteindre l’hémostase à l’aide d’un hémostat absorbable et exécuter deux sutures avec tressé fil de suture non absorbable.
    12. Immédiatement après la chirurgie, isoler et positionner la souris dans le décubitus déclin et le couvrir avec une couverture de survie dans une boîte ouverte pour la durée de la récupération.
  2. Deuxième jour d’intronisation (D0)
    1. Après 24 heures, induire l’anesthésie (voir les étapes 1.3.2 et 1.3.3). Injecter à nouveau 100 μL de buprénorphine (0,1 mg/kg) et prévenir les yeux secs en utilisant du gel liquide protecteur (voir les étapes 2.7 et 2.8).
    2. Installez l’animal sur le cadre stéréotaxique comme la veille.
    3. Retirer soigneusement les sutures à l’une des microscisseuses.
    4. Préparer la membrane atlanto-occipitale comme avant et appliquer une préparation antiseptique sur la zone rasée du cou à l’aide d’une tige de coton stérile.
    5. Injectez 30 μL de sang ou d’aCSF à faible taux (voir les étapes 3.1.2 à 3.1.8). Surveiller la fréquence respiratoire et la température rectale.
    6. À la fin de l’injection, retirez soigneusement la pipette et contrôlez l’absence de fuite de sang pendant le sevrage.
    7. Atteindre l’hémostase et exécuter deux sutures avec tressé fil de suture absorbable.

4. Suivi postopératoire et fin de l’expérience

  1. Immédiatement après la chirurgie, isoler et positionner la souris dans le décubitus déclin avec une couverture de survie sur le dos dans une boîte ouverte pendant la récupération.
  2. Peser et observer attentivement quotidiennement le comportement de chaque souris jusqu’au sacrifice (p. ex., D7 post-chirurgie).
  3. Parmi les critères d’évaluation humains, une perte de poids significative (>15% du poids) est classiquement remarqué. Une posture « bossu du dos », des mouvements lents, une prostration, des vocalisations anormales de blessures et/ou un comportement agressif important sont également des signes importants de souffrance animale. Si l’un de ces signes ou une combinaison de signes apparaît, la surveillance de l’animal est renforcée dans les heures suivant son apparition. Si le bien-être de l’animal s’aggrave ou ne s’améliore pas dans les 48 heures, on considérera qu’un niveau de souffrance intolérable est atteint et que l’euthanasie est pratiquée.
  4. Au moment de votre choix, sacrifiez les souris anesthésiées par décapitation et récoltez des cerveaux pour d’autres analyses.
  5. Effectuer l’euthanasie (décapitation) après anesthésie isoflurane (5%).

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Representative Results

Chronologie expérimentale, procédure, suivi et mortalité
La figure 1A et la figure 1B résument le protocole du modèle SAH par double injection intracisternale de sang. En bref, le premier jour de l’induction de sah (D-1), 60 μL de sang retiré d’une souris homologue ou 60 μL de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) ont été injectés dans le cisterna magna dans des conditions sah ou de faux, respectivement. Le lendemain (D0), 30 μL de sang retiré d’une souris homologue ou 30 μL d’aCSF ont été injectés dans le cisterna magna dans des conditions sah ou sham, respectivement. Vingt-quatre heures après la chirurgie, le meurtre de souris et l’analyse du cerveau ont permis d’observer la distribution de sang dans les espaces paravasculaires comme illustré dans la figure 1C. En tant qu’indicateur sensible pour le bien-être général de D1 au sacrifice, le poids corporel a été évalué quotidiennement de la D1 à D8 et a montré un gain de poids corporel sensible réduit dans sah comparé aux animaux factices de D1 à D8 (Figure 1D), suggérant un processus de récupération à long terme et des événements pathologiques prolongés post-SAH. La mortalité postopératoire était de 26,7 % à D7, la plupart des animaux mouraient sur D1 ou D4 après une intervention chirurgicale (figure 1D). La perfusion transcardique d’encre indienne à D5 a permis l’observation du CVS macroscopique comme illustré à la figure 1C.

Vasospasme cérébral après SAH
Comme l’ont montré El Amki et coll.22, CVS de l’artère basilaire (BA), l’artère cérébrale moyenne (MCA) et l’artère cérébrale antérieure (ACA) était présent dans le modèle sah par double injection intracisternale de sang dans l’ACA, MCA ou BA de D3 à D10 post-chirurgie. Brièvement (figure 2A), après sacrifice et décapitation de souris, les cerveaux ont été récoltés et post-fixés en paraformaldéhyde de 4 %, puis congelés à -80 °C, avant d’être coupés en tranches transversales de 20 μm à l’aide d’un cryostat. La coloration de l’hématoxyline et de l’éosine a été effectuée pour BA (interaural 0,40 mm; bregma -3,40 mm), MCA (interaural 2,58 mm; bregma -1,22 mm) et ACA (interaural 4,90 mm; bregma 1,10 mm) pour permettre l’identification CVS par l’acquisition systématique d’images de tranches colorées à l’aide d’une caméra montée au microscope. Afin d’évaluer l’absence ou la présence de CVS macroscopique, le rapport d’épaisseur de la zone lumen/mur a été calculé pour chaque artère tachée. Plus le ratio est bas, plus le CVS est sévère. Ainsi, un CVS s’est produit dans ba dans les cerveaux sah comparés au cerveau de souris factice (figure 2B) mais également dans d’autres grandes artères cérébrales (MCA, ACA, données non montrées22).

Dysfonctionnements sensitivomoteurs après sah
La mesure des déficits moteurs spécifiques, bien décrite dans ce modèle sah par El Amki et coll.22 et Clavier et al.23, peut être considérée comme un critère d’évaluation principal des résultats pour tester des cibles thérapeutiques spécifiques régulant ces effets à long terme associés à la SAH. En bref (figure 3A), à D6 après la chirurgie, chaque souris a été évaluée dans le test en plein champ pendant 10 minutes. Au moyen du logiciel ANY-maze version 4.99, la distance parcourue et le nombre d’élevage et de penchement ont été enregistrés. Vingt-quatre heures après l’essai en plein champ, chaque souris a participé à trois sessions successives de l’essai de marche par faisceau impliquant, après une période d’accoutumance du dispositif, la mesure du temps total de marche, le temps d’atteindre la plate-forme et le nombre de voyages. Les résultats ont été exprimés en moyenne de trois séances. Comme l’ont montré El Amki et coll.22, les dysfonctionnements sensitivomoteurs évalués par le test de marche par faisceau à D10 après la chirurgie se sont avérés présents dans le modèle SAH (Figure 3B). À D9, l’activité spontanée des souris évaluées par l’essai en champ ouvert pendant 10 minutes, a également été significativement affectée par la SAH détectée par la distance franchie et l’activité verticale par rapport à l’état fictif (Figure 3C).

Figure 1
Figure 1. Conception expérimentale, intervention chirurgicale, distribution de sang, vasospasme macroscopique, poids corporel et mortalité après SAH. (A) Diagramme schématique montrant la conception expérimentale de ce protocole. D-1 et D0 représentent les jours de la chirurgie avec une double injection de 60 et 30 μL d’aCSF (Sham) ou de sang (SAH) dans la cisterna magna, respectivement. De D1 à D8, les souris ont été observées quotidiennement et pesées. À D1, des cerveaux ont été récoltés pour observer la distribution de sang dans les espaces paravasculaires (C). Les D6 et D7 ont été choisis comme fenêtre de temps optimisée pour les analyses comportementales, y compris les tests de marche en champ ouvert et en faisceau. À D8, les cerveaux ont été échantillonnés pour évaluer CVS, comme indiqué macroscopiquement dans (C). (B) Procédure chirurgicale d’injection de sang dans le cisterna magna. Le sang a été recueilli à partir de l’artère carotide d’une souris homologue. Après la préparation et l’installation d’animaux sur le cadre stéréotaxique, une incision de nuque a été effectuée dans le cou postérieur, les muscles postérieurs ont été séparés, et puis les muscles sous-jacents ont été disséqués pour ouvrir un accès à la membrane vascularisée délimitant la magna de cisterna. La pipette a été insérée dans la cisterna magna avant l’injection de sang. (C) Illustration de la distribution de sang dans les espaces paravasculaires vingt-quatre heures après chirurgie et de CVS macroscopique après perfusion transcardique de l’encre indienne cinq jours après chirurgie dans SAH comparée à l’état de Sham. (D) Évolution du poids de D-1 à D8 post-chirurgie chez les souris Sham (n=10) et SAH C57Bl/6J (n=15). Les souris SAH ont montré une diminution du pourcentage de gain de poids corporel de D1 à D8 par rapport aux souris factices (p<0.01). ANOVA avec le test post hoc de Bonferroni pour de multiples tests de comparaison. Courbe de survie après la chirurgie chez les souris factices (n=10) et SAH C57Bl/6J (n=15). Les données ont été exprimées sous forme de courbes Kaplan Meier. Les souris sah ont montré une mortalité plus importante à D7 après la chirurgie comparée aux souris factices (p<0.05). Test Mantel-Cox. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Conception expérimentale pour l’analyse cérébrale de vasospasme et le cours de temps du vasospasme cérébral dans l’artère basilaire après SAH. (A) Diagramme schématique montrant la conception expérimentale du protocole pour la quantification cvs. Après la post-fixation par 4% PFA, les cerveaux congelés ont été tranchés en série à l’aide d’un cryostat en tranches transversales de 20 μm sur des lames de verre enduites de gélatine. L’hématoxyline et l’éosine (H&E) ont été effectuées à partir de tranches cérébrales portant ACA, MCA et BA. Des microphotographies ont été acquises à l’aide d’une caméra montée au microscope à un grossissement de 200x. La zone de Lumen et l’épaisseur de la paroi du navire ont été quantifiées à l’aide d’ImageJ par une méthode simple à l’aveugle. (B) Cours de temps de CVS en BA après SAH. Microphotographies représentatives de la coloration H&E montrant la morphologie ba (zone de lumen et épaisseur de mur) dans les tranches de cerveau de faux et de SAH à D7 post-SAH. Quantification des histogrammes du rapport d’épaisseur de la zone lumen/mur montrant cvs dans le BA de D3 à D10 après la chirurgie (*, p<0.05). Les données ont été exprimées en moyenne ± SEM. n=6/condition. ANOVA avec le test post hoc de Bonferroni pour de multiples comparaisons. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. Conception expérimentale pour l’analyse comportementale des déficits sensibleivomoteurs à long terme après SAH. (A) Diagramme schématique montrant la conception expérimentale du protocole d’analyse comportementale après SAH. En bref, à D6 après la chirurgie, le comportement d’activité motrice des souris a été évalué par un essai en champ ouvert pendant 10 minutes, dans lequel la distance couverte et le nombre d’élevage et de penchement a été enregistré. Après une période de repos de 24 h, le comportement sensitivomoteur des souris a été évalué par le test de marche par faisceau, dans lequel le temps de marche, le temps d’atteindre la plate-forme et le nombre de voyages ont été enregistrés. (B) D’El Amki et coll.22: Dans le test de marche par faisceau, les souris SAH ont montré un nombre accru de voyages par rapport aux commandes à D7 (**, p<0,01), D10 (***, p<0,001) et D14 (*, p<0,05) et avec des souris factices à D10 (*, p<0,05). (C) D’El Amki et coll.22: Les souris SAH ont montré une distance réduite franchie (*, p < 0,05) et l’activité verticale par rapport aux souris Sham à D9 (*, p< 0,01). ANOVA suivi du test de comparaisons multiples de Sidak. Les données ont été exprimées en moyenne ± SEM. n=10-12/condition. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Malgré l’intensité de la recherche dans le domaine de la SAH et le développement de stratégies thérapeutiques telles que les options de traitement endovasculaire et pharmacologique augmentant au cours des vingt dernières années, la mortalité reste élevée au cours de la première semaine d’hospitalisation et atteint environ 50% au cours des 6 mois suivants24,25. Ce modèle préclinique actuel par double injection quotidienne de sang artériel homologue dans le cisterna magna a été reconnu pour sa validité et son association avec un faible taux de mortalité. En effet, parmi les modèles de rongeurs SAH, un large éventail de taux de mortalité a été signalé: 0-16% mortalité avec injection de sang unique dans cisterna magn26,27,28,29,30,31,32,33,3434,35, 10-33% mortalité avec injection de sang dans cister préchiasmatique20,27,36,37, 16-66% mortalité dans le modèle par perforation endovasculaire38,39,40,41,42,43,44,45 et 0-43% avec le modèle par double injection de sang dans cisterna magna34,35,46,47,48. Le faible taux de mortalité dans le modèle (9% ou 27%, selon l’âge des souris) peut résulter de la faible quantité de sang injecté, la durée lente de l’injection, et l’inclinaison de l’animal évitant la pression localisée sur le tronc cérébral, par rapport à d’autres modèles à double injection. Chez les patients atteints de SAH, la fenêtre de l’occurrence de CVS est classiquement détectée à la post-hémorragie de D4-D10. Toutefois, chez les animaux, le temps d’apparition et la durée du CVS sont moins étudiés et peuvent varier d’un modèle hsa à l’autre, probablement selon les protocoles expérimentaux et les espèces animales21.

Dans ce contexte, le modèle ressemble ici à la physiopathologie clinique sah en termes de CVS sah-associé. En général, dans le modèle de perforation endovasculaire, CVS se produit dans le MCA et BA après 1 heure chez les rats40 et après 3 jours chez les souris17. Dans le modèle par injection de sang dans la citerne préchiasmatique, l’occurrence de CVS a été montrée entre deux49 et huit jours37 chez des rats. Dans le modèle de double injection dans le cisterna magna chez les rats, CVS développe entre 10 minutes29 et 3 jours31. Nous sommes les premiers à décrire la cinétique de l’apparence de CVS dans un modèle de souris de SAH par double injection, établissant CVS dans les artères cérébrales principales (ACA, MCA et BA) depuis 3 jours et étant soutenu jusqu’au 10ème jour post-SAH22, proche de ce qui est observé chez les patients SAH. Ce dernier modèle pourrait être défini comme un modèle qualifié de SAH, assez sévère sans mortalité, permettant l’étude des mécanismes et des thérapies ciblant CVS.

Toutefois, ce modèle sah souris peut également présenter certaines limites. Le premier point est l’absence de rupture de la paroi du vaisseau, comme peut-être reproduit dans le modèle sah induite par la collagènease, par la destruction / digestion des vaisseaux sanguins basal lamina50. En ce qui concerne l’occurrence du CVS macroscopique, le flux sanguin cérébral réduit (CBF) dans quelques territoires de cerveau n’est pas systématiquement corrélé avec le résultat neurologique, ainsi CBF devrait être évalué dans ce modèle proposé de SAH. Des études antérieures sur le rat utilisant la flowmétrie laser doppler dans un modèle sah de double injection ont démontré la diminution aiguë de la CBF à 30–52 % par rapport à la ligne de base après la première injection, avec un retour à la ligne de base après 2 à 3 jours après l’injection51,52,53. En accord, il a été montré par l’IRM une diminution de CBF de 33-50% à D3 et 27-44% à D5 après l’induction SAH dans les modèles rat double injection54,55. La double injection dans la cisterna magna permet une distribution prévisible du sang le long de l’espace sous-arachnoïde, résultant en particulier dans les caillots sanguins autour de la circulation postérieure, mais peut introduire des variations dans les paramètres physiologiques. Pour éviter que la pression intracrânienne (PIC) ne s’élève avec le volume de sang injecté entrant dans le canal spinal, les deux conduisant à confondre les déficiences fonctionnelles56, le choix d’enlever un volume équivalent de liquide céphalo-rachidien pourrait être fait, comme précédemment fait dans d’autres modèles30,51. Dans le modèle ici, les souris factices ont reçu un volume équivalent d’aCSF ou physiologique 0,9% NaCl, selon l’expérience, conduisant évidemment à une hausse de l’ICP. Ainsi, une augmentation aiguë du PIC entraîne une augmentation de 18 mmHg à 120 mmHg27,48,53 dans l’injection unique de sang dans le modèle de cisterna magna, de 46 à 107 mmHg27,37,49 dans le modèle préchiasmatique d’injection de sang de citerne, et de 27 à 110 mmHg 39,40,53,57,58 dans le modèle de perforation endovasculaire. En revanche, la double injection de sang dans le cisterna magna a été associée à une augmentation plus faible ICP de 60 à 67 mmHg48,53. En outre, l’action de suppression du CSF modifierait également le PIC et modifierait le FSC. Dans le modèle SAH ici, la décision était de ne pas enlever le CSF avant l’injection de sang, mais d’accompagner la chirurgie par une procédure consistant à hilting la tête de l’animal de 30°. L’objectif est d’atténuer ICP en permettant la distribution du sang dans la circulation antérieure, une étape importante et nécessaire pour imiter la physiopathologie humaine sah. Chez les patients atteints de SAH, une forte augmentation du PIC est détectée et est associée à une ischémie cérébrale mondiale transitoire59, contribuant probablement à une déficience soutenue de l’autorégulation et de la perte précoce de cellules neuronales60. Cependant, après le premier événement post-SAH, un drainage ventriculaire externe précoce est souvent adopté pour les patients concernés SAH, pour éviter l’enflure du cerveau et l’hydrocéphalie61. Ici, le modèle sah à double injection peut ne pas être grave lors du premier événement de saignement pour provoquer les conséquences ICP-dépendante observées chez les patients, mais probablement reproduire un ICP soutenu et doux amélioré pendant des jours après-SAH.

En outre, un autre paramètre incontrôlé dans le modèle sah ici était les variations potentielles de la pression artérielle moyenne (MABP) induite par la procédure d’injection de sang excessivement rapide27. En effet, MABP augmente généralement fortement après SAH expérimental pour préserver la pression de perfusion cérébrale et par la suite, tombe à la ligne de base. Dans le modèle SAH ici, nous avons injecté du sang ou de l’aCSF (~ 10 μL/min) à un faible taux pour éviter ces variations MABP. En ce qui concerne les événements neurobiologiques dans ce modèle imitant ceux observés chez l’homme, nous avons précédemment montré que le modèle d’injection de sang double de SAH induit cvs de longue durée, formation de microthrombosis et lésions cérébrales cérébrales, y compris le défaut dans la diffusion paravasculaire potentielle du jour 3 au jour 10 post-SAH22. Toutefois, des données récentes décrivant que la CSD est impliquée dans le DCI13 associé à la SAH appuient fortement la poursuite de ce type d’enquêtes dans le modèle de souris de double injection. Cela devrait permettre des percées scientifiques sur l’impact bénéfique de nouvelles thérapies ciblant la CSD.

Pour conclure, le modèle de double injection de sang artériel entier dans le cisterna magna est un modèle maîtrisé qui permet un moyen facile d’imiter la physiopathologie humaine SAH, y compris CVS, microthrombose, inflammation vasculaire, déficits neurologiques et le taux de mortalité. Il représente un modèle validé pour tester de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter la morbi-mortalité associée à la SAH.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions la plate-forme PRIMACEN (Université Normandie Rouen, France) pour les équipements d’imagerie et M. Arnaud Arabo, Mme Julie Maucotel et Mme Martine Dubois, pour le logement et les soins aux animaux. Nous remercions Mme Celeste Nicola d’avoir prêté sa voix à l’enregistrement vidéo du protocole. Ce travail a été soutenu par le programme de maturation seinari Normandie, fondation AVC sous l’égide de la FRM, normandie Rouen University et Inserm. La Région Normandie et l’Union européenne (projet 3R). L’Europe s’implique en Normandie avec le Fonds européen de développement régional (FEDER).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
absorbable hemostat Ethicon Surgicel
absorbable suturing thread Ethicon Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket Harvard Apparatus 50-7087-F
bluetack for capillary fixation UHU Patafix
electronic balance Denver Instrument MXX-2001
glass capillaries Harvard Apparatus GC150F-15 inner diameter 0.86 mm
outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer Phymep V100
micropipette puller Sutter Instrument Company P-97
needle 26 G BD microbalance 300300
non absorbable suturing thread Peters surgical Filapeau 4.0
stereotaxic frame David Kopf instruments Model 902
surgical equipment Kent scientific clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO Thermofisher 11866071

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Neuroscience Numéro 162 Hémorragie subarachnoïde cisterna magna souris vasospasme modèle animal test sensitivo-moteur sang
Double injection directe de sang dans la Cisterna Magna comme modèle d’hémorragie subarachnoïde
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Pedard, M., El Amki, M.,… More

Pedard, M., El Amki, M., Lefevre-Scelles, A., Compère, V., Castel, H. Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage. J. Vis. Exp. (162), e61322, doi:10.3791/61322 (2020).

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