Live-Cell Forward генетический подход к выявлению и изоляции развития мутантов в Chlamydia trachomatis
Summary
Этот протокол использует флуоресцентные промоутер-репортеры, живая микроскопия клеток, и индивидуальное включение экстракции в направленном вперед генетический подход для выявления и изоляции развития мутантов Chlamydia trachomatis.
Abstract
Внутриклеточный бактериальный патоген Chlamydia trachomatis проходит цикл развития, состоящий из двух морфологически дискретных форм развития. Невоспроизводимое элементарное тело (EB) инициирует заражение хозяина. Оказавшись внутри, EB дифференцирует в тело срешы (RB). ЗАТЕМ RB проходит несколько раундов репликации, прежде чем дифференцировать обратно в инфекционную форму EB. Этот цикл имеет важное значение для выживания хламидий, так как неспособность переключаться между типами клеток предотвращает вторжение или репликацию хозяина.
Ограничения в генетических методах из-за обязательного внутриклеточного характера хламидиоза препятствовали идентификации молекулярных механизмов, участвующих в развитии клеточного типа. Мы разработали новую двойную систему плазмидного промоутера-репортера, которая в сочетании с 7-клеточной микроскопией позволяет осуществлять визуализацию переключения типа клеток в режиме реального времени. Для выявления генов, участвующих в регуляции развития клеточного типа, живая система промоутера-репортера была использована для развития передового генетического подхода путем объединения химического мутагенеза двойного штамма репортера, визуализации и отслеживания хламидиоза с измененной кинетикой развития, за которой последовала клональная изоляция мутантов. Этот передний генетический рабочий процесс является гибким инструментом, который может быть изменен для направленного допроса в широкий спектр генетических путей.
Introduction
Chlamydia trachomatis (Ctr) является обязательным внутриклеточным патогеном, который прогрессирует через двухфазный цикл развития, который необходим для его выживания и распространения1. Этот цикл состоит из двух форм развития, элементарного тела (EB) и тела сгностика (RB). EB является репликация некомпетентным, но посредни в средствах клеточного вторжения через эффектор индуцированного эндоцитоза2. Оказавшись в хосте, EB созревает до репликационого RB. РБ проводит несколько раундов репликации до преобразования обратно в EB для того, чтобы инициировать последующие раунды инфекции.
Ограниченный спектр генетических инструментов ограничил большинство хламидийных исследований биохимическими исследованиями или использованием суррогатных систем. Как следствие, выяснение регуляции генов и контроля цикла развития было трудно3,4. Одной из наиболее важных проблем в хламидийной области является временное отслеживание хламидийного цикла развития с высоким разрешением и выявление белков, участвующих в его регулировании. Выражение гена во время цикла развития хламидий традиционно выполняется разрушительными методами «конечной точки», включая RNAseq, qPCR и фиксированную клеточную микроскопию5,,6. Хотя эти методы предоставили бесценную информацию, используемые методы являются трудоемкими и имеют низкое временное разрешение5,6.
В течение последнего десятилетия, генетические манипуляции Ctr прогрессировала с введением плазмидной трансформации и методы для мутагенеза7,8,9. Для этого исследования была разработана плазмидная система для мониторинга развития хламидий в отдельных включениях в режиме реального времени в течение инфекции. Хламидиальный трансформант был создан, что выразил как РБ и EB ячейки типа конкретных промоутер-репортер. RB конкретных репортер был построен путем слияния промоутер раннего гена РБ euo вверх по течению флуоресцентного белка клевера. EUO является транскрипционного регулятора, который подавляет подмножество поздних ЕБ связанных генов10. Промоутер hctB, который кодирует гистоноподобный белок, участвующий в конденсации Э.Б. нуклеоида, был клонирован непосредственно вверх по течению mKate2 (RFP) для создания специального репортераEB 11. Основой для hctBвыпускного-mKate2/euoprom-Clover был p2TK2SW27. Промоутеры HCTB и euo были усилены геномной ДНК Ctr-L2. Каждая последовательность промоутеров состояла из 100 базовых пар вверх по течению от прогнозируемого места начала транскрипции для указанного хламидиального гена плюс первые 30 нуклеотида (10 аминокислот) соответствующего ORF. Флуоресцентные варианты FP были коммерчески получены как Ctr codon оптимизированные блокы гена и клонированы в кадре с первыми 30 нуклеотидами каждого хламидиального гена и промотора. Терминатор incD был клонирован непосредственно вниз по течению от mKate2. Второй промоутер-репортер был вставлен вниз по течению от incD терминатора. Ген резистентности ампициллина(bla)в p2TK2SW2 был заменен геном аада (Сопротивление Spectinomycin) от pBam4. Это привело к окончательной конструкции p2TK2-hctBвыпускного вечера-mKate2/euoprom-Clover(рисунок 1A),которая была преобразована в Ctr-L27. Это РБ / EB репортер штамм позволил для наблюдения цикла развития в рамках одного включения с использованием живоклеточной микроскопии (Рисунок 1B,C).
Используя наш промоутер-репортер построить в сочетании с химическим мутагенезом, протокол был разработан для отслеживания и изоляции отдельных клонов, которые выставлены отклонения развития от мутагенизированных популяций Ctr serovar L2. Этот протокол позволяет осуществлять прямой мониторинг отдельных хламидийных включений, отслеживать профили экспрессии генов с течением времени, выявлять хламидидиальные клоны, выражаюющие измененную модель экспрессии генов развития, и клональную изоляцию хламидиоза от отдельных включений.
Хотя этот протокол был создан специально для выявления генов, участвующих в развитии хламидий, он может быть легко адаптирован для допроса любого количества хламидийных генетических путей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рассечение механизмов, контролирующих цикл развития хламидий, было затруднено ограничениями имеющихся в настоящее время генетических инструментов. Используя наш промоутер-репортер Chlamydia в сочетании с живой клеткой автоматизированной микроскопии, система была построена, котора?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Андерса Омсленда из Университета штата Вашингтон за поставку CIP-1 axenic средств массовой информации. Эта работа была поддержана грантом NIH R01AI130072, R21AI135691 и R21AI113617. Дополнительная поддержка была оказана стартап-фондами из Университета Айдахо и Центра моделирования комплексных взаимодействий через их грант NIH P20GM104420.
Materials
| 24-well polystyrene plates | Corning | 3524 | Cell culture growth for reinfection of isolates |
| 6-well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | Cell culture growth for imaging |
| 96-well glass bottom plates | Nunc | 165305 | Cell culture growth for imaging |
| Bold line CO2 Unit | OKO Labs | CO2 UNIT BL | Stage incubator CO2 control |
| Bold line T Unit | OKO Labs | H301-T-UNIT-BL-PLUS | Stage incubator temperature control |
| Borosilicate glass capillary tubes | Sutter Instrument | B1005010 | Capillary tubes |
| BrightLine bandpass emissions filter (514/30nm) | Semrock | FF01-514/30-25 | Fluoescent filter cube |
| BrightLine bandpass emissions filter (641/75nm) | Semrock | FF02-641/75-25 | Fluoescent filter cube |
| CellTram Vario | Eppendorf | 5196000030 | Microinjector |
| Chlamydia trachmatis serovar L2 | ATCC | VR-577 | Chlamydia trachomatis |
| CIP-1 media | In house | NA | Axenic media. IPB supplemented with 1% FBS, 25 μM amino acids, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT, and 50 μM GTP, UTP, and CTP. (Omsland, A. 2012) made in-house. |
| Cos-7 cells (ATCC) | ATCC | CRL-1651 | African green monkey kidney cell (host cells) |
| Cycloheximide | MP Biomedicals | 194527 | Host cell growth inhibitor |
| Ethyl methanesulfonate, 99% | Acros Organics | AC205260100 | Mutagen |
| Fetal Plex | Gemini Bio-Products | 100-602 | Supplement for base growth media |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/Fiji | NA | Open sourse Image analysis software. https://imagej.net/Fiji |
| Galaxy 170 S CO2 incubator | Eppendorf | CO1700100X | Cell culture incubation |
| gblocks (Fluorescent FP variants: Clover and mKate2) | Integrated DNA Technologies | NA | gblock ORFs of Ctr optimized FP varients for cloning into p2TK2SW2 |
| Gentamycin 10mg/ml | Gibco | 15710-064 | Antibiotic for growth media |
| HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) | Corning | 21-020-CM | Host cells rinse |
| Heparin sodium | Amersham Life Science | 16920 | inhibits and reverses the early electrostatic interactions between the host cell and EBs |
| HEPES 1M | GE Life Sciences | SH30237.01 | pH buffer for growth media |
| InjectMan | Eppendorf | 5179 000.018 | Micromanipulator |
| Jupyter Notebook | https://jupyter.org/ | NA | Visualization of inclusion traces. https://jupyter.org/ |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | LB10-3 | Filter wheel controler |
| Oko Touch | OKO Labs | Oko Touch | Interface to control the Bold line T and CO2 Unit |
| Prior XY stage | Prior | H107 | Motorized XY microscope stage |
| PrismR Centrifuge | Labnet | C2500-R | Temperature controlled microcentrifuge |
| Problot Hybridization oven | Labnet | H1200A | Rocking Incubator for infection with Chlamydia |
| Proscan II | Prior | H30V4 | XYZ microscope stage controler |
| Purifier Class 2 Biosafety Cabinet | Labconco | 362804 | Cell culture work |
| RPMI-1640 (no phenol red) | Gibco | 11835-030 | Base growth media for imaging |
| RPMI-1640 (phenol red) | GE Life Sciences | SH30027.01 | Base growth media |
| scopeLED excitation LEDs (470nm,595nm) | scopeLED | F140 | Excitation light |
| Sonic Dismembrator Model 500 | Fisher Scientific | 15-338-550 | Sonicator, resuspending chlamydial pellet |
| Stage incubator | OKO Labs | H301-K-FRAME | Cluster well plate incubation chamber |
| sucrose-phosphate-glutamate buffer 1X (SPG) | In house | NA | Chlamydial storage buffer. (10 mM sodium phosphate [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutamic acid; pH 7.4) |
| T-75 Flasks | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture growth |
| TE 300 inverted microscope | Nikon | 16724 | microscope |
| THOR LED | Thor Labs | LEDD1B | White light |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | Dislodges host cells from flask for seeding into plates |
| Zyla sCMOS | Andor | ZYLA-5.5-USB3 | imaging camera |
| µManager 2.0gamma | https://github.com/micro-manager/micro-manager | NA | Open sourse automated microscope control software package |
References
- AbdelRahman, Y., Belland, R. The chlamydial developmental cycle. FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).
- Clifton, D., et al. A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).
- Yu, H. H. Y., Tan, M. σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia. Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).
- Koo, I., Stephens, R. A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).
- Grieshaber, S., et al. Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity. Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065 (2018).
- Belland, R., et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).
- Wang, Y., et al. Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
- Nguyen, B., Valdivia, R. Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).
- Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. MBio. 7 (1), 01817 (2016).
- Rosario, C. J., Tan, M. The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes. Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).
- Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity. Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).
- Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).
- Su, H., et al. A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).
- Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Plotly Technologies Inc. . Collaborative data science. , (2015).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).
- Sega, G. A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate. Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).
- Ferguson, L., Denny, W. Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands. Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).
