Summary
Tek taraflı üreteral obstrüksiyonu (UUO) olan farelerin böbreklerinde mikroRNA ekspresyonunu kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile değerlendirmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokol UUO ile farelerde ve diğer patolojik durumlar bağlamında böbrek mikroRNA ekspresyon profillerinin incelenmesi için uygundur.
Abstract
MicroRNA'lar (miRNA'lar), mRNA'nın çevirisini ve stabilitesini azaltan messenger RNA'nın (mRNA) 3' çevrilmemiş bölgesinde (UTR) kısmen tamamlayıcı hedef bölgelere bağlanarak gen ekspresyonunu transkripsiyon sonrası düzeyde düzenleyen tek iplikli, kodlamayan RNA molekülleridir. Farelerin çeşitli organ ve dokularında miRNA ekspresyonu profilleri araştırılmış, ancak fare böbreğindeki miRNA'nın saflaştırılması ve nicelleştirilmesi için standart yöntemler bulunmamaktadır. Fare böbreğinde miRNA ekspresyonunun alınması ve değerlendirilmesi için etkili ve güvenilir bir yöntem oluşturduk. Protokol beş adım gerektiriyordu: (1) sahte ve tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) farelerin yaratılması; (2) UUO farelerböbrek örneklerinin çıkarılması; (3) böbrek örneklerinden miRNA içeren toplam RNA çıkarma; (4) tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi miRNA ters transkripsiyon ile; ve (5) qRT-PCR cDNA kullanarak. Bu protokolü kullanarak, kontrollere göre miRNA-3070-3p ekspresyonunun anlamlı olarak arttığını, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p ekspresyonunun renal interstisyel fibrozisin fare modelinin böbreklerinde önemli ölçüde azaldığını başarıyla doğruladık. Bu protokol UUO ile farelerin böbreklerinde miRNA ekspresyonu belirlemek için kullanılabilir.
Introduction
MikroRNA'lar (miRNA'lar) — haberci RNA'nın (mRNA)1 bozulmasına ve transkripsiyonel inhibisyonuna neden olan kısa, kodlayıcı olmayan RNA'ların, hem fizyolojide hem de hastalıkta (örn. inflamasyon, fibrozis, metabolik bozukluklar ve kanser) önemli rolleri olan çeşitli mRNA'ların ekspresyonunu düzenlediği gösterilmiştir. Bazı miRNA'lar bu nedenle çeşitlihastalıklariçin aday yeni biyobelirteçler ve tedavi hedefleri 2 ,3,,4,5olabilir. Beyin, kalp, akciğer, karaciğer ve böbrek gibi fare organlarıve dokularda miRNA ekspresyon profilleri6,7,8,9,10olarak tanımlanmış olmasına rağmen, böbrek interstisyel fibrozisli fare böbreği miRNA'ların çıkarılması ve değerlendirilmesi için standart bir yöntem bulunmamaktadır.6
Renal interstisyel fibrozisli farelerin böbreklerinde miRNA ifadelerini güvenilir bir şekilde arındırmak ve tespit etmek için bir protokol tasarladık. Protokol aşağıdaki gibi beş ana adımdan oluşur. (1) 8 haftalık C57BL/6 erkek fareler, renal interstisyel fibroza bağlı tek taraflı üreteral obstrüksiyon (UUO) sağlayan bir ameliyata tabi tutulan fare grupları (kontroller) ve farelere ayrılır. (2) Böbrek örnekleri sham ve UUO fareler, bir silikon homogenizer ayrı ayrı homojenize ve daha sonra bir mikrosantrifüj spin sütun11,,12bir biyopolimer parçalama sistemine aktarılır ayıklanır. (3) MiRNA içeren toplam RNA böbrek örneklerinden silika membran tabanlı spin sütun12,13ile elde edilir. (4) Bu çıkarılan toplam RNA kullanılarak, tamamlayıcı DNA (cDNA) ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT astar14,15kullanımı ile toplam RNA sentezlenir. (5) miRNA'ların ifadeleri kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR)14,15ile incelenir.
Bu protokol, çeşitli dokularda miRNA'ların anlamlı ekstraksiyonve değerlendirmeleri elde edilen araştırmalara dayanmaktadır11,12,13,14,15, ve protokolde kullanılan biyopolimer-parçalama sistemi 2006 yılında dokulardan yüksek kaliteli, toplam RNA arındırmak için gösterilmiştir12. Buna ek olarak, önceki çalışmalar da protokolün yönlerinin doğruluğunu ve hassasiyetini (yani ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT astarları ile ekstre toplam RNA) qRT-PCR ile miRNA ekspresyonunun belirlenmesi için ters bir boya14,15. Yeni protokol basitlik, zaman tasarrufu ve teknik hataların azaltılması avantajlarına sahip olduğundan, protokol fare böbreği miRNA profilinin doğru ve hassas bir şekilde tanımlanmasını gerektiren araştırmalarda kullanılabilir. Ayrıca protokol birçok patolojik durum la ilgili araştırmalara da uygulanabilir.
Daha sonra uuo ile farelerde miRNA ekspresyon profillerinin belirlenmesi ni açıklayacağız, bu da renal interstisyel fibrozis ile bağlantılıdır. İnsanlarda renal interstisyel fibrozis hem kronik böbrek hastalığının hem de son dönem böbrek hastalıklarının16,17yaygın ve önemli bir özelliğidir. Bu renal interstisyel fibrozis böbrek yetmezliğinin ilerlemesi ile ilişkilidir, ve interstisyel alanlarda ekstrasellüler matriks bileşenlerinin artan ekspresyonları ile karakterizedir (örneğin, kollajen, fibronektin, ve α-düz kas aktin)17,18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneysel protokolleri Jichi Tıp Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Jichi Tıp Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Rehberi'nden Deneysel Hayvanların Kullanımı ve Bakımı yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Sahte cerrahi
- Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: isoflurane, mantar levha, tüy dökücü krem, laboratuvar mendilleri, fosfat tamponlu salin (PBS), 4-0 naylon, cımbız, cerrahi makas, pamuklu swabs ve 8 haftalık C57BL /6 erkek fareler ile Petri çanak.
- % 1.5 izofluran eile bir fare anestezi keleve% 1.5 korumak. Daha sonra farenin karnına tüy dökücü krem uygulayın. Birkaç dakika sonra, tüy dökücü kremi PBS'li bir laboratuvar mendiliyle silin.
- Farenin karnına %70 etanol enjekte edin ve fareyi supine pozisyonunda mantar tabakasının üzerine yerleştirin.
- Cerrahi makas ve cımbız kullanarak, karın deride bir kesi yapmak ve kaburga sol alt kenarına mesane kas ve periton zarı kesti.
- PBS ile iki pamuklu bez nemlendirin ve sonra dikkatle yan bağırsakçekin. Sol böbrek ve üreter tanımlamak için nemlendirilmiş bezleri yerleştirin.
- Periton zarını kapatın ve kesiyi 4-0 naylon ile kapatın.
2. UUO cerrahisi
- Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: isoflurane, mantar levha, tüy dökücü krem, laboratuvar mendilleri, PBS ile Petri çanak, 4-0 ipek, 4-0 naylon, 2,5 mL şırınga, pamuk lu swabs, cımbız, cerrahi makas, ve 8 haftalık C57BL /6 erkek fareler.
- % 1.5 izofluran eile bir fare anestezi keleve% 1.5 korumak. Daha sonra farenin karnına tüy dökücü krem uygulayın. Birkaç dakika sonra, tüy dökücü kremi PBS'li bir laboratuvar mendiliyle silin.
- Farenin karın faresine %70 etanol enjekte edin ve fareyi mantar tabakasının üzerindeki supine pozisyonuna yerleştirin.
- Cerrahi makas ve cımbız kullanarak, karın deride bir kesi yapmak ve kaburga sol alt kenarına mesane kas ve periton zarı kesti.
- 2,5 mL şırıngayı farenin altına yerleştirin. İki pamuklu bez alın ve PBS ile nemlendirin. Bağırsakları cımbızla dikkatlice kenara çekin ve nemlendirilmiş bezleri sol üreteri tanımlamak için uygun şekilde yerleştirin. Cımbızı kullanarak sol böbreği kaldır.
- Yaklaşık 1 cm arayla iki yerde sol üreter inilemek için 4-0 ipek kullanın. İki ligasyonun merkez noktasında üreteci kesin ve periton zarını ve kesisini kapatmak için 4-0 naylon dikiş kullanın.
3. Böbrek örneklerinin toplanması
- Aşağıdakileri hazırlayın: 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler, izofluran, mantar levha, 70% etanol, PBS ile Petri çanak, cımbız, ve cerrahi makas.
- % 1.5 izofluran eile bir fare anestezi keleve% 1.5 korumak. Karnına %70 etanol enjekte edin ve fareyi supine pozisyonunda mantar tabakasının üzerine koyun.
- Cerrahi makas ve cımbız kullanarak, karın deride bir kesi yapmak ve kaburga sol alt kenarına mesane kas ve periton zarı kesti.
- Cımbızla periton zarını kaldırın. Cerrahi makas ile, periton zarının üst kenarında yan bir kesi yapmak, ve kaburga en alt kenarı boyunca kesi devam.
- Sonra, sol böbrek belirlemek, böbrek damarlardan kan yıkamak için sarı-beyaz dönene kadar PBS ile reflü, ve cerrahi makas ile sol böbrek arter ve damar keserek böbrek kaldırın. Petri kabına böbreği yerleştirin ve PBS ile dikkatlice yıkayın.
- Cerrahi makas ve cımbız (10 mg sonraki adım için uygun bir boyut) ile 10 mg örnekleri içine böbrek kesin. Böbreğin her bir parçasını kendi 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne koyun ve tüpün kapağını kapatın.
- Her mikrosentrifuge tüpünü sıvı nitrojene aktarın ve tüpleri kullanmadan önce uzun süreli depolama için −80 °C'de tutun.
4. Böbrek örneklerinden total RNA çıkarılması
- Aşağıdaki öğeleri hazırlayın: 1.5 mL mikrosantrifüj tüpler, 2,0 mL mikrosantrifüj tüpler, 100% etanol, kloroform, silikon homogenizer, buz, bir girdap karıştırıcı, biyopolimer spin sütunlar 2.0 mL toplama tüpleri11,12, membran demirlemiş spin sütunları 2.0 mL toplama tüpleri12,13, fenol / guanidin bazlı lizis reaktif, guanidin ve etanol içeren tampon yıkama (yıkama tampon 1), yıkama tampon içeren etanol (yıkama buffer 2), ve RNase-su tampon.
- Silikon homogenizer 10 mg böbrek örneği koyun. Homogenizer fenol/guanidin bazlı lizis reaktifinin 700 μL'sini ekleyin.
- Homogenizer'ı hazırlayın ve numuneyi homojenize etmek için homogenizer'in zararlısını böbrek örneğine doğru yavaşça bastırın/bükün. Böbrek numunesi fenol/guanidin bazlı lisis reaktifinde tamamen eriyene kadar presle/bükümü tekrarlayın.
- Numuneyi daha fazla homojenize etmek için homojenize lisat (2.0 mL toplama tüpünde) biyopolimer spin sütununa aktarın.
- Homojenize lysat'ı oda sıcaklığında (RT) 3 dk için 14.000 x g'de döndürün ve daha sonra çökelmiş lysat'ı kullanılmayan 1,5 mL mikrosentrifüge tüpe aktarın.
- Tüpteki lysate'yi 140 μL kloroform ile birleştirin ve tüp kapağını sıkıca kapatın. Lysat ve kloroformu karıştırmak için tüpü 15 kez ters çevirin.
NOT: Kloroform başlık olmadan kullanılabilir. - Her numuneyi 2-3 dakika RT'de kuluçkaya yatırın ve her numuneyi 12.000 x g'de 4°C'de 15 dakika döndürün.
- Çökeltiyi bozmadan, süpernatantı (tipik olarak ~300 μL) yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve sonra hacmini (genellikle ~450 μL) %100 etanol ekleyin. 5 s için karışımı girdap.
- Numunenin 700 μL'sini 2,0 mL toplama tüpündeki membran bağlantılı spin sütununa yükleyin. Sütun kapağını kapatın ve 15.000 x g'de 15 s'de çevirin. Toplama tüpündeki çökelmiş lysate'yi atın.
- 2,0 mL toplama tüpündeki membran bağlantılı spin sütununa 700 μL yıkama tamponu 1 ekleyerek numuneyi iyice yıkayın. Sütun kapağını kapatın ve sütunu 15.000 x g'de 15 s'de döndürün. Toplama tüpündeki çökelmiş lysate'yi atın.
- İz tuzları çıkarmak için membran akaralı spin sütununa 2,0 mL toplama tüpünde 500 μL yıkama tamponu yükleyin. Sütun kapağını kapatın ve sütunu 15.000 x g'de 15 s'de döndürün. Toplama tüpündeki çökelmiş lysate'yi atın.
NOT: Membran astarlı bir spin sütunu RNA ve DNA'yı birbirinden ayırabilir. - Adım 4.11'i tekrar gerçekleştirin.
- Membran bağlantılı spin kolonu 2,0 mL toplama tüpünde 1 dk için 15.000 x g'de tekrar döndürün. Toplama tüpündeki çökelmiş lysate'yi atın.
- Membran bağlantılı spin kolonu yeni bir 1,5 mL toplama tüpüne aktarın. Koldağa 30 μL RNaiçermeyen su ekleyerek toplam RNA'yı çözün. Sütun kapağını kapatın ve oda sıcaklığında 5 dk bekleyin. Daha sonra, 1 dk için 15.000 x g sütun döndürün.
- Toplam RNA içeren numune miktarını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüplerin her birini buza koyun ve spektrofotometri ile toplam RNA konsantrasyonu ölçün.
- Tüpleri numuneli olarak kullanmadan önce uzun süreli depolama için −80 °C'de saklayın.
5. Toplam RNA'nın ters transkripsiyonu ile cDNA sentezi
NOT: MIQE (Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Deneylerinin Yayınlanması için Minimum Bilgi) yönergeleri daha iyi deneysel uygulamaları teşvik etmek ve güvenilir ve kesin sonuçlar elde etmeye yardımcı olmak için yayınlanmıştır19. Bu protokolde cDNA, ters transkriptaz, poli(A) polimeraz ve oligo-dT astarı kullanılarak iki aşamalı bir işlemle saflaştırılmış toplam RNA'nın 1.0 g'ından sentezlenir.
- Aşağıdakileri hazırlayın: 1.5 mL microcentrifuge tüpler, kapaklı sekiz kuyuşerit tüpler, her sekiz şeritli tüpün kapağı, distile su, buz, ters transkriptaz kiti (Malzeme Tablosunabakın)14,15 erimiş durumda, bir termal döngücü ve bir girdap karıştırıcı.
- Termal döngüyü başlatın.
- Ana karışım çözeltisi hazırlayın: 2.0 μL ters transkriptaz karışımı (kitdahil) ve 2.0 μL 10x nükleik asit karışımını 4,0 μL 5x hi-spec tampona ekleyin (tüp başına toplam 8,0 l master mix elde etmek için).
- Sekiz kuyulu şeritli bir tüpün her tüpüne ana karışım çözeltisinin 8,0 μL'sini koyun.
- Toplam RNA yoğunluğunu ayarlayın. 12 μL RNa içermeyen sudaki böbrek örneklerinden toplam RNA'nın 1,0 g'ını izole etmek için, adım 4.15'te açıklanan yoğunluk verilerini kullanarak uygun miktarda toplam RNA'yı distile suya aktarın.
NOT: Herhangi bir DNA kontaminasyonu varsa, kirlenmiş DNA qRT-PCR'de birlikte güçlendirilecektir. - Her tüpe toplam RNA'dan 12 μL'lik bir aliquot yerleştirin ve tüpün kapağını kapatın. Tüpü 15 x santrifüj edin.
- Tüpü termal döngüye koyun ve numuneyi 37 °C'de 60 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, cDNA sentezi için 95 °C'de 5 dk için numuneyi hemen kuluçkaya yatırın.
- Kuluçka tamamlandığında, cDNA'yı yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe aktarın ve cDNA'yı damıtılmış suyla on kez (1:10) seyreltin. Girdap ve 5 s için tüp santrifüj.
- Seyreltilmiş cDNA'yı geçici olarak buz üzerinde saklayın ve numuneleri kullanmadan önce uzun süreli depolama için −80 °C'ye taşıyın.
6. miRNA'nın 6. qRT-PCR
NOT: MiRNAnın qRT-PCR'sini gerçekleştirmek için interkalatör yöntemini kullandık. RNA için astarlar U6 küçük nükleer 2 (RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p kullanılmıştır.
- Aşağıdakileri hazırlayın: 1,5 mL mikrosantrifüj tüpler, girdap karıştırıcı, qRT-PCR için 96 iyi bir reaksiyon plakası, 96-iyi reaksiyon plakası için yapışkan film, yapışkan film aplikatör, 96-iyi santrifüj rotor, miRNA özgü astarlar, gerçek zamanlı PCR astar, ve yeşil boya tabanlı PCR kiti (Malzeme Tablosubakınız)14,15 içeren 2x PCR master mixr ve 10x.
- 1,5 mL mikrosentrifüge tüpleri karıştırdıktan sonra, aşağıdaki öğeleri girdap: 6,25 μL distile su, her 5 μM miRNA astar 1.25 μL çekirdeksiz suda çözünmüş, 12.5 μL 2× PCR ana karışımı ve 2.5 μL 10x evrensel astar.
- 5. adımda açıklandığı gibi sentezlenen cDNA'yı hazırlayın ve eritin. Girdap ve 5 s için cDNA santrifüj.
- 96 kuyulu plakanın her kuyusuna reaktifin 22,5°L aliquot'u (adım 6.2'de açıklandığı şekilde oluşturulmuş) yerleştirin.
- Plakanın her bir kuyununa 2,5 μL'lik bir cDNA aliquot koyun.
- Yapışkan film aplikatör'ü kullanarak yapışkan filmi 96 kuyulu plakaya sıkıca sabitlayın. Her kuyunun altındaki reaksiyonları gidermek için 1.000 x g'de 96 kuyulu santrifüj rotorlu plakayı 30 s'de santrifüj edin.
7. PCR bisiklet
- Gerçek zamanlı PCR sistemini başlatın ve oluşturulan plakayı adım 6.6'da açıklandığı gibi yerleştirin. gerçek zamanlı PCR sisteminde. Deneme özelliklerini sonraki olarak ayarlayın; deneme adını tanımlayın. Aşağıdakileri seçin: sistemin deney türü olarak "96-well (0,2 mL)" ölçüyöntemi olarak "Karşılaştırmalı CT (ΔΔCT)", hedef sırasını algılamak için reaktif olarak "SYBR Yeşil Reaktifler" ve sistemin çalışması olarak "standart".
- Örnek ve hedef miRNA'ya bir ad atayın ve ardından her kuyuda numuneye bir ad atayın ve miRNA'yı hedef alın. Örnekler, sonuçların teyidi için uygun verileri elde etmek için yinelenen olarak atanmalıdır. Bir başvuru örneği ve endojen denetim seçin ve boyanın pasif başvuru olarak kullanılması için "yok" seçeneğini belirleyin. Reaktiflerin çapraz kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için miRNA ifadesi için negatif ters transkriptaz ve şablon olmayan denetimi ayarladıklarından emin olun.
- Reaksiyon hacmi ayarı "20°L" ve PCR bisiklet koşulları 15 dakika için 95 °C olarak ayarlandı, ardından 94 °C'de 15 s için 40 döngü denatürasyon, 30 s için 55 °C'de annealing ve 30 s için 70 °C'de uzatma ayarlandı.
- qRT-PCR işlemi tamamlandıktan sonra, qRT-PCR verilerini analiz etmek için sistemin yazılım programını kullanın. Yazılım programı tarafından otomatik olarak seçilen eşik çizgisinin her kuyu için uygun olduğundan emin olun.
- Her örnekte analiz edilen endojen kontrolün eşik döngüsü (CT) değerini ve hedef miRNA'yı kontrol edin. CT değeri amplifikasyon eğrisi ve eşik çizgisinin kesiştiği tarafından belirlenir. Bu çalışmada, rnu6-2 hedef miRNA ifade düzeyi için endojen bir kontrol olarak kullanılan ve her hedef miRNA 20 göreli ifade düzeyini belirlemek için ΔΔCT yönteminikullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
UUO fare modeli, 20-25 g ağırlığındaki 8 haftalık erkek farelerde21'inde açıklandığı gibi sol üreteral ligasyon ile oluşturulmuştur. Üreterler 4-0 ipek sütürile çift ligasyon ile tamamen tıkandı. Ameliyat öncesi ve ameliyat sonrası 2 gün boyunca her gün analjezik (meloksikam 5 mg/kg, deri altı enjeksiyon) uygulandı. Ameliyat sonrası 8 gün sonra böbrekler toplandı, PBS ile durulandı, incelendi ve daha fazla analiz için sıvı nitrojende depolandı. Sham ile çalışan fareler kontrol görevi yaptı. Sol böbrekte hidronefroz varsa çift ligasyon başarılı olur. Bu UUO modeli kullanılarak elde edilen miRNA qRT-PCR verilerine dayanarak miRNA-3070-3p düzeyi önemli ölçüde artmış ve miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p düzeyleri kontrollere göre UUO farelerin böbreklerinde önemli ölçüde azalmıştır(Şekil 1).
Şekil 1: UUO farelerinin böbreklerinde farklı olarak ifade edilen miRNA'lar. miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p ve miRNA-7219-5p ifadenin qRT-PCR analizi şam farelerde (n=8) ve UUO farelerde (n=8). Değerler standart hata (hata çubukları) ± ortalamasıdır. Gruplar arasındaki önemli farklılıkları araştırmak için T-testleri kullanıldı. P-değeri <0.05 olan T-testleri anlamlı kabul edildi. miRNA: microRNA, n.s.: önemli değil, qRT-PCR: kantitatif gerçek zamanlı ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu, UUO: tek taraflı üreteral obstrüksiyon. *p<0.05. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için burayı tıklatın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
QRT-PCR ile yukarıda açıklanan protokol, hedeflenen miRNA'ların ifade düzeylerini başarıyla belirlemiştir. Anlamlı qRT-PCR verileri elde etmek isteyen ayıklanmış miRNA'ların değerlendirilmesi önemlidir ve qRT-PCR'yi gerçekleştirmeden önce miRNA'ların kalitesini doğrulamak için 260 nm'deki absorbans oranı 280 nm'de spektrofotometre ile kontrol edilmelidir. Beklenen uzunluk ve erime sıcaklığının tek bir PCR amplifikasyonu veya monomodal erime eğrisi qRT-PCR ile elde edilemiyorsa, reaksiyon plakasının her kuyuda DNA kontaminasyonu veya astar dimrolabilir.
MiRNA'ların ekspresyon düzeyleri mikrodizi, kuzey lekeleme ve ribonükleaz koruma teşbit yöntemleri de dahil olmak üzere qRT-PCR dışındaki çeşitli yöntemlerle değerlendirilebilir. Ancak, qRT-PCR hem doğru ve hassas basit, son derece tekrarlanabilir bir işlemdir ve daha küçük numune hacimleri kuzey lekeleme ve ribonuclease koruma tahlilleri22göre qRT-PCR için kullanılabilir. Buna ek olarak, mikrodiziler on binlerce miRNA'nın ekspresyonunun eşzamanlı olarak ölçülmesini sağladığından, aday miRNA işaretleyicilerini belirleyebilirler. Mikrodizi verileri qRT-PCR23ile elde edilen verilerle genel olarak yüksek korelasyon göstermiştir, ancak birbirinden farklı çalışmalarda elde edilen mikrodizi verilerinin karşılaştırılması için en uygun metodoloji üzerinde bir fikir birliği ne kadarönemli 24'eulaşılamamıştır.
Yeni protokol aşağıdaki sınırlamaları vardır. Bu protokolün yararı karaciğer ve akciğer gibi diğer organlarda doğrulanmamıştır; ve protokol diğer laboratuvar hayvanlarında (örneğin, sıçanlar, köpekler ve domuzlar) test edilmemiştir. Çeşitli gruplar bu protokol (saflaştırma ve qRT-PCR tarafından miRNA saptama için) dokulardan yüksek kaliteli RNA arınma etkin olduğunu bildirdi12,14,15. Yöntem miRNA ekspresyonu tespit etmek için yüksek doğruluk ve hassasiyete sahiptir12,14. Bu rapor, bu protokolün fare böbreğindeki miRNA ifadesini başarıyla tespit etmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Protokol böylece hastalık durumları geniş bir yelpazede farelerin böbreklerinde miRNA ifade profilleri belirlemek için kullanılabilir. Protokolün basitliği nedeniyle, birçok örnek aynı anda işlenebilir ve bu nedenle protokolün kullanılması böbreğin çeşitli patolojik koşullarında birçok miRNA'nın ekspresyonunun analizine katkıda bulunabilir.
Protokolün farkında olması ve akılda tutulması gereken bazı yönleri vardır. İlk olarak, arınmış RNA'lar oda sıcaklığında bozulmayı önlemek için buzüzerinde tutulmalıdır. Böbrek örnekleri, lysis reaktifinde numuneler tamamen eriyene kadar homojenize edilmelidir. Fare böbrekleri lysis reaktifinde çözünmeyen önemli bağ dokusu içerdiğinden, daha fazla homojenizasyon için bir kolon parçalayıcı gereklidir. İkinci olarak, uygun endojen kontrol miRNA (olan ifade örnekleri arasında istikrarlı) qRT-PCR deneysel kurulum boyunca doğrulanmalıdır çünkü bu protokol altında çeşitli maddelerin işgali endojen kontrol miRNA ifade düzeyini değiştirebilir, muhtemelen sonuçları ödün.
Sonuç olarak, UUO ile fare böbreğindeki mikroRNA ifadelerinin saptanması, saflaştırılması ve değerlendirilmesi için qRT-PCR protokolünün ayrıntılarını sunduk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışmaları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Edanz Group'tan (https://en-author-services.edanzgroup.com/) Bu el yazmasının taslağını düzenlediği için Doktora lı Michelle Goody'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen | 79216 | Wash buffer 2 | |
| Qiagen | 1067933 | Wash buffer 1 | |
| Tokyo Laboratory Animals Science | Not assigned | ||
| Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate | |
| Thermo Fisher Scientific | 4311971 | Adhesive film for 96-well reaction plate | |
| Qiagen | MS00001701 | 5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00065141 | 5'-UUACACUCCAGUGGUGUCGGGU-3' | |
| Qiagen | MS00068067 | 5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3' | |
| Qiagen | MS00068081 | 5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3' | |
| Qiagen | 217004 | Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 218161 | Reverse transcriptase kit | |
| Qiagen | 218073 | Green dye-based PCR kit | |
| Qiagen | 79654 | Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube | |
| Qiagen | 79306 | Phenol/guanidine-based lysis reagent | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument | |
| Thermo Fisher Scientific | 4472380 | Real-time PCR instrument software | |
| Qiagen | 129112 | ||
| Qiagen | MS00033740 | Not disclosed | |
| Takara Bio | 9790B | Silicon homogenizer | |
| ASKUL | GA04SW | ||
| AS ONE | ER1004NA45-KF2,62 -9968-32 |
References
- Liu, B., et al. Identifying functional miRNA-mRNA regulatory modules with correspondence latent dirichlet allocation. Bioinformatics. 26 (24), 3105-3111 (2010).
- Rottiers, V., Naar, A. M. MicroRNAs in metabolism and metabolic disorders. Nature Review Molecular Cell Biology. 13 (4), 239-250 (2012).
- Roy, S. miRNA in Macrophage Development and Function. Antioxidants and Redox Signaling. 25 (15), 795-804 (2016).
- Sun, Z., et al. Effect of exosomal miRNA on cancer biology and clinical applications. Molecular Cancer. 17 (1), 147 (2018).
- Zhou, W. C., Zhang, Q. B., Qiao, L.
- Schuler, E., Parris, T. Z., Helou, K., Forssell-Aronsson, E. Distinct microRNA expression profiles in mouse renal cortical tissue after 177Lu-octreotate administration. PLoS One. 9 (11), 112645 (2014).
- Blasco-Baque, V., et al. Associations between hepatic miRNA expression, liver triacylglycerols and gut microbiota during metabolic adaptation to high-fat diet in mice. Diabetologia. 60 (4), 690-700 (2017).
- Cohen, A., Zinger, A., Tiberti, N., Grau, G. E. R., Combes, V. Differential plasma microvesicle and brain profiles of microRNA in experimental cerebral malaria. Malaria Journal. 17 (1), 192 (2018).
- Gao, F., et al. Therapeutic role of miR-19a/19b in cardiac regeneration and protection from myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 1802 (2019).
- Xie, W., et al. miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).
- Clark, R. M., Coffman, B., McGuire, P. G., Howdieshell, T. R. Myocutaneous revascularization following graded ischemia in lean and obese mice. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 9, 325-336 (2016).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnology. 14, 94 (2014).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Kang, K., et al. A novel real-time PCR assay of microRNAs using S-Poly(T), a specific oligo(dT) reverse transcription primer with excellent sensitivity and specificity. PLoS One. 7 (11), 48536 (2012).
- Lv, W., et al. Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD. Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).
- Liu, S. H., et al. C/EBP homologous protein (CHOP) deficiency ameliorates renal fibrosis in unilateral ureteral obstructive kidney disease. Oncotarget. 7 (16), 21900-21912 (2016).
- Buchtler, S., et al. Cellular Origin and Functional Relevance of Collagen I Production in the Kidney. Journal of the American Society Nephrology. 29 (7), 1859-1873 (2018).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Rao, X., Huang, X., Zhou, Z., Lin, X. An improvement of the 2^(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostatics Bioinformatics and Biomathematics. 3 (3), 71-85 (2013).
- Chevalier, R. L., Forbes, M. S., Thornhill, B. A. Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney International. 75 (11), 1145-1152 (2009).
- Radonic, A., et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR. Biochemical and Biophysical Research Communications. 313 (4), 856-862 (2004).
- Zubakov, D., et al. MicroRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation. International Journal of Legal Medicine. 124 (3), 217-226 (2010).
- Brazma, A., et al. Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nature Genetics. 29 (4), 365-371 (2001).
