Summary
RNA-Interferenz ist eine weit verbreitete, leistungsfähige Technik zur Manipulation der Genexpression in bestimmten Entwicklungsstadien. Hier beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Umsetzung dieser Technik im Wassertauchkäfer Thermonectus marmoratus, vom Erwerb von Gensequenzen bis zum Knockdown von Genen, die Struktur oder Verhalten beeinflussen.
Abstract
Die RNA-Interferenz (RNAi) bleibt eine leistungsfähige Technik, die eine gezielte Reduktion der Genexpression durch mRNA-Abbau ermöglicht. Diese Technik ist auf eine Vielzahl von Organismen anwendbar und ist in der artenreichen Ordnung Coleoptera (Käfer) hocheffizient. Hier fassen wir die notwendigen Schritte für die Entwicklung dieser Technik in einem neuartigen Organismus zusammen und veranschaulichen deren Anwendung auf die verschiedenen Entwicklungsstadien des Wassertauchkäfers Thermonectus marmoratus. Zielgensequenzen können kostengünstig durch die Zusammenstellung von Transkriptomen gegen einen nahen Verwandten mit bekannter Genomik oder de novo erhalten werden. Das Klonen von Kandidatengenverwendet einen spezifischen Klonvektor (das pCR4-TOPO-Plasmid), das die Synthese von doppelsträngiger RNA (dsRNA) für jedes Gen unter Verwendung eines einzigen gemeinsamen Primers ermöglicht. Die synthetisierte dsRNA kann entweder in Embryonen für frühe Entwicklungsprozesse oder Larven für spätere Entwicklungsprozesse injiziert werden. Wir veranschaulichen dann, wie RNAi mit Hilfe der Immobilisierung bei Agarose in Wasserlarven injiziert werden kann. Um die Technik zu demonstrieren, stellen wir mehrere Beispiele für RNAi-Experimente bereit, die spezifische Knockdowns mit vorhergesagten Phänotypen generieren. Insbesondere RNAi für das Gerbgen laccase2 führt zu einer Nagelhautaufhellung sowohl bei Larven als auch bei Erwachsenen, und RNAi für das Augenpigmentierungsgen weiß erzeugt eine Aufhellung/mangelnde Pigmentierung in Augenröhrchen. Darüber hinaus führt der Knockdown eines Schlüssellinsenproteins zu Larven mit optischen Mängeln und einer verminderten Fähigkeit, Beute zu jagen. Kombiniert, veranschaulichen diese Ergebnisse die Macht von RNAi als Werkzeug zur Untersuchung sowohl morphologischer Muster- als auch Verhaltensmerkmale in Organismen mit nur transkriptomischen Datenbanken.
Introduction
Die Frage, wie spezifische Gene zur Evolution unterschiedlicher Merkmale beitragen, ist ein spannendes Thema in der Biologie. In den letzten Jahrzehnten wurden große Fortschritte bei der Zersebung der genetischen Grundlagen von Entwicklungsprozessen in einigen wenigen Modellorganismen gemacht, wie der Nematode Caenorhabditis elegans, der Fruchtfliege Drosophila melanogasterund der Hausmaus Mus musculus1. In jüngerer Zeit hat die Erfindung leistungsstarker Gen-Editing-Techniken wie gruppierter, regelmäßig interspaced short palindromischer Wiederholungen (CRISPR)/Cas92 die Möglichkeit geboten, den genetischen Code von Nicht-Modellorganismen zu ändern (Beispiele siehe3,4). Infolgedessen gab es einen Anstieg der genetischen Studien an einer Vielzahl von Organismen, die zuvor nicht durch molekulare Techniken angegangen worden waren. Angesichts der enormen Vielfalt unseres Tierreichs mit vielen interessanten Merkmalen oder Merkmalsvarianzen, die nur in bestimmten Arten vertreten sind, hat dieser Fortschritt es zu einer aufregenden Zeit für die evolutions-entwicklungsbezogene Arbeit ("evo-devo") gemacht. Die Genom-Editing-Techniken, die Nicht-Modellorganismen zur Verfügung stehen, sind jedoch relativ eingeschränkt, was die Entwicklungszeitpunkte betrifft, auf die sie angewendet werden können, was es schwierig macht, die zeitlichen Eigenschaften zu unterscheiden, die mit der Rolle zusammenhängen, die bestimmte Gene in jeder Eigenschaft spielen. Darüber hinaus sind transgene Techniken oft auf Gene beschränkt, die für das Überleben nicht wesentlich sind (d. h., deren Knockout nicht zu Tödlichkeit führt). Obwohl die Gen-Editing-Techniken immer beliebter geworden sind, besteht daher nach wie vor bedarf es effektiver Techniken, die auf eine Vielzahl verschiedener Organismen zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten anwendbar sind und teilweise Knockdowns (anstelle des vollständigen Funktionsverlusts) erleichtern. Hier machen wir auf RNA-Interferenz (RNAi) aufmerksam, eine etwas veraltete, aber leistungsstarke Gen-Knockdown-Technik5, die als synergistischer Ansatz zur Genbearbeitung besonders wertvoll ist. Insbesondere haben wir Verfahren entwickelt, die die Anwendung von RNAi auf Wassertauchkäfer als Beispiel ermöglichen, das die Umsetzung dieser Technik veranschaulicht, vom Erwerb der notwendigen molekularen Sequenzen bis zur erfolgreichen Injektion von doppelsträngiger RNA (dsRNA) in Eier und Larven.
RNAi-basierte Gen Knockdown nutzt einen angeborenen Abwehrmechanismus von Organismen, in dem dsRNA-Moleküle das Schweigen von eindringenden Nukleinsäuresequenzen wie Viren und Transposons6erleichtern. Kurz gesagt, dsRNA wird in die Zelle aufgenommen, wo es durch das Dicer-Enzym in 20–25 Nukleotidstücke geschnitten wird. Diese Teile aktivieren dann die Bildung des RNA-induzierten Silencing-Komplexes (RISC), der die gezielte mRNA hemmt, indem sie an bestimmten Stellen mit dem Führungsstrang an sie bindet. Dieser Prozess führt letztlich zum mRNA-Abbau und stört somit die Translation von mRNA in das jeweilige Protein6. Die hier vorgestellte RNAi-basierte Gen-Knockdown-Technik beruht daher auf der Injektion von dsRNA. Für Tiermodelle wurde diese Technik ursprünglich in C. elegans7 und D. melanogaster8 entwickelt, hat sich aber seitdem als leistungsfähiges funktionelles genetisches Werkzeug in Nicht-Modellorganismen9,10herauskristallisiert. Aufgrund seiner hochwirksamen Natur bei einigen Insekten kann RNAi sogar im Schädlingsmanagement eingesetzt werden11.
Als Forschungsinstrument wurde RNAi verwendet, um zu untersuchen, wie wichtige molekulare Entwicklungspfade in nichttraditionellen Insektenmodellen funktionieren. Zum Beispiel hat RNAi im Mehlkäfer Tribolium castaneum entscheidend dazu beigetragen, wie tief konservierte Gene zu bestimmten Merkmalen in diesem Käfer beitragen, wie beispielhaft für die Entwicklung von speziell geformten Flügeln12,13,14 und Augen15,16. Die Techniken, die den Manipulationen in T. castaneum zugrunde liegen, wurden gut beschrieben17 und verlassen sich auf die Fähigkeit, relativ trockene Eier und Larven auf einer klebrigen Oberfläche zu immobilisieren. Eine solche Immobilisierung ist jedoch für die nassen Entwicklungsformen von Wasserorganismen wie dem Sunburst Diving Beetle Thermonectus marmoratusnicht möglich. Wie bei vielen nichttraditionellen Modellorganismen fehlt ihm ein verfremdetes Genom. Um die Genexpression in jedem Organismus ohne Genom zu manipulieren, besteht ein vernünftiger und kostengünstiger erster Schritt darin, Transkriptome zu erzeugen und die vermeintlichen Nukleotidsequenzen der exprimierten Gene von Interesse auf der Grundlage von Sequenzähnlichkeit mit verwandten, aber etablierteren Modellorganismen, in diesem Fall in erster Linie Tribolium (Coleoptera) und Drosophila-Gene, zu identifizieren.
Um zu zeigen, wie RNAi auf einem Wasserorganismus eingesetzt werden kann, diskutieren wir zunächst Protokolle und Software für die RNA-Extraktion und Transkriptom-Generierung und -Assemblage, die die Identifizierung spezifischer gezielter Gensequenzen ermöglichen. Anschließend fassen wir die notwendigen Schritte zur Synthese genspezifischer dsRNA zusammen. Anschließend zeigen wir, wie Eier in eine aquatische Umgebung injiziert werden können, und zeigen Inkubationsprotokolle für die Kultivierung von Embryonen. Darüber hinaus zeigen wir, wie Agarose-Gel verwendet werden kann, um Larven während des Injektionsprozesses vollständig zu immobilisieren, eine Technik, die in der Regel während verschiedener Verfahren nützlich ist und auf eine Vielzahl von Arthropoden angewendet werden könnte. Um zu zeigen, wie RNAi auf verschiedene Entwicklungsstadien angewendet werden kann, fügen wir ein Beispiel an, in dem wir das Augenpigmentierungsgen weiß in Embryonen zum Schweigen gebracht haben. Darüber hinaus beschreiben wir ein Beispiel, in dem das Gerbungsgen laccase2(lac2) sowohl während des zweiten Larveninsterns (zur Beeinflussung von Larven des dritten Larveninsterns) als auch während des dritten Larveninsterns (um Erwachsene zu beeinflussen) zum Schweigen gebracht wurde. Schließlich zeigen wir, dass die Injektion einer niedrigeren Konzentration von dsRNA zu einem partiellen Knockdown führt, was zeigt, dass diese Technik auch auf Gene angewendet werden kann, bei denen Funktionsverlust bekanntlich tödlich ist.
Protocol
1. RNA-Isolation und de novo-Transkriptom-Baugruppe
- Führen Sie die vollständige RNA-Isolierung von spätstufem dritten inStar-Tauchkäfer-Larvenaugenröhren und erwachsenen Käfern mithilfe eines RNA-Isolationskits (siehe Tabelle der Materialien) durch, das für lipidreiches Gewebe entwickelt wurde. Isolieren Sie die gesamte RNA von T. marmoratus und sequenzieren Sie sie nach zuvor beschriebenen Methoden18.
- De novo Transkriptom-Baugruppe
ANMERKUNG: Zur Montage des Transkriptoms de novo können verschiedene Bioinformatik-Plattformen verwendet werden (siehe Materialtabelle). Diese Plattformen sind kommerziell erhältlich und in einigen Fällen als Unix-basierte Befehlszeilenskripts vorhanden. Da die Baugruppe de novo ist, wird empfohlen, die Transkriptome unabhängig auf zwei Plattformen zusammenzusetzen und die Ergebnisse zu vergleichen, um falsche Positiv- oder Falschnegative auszuschließen.- Um mit der Montage der Transkriptome zu beginnen, laden Sie die Rohlesevorgänge auf die jeweilige Bioinformatik-Plattform hoch.
HINWEIS: Diese Dateien werden in der Regel komprimiert und im Format FASTQSANGER. Gz. Es besteht keine Notwendigkeit, die Dateien zu dekomprimieren, da dieses Format im nächsten Schritt akzeptiert wird. - Trimmomatic-Befehlszeile verwenden, trimmen Sie die Rohlesevorgänge, um Adaptersequenzen oder kurze Lesevorgänge zu entfernen, die unter den Standardschwellenwert fallen. Dekomprimieren Sie die getrimmten Rohlesevorgänge; Die Dateien werden nun im FASTQ-Format vorliegen. Verketten Sie die FASTQ-Rohlesefür jedes Beispiel, um Dateien zu erhalten, die für die de novo-Assembly bereit sind.
- Stellen Sie die verketteten Rohlesede de novo mithilfe eines beliebigen Befehlszeilenskripts zusammen, das Transkriptome de novo zusammenstellen kann. Speichern Sie das zusammengebaute Transkriptom, das nun eine Liste von Contigs mit ihren jeweiligen Sequenzen enthält, als FASTA-Datei. Um die Abdeckung der Montage zu erhöhen, kombinieren und montieren Sie mehrere Transkriptome für die gleiche Art.
HINWEIS: Dieser Prozess erhöht die Wahrscheinlichkeit, genauere Kontasgen zu erzeugen, und ist besonders wichtig, wenn Gene mit geringer Kopierzahl von Interesse sind. - Bewerten Sie nach der Montage das Transkriptom auf Vollständigkeit, indem Sie Deckungsergebnisse berechnen (Coverage Assessment Software ist frei verfügbar, siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Ein Transkriptom mit einem Coverage-Score >75% gilt als gut. Die Relevanz dieser Partitur hängt jedoch vom Grund für die Transkriptom-Generierung ab. Wenn das Transkriptom beispielsweise verwendet wird, um Gene mit niedriger Kopierzahl zu identifizieren, ist ein Score >85% besser, da er eine größere Abdeckung bedeutet. - Kommentieren Sie das de novo zusammengesetzte Transkriptom mit einem grundlegenden lokalen Ausrichtungssuchwerkzeug (BLAST; siehe Tabelle der Materialien).
HINWEIS: Für dieses Experiment wurde das Transkriptom in erster Linie mit einer Datenbank bekannter Drosophila-Proteine und einer Datenbank bekannter Käferproteine bezeichnet. Die Liste der Anmerkungen kann als Tabellenkalkulation heruntergeladen werden und Contig/Contigs, die auf Sequenzähnlichkeit mit den Proteinen anderer Organismen hinweisen, können als FASTA-Datei heruntergeladen werden. - Identifizieren Sie die Contig-Zahl/Zahlen des von Interesse sindden Proteins und extrahieren Sie die Nukleotidsequenzen. Verwenden Sie BLAST, um zu ermitteln, ob proteinspezifische konservierte Regionen (z. B. Homeobox-Domänen) in der annotierten Nukleotidsequenz vorhanden sind. Überprüfen Sie andere Konvergs mit der gleichen Anmerkung auf Nukleotid-Sequenzüberlappungen, um die Sequenz eines genspezifischen Transkripts zu generieren.
HINWEIS: Die Identifizierung von Kontierungen mit Sequenzüberlappung ist in der Regel nicht für alle Gene möglich, insbesondere bei Genen mit geringer Kopierzahl. - Wenn die Sequenz des Gens in voller Länge benötigt wird, beginnen Sie mit dem Kontich, das die höchste Sequenzähnlichkeit als Initiationspunkt zur Identifizierung der Nukleotidsequenz des gesamten reifen Transkripts mit Techniken wie 3" und 5" schneller Amplifikation von cDNA-Enden hat (RACE19).
- Kommentieren Sie die von der zweiten Plattform erhaltene Baugruppe nach den Schritten 1.2.4–1.2.7.
HINWEIS: Idealerweise sollten die Ergebnisse für die Proteine von Interesse ähnlich sein; Die Abdeckung kann jedoch bis zu einem gewissen Grad zwischen den Plattformen unterschiedlich sein. - Verwenden Sie das zusammengesetzte Transkriptom, um artspezifische dsRNA zu synthetisieren, wie in Abschnitt 2 beschrieben.
- Um mit der Montage der Transkriptome zu beginnen, laden Sie die Rohlesevorgänge auf die jeweilige Bioinformatik-Plattform hoch.
2. Klonen und genspezifische dsRNA-Synthese
HINWEIS: Genespezifischeklonen und dsRNA-Synthese wurden für T. castaneum20,21,22ausführlich beschrieben. Die folgenden Schritte geben einen kurzen Überblick.
- Klonen, bakterielle Transformation und Plasmidsequenzierung
- Isolieren Sie die gesamte RNA aus dem Organismus (wie in Schritt 1.1 beschrieben) und erstellen Sie komplementäre DNA (cDNA) mit einem Reverse-Transkriptionskit (siehe Tabelle der Materialien). Identifizieren Sie eine oder zwei 100–1000 bp Nukleotidsequenzen aus Contigs, die spezifisch für die Gene von Interesse sind.
- Design-Primer-Paare, die die gesamte identifizierte Strecke von Nukleotiden umfassen und die Sequenz durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verstärken. Fügen Sie am Ende einen zusätzlichen 30-min-Schritt hinzu, um 3-Adenin-Überhänge im verstärkten DNA-Produkt zu erzeugen. Reinigen Sie dieses Produkt mit einem PCR-Reinigungskit (siehe Materialtabelle).
- Klonen Sie das gereinigte Produkt in einen pCR4-TOPO-Plasmidvektor (siehe Materialtabelle) nach dem mit dem Klonkit bereitgestellten Protokoll des Herstellers. Durch die Verwendung der Wärmeschockbehandlung verwandeln Sie die geklonten Plasmide in kompetente Bakterienzellen (Stamm: E.coli DH10B) nach dem Protokoll des Anbieters für kompetente Zellen (siehe Tabelle der Materialien)und den Bildschirm für erfolgreich transformierte Zellen.
HINWEIS: Platten mit Kolonien können in Paraffinfolie eingewickelt werden, um Feuchtigkeit zu behalten und bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden. - Pflücken Sie Kolonien transformierter Zellen mit einer 10-L-Pipettenspitze und -kultur in Lysogenesy-Brühe (LB), die Ampicillin (50 g/ml) in einem Shaker-Inkubator bei 37 °C und 200 Rpm für 24 h enthält.
HINWEIS: Zur Langzeitlagerung können kultivierte Zellen 1:1 mit 100 % Glycerin verdünnt und bei -80 °C als Glycerinvorräte eingefroren werden. - Isolieren Sie Plasmide, die das Gen dieser Kultur enthalten, mit einem Miniprep-Isolationskit (siehe Tabelle der Materialien). Bewahren Sie die isolierten Plasmide (Minipreps) bei -20 °C auf, nachdem sie die Ausbeute spektrophotometrisch beurteilt haben. Messen Sie insbesondere die Probenabsorption bei 260 nm, 280 nm und 230 nm. Berechnen Sie die Verhältnisse A260/A280 für die Quantifizierung der DNA und A260/A230 zur Quantifizierung der DNA-Reinheit.
HINWEIS: Ein Verhältnis von 260/280 von 1,8 ist allgemein als ausreichend reine DNA anerkannt, Einverhältnisse unter 1,5 deuten auf das Vorhandensein von Restextraktionsreagenzien wie Phenol hin. Das Verhältnis 260/230 sollte größer oder gleich dem Verhältnis 260/280 sein. Niedrigere Verhältnisse deuten auf eine Restreagenzienkontamination hin. Die Ausbeute liegt in der Regel zwischen 100 und 500 ng/L. - Sequenzieren Sie die isolierten Minipreps, um zu bestätigen, dass das genspezifische Fragment erfolgreich integriert wurde und zwischen den Promotorregionen 5 t7 und 3 t3 im Plasmid flankiert wird; Dies kann mit universellen T7- und T3-Sequenzierungsprimern22erfolgen. Verwenden Sie die Minipreps mit der genspezifischen Sequenz von Interesse für die dsRNA-Vorbereitung.
- Isolieren Sie die gesamte RNA aus dem Organismus (wie in Schritt 1.1 beschrieben) und erstellen Sie komplementäre DNA (cDNA) mit einem Reverse-Transkriptionskit (siehe Tabelle der Materialien). Identifizieren Sie eine oder zwei 100–1000 bp Nukleotidsequenzen aus Contigs, die spezifisch für die Gene von Interesse sind.
- PCR-Amplifikation und In-vitro-dsRNA-Synthese
- PCR-Verstärkung und Produktreinigung
- Entwerfen Sie plasmidspezifische oder genspezifische Primer, deren 5'-Seite die T7-Promotorsequenz hat (Details siehe Referenz22), um ein lineares Fragment des eingefügten Gens zu verstärken. Optimieren Sie die Ausbeute, indem Sie mindestens 10 Reaktionen zu je 20 L einrichten.
HINWEIS: Das resultierende Produkt wird von zwei 20 bp T7 Polymerase-Bindungsstellen flankiert. - Reinigen Sie das PCR-Produkt mit einem PCR-Produktreinigungskit (siehe Tabelle der Materialien),das dem spaltenbasierten Elution-Protokoll des Herstellers folgt. Um die Ausbeute zu erhöhen, wiederholen Sie den letzten Elutionsschritt bis zu 3 Mal mit dem gleichen Eluent. Bewerten Sie die Ausbeute spektrophotometrisch.
HINWEIS: Die Ausbeute liegt in der Regel zwischen 100 und 700 ng/l. Dieses gereinigte Produkt kann bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert werden.
- Entwerfen Sie plasmidspezifische oder genspezifische Primer, deren 5'-Seite die T7-Promotorsequenz hat (Details siehe Referenz22), um ein lineares Fragment des eingefügten Gens zu verstärken. Optimieren Sie die Ausbeute, indem Sie mindestens 10 Reaktionen zu je 20 L einrichten.
- In-vitro-dsRNA-Synthese und -Reinigung
- Verwenden Sie das genspezifische PCR-gereinigte Produkt, um dsRNA in vitro gemäß dem Protokoll eines dsRNA-Synthesekits der Wahl zu synthetisieren. Verlängern Sie bei Bedarf die Inkubationszeit für eine erhöhte dsRNA-Produktion.
- Bewerten Sie das Fortschreiten der Reaktion basierend auf der Opazität des Reaktionsgemisches (je größer die Menge des dsRNA-Produkts, desto höher die Trübung). Beenden Sie am Ende der Inkubation die Reaktion mit einer DNase-Behandlung. Dazu fügen Sie dem Reaktionsgemisch 1 l aus einem Vorrat von 2 U/L hinzu. Erweitern Sie diese Behandlung auf 1-2 h, um den optimalen Abbau der Vorlagen-DNA zu gewährleisten.
- Reinigen Sie die dsRNA mit einem Reinigungskit oder mit den folgenden Schritten.
- Das resultierende Produkt mit 115 l nukleasefreiem Wasser verdünnen und 15 l 3 M Natriumacetat hinzufügen. Fügen Sie 2 Volumen eiskaltes 100% Ethanol zu diesem Reaktionsgemisch hinzu und fällen Sie die dsRNA über Nacht bei -20 °C.
HINWEIS: An dieser Stelle können Proben sicher gelagert werden, ohne die Endausbeute zu beeinträchtigen. - Zentrifugieren Sie den Niederschlag bei 0 °C für 20 min bei 9000 x g und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Produkt einmal mit eiskaltem 70% Ethanol und Zentrifuge für 15 min bei 13000 x g.
- Entfernen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet 5–15 min. Setzen Sie das Pellet in bis zu 40 l nukleasefreiem Wasser aus (dieses Volumen kann basierend auf der isolierten Pelletgröße eingestellt werden) und bewerten Sie die Ausbeute und Reinheit spektrophotometrisch, wie in 2.1.4 beschrieben.
- Bewahren Sie die gereinigte dsRNA bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung auf. Verwenden Sie die gereinigte dsRNA zur Injektion im gewünschten Entwicklungsstadium.
- Das resultierende Produkt mit 115 l nukleasefreiem Wasser verdünnen und 15 l 3 M Natriumacetat hinzufügen. Fügen Sie 2 Volumen eiskaltes 100% Ethanol zu diesem Reaktionsgemisch hinzu und fällen Sie die dsRNA über Nacht bei -20 °C.
- PCR-Verstärkung und Produktreinigung
3. Entnahme und Vorbereitung von Frühen Stadium T. marmoratus Embryonen für dsRNA-Injektionen
- Bereiten Sie eine Agaroseplatte für die Inkubation von T. marmoratus Embryonen vor.
- Lösen Sie zunächst 20 mg niedrigschmelzendes Agarosepulver in 100 ml autoklaviertem destilliertem Wasser (2% Agarose) auf und kochen Sie diese Mischung dann in einer Mikrowelle, bis eine klare Lösung gefunden ist. Achten Sie auf die heiße Lösung, da Luftblasen dazu führen können, dass sie überlaufen.
- Geben Sie diese Lösung in eine kleine Petrischale. Um Rillen (die die Embryonen halten) auf der Oberfläche der Agaroseplatte herzustellen, legen Sie drei 1–2 mm breite Kunststoffrohre (wie die Spitzen von Kunststofftransferpipetten) auf die Oberfläche der flüssigen Agarose, bevor sie erstarrt.
- Sobald die Agarose verfestigt ist, verwenden Sie ein Paar stumpfe Zange, um diese Rohre zu entfernen. Fügen Sie 500 l autoklaviertes destilliertes Wasser mit einer P1000-Mikropipette hinzu, um diese Einbuchtungen in der Agarose abzudecken.
- Sammeln Sie mit einem feinen Naturhaarpinsel T. marmoratus-Embryonen, die 5-8 h alt sind, von den Käfernistplätzen in einer Glashöhlenschale, die mit autoklaviertem destilliertem Wasser gefüllt ist. Überwachen Sie die Nistplätze häufig, um sicherzustellen, dass die erhaltenen Eier im richtigen Alter sind.
- Dechorionate die Embryonen unter einem Stereomikroskop mit feinen Sezierzangen. Um dies zu tun, visualisieren Sie die Chorion unter dem Mikroskop (bei der gewünschten Vergrößerung), indem Sie die Lichtquelle in einem geeigneten Winkel positionieren, dann greifen Sie die Chorion von zwei Seiten mit scharfen Zangen, reißen Sie sie auf und schieben Sie den Embryo vorsichtig heraus. Da es zwei Ebenen gibt, stellen Sie sicher, dass beide entfernt werden.
- Mit einem feinen Naturhaarpinsel die Embryonen vorsichtig von der Glashöhlenschale auf die Agaroseplatte übertragen und in den Rillen unter einem Stereomikroskop anordnen. Achten Sie dabei sehr darauf, da dechorionierte Embryonen sehr zerbrechlich sind. Verwenden Sie die vorbereiteten Embryonen für dsRNA-Injektionen.
HINWEIS: Das etwas dickere Ende ist die Seite des Embryos, in der sich der Kopf entwickeln wird.
4. dsRNA-Mikroinjektionen im Frühstadium T. marmoratus-Embryonen
- Um Embryonen im Frühstadium mit genspezifischer dsRNA zu injizieren, bereiten Sie Mikroinjektionsnadeln mit einem Mikroinjektionsnadelzieher vor (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie bei der Visualisierung der Nadelspitze unter einem Stereomikroskop ein Paar feiner Zangen, um die Nadelspitze zu brechen und so eine scharfe Kante zu erzeugen. Im Idealfall brechen Sie die Nadelspitze diagonal, so dass eine schärfere Kante auf einer Seite bleibt, wodurch sie in den Embryo gelangen kann, während sie minimale Verletzungen verursacht.
- Die gereinigte DsRNA-Lösung auf Eis auftauen, 1 L des 10-fachen Injektionspuffers hinzufügen und mit doppelt destilliertem Wasser überhämpfen, um eine Injektionslösung von 10 l herzustellen. Für Injektionen ist in der Regel eine dsRNA-Konzentration von 1 g/l geeignet, kann aber entsprechend der phänotypischen Schwere der resultierenden Tiere eingestellt werden).
ANMERKUNG: Bereiten Sie 1 ml 10x Injektionspuffer22 vor, indem Sie 10 l 0,1 M Natriumphosphatpuffer (durch Mischen von 8,5 ml 1 M Na2HPO4 und 1,5 ml von 1 M) NaH2PO4 angepasst auf einen pH-Wert 7,6 bei 25 °C mit 100 l von 0,5 M KCl, 100 l Lebensmittelfarbstoff und 790 l doppeldestilliertem Wasser.- Mit einer P10-Pipette die Mikroinjektionsnadel mit der arbeitenden dsRNA-Lösung verfüllen. Sobald die Lösung die Spitze der Nadel gefüllt hat, befestigen Sie sie an einem Mikronadelhalter, der mit einem Mikroinjektionssystem verbunden ist, das die Druckauswurftechnologie nutzt (siehe Tabelle der Materialien).
- Schalten Sie das Mikroinjektionssystem und die Druckluftzufuhr ein. Stellen Sie den Einspritzdruck mit dem Mikroventil am Mikroinjektionssystem auf 15 psi ein. Stellen Sie die Einspritzdauer mit dem Zeiteinstellungsknopf ein (stellen Sie sie auf "Sekunden" ein).
- Da die Injektionsdauer vom erforderlichen Injektionsvolumen abhängt, stellen Sie diesen Parameter ggf. vor jeder Injektion auf dem Mikroinjektionssystem ein. Verwenden Sie ein Injektionsvolumen von 1–2 nL für T. marmoratus Embryonen im Frühstadium.
HINWEIS: Höhere Injektionsvolumina neigen dazu, die Überlebensrate des Embryos zu beeinträchtigen.
- Da die Injektionsdauer vom erforderlichen Injektionsvolumen abhängt, stellen Sie diesen Parameter ggf. vor jeder Injektion auf dem Mikroinjektionssystem ein. Verwenden Sie ein Injektionsvolumen von 1–2 nL für T. marmoratus Embryonen im Frühstadium.
- Um das Volumen der Injektionsflüssigkeit zu messen, die vom Mikroinjektionssystem abgegeben wird, kalibrieren Sie die Injektionsnadel, indem Sie das Volumen der Flüssigkeitsblase bewerten, die bei der Injektion in die Luft an der Spitze der Nadel gebildet wird. Verwenden Sie für T. marmoratus-Embryonen eine optimale Blasengröße von 100–200 m. Die Injektionsnadel ist von guter Qualität, wenn dies bei 15 psi mit einer Injektionsdauer von 3 s erreicht werden kann.
- Richten Sie die Nadel und die Agaroseplatte, die die Embryonen enthält, unter einem Stereomikroskop aus, so dass sich die Nadel den Embryonen in einem Winkel zwischen 45° und 60° nähert.
- Bewegen Sie die Mikronadel mit dem Mikromanipulator langsam, während Sie den Fortschritt durch das Stereomikroskop überwachen. Sobald die Spitze der Nadel die Oberfläche eines Embryos berührt, bewegen Sie die Nadel vorsichtig nach vorne, bis sie die Oberfläche des Embryos durchbohrt. Perforieren Sie den Embryo nicht tief mit der Nadelspitze, da dies das Überleben des Embryos beeinträchtigen kann. Um die Variabilität zu reduzieren, liefern Sie die Injektion in der Mitte des Embryos.
- Sobald sich die Nadel im Embryo befindet, drücken Sie vorsichtig den Injektionsknopf des Mikroinjektors, um die Dosis von dsRNA an den Embryo zu liefern. Nach der Injektion von 1-2 nL dsRNA, ziehen Sie die Nadel langsam aus dem Embryo, so dass es nicht dazu führt, dass der Embryo zu brechen.
- Injizieren Sie die anderen Embryonen in ähnlicher Weise. Wenn die Mikroinjektionsnadel während des Eingriffs blockiert wird, entsperren Sie sie, indem Sie den Injektionsdruck und die Dauer erhöhen. Visuell identifizieren erfolgreich injizierte Embryonen durch das Vorhandensein eines farbigen Flecks an der Injektionsstelle (da der Injektionspuffer Lebensmittelfärbung enthält).
- Legen Sie die Schale mit injizierten Embryonen vorsichtig in eine Feuchtigkeitskammer.
- Um eine solche Kammer zu konstruieren, nehmen Sie jede Plastikbox mit einem Deckel, sterilisieren Sie sie mit 70% Ethanol, lassen Sie sie trocknen und legen Sie Gewebe in autoklaviertem Wasser an den Boden, um eine feuchte Umgebung zu bieten. Legen Sie diese Feuchtigkeitskammer in einen Inkubator mit einer entsprechenden Temperatur (in diesem Fall 25 °C) und Lichtzyklus von 14 h Licht und 10 h dunkel.
- Lassen Sie injizierte Embryonen zu ersten Insternlarven entwickeln, was 4-5 Tage erfordert. Überwachen Sie den Fortschritt der Embryoentwicklung täglich mit einem Stereomikroskop, um morphologisch sichtbare Knockdown-Phänotypen zu identifizieren, wie in Abbildung 2dargestellt.
- Dokumentieren Sie diesen Fortschritt, indem Sie digitale Bilder mit einer hochauflösenden Kamera aufnehmen. Entfernen Sie tote Embryonen und füllen Sie das Wasser auf der Agaroseplatte täglich auf, um eine Austrocknung und die mögliche Ausbreitung der mikrobiellen Kontamination auf andere überlebende Embryonen während der Inkubationszeit zu vermeiden.
- Führen Sie geeignete Kontrollen für dsRNA-Injektionen durch, einschließlich Pufferinjektionen, Injektionen von dsRNA, die gegen den Sinnesstrang des Gens von Interesse synthetisiert werden, und Injektionen von dsRNA, die gegen Sequenzen synthetisiert werden, die nicht innerhalb des Zielorganismus vorhanden sind. Bestätigen Sie RNAi Knockdown mit zusätzlichen molekularen Methoden22.
5. Herstellung von T. marmoratus Larven für dsRNA-Injektionen
HINWEIS: Im Gegensatz zu Embryonen im frühstadium sind T. marmoratus Larven relativ robust und können mit größeren Volumina injiziert werden. Zum Beispiel können zweite Insterne mit bis zu 2 l dsRNA-Arbeitslösung und dritten Insternen mit mindestens 3 l injiziert werden, ohne dass dies spürbare negative Auswirkungen auf die Überlebensrate hat. Um dsRNA zu injizieren, ist es hilfreich, Larven zu immobilisieren, indem sie in Agarose eingebettet werden.
- Vor dem Sammeln der Larven 2% Agarose schmelzen und in einem Wasserbad bei 60–70 °C aufbewahren, um sie in flüssiger Form zu halten. Bereiten Sie eine Immobilisierungsschale vor, indem Sie geschmolzene 2% Agarose in eine kleine Petrischale gießen und dann abkühlen, bis sie erstarrt ist. Verwenden Sie stumpfe Zangen, um eine flache Nut in der Agarose-Platte (etwa die Größe des zu eingebetteten Arthropoden) für jedes Zuglasende zu machen.
- Sammeln Sie junge Larven in der entsprechenden Entwicklungsphase (eine Stufe vor der für die Analyse gewünschten Phase). Um dies zu tun, abtropfen lassen Sie das Wasser vorsichtig aus den Kulturbechern, die die Larven enthalten, und folgen Sie den unten genannten Schritten.
- Anästhesisieren Sie auf Eis (pflücken Sie die Larve vorsichtig aus ihrem Wasserbecher und legen Sie sie sanft auf Eis), bis die Larve keine nennenswerten Bewegungen zeigt. Verwenden Sie stumpfe, weich endete Zange, um die Larve vorsichtig vom Eis zu heben und sie auf die Immobilisierungsstufe mit Hals und Körper in der Nut zu legen, aber ihren Schwanz über der Agarose-Oberfläche, so dass sie nicht bedeckt wird, was es der Larve ermöglicht, durch ihre Schwanzspracles weiter zu atmen.
- Bedecken Sie die Larve mit einer dicken Schicht Agarose, die noch flüssig, aber nicht gefährlich heiß ist. Wenn es versehentlich abgedeckt wurde, verwenden Sie die Zange, um den Schwanz und die beiden Segmente darunter von der Agarose zu befreien. Sobald sich die Agarose verfestigt, verwenden Sie die Larve für dsRNA-Injektionen.
6. dsRNA Mikroinjektionen in T. marmoratus Larven
- Bereiten und verfüllen Sie eine Mikroinjektionsnadel mit der gewünschten Menge an genspezifischer dsRNA-Arbeitslösung (wie in den Schritten 4.1–4.2 beschrieben). Befestigen Sie die Nadel an einem Nadelhalter, der an eine manuell gesteuerte Mikroinjektionsspritze angeschlossen ist. Bevor Sie die Nadel befestigen, ziehen Sie den Spritzenkolben ganz aus, um zu vermeiden, dass der Injektionsdruck während des Eingriffs ausgeht.
- Positionieren Sie die immobilisierte Larve so, dass die Injektionsstelle, die sich dorsal zwischen dem dritten und vierten Körperplattensegment befindet, in einem relativ flachen Winkel (fast parallel zur Stufe) mit der Flugbahn der Mikroinjektionsnadel ausgerichtet ist.
HINWEIS: Das Angeln der Nadel und der Larve in dieser Position ist wichtig, da sie den Weg des geringsten Widerstands für die Nadelspitze bietet, um die Larven mit minimalen Schäden zu perforieren. - Sobald die Nadel und die Larve positioniert sind, bewegen Sie vorsichtig die Nadelspitze in die Larve mit dem Mikromanipulator, während Sie den Fortschritt durch ein Stereomikroskop überwachen.
- Nach der Spitze perforiert das Gewebe, langsam und vorsichtig Druck auf die Spritze ausüben. Stellen Sie den Injektionsdruck ein, indem Sie die Bewegung der farbigen Injektionsflüssigkeit in der Nadel unter dem Mikroskop beobachten.
- Ziehen Sie die Nadel nach der Injektion vorsichtig zurück. Verwenden Sie weiche Zangen, um wegzuschälen und damit die Larve von der Agarose zu befreien. Die Larve wieder in einen Behälter mit Wasser (bei Raumtemperatur) geben und in einem Inkubator oder Kulturraum bei 25-u201228 °C und einem Lichtzyklus von 14 h Licht und 10 h Dunkel weiterentwickeln lassen.
- Verwenden Sie geeignete Kontrollinjektionen und Knockdown-Quantifizierungen, wie in Schritt 4.10 beschrieben.
Representative Results
Mit dem oben beschriebenen Protokoll haben wir drei verschiedene Gene, nämlich weiß, laccase2 (lac2) und Lens3 (Tabelle 1), in einer Vielzahl von Entwicklungsstadien des Sunburst Diving Beetle T. marmoratusniedergeklopft. Wir führten RNAi in T. marmoratus durch Injektion von dsRNA in einem sehr frühen Stadium während der Embryogenese (Abbildung 1A). Da einige der Embryonen den Prozess nicht überleben und nekrotisch werden (Abbildung 1B), müssen sie entfernt werden, um die verbleibenden Embryonen gesund zu halten. Beispielhaft sind hier die Injektionen von dsRNA gegen das weiße Gen. Dieses Gen ist in Drosophila als einer von drei ATP-bindenden Kassetten (ABC) Transportern bekannt, die an der Aufnahme und Lagerung der Vorläufer des Augenpigments23beteiligt sind. Dementsprechend führt sein Funktionsverlust zu einem unpigmentierten, weißäugigen Phänotyp. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Injektionen von dsRNA, die auf das orthologe weiße Gen in T. marmoratus Embryonen abzielen, zum Verlust der Augenpigmentierung bei neu entstehenden Larven führen. In diesem Fall sind Wildlarven durch stark pigmentierte Augen gekennzeichnet, und der RNAi-Knockdown von Weiß führt zu verschiedenen Reduktionsgraden und sogar zur vollständigen Eliminierung von Augenpigmenten. Insgesamt beobachteten wir bei 34 % der überlebenden Embryonen zumindest eine gewisse Verringerung der Augenfärbung (n = 35). Abbildung 2A vergleicht eine Steuerperson und eine Person mit einer etwas helleren Augenfarbe. Abbildung 2B zeigt einen schwereren Knockdown bei einem Individuum, bei dem die ventralen Augen (Augen 2–5) des Clusters völlig unpigmentiert sind, während die dorsalen Augen noch eine gewisse Pigmentierung aufweisen. Diese Unterschiede zeigen, wie die Effizienz des Knockdowns regional variieren kann, was möglicherweise mit Unterschieden in der Wirksamkeit der dsRNA-Penetration in dichtem Gewebe zusammenhängt. Eine andere Person zeigt im Wesentlichen vollständigen Pigmentverlust in allen Augen (Abbildung 2C).
Um zu untersuchen, wie gut RNAi im Larvenstadium von T. marmoratusarbeitet, injizierten wir dsRNA, die auf das Tannengen lac2 abzielte, wenige Tage vor dem Versuch, in dritte Insterne einzudringen (Abbildung 3) und bewerteten die Wirkung auf die schnittförmige Färbung der dritten Instarlarven. Lac2 ist eine Art von Phenoloxidase, die Proteine oxidativ konjugiert, um sie unlöslich, härter und dunkler zu machen. Knockdown im Mehlkäfer T. castaneum hat gezeigt, dass zu helleren farbigen Personen in niedrigen Dosen führen, aber gilt als tödlich in hohen Dosen24. Abbildung 4 zeigt, dass diese Behandlung auch zu helleren Sunburst Diving Beetle Larven führt. Insbesondere hatten in diesem Experiment 75% der überlebenden injizierten Larven (n = 12) eine reduzierte Pigmentierung (im Vergleich zu 0% in der Kontrollgruppe). Abbildung 4A zeigt ein Individuum mit relativ leichter Depigmentierung, während Abbildung 4C den Kopf einer T. marmoratus Larve zeigt, bei der die dunkle Färbung der Nagelhaut fast fehlt. Die Depigmentierung war besonders deutlich bei der für diese Larven typischen zentralen dunklen Musterung, während dieses Muster bei einem kontrollinjizierten Individuum deutlich sichtbar blieb (Abbildung 4B). Darüber hinaus wurde eine Aufhellung der Schwanzluftröhre beobachtet, wie in Abbildung 4Ddargestellt. In dem Fall, in dem lac2 dsRNA in dritte Instarlarven injiziert wurde, wurden leichtere erwachsene Individuen erhalten (Abbildung 5). Beachten Sie, dass die Flügel des Abstoßkäfers etwas deformiert sind, wahrscheinlich aufgrund seiner ungewöhnlichen Weichheit.
Neben der Veränderung morphologischer Merkmale ist es möglich, RNAi zu verwenden, um Gene zu zielen, die das Verhalten beeinflussen. Um dies zu demonstrieren, führten wir RNAi gegen ein Schlüssellinsenprotein-Codierungsgen, Lens318, durch und injizierten es in zweite Instar-Larven, um die optischen Eigenschaften von dritten Insternlarvenaugen zu beeinflussen. Alle Auswirkungen auf die Linse, die hier beobachtet werden, sind wahrscheinlich, da die Augen von T. marmoratus Larven bei diesem Übergang einem großen Augenwachstum unterzogen werden, was auch große optische Veränderungen der Linse beinhaltet25. RNAi Knockdown in diesem Experiment war hocheffizient. Die Überprüfung durch qPCR ergab eine Erfolgsquote von 100 %; von 13 getesteten Personen wurden 12 auf weniger als 10 % des Expressionsniveaus von Kontrollpersonen reduziert, wobei die verbleibende Person eine Expressionsstufe von 17 % der Kontrollstufe (unveröffentlichte Beobachtung) hatte. Auf der phänotypischen Ebene waren nur einige Personen schwer behindert oder unfähig, Beute zu fangen, wie in Abbildung 6 für eine Person dargestellt wird, die sich ihrer Beute immer wieder aus sehr großer Entfernung näherte, sie aber konsequent überschoss.
Tabelle 1: Primersequenzen und Amplicons für weiße, lac2- und Lens3-Proteine. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Abbildung 1: Abbildung der Embryoinjektionen. (A) Dechorionierte Embryonen, die auf einer Agaroseplatte aufgereiht und in der Nähe ihres Zentrums mit einer Mikroinjektionsnadel injiziert wurden, die mit dsRNA und einem lebensmittelfärbenden Injektionspuffer gefüllt war. Der Maßstabsbalken entspricht 500 m. (B) Eine Person mit einem schwereren Knockdown. Injizierte Embryonen werden in einer Feuchtigkeitskammer aufbewahrt und täglich überwacht, um Phänotypen zu bewerten und tote Individuen zu entfernen (die braun werden). Die Maßstabsleiste stellt 5 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Beispiel für voll entwickelte Embryonen, die mit dsRNA gegen Weiß injiziert wurden. (A) Vergleich einer Person mit einer Reduktion der Augenpigmentierung (links) und einer kontrollinjizierten Person (rechts). E1–E6 siehe Eyes 1–6. (B) Eine Person mit einem schwereren Knockdown-Phänotyp, was zeigt, dass manchmal einige der Augen innerhalb des Clusters stärker von dem Knockdown betroffen sind als andere. (C) Einzelperson mit einem nahezu vollständigen Verlust der Augenpigmentierung. Der Maßstabsbalken entspricht 200 m; Die Panels B und C sind in der gleichen Skala dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Abbildung der Larveninjektionen. (A) Mehrere Larven, die durch Einbettung in 2% Agarose mit ihren Schwanzspracles frei von jeder Agarose immobilisiert wurden. (B) Mikroelektrode, die die Injektionslösung enthält, so dass ihre Spitze die feine Membran zwischen zwei Segmenten durchdringen kann. (C) Blauer Injektionsfarbstoff, der nach der Injektion an der Injektionsstelle sichtbar ist. Maßstabsleisten stellen 1 cm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: RNAi für laccase2, die auf zweite Instar-Larven angewendet wird, was zu einer reduzierten Nagelhautfärbung bei dritten Instarlarven führt. (A) Relativ leichter Verlust der Färbung in einem lac2 RNAi Individuum (unten) im Vergleich zu einem kontrollinjizierten Individuum (oben). Die Skalenstange stellt 5 mm dar. (B) Kopf einer Steuerperson, die das charakteristische dunkel gefärbte Muster in der Mitte des Kopfes zeigt. (C) Relativ schwerer Knockdown von Lac2, was zu einem nahezu vollständigen Verlust der zentralen Kopffärbung führt. (D) Verlust der Färbung in der Hauptschwanznagel eines lac2 RNAi Individuums (unten) im Vergleich zu einem kontrollinjizierten Individuum (oben). Maßstabsleisten in B-u2012D stellen 1 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: RNAi für laccase2 auf eine dritte Instar-Larve angewendet, was zu einer reduzierten Nagelhautfärbung bei einem Erwachsenen führt. Das Knockdown-Individuum (links) zeichnet sich auch im Vergleich zur Steuerung (rechts) durch sehr weiches Elytra aus. Die Maßstabsleiste stellt 5 mm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Knockdown eines großen Linsenproteins, das zu Mängeln bei der Beuteerfassung führt. (A–C). Drei Beispiele, in denen eine Sunburst Diving Beetle Larve, in der optische Defizite durch RNAi induziert wurden, nicht in der Lage war, Beute (Mückenlarven) zu fangen. Repräsentative Standbilder wurden aus einer Videoaufzeichnung charakteristischer Beuteaufnahmen ausgewählt. (D) Kontrolle Larven fangen Beute. Alle Maßstabsleisten stellen 2 cm dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Discussion
Unser Ziel ist es, dass diese Zusammenstellung von Methoden RNAi weit verfügbar machen wird, zumal dieses Tool eine leistungsstarke synergistische Technik zur CRISPR/Cas9-basierten Genbearbeitung bleibt, mit dem Vorteil, dass es auf die gewünschten Entwicklungsstadien untersuchter Organismen angewendet werden kann. Um diese Stärke zu veranschaulichen, injizierten wir dsRNA in Embryonen und in verschiedene Larvenstadien. Injektionen in Eier beeinflussten die Entwicklung von Embryonen (Abbildung 2), Injektionen in das zweite Larvenstadium hatten offensichtliche Auswirkungen auf das dritte Larvenstadium (Abbildung 4 und Abbildung 6), und Injektionen in das dritte Larvenstadium zeigten Effekte bei Den Erwachsenen (Abbildung 5). Während der genaue Zeitpunkt experimentell festgelegt werden muss, in der Regel, Injektionen wirksam innerhalb von ein paar Tagen. Der Erfolg dieses Prozesses kann durch die Länge der dsRNA-Sequenz beeinflusst werden. Hier präsentierten wir Beispiele mit etwas mehr als 200 bp bis über 800 bp. In der Regel werden Sequenzen zwischen 100 und 600 bp bevorzugt, um Off-Target-Effekte zu begrenzen, aber Sequenzen bis zu 1000 bp ergeben gute Ergebnisse22. Eine Frage in Bezug auf RNAi ist die Dauer des Knockdown, die durch diese Technik erreicht werden kann. Da die Phänotypen in jeder Phase terminal waren, können wir dieses Problem nicht auf der Grundlage unserer vorgestellten Ergebnisse kommentieren. Jedoch, Es wurde zuvor festgestellt, dass RNAi-Effekte sind in der Regel relativ langlebig, und dass höhere Konzentrationen führen zu länger anhaltenden Knockdowns20.
Eine Einschränkung dieser Technik ist, dass es für einige Organismen besser funktioniert als für andere, und es scheint keine direkte Möglichkeit zu geben, vorherzusagen, wie gut es a priori funktionieren wird. Dennoch hat sich herausgestellt, dass es für eine Vielzahl von verschiedenen Organismen gut funktioniert. Innerhalb der Arthropoden, dies umfasst Arachniden26, Krebstiere27, und eine Vielzahl von Insekten, mit besonders hohen Erfolgsraten bei Käfern28. Eine weitere Komplikation ist, dass Unterschiede in der Phänotyp-Schwere oft zwischen Individuen auftreten, trotz der Anwendung der gleichen Menge an dsRNA. Wie in Abbildung 2Bdargestellt, kann es sogar innerhalb eines Individuums zu Abweichungen kommen. In unseren RNAi-Studien, die auf verschiedene Gene abzielen, die an der Entwicklung von T. marmoratus Larvenaugen beteiligt sind, haben wir häufig festgestellt, dass einige Augen stärker betroffen sind als andere. Dieses Phänomen kann mit dem relativ dichten Gewebe des Augenhaufens zusammenhängen, wobei die dsRNA besser in der Lage ist, einige der Einheiten zu erreichen.
Für die erfolgreiche Durchführung von RNAi-Experimenten ist es entscheidend, dass mehrere Parameter für das Zielgen optimiert sind. Zum Beispiel kann die Konzentration der dsRNA und die Länge des Zielgens das Ergebnis stark beeinflussen20. Ein weiterer kritischer Parameter ist, wie die Injektionen ausgeführt werden, da dieser Prozess die Überlebensrate stark beeinflussen kann. Bei Embryonen erzielten wir die besten Ergebnisse, indem wir auf das Zentrum des Embryos zielten. Eine gut angelegte Platte ermöglicht die Injektion von 100 oder mehr Embryonen in einer einzigen Sitzung. Bei Larven ist es wichtig, die Injektionsnadel zwischen die Segmente einzufügen. Diese Injektionen erfordern mehr dsRNA, und basierend auf der Verfügbarkeit von Larven bestanden unsere Injektionssets hier in der Regel nur aus wenigen Tieren gleichzeitig. Bei allen Injektionen ist es wichtig, zu verhindern, dass Luft in den Organismus gelangt.
In einigen Fällen können die Rückkopplungsschleifen eines Genregulierungsnetzwerks und genetische Redundanz die Penetranz von RNAi-Phänotypen beeinflussen, trotz konsequenter Knockdowns. Dies scheint der Fall für unsere Verhaltensbeobachtungen von Larven mit sehr erfolgreichen Knockdowns eines prominenten Linsenproteins, Lens318, zu sein. Obwohl wir die hohe Effizienz dieser Knockdowns durch qPCR überprüften, wurden erhebliche Abweichungen bei den zugehörigen Phänotypen beobachtet. Dieses Ergebnis unterstreicht die Notwendigkeit einer ordnungsgemäßen Quantifizierung von RNAi-Knockdowns (Details zu Optionen siehe22). Wenn es keine klare a priori Erwartung in Bezug auf die resultierenden Phänotypen gibt, ist eine gute Möglichkeit, die Off-Target-Effekte von RNAi zu kontrollieren, das gleiche Gen mit zwei nicht überlappenden Sequenzen von dsRNA anzuvisieren und die Ergebnisse für gängige Phänotypen zu bewerten.
Im Gegensatz zu Gen-Editing-Techniken ist RNAi auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um tödliche Gene zu untersuchen, und es gibt zwei Möglichkeiten, dies zu tun. Wenn man zum Beispiel an dem funktionellen Beitrag eines Gens interessiert ist, bei dem der Funktionsverlust früh in der Entwicklung als tödlich bekannt ist, kann eine funktionelle Untersuchung eines solchen Gens erreicht werden, indem man dem Tier einfach erlaubt, sich normal zu entwickeln, und dann das Gen später in der Entwicklung (d. h. beim Erwachsenen) über RNAi niederschlägt. Alternativ kann ein Gen, bei dem der vollständige Funktionsverlust als tödlich bekannt ist, durch einen partiellen Knockdown untersucht werden, der durch Injektion einer Reihe von dsRNA-Konzentrationen erreicht werden kann. Einige unserer Ergebnisse zeigen Knockdowns von lac2, die bekanntermaßen tödlich sind, wenn die Nagelhaut bei Insekten zu weich wird24. Selbst der in Abbildung 5 abgebildete Lac2-RNAi-Käfer würde außerhalb der Laborbedingungen wahrscheinlich nicht überleben. lac2 Ein weiteres tödliches Gen wird geschnitten,das codes für einen Transkriptionsfaktor, der für die Zell-Fate-Spezifikation in verschiedenen Organsystemen in Arthropoden grundlegend ist und mit der Gliaentwicklung im Visuellen System Drosophila in Verbindung gebracht wurde29. Basierend auf unseren Erfahrungen mit geschnittenen RNAi in T. marmoratus Embryonen können wir informative Augenphänotypen in Embryonen evozieren, die in der Lage sind, ihre embryonale Augenentwicklung abzuschließen (unveröffentlichte Beobachtungen). Hier, höhere Dosierungen scheinen zu höheren Tödlichkeitsraten führen, während niedrigere Dosen führen in beobachtbaren und informativen Phänotypen.
Unser Protokoll listet nicht nur die notwendigen Schritte auf, damit ein Forscher RNAi-Experimente an T. marmoratusdurchführen kann, wie dargestellt, sondern ist auch allgemein auf andere Organismen, insbesondere Wasserorganismen, anwendbar. Unter den Wasserorganismen gibt es bereits mehrere Beispiele innerhalb von Krebstieren wie den Wasserflöhen Daphnia30 und Garnelen (für eine aktuelle Überprüfung, siehe Referenz31). Es gibt genügend Möglichkeiten unter Wasserinsekten, da sie schätzungsweise etwa 6% der gesamten Insektenvielfalt ausmachen, mit wahrscheinlich mehr als 200.000 Arten32. Darüber hinaus wurde RNAi bereits an Wasserstridern durchgeführt, die dazu neigen, die Oberfläche von aquatischen Umgebungen zu bewohnen33. Wenn kein Genom vorhanden ist, kann ein Transkriptom de novo zusammengesetzt werden. Solange dieser Prozess Kontaste von einigen hundert Nukleotiden offenbart, kann dsRNA gegen bestimmte Gene entwickelt werden. Unser Protokoll zur Immobilisierung von Insekten in Agarose wird wahrscheinlich auch für andere Verfahren nützlich sein, insbesondere für weiche, formbare und Wasserorganismen. Zusammengenommen bleibt RNAi eine leistungsfähige Technik zur Manipulation der Genexpression in einer vielfältigen Gruppe von Organismen, auch wenn keine anderen molekularen und genetischen Werkzeuge zur Verfügung stehen.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Josh Benoit für seine Unterstützung bei der Bioinformatik Hailey Tobler für ihre Hilfe bei der Aufzucht von Sunburst Diving Beetles und Tamara Pace für redaktionelle Unterstützung. Diese Forschung wurde von der National Science Foundation unter den Stipendien IOS-1456757 und IOS-1856341 an EKB und IOS1557936 an YT unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly | |||
| liquid nitrogen | University Stockroom | Typically locally available at research institutions | |
| pipette tips | Fisher Scientific | size dependent | Products from other vendors would work equally well |
| RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) | Qiagen | 74804 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 1.2. De novo transcriptome assembly. | |||
| BUSCO.v3 | https://busco.ezlab.org/ | Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used. | |
| CLC Genomics workbench | Qiagen | 832021 | Other equivalent software packages are also available |
| Galaxy workbench | https://usegalaxy.org/ | An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline | |
| NCBI BLASTx | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx | An open source online alignment and annotation pipeline | |
| 2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation | |||
| ampicillin sodium salt | Gibco | 11593-027 | Products from other vendors would work equally well |
| glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | Products from other vendors would work equally well |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-500 | Products from other vendors would work equally well |
| Omniscript RT (reverse trasncription) kit | Qiagen | 205111 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit | ThermoFischer | 771471 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| shaker-incubator | Labnet | 211DS | Other models would work equally well |
| spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| thermal cycler for PCR | BioRad | T100 | Other models would work equally well |
| TOPO TA Cloning kit | Invitrogen | 1845069 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| X-Gal Solution | Thermo Scientific | R0941 | Products from other vendors would work equally well |
| 2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis | |||
| Centrifuge | Fisher Scientific | accuSpin Micro 17R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| FastTaq DNA Polymerase, dNTPack | Roche | 13873432 | This kit contains all the reagents necessary for a PCR |
| MEGAclear Transcriiption clean up kit | ThermoFischer | AM1908 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| MEGAscript T7 Transcription kit | ThermoFischer | AM1334 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| nuclease-free water | Fisher Scientific | AM9932 | Products from other vendors would work equally well |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Detailed specific protocol is provided with the kit |
| sodium acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | Make 3M working solution |
| Spectrophotometer (NnanoDrop) | Thermo Fisher | 9836674 | Other models would work equally well |
| 3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| distilled water | Fisher Scientific | 9180 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| glass cavity dish (3 well-dish) | Fisher Scientific | 50-243-43 | Products from other vendors would work equally well |
| microwave | Welbilt | turn-table | Other models would work equally well |
| natural hair paintbrush | Amazon | Any fine brush will do | |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| transfer pipettes | Fisher Scientific | 21-200-109 | Products from other vendors would work equally well |
| 4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos | |||
| digital camera | Edmund optics (Qimaging) | Retiga 2000R | Other models would work equally well |
| ethanol | Fisher Scientific | A4094 | Products from other vendors would work equally well |
| food dye | Kroger | Any available food dye should work fine | |
| humidity chamber | take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry | ||
| incubator | Labline | 203 | Other models would work equally well |
| injection buffer | Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C. | ||
| intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) | Parker | 052-0500-900 | Currently the model III is available, but older models work also |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micromanipulator | Drummond Scientific Company | 3-000-024-R | Any quality micromanipulator will work |
| monosodium phosphate | Fischer scientific | 7558-80-7 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| P10 micro-pipetter | Gilson | F144802 | Other models would work equally well |
| P1000 micro-pipetter | Gilson | F123602 | Other models would work equally well |
| potassium chloride | Fischer scientific | 7447-40-7 | To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained. |
| sodium phosphate buffer (0.1M) | To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature. | ||
| sodium phosphate dibasic | Fischer scientific | 7558-79-4 | To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
| 5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections | |||
| agarose | Fisher Scientific | 9012-36-6 | Products from other vendors would work equally well |
| forceps (Dumon #4 Biology) | Fine Science Tools | 11242-40 | Products from other vendors would work equally well |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | Products from other vendors would work equally well |
| 6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae | |||
| injection buffer (10x) | See section 4 | ||
| microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| microinjection syringe | A-M Systems | 603000 | Other models would work equally well |
| micro needle holder | A-M Systems | 672441 | Other products would work equally well |
| P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-1000 | Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700. |
| stereomicroscope | Microsocope Central | 10446293 | Any good stereomicroscope will work |
References
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