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विशिष्ट विकासात्मक समय बिंदुओं पर जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में जलीय बीटल में आरएनए हस्तक्षेप

Published: May 29, 2020 doi: 10.3791/61477
Automatic Translation
1, 1, 2,3, 1,4, 2, 1
1Department of Biological Sciences, University of Cincinnati, 2Department of Biology, Miami University, 3Department of Biology, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Neuroscience, The Scripps Research Institute

Summary

आरएनए हस्तक्षेप विशिष्ट विकास के चरणों में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर के लिए एक व्यापक रूप से लागू, शक्तिशाली तकनीक है । यहां, हम जलीय डाइविंग बीटल थर्मोनेक्टस मार्मोरेटसमें इस तकनीक को लागू करने के लिए आवश्यक चरणों का वर्णन करते हैं, जीन दृश्यों के अधिग्रहण से लेकर संरचना या व्यवहार को प्रभावित करने वाले जीन के नॉकआउट तक।

Abstract

आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) एक शक्तिशाली तकनीक बनी हुई है जो एमआरएनए क्षरण के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति की लक्षित कमी के लिए अनुमति देती है। यह तकनीक विभिन्न प्रकार के जीवों पर लागू होती है और प्रजातियों से भरपूर आदेश कोलियोप्टेरा (बीटल) में अत्यधिक कुशल है। यहां, हम एक उपन्यास जीव में इस तकनीक को विकसित करने के लिए आवश्यक चरणों को संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं और जलीय डाइविंग बीटल थर्मोनेक्टस मार्मोरेटस के विभिन्न विकासात्मक चरणों में इसके आवेदन को चित्रित करते हैं। ज्ञात जीनोमिक्स या डी नोवो के साथ एक करीबी रिश्तेदार के खिलाफ ट्रांसक्रिप्टोम की असेंबली के माध्यम से लक्ष्य जीन दृश्यों को लागत प्रभावी रूप से प्राप्त किया जा सकता है। उम्मीदवार जीन क्लोनिंग एक विशिष्ट क्लोनिंग वेक्टर (पीसीआर 4-टोपो प्लाज्मिड) का उपयोग करता है, जो एक आम प्राइमर के उपयोग के साथ किसी भी जीन के लिए डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) के संश्लेषण की अनुमति देता है। संश्लेषित डीएसआरएनए को बाद की विकास प्रक्रियाओं के लिए प्रारंभिक विकास प्रक्रियाओं या लार्वा के लिए या तो भ्रूण में इंजेक्ट किया जा सकता है। फिर हम बताते हैं कि कैसे आरएनएआई को एगरेएन में स्थिरीकरण का उपयोग करके जलीय लार्वा में इंजेक्ट किया जा सकता है। तकनीक को प्रदर्शित करने के लिए, हम आरएनएआई प्रयोगों के कई उदाहरण प्रदान करते हैं, भविष्यवाणी किए गए फेनोटाइप के साथ विशिष्ट नॉकडाउन उत्पन्न करते हैं। विशेष रूप से, कमाना जीन laccase2 के लिए आरएनएआई दोनों लार्वा और वयस्कों में हल्का बिजली की ओर जाता है, और आंखों के पिगमेंटेशन जीन सफेद के लिए आरएनएआई आंखों की ट्यूबों में पिगमेंटेशन की कमी पैदा करता है । इसके अलावा, एक प्रमुख लेंस प्रोटीन के नॉकआउट ऑप्टिकल कमियों और शिकार करने के लिए एक कम क्षमता के साथ लार्वा की ओर जाता है । संयुक्त रूप से, ये परिणाम केवल ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटाबेस वाले जीवों में रूपात्मक पैटर्निंग और व्यवहार लक्षणों दोनों की जांच के लिए एक उपकरण के रूप में आरएनएआई की शक्ति का उदाहरण देते हैं।

Introduction

कैसे विशिष्ट जीन विविध लक्षण के विकास में योगदान का सवाल जीव विज्ञान में एक रोमांचक विषय है । पिछले कुछ दशकों में, नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस,फल फ्लाई ड्रोसोफिला मेलानोगेस्टरऔर घर के माउस मस्कुलस1जैसे कुछ मॉडल जीवों में विकासात्मक प्रक्रियाओं के आनुवंशिक आधार को विच्छेदन करने के संबंध में बहुत प्रगति हुई है। हाल ही में, शक्तिशाली जीन-संपादन तकनीकों के आविष्कार जैसे क्लस्टर नियमित रूप से इंटरस्पेस्ड शॉर्ट पैलिंड्रोमिक रिपीट्स (CRISPR)/Cas92 ने गैर-मॉडल जीवों के आनुवंशिक कोड को बदलने की क्षमता प्रदान की है (उदाहरण के लिए3,,4देखें)। नतीजतन, विभिन्न प्रकार के जीवों पर आनुवंशिक अध्ययनों में वृद्धि हुई है, जिनसे पहले आणविक तकनीकों के माध्यम से संपर्क नहीं किया गया था । हमारे पशु साम्राज्य की विशाल विविधता को ध्यान में रखते हुए, कई दिलचस्प लक्षण या विशेषता विचरण के साथ जो केवल विशिष्ट प्रजातियों में प्रतिनिधित्व करते हैं, इस प्रगति ने इसे विकासवादी-विकासात्मक जीव विज्ञान ("इवो-देवो") से संबंधित काम के लिए एक रोमांचक समय बना दिया है। हालांकि, गैर-मॉडल जीवों के लिए उपलब्ध जीनोम-संपादन तकनीकों को विकास के समय के बिंदुओं के संबंध में अपेक्षाकृत प्रतिबंधित किया जाता है, जिससे उन्हें लागू किया जा सकता है, जिससे किसी भी विशेषता में विशिष्ट जीन खेलने वाली भूमिका से संबंधित लौकिक गुणों को समझना चुनौतीपूर्ण हो जाता है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक तकनीक अक्सर उन जीनों तक सीमित होती है जो जीवित रहने के लिए गैरजरूरी हैं (यानी, जिनके नॉकआउट में घातकता नहीं होती है)। इसलिए, जबकि जीन-संपादन तकनीकें लोकप्रिय होने लगी हैं, प्रभावी तकनीकों की आवश्यकता बनी हुई है जो विशिष्ट विकासात्मक समय बिंदुओं पर विभिन्न जीवों की एक किस्म पर लागू होती हैं और आंशिक नॉकडाउन (पूरी हानि-कार्य के बजाय) की सुविधा प्रदान करती हैं। यहां, हम आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) की ओर ध्यान आकर्षित करते हैं, जो कुछ हद तक दिनांकित अभी तक शक्तिशाली जीन नॉकडाउन तकनीक5 है जो जीन संपादन के लिए एक सहक्रियात्मक दृष्टिकोण के रूप में विशेष रूप से मूल्यवान है। विशेष रूप से, हमने ऐसी प्रक्रियाएं विकसित की हैं जो आरएनएआई के अनुप्रयोग के लिए जलीय डाइविंग बीटल को एक उदाहरण के रूप में अनुमति देती हैं जो आवश्यक आणविक दृश्यों के अधिग्रहण से लेकर अंडे और लार्वा में डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) के सफल इंजेक्शन तक, इस तकनीक के कार्यान्वयन को दर्शाती है।

आरएनएआई आधारित जीन नॉकडाउन जीवों के एक सहज रक्षा तंत्र का लाभ उठाता है, जिसमें dsRNA अणु वायरस और ट्रांसपोसंस6जैसे न्यूक्लिक एसिड दृश्यों पर हमला करने की सुविधा प्रदान करते हैं। संक्षेप में, डीएसआरएनए को कोशिका में ले जाया जाता है, जहां इसे डिसर एंजाइम द्वारा 20-25 न्यूक्लियोटाइड टुकड़ों में काटा जाता है। ये टुकड़े तब आरएनए-प्रेरित चुप्पी परिसर (आरआईएससी) के गठन को सक्रिय करते हैं, जो गाइड स्ट्रैंड का उपयोग करके विशिष्ट साइटों पर इसे बाध्यकारी करके लक्षित एमआरएनए को रोकता है। इस प्रक्रिया से अंतत एमआरएनए का क्षरण होता है और इसलिए एमआरएनए के संबंधित प्रोटीन 6 में अनुवाद में हस्तक्षेपहोताहै । आरएनएआई आधारित जीन नॉकडाउन तकनीक यहां प्रस्तुत इसलिए dsRNA के इंजेक्शन पर निर्भर करता है । पशु मॉडल के लिए, यह तकनीक मूल रूप से सी एलिगेंस7 और डी मेलनोगेस्टर8 में विकसित की गई थी, लेकिन तब से गैर-मॉडल जीवों9,,10में एक शक्तिशाली कार्यात्मक आनुवंशिक उपकरण के रूप में उभरा है।8 कुछ कीड़ों में इसकी अत्यधिक प्रभावी प्रकृति के कारण, आरएनएआई को कीट प्रबंधन11में भी लागू किया जा सकता है।

एक शोध उपकरण के रूप में, आरएनएआई का उपयोग यह जांचने के लिए किया गया है कि गैर-पारंपरिक कीट मॉडलों में प्रमुख आणविक-विकासात्मक रास्ते कैसे कार्य करते हैं। उदाहरण के लिए, आटे की बीटल ट्राइबोलियम , कास्टेनियम में आरएनएआई यह निर्धारित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता रहा है कि जीन उस बीटल में विशिष्ट लक्षणों में कितना गहराई से योगदान करते हैं, जैसा कि विशेष रूप से आकार केपंखों 12,13, 14और आंखों के विकास के लिए उदाहरण है,15,,16।14 टी कास्टेनियम में जोड़तोड़ को रेखांकित करने वाली तकनीकों को अच्छी तरह से17 वर्णित किया गया है और चिपचिपा सतह पर अपेक्षाकृत सूखे अंडे और लार्वा को स्थिर करने की क्षमता पर भरोसा करते हैं। इस तरह के स्थिरीकरण हालांकि जलीय जीवों जैसे सनबर्स्ट डाइविंग बीटल थर्मोनेक्टस मार्मोरेटसके गीले विकासात्मक रूपों के लिए संभव नहीं है । जैसा कि कई गैर-पारंपरिक मॉडल जीवों के लिए मामला है, इसमें एनोटेटेड जीनोम का अभाव है। जीनोम के बिना किसी भी जीव में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए, एक उचित और लागत-कुशल पहला कदम ट्रांसक्रिप्टोम उत्पन्न करना और संबंधित लेकिन अधिक स्थापित मॉडल जीवों के साथ अनुक्रम समानता के आधार पर ब्याज के व्यक्त किए गए जीन के ख्यात न्यूक्लियोटाइड दृश्यों की पहचान करना है, इस मामले में, मुख्य रूप से ट्राइबोलियम (कोलोप्टेरा) और ड्रोसोफिला जीन।

यहां, यह प्रदर्शित करने के लिए कि आरएनएआई का उपयोग जलीय जीव पर कैसे किया जा सकता है, हम पहले आरएनए निष्कर्षण और ट्रांसक्रिप्टोम पीढ़ी और संयोजन के लिए प्रोटोकॉल और सॉफ्टवेयर पर चर्चा करते हैं, जो विशिष्ट लक्षित जीन दृश्यों की पहचान के लिए अनुमति देते हैं। इसके बाद हम जीन-विशिष्ट dsRNA संश्लेषण के लिए आवश्यक कदम संक्षेप में प्रस्तुत करते हैं । इसके बाद, हम वर्णन करते हैं कि कैसे अंडे को जलीय वातावरण में इंजेक्ट किया जा सकता है और भ्रूण के विकास के लिए इनक्यूबेशन प्रोटोकॉल प्रदर्शित कर सकते हैं । इसके अलावा, हम दिखाते हैं कि इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान लार्वा को पूरी तरह से स्थिर करने के लिए एगर उठे जेल का उपयोग कैसे किया जा सकता है, एक तकनीक जो आम तौर पर विभिन्न प्रक्रियाओं के दौरान उपयोगी होती है और विभिन्न प्रकार के आर्थ्रोपोड पर लागू की जा सकती है। यह प्रदर्शित करने के लिए कि आरएनएआई को विभिन्न विकासात्मक चरणों में कैसे लागू किया जा सकता है, हम एक उदाहरण शामिल करते हैं जिसमें हमने भ्रूण में आंखों के पिगमेंटेशन जीन सफेद को खामोश कर दिया । इसके अलावा, हम एक उदाहरण का वर्णन करते हैं जिसमें टैनिंग जीन लैक्केस 2(lac2) दोनों दूसरे लार्वा इंस्टार (तीसरे लार्वा इनस्टार के लार्वा को प्रभावित करने के लिए) और तीसरा लार्वा इंस्टार (वयस्कों को प्रभावित करने के लिए) के दौरान खामोश कर दिया गया था। अंत में, हम प्रदर्शित करते हैं कि डीएसआरएनए की कम एकाग्रता का इंजेक्शन आंशिक नॉकडाउन की ओर जाता है, जिससे पता चलता है कि इस तकनीक को जीन पर भी लागू किया जा सकता है जहां नुकसान-कार्य घातक माना जाता है।

Protocol

1. आरएनए अलगाव और डी नोवो ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली

  1. देर से चरण तीसरे इनस्टार डाइविंग बीटल लार्वा आंख ट्यूबों और वयस्क बीटल से आरएनए आइसोलेशन किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके कुल आरएनए अलगाव करें जो लिपिड-समृद्ध ऊतक के लिए डिज़ाइन किया गया है। टी मार्मोरेटस से कुल आरएनए को अलग करें और इसे पहले वर्णित तरीकों के बादअनुक्रम 18।
  2. डी नोवो ट्रांसक्रिप्टोम असेंबली
    नोट: ट्रांसक्रिप्टोम डी नोवो को इकट्ठा करने के लिए, विभिन्न बायोइन्फॉर्मेटिक्स प्लेटफार्मों का उपयोग किया जा सकता है (सामग्री की तालिकादेखें)। ये प्लेटफ़ॉर्म व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं और कुछ मामलों में, Unix-आधारित कमांड लाइन लिपियों के रूप में मौजूद हैं। चूंकि असेंबली डी नोवो है, इसलिए दो प्लेटफार्मों पर स्वतंत्र रूप से ट्रांसक्रिप्टोम को इकट्ठा करने और झूठे सकारात्मक या झूठे नकारात्मक को बाहर करने के लिए परिणामों की तुलना करने की सिफारिश की जाती है।
    1. ट्रांसक्रिप्टम को कोडांतरण शुरू करने के लिए, संबंधित बायोइन्फॉर्मेटिक्स प्लेटफॉर्म पर कच्चे रीड्स अपलोड करें।
      नोट: ये फाइलें आमतौर पर संकुचित और प्रारूप FASTQSANGER में होती हैं। Gz. फाइलों को डिकंप्रेस करने की कोई जरूरत नहीं है क्योंकि यह फॉर्मेट अगले स्टेप में स्वीकार किया जाता है ।
    2. ट्रिमोमैटिक कमांड लाइन का उपयोग करके, डिफ़ॉल्ट सीमा से नीचे गिरने वाले एडाप्टर दृश्यों या शॉर्ट रीड्स को हटाने के लिए कच्चे पढ़ता है ट्रिम करें। छंटनी कच्चे पढ़ता है Decompress; फाइलें अब फास्टक्यू फॉर्मेट में होंगी। डी नोवो असेंबली के लिए तैयार फ़ाइलों को प्राप्त करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए FASTQ कच्चे पढ़ता है।
    3. असेंबल किया गया कच्चा किसी भी कमांड लाइन स्क्रिप्ट का उपयोग करके डी नोवो पढ़ता है जो ट्रांसक्रिप्टोम डी नोवो को इकट्ठा कर सकता है। इकट्ठे हुए ट्रांसक्रिप्टोम को सेव करें, जिसमें अब अपने-अपने सीक्वेंस के साथ कॉन्टिग्स की लिस्ट होगी, जो एक FASTA फाइल के रूप में होगी । विधानसभा के कवरेज को बढ़ाने के लिए, एक ही प्रजाति के लिए कई ट्रांसक्रिप्टोम को मिलाएं और इकट्ठा करें।
      नोट: इस प्रक्रिया को और अधिक सटीक contigs पैदा करने की संभावना बढ़ जाती है और विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर कम कॉपी संख्या जीन ब्याज की हैं ।
    4. एक बार इकट्ठा होने के बाद, कवरेज स्कोर की गणना करके पूर्णता के लिए ट्रांसक्रिप्टोम का आकलन करें (कवरेज मूल्यांकन सॉफ्टवेयर स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है, सामग्री की तालिकादेखें)।
      नोट: कवरेज स्कोर और 75% के साथ एक ट्रांसक्रिप्टोम अच्छा माना जाता है। हालांकि, इस स्कोर की प्रासंगिकता ट्रांसक्रिप्टोम पीढ़ी के कारण पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, यदि ट्रांसक्रिप्टोम का उपयोग कम कॉपी नंबर जीन की पहचान करने के लिए किया जा रहा है, तो एक स्कोर और 85% बेहतर है, क्योंकि यह अधिक कवरेज का प्रतीक है।
    5. एक बुनियादी स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट; सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके डी नोवो असेंबल ट्रांसक्रिप्टोम को एनोटेट करें।
      नोट: इस प्रयोग के लिए, ट्रांसक्रिप्टोम को मुख्य रूप से ज्ञात ड्रोसोफिला प्रोटीन के डेटाबेस और ज्ञात बीटल प्रोटीन के डेटाबेस के खिलाफ एनोटेट किया गया था। एनोटेशन की सूची को स्प्रेडशीट फाइल के रूप में डाउनलोड किया जा सकता है और अन्य जीवों के प्रोटीन में अनुक्रम समानता का संकेत देने वाले को फास्टा फाइल के रूप में डाउनलोड किया जा सकता है ।
    6. ब्याज के प्रोटीन के कॉन्टिग नंबर/नंबर की पहचान करें और न्यूक्लियोटाइड सीक्वेंस निकालें । यह पहचानने के लिए ब्लास्ट का उपयोग करें कि क्या प्रोटीन-विशिष्ट संरक्षित क्षेत्र (जैसे होमोबॉक्स डोमेन) ब्याज के एनोटेटेड न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम में मौजूद हैं। जीन-विशिष्ट प्रतिलिपि के अनुक्रम को उत्पन्न करने के लिए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम ओवरलैप के लिए एक ही एनोटेशन के साथ अन्य कॉन्टिग्स की जांच करें।
      नोट: अनुक्रम ओवरलैप के साथ contigs की पहचान आमतौर पर सभी जीन के लिए संभव नहीं है, विशेष रूप से कम कॉपी संख्या जीन के लिए ।
    7. यदि जीन के पूर्ण लंबाई अनुक्रम की आवश्यकता है, तो उस कॉन्टिग के साथ शुरू करें जिसमें 3 ' और सीडीएनए समाप्त होता है (रेस19)के 5 ' रैपिड प्रवर्धन जैसी तकनीकों का उपयोग करके पूरे परिपक्व ट्रांसक्रिप्ट के न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम की पहचान करने के लिए एक दीक्षा बिंदु के रूप में उच्चतम अनुक्रम समानता है।
    8. दूसरे मंच से प्राप्त असेंबली को 1.2.4-1.2.7 चरणों के बाद एनोटेट करें।
      नोट: आदर्श रूप में, परिणाम ब्याज के प्रोटीन के लिए समान होना चाहिए; हालांकि, कवरेज कुछ हद तक प्लेटफार्मों के बीच भिन्न हो सकता है।
    9. धारा 2 में उल्लिखित प्रजातियों-विशिष्ट डीएसआरएनए को संश्लेषित करने के लिए इकट्ठे हुए ट्रांसक्रिप्टोम का उपयोग करें।

2. क्लोनिंग और जीन विशिष्ट dsRNA संश्लेषण

नोट: जीन-विशिष्ट क्लोनिंग और डीएसआरएनए संश्लेषण टी कास्टेनियम20, 21, 22,21के लिए विस्तार से वर्णित किया गया,है। निम्नलिखित चरण एक संक्षिप्त अवलोकन हैं।

  1. क्लोनिंग, बैक्टीरियल ट्रांसफॉर्मेशन, और प्लाज्मिड अनुक्रमण
    1. जीव से कुल आरएनए को अलग करें (जैसा कि चरण 1.1 में वर्णित है) और रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करके पूरक डीएनए (सीडीएनए) बनाएं। ब्याज के जीन के लिए विशिष्ट हैं कि contigs से एक या दो 100-1000 बीपी न्यूक्लियोटाइड दृश्यों की पहचान करें।
      1. न्यूक्लियोटाइड के पूरे पहचाने गए खंड में फैले डिजाइन प्राइमर जोड़े और पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) के माध्यम से अनुक्रम को बढ़ाते हैं। प्रवर्धित डीएनए उत्पाद में 3 ' एडेनिन ओवरहांग बनाने के लिए अंत में एक अतिरिक्त 30 मिनट का कदम जोड़ें। पीसीआर शुद्धिकरण किट का उपयोग करके इस उत्पाद को शुद्ध करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    2. क्लोनिंग किट के साथ प्रदान किए गए विक्रेता के प्रोटोकॉल के बाद शुद्ध उत्पाद को पीसीआर 4-टोपो प्लाज्मिड वेक्टर (सामग्रीकी तालिका देखें) में क्लोन करें। हीट-शॉक उपचार का उपयोग सक्षम कोशिकाओं के लिए विक्रेता के प्रोटोकॉल (सामग्रीदेखें) के बाद क्लोन किए गए प्लाज्मिड को सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं (स्ट्रेन: ई. कोलाई DH10B) में बदल देते हैं, और सफलतापूर्वक परिवर्तित कोशिकाओं के लिए स्क्रीन।
      नोट: कालोनियों के साथ प्लेटें नमी बनाए रखने के लिए पैराफिन फिल्म में लपेटा जा सकता है और एक महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
    3. 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर एक शेखर-इनक्यूबेटर में एम्पीसिलिन (50 माइक्रोग्राम/एमएल) युक्त एम्पिसिलिन (50 माइक्रोन/एमएल) युक्त 10 माइक्रोल पिपेट टिप और संस्कृति का उपयोग करके परिवर्तित कोशिकाओं की कालोनियों को चुनें।
      नोट: दीर्घकालिक भंडारण के लिए, सुसंस्कृत कोशिकाओं को 100% ग्लाइस्रोल के साथ 1:1 पतला किया जा सकता है और ग्लिसरोल स्टॉक के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए हैं।
    4. एक मिनीप्रेप आइसोलेशन किट (सामग्रीकी तालिका देखें) का उपयोग करके इस संस्कृति से ब्याज के जीन युक्त प्लाज्मिड को अलग करें। उपज स्पेक्ट्रोफोटोमेटिक रूप से आकलन करने के बाद -20 डिग्री सेल्सियस पर अलग प्लाज्मिड (मिनीप्रिप्स) स्टोर करें। विशेष रूप से, 260 एनएम, 280 एनएम और 230 एनएम पर नमूना अवशोषण को मापें। डीएनए की मात्रा निर्धारित करने के लिए अनुपात एक२६०/A२८० की गणना करें, और डीएनए शुद्धता की मात्रा के लिए एक२६०/A २३० ।260
      नोट: 1.8 का 260/280 अनुपात आम तौर पर पर्याप्त रूप से शुद्ध डीएनए के रूप में स्वीकार किया जाता है, 1.5 से कम अनुपात फेनोल जैसे अवशिष्ट निष्कर्षण रिएजेंटों की उपस्थिति का संकेत देता है। 260/230 अनुपात 260/280 अनुपात से अधिक या उसके बराबर होना चाहिए । कम अनुपात अवशिष्ट रिएजेंट संदूषण का संकेत देते हैं। उपज आम तौर पर १०० से ५०० एनजी/μL के लिए पर्वतमाला ।
    5. इस बात की पुष्टि करने के लिए अलग-थलग मिनीप्रिप्स का अनुक्रम करें कि जीन-विशिष्ट टुकड़े को सफलतापूर्वक एकीकृत किया गया है, प्लाज्मिड में 5 ' T7 और 3 ' T3 प्रमोटर क्षेत्रों के बीच घिरा हुआ है; यह यूनिवर्सल T7 और T3 अनुक्रमण प्राइमर22का उपयोग किया जा सकता है . dsRNA तैयारी के लिए ब्याज के जीन विशिष्ट अनुक्रम के साथ minipreps का उपयोग करें।
  2. पीसीआर प्रवर्धन और इन विट्रो डीएसआरएनए संश्लेषण
    1. पीसीआर प्रवर्धन और उत्पाद शुद्धि
      1. डिजाइन प्लाज्मिड-विशिष्ट या जीन-विशिष्ट प्राइमर जिनके पास टी 7 प्रमोटर अनुक्रम उनके 5'पक्षों पर है (विवरण के लिए संदर्भ22 देखें) डाला जीन के एक रैखिक टुकड़े को बढ़ाना। प्रत्येक 20 माइक्रोन की कम से कम 10 प्रतिक्रियाओं को स्थापित करके उपज का अनुकूलन करें।
        नोट: परिणामस्वरूप उत्पाद दो 20 बीपी T7 पॉलीमरेज बाध्यकारी साइटों द्वारा घिरा हुआ है।
      2. विक्रेता के कॉलम-आधारित एल्यूशन प्रोटोकॉल कापालन करते हुए पीसीआर उत्पाद को शुद्ध करें। उपज बढ़ाने के लिए, एक ही एलुएंट के साथ 3 गुना तक अंतिम एल्यूशन कदम दोहराएं। उपज स्पेक्ट्रोफोटोमेत्रिक रूप से आकलन करें।
        नोट: उपज आमतौर पर १०० से ७०० एनजी/μL पर्वतमाला । इस शुद्ध उत्पाद को आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    2. इन विट्रो डीएसआरएनए संश्लेषण और शुद्धि
      1. पसंद के एक dsRNA संश्लेषण किट के प्रोटोकॉल के अनुसार विट्रो में dsRNA संश्लेषण करने के लिए जीन विशिष्ट पीसीआर शुद्ध उत्पाद का उपयोग करें । यदि आवश्यक हो, तो डीस्आरएनए उत्पादन में वृद्धि के लिए इनक्यूबेशन समय बढ़ाएं।
      2. प्रतिक्रिया मिश्रण की अस्पष्टता के आधार पर प्रतिक्रिया की प्रगति का आकलन करें (डीएसआरएनए उत्पाद की अधिक मात्रा, टर्बिडिटी उतनी ही अधिक होगी)। इनक्यूबेशन के अंत में, DNase उपचार का उपयोग करके प्रतिक्रिया बंद करें। ऐसा करने के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए, 2 यू/ टेम्पलेट डीएनए के इष्टतम क्षरण को सुनिश्चित करने के लिए इस उपचार को 1-2 घंटे तक बढ़ाएं।
      3. एक शुद्धि किट के साथ या निम्नलिखित चरणों के माध्यम से dsRNA शुद्ध।
        1. नाभिक मुक्त पानी के 115 माइक्रोन के साथ परिणामी उत्पाद को पतला करें और 3 एम सोडियम एसीटेट के 15 माइक्रोन जोड़ें। इस प्रतिक्रिया मिश्रण में 2 वॉल्यूम बर्फ-कोल्ड 100% इथेनॉल जोड़ें और -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर dsRNA को उपजी।
          नोट: इस बिंदु पर, नमूनों को अंतिम उपज को प्रभावित किए बिना सुरक्षित रूप से संग्रहीत किया जा सकता है।
        2. 9000 x g पर 20 मिनट के लिए 0 डिग्री सेल्सियस पर तेज़ी और सुपरनैंट को त्यागें। 13000 x ग्राम पर 15 मिनट के लिए बर्फ-ठंड 70% इथेनॉल और सेंट्रलाइज के साथ एक बार उत्पाद धोएं।
        3. सुपरनेट को निकालें और हवा 5-15 मिनट के लिए गोली सूखी। 2.1.4 में वर्णित के अनुसार, नाभिक मुक्त पानी के 40 माइक्रोन तक में गोली को फिर से खर्च करें (इस मात्रा को अलग-थलग गोली आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है) और उपज और शुद्धता स्पेक्ट्रोफोटोमीटरिक रूप से आकलन करें।
        4. आगे के उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध dsRNA स्टोर करें। वांछित विकास स्तर पर इंजेक्शन के लिए शुद्ध डीएसआरएनए का उपयोग करें।

3. dsRNA इंजेक्शन के लिए प्रारंभिक चरण टी मार्मोरेटस भ्रूण का संग्रह और तैयारी

  1. टी मार्मोरेटस भ्रूण के इनक्यूबेशन के लिए एक एगरेजर प्लेट तैयार करें।
    1. सबसे पहले, ऑटोक्लेव्ड आसुत पानी (2% एगर उठे) के 100 मिलीलन में 20 मिलीग्राम कम पिघलने वाले एगरेज़ पाउडर को भंग करें और फिर इस मिश्रण को माइक्रोवेव में उबालें जब तक कि एक स्पष्ट समाधान प्राप्त न हो जाए। गर्म समाधान के साथ ध्यान रखें, क्योंकि हवा के बुलबुले इसे ओवरफ्लो कर सकते हैं।
    2. इस घोल को एक छोटे से पेट्री डिश में बांटें। एगर उठे प्लेट की सतह पर खांचे (जो भ्रूण पकड़ लेंगे) बनाने के लिए, तरल एगर की सतह पर तीन 1-2 मिमी चौड़ी प्लास्टिक ट्यूब (जैसे प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट) रखें इससे पहले कि यह जम जाए।
    3. एक बार जब एगरेज़ जम जाता है, तो इन ट्यूबों को हटाने के लिए कुंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। एग्रिस में इन इंडेंटेशन को कवर करने के लिए P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके ऑटोक्लेव्ड आसुत पानी का 500μL जोड़ें।
  2. एक ठीक प्राकृतिक बाल तूलिका का उपयोग करना, टी मार्मोरेटस भ्रूण एकत्र करें जो ऑटोक्लेव आसुत पानी से भरे ग्लास गुहा पकवान में बीटल नेस्टिंग साइटों से 5-8 घंटे पुराने हैं। घोंसले की साइटों की निगरानी अक्सर यह आश्वस्त करने के लिए कि प्राप्त अंडे उचित उम्र के हैं।
  3. ठीक विच्छेदन संदंश का उपयोग करके भ्रूण को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत डिकोरोनेट करें। ऐसा करने के लिए, एक उपयुक्त कोण पर प्रकाश स्रोत की स्थिति से माइक्रोस्कोप (वांछित आवर्धन पर) के तहत कोरिक्शन की कल्पना करें, फिर तेज संदंश के साथ दो पक्षों से कोरन को पकड़ें, इसे खोलें, और धीरे-धीरे भ्रूण को स्लाइड करें। चूंकि दो परतें हैं, इसलिए सुनिश्चित करें कि दोनों को हटा दिया जाए।
  4. एक ठीक प्राकृतिक बाल तूलिका का उपयोग करना, ध्यान से कांच गुहा पकवान से agarose प्लेट के लिए भ्रूण हस्तांतरण और उन्हें एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत खांचे में व्यवस्था। इस प्रक्रिया के दौरान बहुत ध्यान रखें, क्योंकि डिकोरियोनेटेड भ्रूण बहुत नाजुक होते हैं। DsRNA इंजेक्शन के लिए तैयार भ्रूण का उपयोग करें।
    नोट: थोड़ा मोटा अंत भ्रूण का पक्ष है जिसमें सिर विकसित होगा।

4. शुरुआती चरण में dsRNA माइक्रोइंजेक्शन टी मार्मोरेटस भ्रूण

  1. जीन-विशिष्ट dsRNA के साथ प्रारंभिक चरण के भ्रूण को इंजेक्ट करने के लिए, माइक्रोइंजेक्शन सुई खींचने वाले (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयार करें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सुई टिप की कल्पना करते समय, सुई टिप को तोड़ने के लिए ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें, एक तेज धार पैदा करते हैं। आदर्श रूप से, सुई टिप को तिरछे तोड़ दें ताकि एक तेज किनारा एक तरफ बना रहे, जो इसे न्यूनतम चोट पैदा करते हुए भ्रूण में प्रवेश करने की अनुमति देगा।
  2. बर्फ पर शुद्ध स्टॉक dsRNA समाधान गल, 10x इंजेक्शन बफर के 1 μL जोड़ने के लिए और यह डबल आसुत पानी के साथ बंद ऊपर, इंजेक्शन समाधान के 10 μL बनाने के लिए । इंजेक्शन के लिए, 1 μg/μL की एक dsRNA एकाग्रता आमतौर पर उपयुक्त है, लेकिन जिसके परिणामस्वरूप जानवरों की फेनोटाइपिक गंभीरता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है) ।
    नोट: 10x इंजेक्शन बफर22 के 1 एमएल 0.1 एम सोडियम फॉस्फेट बफर के 10 माइक्रोन जोड़कर तैयार करें (1 एम Na2HPO4 के 8.5 एमएल और 1.5 एमएल के मिश्रण से बनाया गया 1 एम NaH2PO4 को 0.5 एम केसीएल के 100 माइक्रोन के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर पीएच 7.6 में समायोजित किया गया, 100 माइक्रोन फूड डाई और 790 माइक्रोन डबल-डिस्टिल्ड पानी।
    1. P10 पिपेट का उपयोग करके, काम करने वाले डीएसआरएनए समाधान के साथ माइक्रोइंजेक्शन सुई को बैकफिल करें। एक बार जब समाधान ने सुई की नोक भर दी है, तो इसे माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम से जुड़े माइक्रोनीडल धारक से अटैच कर दें जो प्रेशर रिजेक्शन तकनीक (सामग्रियों की तालिकादेखें) का उपयोग करता है।
  3. माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम और दबाव वाली हवा की आपूर्ति चालू करें। माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम पर माइक्रोवाल्व का इस्तेमाल करते हुए इंजेक्शन प्रेशर को 15 साई में एडजस्ट करें। समय समायोजन घुंडी का उपयोग करके इंजेक्शन अवधि को समायोजित करें (इसे "सेकंड" में सेट करें)।
    1. चूंकि इंजेक्शन की अवधि आवश्यक इंजेक्शन की मात्रा पर निर्भर करती है, यदि आवश्यक हो, तो प्रत्येक इंजेक्शन से पहले माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम पर इस पैरामीटर को समायोजित करें। प्रारंभिक चरण टी मार्मोरेटस भ्रूण के लिए 1-2 एनएल के इंजेक्शन की मात्रा का उपयोग करें।
      नोट: उच्च इंजेक्शन की मात्रा भ्रूण जीवित रहने की दर के साथ हस्तक्षेप करते हैं ।
  4. इंजेक्शन तरल पदार्थ की मात्रा को मापने के लिए जो माइक्रोइंजेक्शन सिस्टम द्वारा तिरस्कृत किया जाता है, हवा में इंजेक्शन लगाते समय सुई की नोक पर बनने वाले द्रव बुलबुले की मात्रा का आकलन करके इंजेक्शन सुई को कैलिब्रेट करें। टी मार्मोरेटस भ्रूण के लिए, 100-200 माइक्रोन के इष्टतम बुलबुले के आकार का उपयोग करें। इंजेक्शन सुई अच्छी गुणवत्ता की है अगर यह ~ 3 एस की एक इंजेक्शन अवधि के साथ 15 साई में प्राप्त किया जा सकता है।
  5. सुई और एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत भ्रूण युक्त agarose प्लेट संरेखित करें, जैसे कि सुई 45 डिग्री और 60 डिग्री के बीच एक कोण पर भ्रूण दृष्टिकोण।
  6. माइक्रोमैनिपलेटर का उपयोग करके, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रगति की निगरानी करते हुए माइक्रोनीडल को धीरे-धीरे स्थानांतरित करें। एक बार जब सुई की नोक भ्रूण की सतह को छू जाती है, तो सुई को तब तक सावधानीपूर्वक आगे बढ़ाएं जब तक कि यह भ्रूण की सतह को छेद न दे। सुई टिप के साथ गहराई से भ्रूण छिद्रित न करें क्योंकि यह भ्रूण के अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है। परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, भ्रूण के बीच में इंजेक्शन वितरित करें।
  7. एक बार सुई भ्रूण के अंदर हो जाने के बाद, भ्रूण को डीएसआरएनए की खुराक देने के लिए माइक्रो-इंजेक्टर के इंजेक्शन बटन को ध्यान से दबाएं। डीएसआरएनए के 1-2 एनएल इंजेक्शन लगाने के बाद, धीरे-धीरे भ्रूण से सुई को वापस ले लें, जैसे कि यह भ्रूण को टूटने का कारण नहीं बनता है।
    1. इसी तरह के अंदाज में दूसरे भ्रूण को इंजेक्ट करें। यदि प्रक्रिया के दौरान माइक्रोइंजेक्शन सुई अवरुद्ध हो जाती है, तो इंजेक्शन दबाव और अवधि को बढ़ाकर इसे अनब्लॉक करें। नेत्रहीन इंजेक्शन की साइट पर एक रंगीन जगह की उपस्थिति से सफलतापूर्वक इंजेक्शन भ्रूण की पहचान (चूंकि इंजेक्शन बफर में भोजन रंग होता है)।
  8. ध्यान से एक आर्द्रता कक्ष में इंजेक्शन भ्रूण के साथ पकवान जगह है।
    1. इस तरह के एक कक्ष का निर्माण करने के लिए, ढक्कन के साथ किसी भी प्लास्टिक बॉक्स को लें, इसे 70% इथेनॉल के साथ निष्फल करें, इसे सूखने दें, और आर्द्र वातावरण प्रदान करने के लिए नीचे ऑटोक्लेव्ड पानी में भिगोए गए ऊतक रखें। इस आर्द्रता कक्ष को उचित तापमान (इस मामले में, 25 डिग्री सेल्सियस) और 14 घंटे के प्रकाश और 10 घंटे अंधेरे के प्रकाश चक्र के साथ एक इनक्यूबेटर में रखें।
  9. इंजेक्शन भ्रूण को पहले इंस्टार लार्वा में विकसित करने की अनुमति दें, जिसके लिए 4-5 दिनों की आवश्यकता होती है। चित्रा 2में दर्शाए गए रूपात्मक रूप से दिखाई देने वाले नॉकडाउन फेनोटाइप की पहचान करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रतिदिन भ्रूण विकास की प्रगति की निगरानी करें ।
  10. एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन कैमरे का उपयोग करके डिजिटल छवियों को लेकर इस प्रगति को दस्तावेज़ करें। मृत भ्रूण निकालें और इनक्यूबेशन अवधि के दौरान अन्य जीवित भ्रूण के लिए माइक्रोबियल संदूषण के संभावित प्रसार से बचने के लिए प्रतिदिन एगर उठे प्लेट पर पानी की भरपाई करें।
  11. DsRNA इंजेक्शन के लिए उचित नियंत्रण प्रदर्शन, बफर इंजेक्शन सहित, dsRNA के इंजेक्शन ब्याज की जीन की भावना कतरा के खिलाफ संश्लेषित, और DsRNA के इंजेक्शन दृश्यों के खिलाफ संश्लेषित है कि लक्ष्य जीव के भीतर मौजूद नहीं है । अतिरिक्त आणविक तरीकों का उपयोग कर RNAi नॉकडाउन की पुष्टिकरें 22।

5. DsRNA इंजेक्शन के लिए टी मार्मोरेटस लार्वा की तैयारी

नोट: प्रारंभिक चरण के भ्रूण के विपरीत, टी मार्मोरेटस लार्वा अपेक्षाकृत मजबूत होते हैं और इन्हें बड़ी मात्रा में इंजेक्ट किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, दूसरे इंस्टार को डीएसआरएनए वर्किंग सॉल्यूशन के 2 माइक्रोन और तीसरे इंस्टार के साथ कम से कम 3 माइक्रोन के साथ जीवित रहने की दर पर ध्यान देने योग्य नकारात्मक प्रभाव के बिना इंजेक्ट किया जा सकता है। डीएसआरएनए को इंजेक्ट करने के लिए, लार्वा को एगरेज़ में एम्बेड करके स्थिर करना उपयोगी है।

  1. लार्वा इकट्ठा करने से पहले, 2% एगर उठे पिघल जाएं और इसे तरल रूप में बनाए रखने के लिए 60-70 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें। पिघला हुआ 2% एक छोटे पेट्री पकवान में वृद्धि हुई और फिर जम तक ठंडा करके एक स्थिरीकरण पकवान तैयार करें। प्रत्येक जानवर के लिए एग्रेंज प्लेट (मोटे तौर पर एथ्रोपोड का आकार एम्बेडेड होने के लिए) में एक उथले नाली बनाने के लिए कुंद संदंश का उपयोग करें।
  2. उचित विकास के चरण में युवा लार्वा ले लीजिए (विश्लेषण के लिए वांछित चरण से पहले एक चरण)। ऐसा करने के लिए, लार्वा युक्त संस्कृति कप से पानी को सावधानी से निकालें और नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करें।
  3. बर्फ पर एनेस्थेटाइज (सावधानी से लार्वा को अपने पानी के कप से बाहर उठाएं और इसे धीरे-धीरे बर्फ पर रखें) जब तक लार्वा कोई उल्लेखनीय आंदोलन नहीं दिखाता है। बर्फ से लार्वा को सावधानीपूर्वक उठाने के लिए कुंद, नरम-समाप्त संदंश का उपयोग करें और इसे नाली में अपनी गर्दन और शरीर के साथ स्थिरीकरण चरण पर रखें लेकिन इसकी पूंछ सतह के ऊपर स्थित है ताकि इसे कवर नहीं किया जा सके, जो लार्वा को अपनी पूंछ सर्पिल के माध्यम से सांस जारी रखने की अनुमति देता है।
  4. लार्वा को एगर उठे की एक मोटी परत के साथ कवर करें जो अभी भी तरल है लेकिन खतरनाक रूप से गर्म नहीं है। यदि यह गलती से कवर किया गया था, तो पूंछ को मुक्त करने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसके नीचे के दो खंडों को एगर उठे से। एक बार एगरेज़ जम जाता है, डीएसआरएनए इंजेक्शन के लिए लार्वा का उपयोग करें।

6. टी मार्मोरेटस लार्वा में डीएसआरएनए माइक्रोइंजेक्शन

  1. जीन-विशिष्ट डीएसआरएनए कार्य समाधान (जैसा कि चरण 4.1-4.2 में वर्णित है) की वांछित मात्रा के साथ एक माइक्रोइंजेक्शन सुई तैयार करें और बैकफिल करें। मैन्युअल रूप से नियंत्रित माइक्रोइंजेक्शन सिरिंज से जुड़े सुई धारक को सुई संलग्न करें। सुई संलग्न करने से पहले, इंजेक्शन दबाव मध्य प्रक्रिया से बाहर चलने से बचने के लिए सिरिंज प्लंजर को सभी तरह से बाहर खींचें।
  2. स्थिर लार्वा को ऐसी स्थिति दें कि इंजेक्शन साइट, जो तीसरे और चौथे शरीर प्लेट खंडों के बीच पृष्ठीय रूप से स्थित है, अपेक्षाकृत सपाट कोण (चरण के समानांतर) पर माइक्रोइंजेक्शन सुई के प्रक्षेपवक्र के साथ गठबंधन किया गया है।
    नोट: इस स्थिति में सुई और लार्वा को एंगल करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह कम से कम लार्वा को कम से कम नुकसान के साथ छिद्रित करने के लिए सुई टिप के लिए कम से कम प्रतिरोध का रास्ता प्रदान करता है।
  3. एक बार सुई और लार्वा तैनात होने के बाद, स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के माध्यम से प्रगति की निगरानी करते हुए माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करके सुई टिप को लार्वा में सावधानी से स्थानांतरित करें।
  4. टिप के बाद ऊतक छिद्रित, धीरे और ध्यान से सिरिंज के लिए दबाव लागू होते हैं। माइक्रोस्कोप के नीचे सुई में रंगीन इंजेक्शन तरल पदार्थ के आंदोलन को देख कर इंजेक्शन दबाव को समायोजित करें।
  5. इंजेक्शन के बाद सुई को सावधानी से वापस लें। छीलने के लिए नरम संदंश का उपयोग करें और इसलिए लार्वा को एगर उठे से मुक्त करें। लार्वा को पानी (कमरे के तापमान पर) के साथ एक कंटेनर में वापस स्थानांतरित करें और इसे 25\u201228 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर या संस्कृति कक्ष में आगे विकसित करने और 14 घंटे प्रकाश और 10 घंटे अंधेरे के प्रकाश चक्र की अनुमति दें।
  6. उचित नियंत्रण इंजेक्शन और नॉकडाउन मात्रा को नियोजित करें, जैसा कि चरण 4.10 में उल्लिखित है।

Representative Results

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हमने सनबर्स्ट डाइविंग बीटल टी मार्मोरेटसके विभिन्न विकास चरणों में तीन अलग-अलग जीन, नामत सफेद, लैक्केस 2 (लाख 2),और लेंस 3 (टेबल 1)को गिरा दिया। हमने भ्रूणजेनेसिस(चित्रा 1A)के दौरान बहुत शुरुआती चरण में डीएसआरएनए इंजेक्शन लगाकर टी मार्मोरेटस में आरएनएआई का प्रदर्शन किया। के रूप में भ्रूण के कुछ प्रक्रिया जीवित नहीं है और परिगलित(चित्रा 1B)बारी है, वे शेष भ्रूण स्वस्थ रखने के लिए हटा दिया जाना चाहिए । उदाहरण यहां सफेद जीन के खिलाफ dsRNA के इंजेक्शन हैं । यह जीन ड्रोसोफिला में तीन एटीपी-बाइंडिंग कैसेट (एबीसी) ट्रांसपोर्टरों में से एक के रूप में अच्छी तरह से जाना जाता है जो आंख वर्णक23के अग्रदूतों के तेज और भंडारण में शामिल हैं। तदनुसार, इसके नुकसान के समारोह के परिणामस्वरूप एक अनपिगमेंट, सफेद आंख फेनोटाइप होता है। हमारे परिणाम बताते हैं कि टी मार्मोरेटस भ्रूण में ऑर्थोलोगस सफेद जीन को लक्षित करने वाले डीएसआरएनए के इंजेक्शन नए उभरते लार्वा में आंखों के पिगमेंटेशन के नुकसान की ओर ले जाते हैं। इस मामले में, जंगली प्रकार के लार्वा को भारी वर्णक आंखों की विशेषता होती है, और सफेद के आरएनएआई नॉकआउट से विभिन्न स्तरों में कमी आती है और यहां तक कि आंखों के वर्णक का पूर्ण उन्मूलन भी होता है। कुल मिलाकर, हमने जीवित भ्रूण (एन = 35) के 34% में आंखों के रंगाई में कम से कम कुछ कमी देखी। चित्रा 2A एक नियंत्रण व्यक्ति और थोड़ा हल्का आंखों के रंग के साथ एक व्यक्ति की तुलना करता है । चित्रा 2B एक व्यक्ति में एक अधिक गंभीर नॉकडाउन दिखाता है, जिसमें क्लस्टर की अधिक वेंट्रल आंखें (आंखें 2-5) पूरी तरह से अनपिगमेंटेड होती हैं, जबकि पृष्ठीय आंखें अभी भी कुछ पिगमेंटेशन दिखाती हैं। ये मतभेद इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि नॉकआउट की दक्षता क्षेत्रीय रूप से कैसे भिन्न हो सकती है, जो संभवतः घने ऊतक में डीएसआरएनए प्रवेश की प्रभावकारिता में अंतर से संबंधित है। एक अन्य व्यक्ति सभी आंखों में अनिवार्य रूप से पूर्ण वर्णक हानि(चित्रा 2C) दिखाता है।

यह जांचने के लिए कि आरएनएआई टी मार्मोरेटसके लार्वा चरण में कितनी अच्छी तरह काम करता है, हमने डीस्आरएनए को टैनिक जीन लाख 2 को दूसरे इंस्टार लार्वा में लक्षित करने के लिए इंजेक्शन दिया, कुछ दिन पहले वे तीसरे इंस्टार(चित्रा 3)में मोल्ट के कारण थे और तीसरे इंस्टार लार्वा के क्यूटिकुलर रंगाई पर प्रभाव का मूल्यांकन किया। Lac2 एक प्रकार का फेनोलोक्सिडास है जो ऑक्सीडेटिव रूप से प्रोटीन को अघुलनशील, कठिन और गहरा बनाने के लिए संयोजित करता है। आटा बीटल टी कास्टानेम में नॉकडाउन को कम खुराक में हल्का रंग के व्यक्तियों के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाया गया है, लेकिन उच्च खुराक24में घातक माना जाता है। चित्रा 4 दिखाता है कि इस उपचार से हल्का रंग सनबर्स्ट डाइविंग बीटल लार्वा भी होता है। विशेष रूप से, इस प्रयोग में, जीवित इंजेक्शन लार्वा (एन = 12) के 75% ने पिगमेंटेशन (नियंत्रण समूह में 0% की तुलना में) कम कर दिया था। चित्रा 4A अपेक्षाकृत हल्के विरूपण के साथ एक व्यक्ति को दिखाता है, जबकि चित्रा 4C एक टी मार्मोरेटस लार्वा के सिर को दिखाता है जिसमें छल्ली का अंधेरा रंग लगभग अनुपस्थित है। इन लार्वा के लिए विशिष्ट केंद्रीय अंधेरे पैटर्निंग के लिए विशेष रूप से डीपिगमेंटेशन स्पष्ट था, जबकि यह पैटर्न नियंत्रण-इंजेक्शन वाले व्यक्ति(चित्रा 4B)में स्पष्ट रूप से दिखाई देता रहा। इसके अलावा, पूंछ श्वासनली का एक हल्का पाया गया, जैसा कि चित्र 4 डीमें दर्शाया गया है। मामले में जहां lac2 dsRNA तीसरे इंस्टार लार्वा में इंजेक्शन था, हल्का वयस्क व्यक्तियों(चित्रा 5)प्राप्त किया गया । ध्यान दें कि नॉकडाउन बीटल के पंख कुछ हद तक विकृत हैं, इसकी असामान्य कोमलता के कारण होने की संभावना है।

रूपात्मक लक्षणों में फेरबदल के अलावा, व्यवहार को प्रभावित करने वाले जीन को लक्षित करने के लिए आरएनएआई का उपयोग करना संभव है। इसे प्रदर्शित करने के लिए, हमने एक प्रमुख लेंस प्रोटीन कोडिंग जीन, लेंस 318के खिलाफ आरएनएआई का प्रदर्शन किया, और तीसरे इंस्टार लार्वा आंखों के ऑप्टिकल गुणों को प्रभावित करने के लिए इसे दूसरे इंस्टार लार्वा में इंजेक्ट किया। यहां देखे गए लेंस पर कोई भी प्रभाव होने की संभावना है क्योंकि टी मार्मोरेटस लार्वा की आंखें इस संक्रमण में प्रमुख आंखों के विकास से गुजरती हैं, जिसमें लेंस25के प्रमुख ऑप्टिकल परिवर्तन भी शामिल हैं। इस प्रयोग में आरएनएआई नॉकडाउन अत्यधिक कुशल था। क्यूपीसीआर के माध्यम से सत्यापन में 100% सफलता दर दिखाई गई; 13 परीक्षण किए गए व्यक्तियों में से, 12 को नियंत्रण व्यक्तियों के अभिव्यक्ति स्तर के 10% से भी कम तक गिरा दिया गया था, शेष व्यक्ति के पास नियंत्रण स्तर (अप्रकाशित अवलोकन) का 17% का अभिव्यक्ति स्तर था। फेनोटाइपिक स्तर पर, केवल कुछ व्यक्ति गंभीर रूप से विकलांग या शिकार पर कब्जा करने में असमर्थ थे, जैसा कि चित्र 6 में एक व्यक्ति के लिए सचित्र है जो बार-बार अपने शिकार से बहुत करीबी दूरी से संपर्क करता है लेकिन लगातार इसे ओवरशूट करता है।

तालिका 1: सफेद, lac2, और Lens3 प्रोटीन के लिए प्राइमर दृश्यों और एम्प्लिकॉन। कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 1
चित्रा 1: भ्रूण इंजेक्शन का चित्रण। (क)डिकोरियोनेटेड भ्रूण एक एगर उठे प्लेट पर लाइन में खड़ा होता है और डीएसआरएनए और खाद्य डाई युक्त इंजेक्शन बफर से भरे माइक्रोइंजेक्शन सुई का उपयोग करके उनके केंद्र के पास इंजेक्ट किया जाता है । स्केल बार 500 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है। (ख)एक व्यक्ति जो अधिक गंभीर नॉकआउट वाला होता है । इंजेक्शन भ्रूण एक आर्द्रता कक्ष में रखा जाता है और फेनोटाइप स्कोर और मृत व्यक्तियों को हटाने के लिए दैनिक निगरानी (जो भूरे रंग की बारी) । स्केल बार 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: पूरी तरह से विकसित भ्रूण का उदाहरण है कि सफेद के खिलाफ dsRNA के साथ इंजेक्शन थे । (क)नेत्र पिगमेंटेशन (बाएं) में कमी के साथ एक व्यक्ति की तुलना और एक नियंत्रण इंजेक्शन व्यक्ति (दाएं) । E1-E6 आंखें 1-6 को देखें। (ख)एक अधिक गंभीर नॉकडाउन फेनोटाइप वाला व्यक्ति, जो दिखाता है कि, कई बार, क्लस्टर के भीतर कुछ आंखें दूसरों की तुलना में नॉकआउट से अधिक गंभीर रूप से प्रभावित होती हैं । (ग)आंखों के पिगमेंटेशन के लगभग पूर्ण नुकसान के साथ व्यक्तिगत । स्केल बार 200 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है; पैनल बी और सी एक ही पैमाने पर प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: लार्वा इंजेक्शन का चित्रण। (क)2% में एम्बेड करके स्थिर कई लार्वा अपनी पूंछ के साथ उत्पन्न हुए किसी भी एगरेस के स्पष्ट हो गए। (ख)माइक्रोइलेक्ट्रोड जिसमें इंजेक्शन समाधान रखा गया है ताकि इसकी नोक दो खंडों के बीच ठीक झिल्ली में प्रवेश कर सके। (ग)इंजेक्शन के बाद इंजेक्शन स्थल पर दिखने वाला ब्लू इंजेक्शन डाई। स्केल बार 1 सेमी का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: दूसरे इंस्टार लार्वा पर लागू लैक्केस 2 के लिए आरएनएआई जिसके परिणामस्वरूप तीसरे इंस्टार लार्वा में कम क्यूटिकल रंगाई होती है। (क)नियंत्रण-इंजेक्शन वाले व्यक्ति (ऊपर) की तुलना में एक लाख 2 आरएनएआई व्यक्ति (नीचे) में रंगाई का अपेक्षाकृत हल्का नुकसान। स्केल बार सिर के केंद्र में विशेषता काले रंग के पैटर्न को दिखाने वाले नियंत्रण व्यक्ति के 5 मिमी(बी)सिर का प्रतिनिधित्व करता है। (ग) लाख 2 की अपेक्षाकृत गंभीर दस्तक जिससे केंद्रीय सिर के रंगने का लगभग पूर्ण नुकसान होता है । (घ)नियंत्रण-इंजेक्शन वाले व्यक्ति (शीर्ष) की तुलना में एक लाख 2 आरएनएआई व्यक्ति (नीचे) की प्रमुख पूंछ क्यूटिकल में रंगाई का नुकसान। B\u2012D में स्केल बार 1 मिमी का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: एक तिहाई इंस्टार लार्वा पर लागू लैक्केस 2 के लिए आरएनएआई जिसके परिणामस्वरूप वयस्क में कम क्यूटिकल रंगाई होती है। नियंत्रण (दाएं) की तुलना में नॉकडाउन व्यक्ति (बाएं) की विशेषता बहुत नरम एलीट्रा द्वारा भी की जाती है। स्केल बार 5 मिमी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: एक प्रमुख लेंस प्रोटीन का नॉकडाउन जिससे शिकार पर कब्जा करने में कमी होती है। (ए-सी)। तीन उदाहरण जिसमें सनबर्स्ट डाइविंग बीटल लार्वा, जिसमें आरएनएआई के माध्यम से ऑप्टिकल घाटे को प्रेरित किया गया था, शिकार (मच्छर लार्वा) को पकड़ने में असमर्थ था। प्रतिनिधि अभी भी छवियों विशेषता शिकार कब्जा की एक वीडियो रिकॉर्डिंग से चुना गया । (घ)नियंत्रण लार्वा शिकार को पकड़ने । सभी पैमाने पर सलाखों के 2 सेमी का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

हमारा लक्ष्य यह है कि तरीकों का यह संकलन आरएनएआई को व्यापक रूप से उपलब्ध कराएगा, खासकर इस उपकरण के रूप में CRISPR/Cas9 आधारित जीन संपादन के लिए एक शक्तिशाली सहक्रियात्मक तकनीक बनी हुई है, लाभ के साथ कि यह अध्ययन जीवों के वांछित विकास के चरणों पर लागू किया जा सकता है । इस ताकत का उदाहरण देने के लिए, हमने डीएसआरएनए को भ्रूण में और विभिन्न लार्वा चरणों में इंजेक्ट किया। अंडे में इंजेक्शन भ्रूण के विकास को प्रभावित(चित्रा 2),दूसरे लार्वा चरण में इंजेक्शन तीसरे लार्वा चरण(चित्रा 4 और चित्रा 6)पर स्पष्ट प्रभाव था, और तीसरे लार्वा चरण में इंजेक्शन वयस्कों में प्रभावदिखाया (चित्रा 5)। जबकि सटीक समय प्रायोगिक रूप से स्थापित किया जाना है, आम तौर पर, इंजेक्शन कुछ दिनों के भीतर प्रभावी होते हैं । इस प्रक्रिया की सफलता DsRNA अनुक्रम की लंबाई से प्रभावित हो सकता है। यहां, हमने 800 से अधिक बीपी के लिए 200 से अधिक बीपी का उपयोग करके उदाहरण प्रस्तुत किए। एक सामान्य नियम के रूप में, 100 और 600 बीपी के बीच दृश्यों को ऑफ-टारगेट प्रभावों को सीमित करने के लिए पसंद किया जाता है, लेकिन 1000 बीपी तक के दृश्यों से अच्छे परिणाम22होते हैं। आरएनएआई के संबंध में एक प्रश्न नॉकडाउन की अवधि है जिसे इस तकनीक के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। चूंकि प्रत्येक चरण में फेनोटाइप टर्मिनल थे, इसलिए हम अपने प्रस्तुत परिणामों के आधार पर इस मुद्दे पर टिप्पणी नहीं कर सकते । हालांकि, यह पहले उल्लेख किया गया है कि आरएनएआई प्रभाव आम तौर पर अपेक्षाकृत लंबे समय तक रहते हैं, और उच्च सांद्रता लंबे समय तक चलने वाले नॉकडाउन20तक ले जाती है।

इस तकनीक की एक सीमा यह है कि यह दूसरों की तुलना में कुछ जीवों के लिए बेहतर काम करता है, और यह भविष्यवाणी करने का कोई सीधा तरीका नहीं है कि यह प्राथमिकताओं को कितनी अच्छी तरह काम करेगा। इसके बावजूद यह विभिन्न जीवों की एक बड़ी श्रृंखला के लिए अच्छी तरह से काम करने के लिए पाया गया है । आर्थ्रोपोड्स के भीतर, इसमें आरेक्निक26,क्रस्टेसियन27और विभिन्न प्रकार की कीड़े शामिल हैं, जिसमें बीटल28में विशेष रूप से उच्च सफलता दर है। एक और जटिलता यह है कि फेनोटाइप गंभीरता में अंतर अक्सर डीएसआरएनए की एक ही राशि के आवेदन के बावजूद व्यक्तियों के बीच होते हैं। जैसा कि चित्र 2बीमें दर्शाया गया है, एक व्यक्ति के भीतर भिन्नता भी हो सकती है। हमारे आरएनएआई अध्ययनों में टी मार्मोरेटस लार्वा नेत्र विकास में शामिल विभिन्न जीनों को लक्षित करते हुए, हमने अक्सर पाया है कि कुछ आंखें दूसरों की तुलना में अधिक गंभीर रूप से प्रभावित होती हैं। यह घटना आंखों के क्लस्टर के अपेक्षाकृत घने ऊतक से संबंधित हो सकती है, जिसमें डीएसआरएनए कुछ इकाइयों तक पहुंचने में बेहतर ढंग से सक्षम है।

आरएनएआई प्रयोगों के सफल निष्पादन के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि लक्ष्य जीन के लिए कई मापदंडों को अनुकूलित किया जाता है। उदाहरण के लिए, डीएसआरएनए की एकाग्रता और लक्षित जीन की लंबाई परिणाम20को दृढ़ता से प्रभावित कर सकती है। एक और महत्वपूर्ण पैरामीटर यह है कि इंजेक्शन कैसे निष्पादित किए जाते हैं, क्योंकि यह प्रक्रिया जीवित रहने की दर को बहुत प्रभावित कर सकती है। भ्रूण के लिए, हम भ्रूण के केंद्र को लक्षित करके सबसे अच्छा परिणाम हासिल किया । एक अच्छी तरह से रखी प्लेट एक ही सत्र में १०० या अधिक भ्रूण के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है । लार्वा के लिए, खंडों के बीच इंजेक्शन सुई डालने के लिए महत्वपूर्ण है। इन इंजेक्शनों को अधिक डीएसआरएनए की आवश्यकता होती है, और लार्वा उपलब्धता के आधार पर, यहां हमारे इंजेक्शन सेट आमतौर पर केवल एक समय में कुछ जानवरों के होते थे। सभी इंजेक्शन के लिए, वायु को जीव में प्रवेश करने से रोकना महत्वपूर्ण है।

कुछ मामलों में, जीन नियामक नेटवर्क और आनुवंशिक अतिरेक के फीडबैक लूप लगातार नॉकडाउन के बावजूद आरएनएआई फेनोटाइप के पेनेट्रेंसी को प्रभावित कर सकते हैं। यह एक प्रमुख लेंस प्रोटीन, लेंस3 18के अत्यधिक सफल नॉकडाउन के साथ लार्वा के हमारे व्यवहार टिप्पणियों के लिए मामला प्रतीत होता है। यद्यपि हमने क्यूपीसीआर के माध्यम से इन नॉकडाउन की उच्च दक्षता को सत्यापित किया, लेकिन संबंधित फेनोटाइप में काफी भिन्नता देखी गई। यह परिणाम आरएनएआई नॉकडाउन को ठीक से निर्धारित करने की आवश्यकता पर प्रकाश डालता है (विकल्पों पर विवरण के लिए22देखें)। यदि परिणामी फेनोटाइप के संबंध में कोई स्पष्ट प्राथमिकताओं की उम्मीद नहीं है, तो आरएनएआई के ऑफ-टारगेट प्रभावों के लिए नियंत्रित करने का एक अच्छा तरीका डीएसआरएनए के दो गैर-ओवरलैपिंग दृश्यों के साथ एक ही जीन को लक्षित करना और आम फेनोटाइप के परिणामों का मूल्यांकन करना है।

जीन संपादन तकनीकों के विपरीत, आरएनएआई घातक जीन का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण भी है, और ऐसा करने के दो तरीके हैं। उदाहरण के लिए, यदि कोई जीन के कार्यात्मक योगदान में रुचि रखता है जहां विकास में जल्दी हानि-कार्य को घातक माना जाता है, तो ऐसे जीन की कार्यात्मक जांच को केवल जानवर को सामान्य रूप से विकसित करने की अनुमति देकर प्राप्त किया जा सकता है और फिर बाद में विकास में आरएनएआई के माध्यम से जीन को नीचे गिराया जा सकता है (यानी, वयस्क में)। वैकल्पिक रूप से, एक जीन जहां पूर्ण हानि के कार्य के लिए जाना जाता है घातक होने के लिए एक आंशिक नॉकडाउन के माध्यम से जांच की जा सकती है, जो dsRNA सांद्रता की एक श्रृंखला इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । हमारे कुछ परिणाम लाख2के नॉकडाउन दिखाते हैं , जो घातक होते हैं यदि कीड़ों में क्यूटिकल24से अधिक नरम हो जाता है । यहां तक कि चित्रा 5 में चित्रित लाख 2 आरएनएआई बीटल प्रयोगशाला की स्थिति के बाहर जीवित रहने की संभावना नहीं होगी। एक अन्य घातक जीन को काटा जाताहै, जो एक प्रतिलेखन कारक के लिए कोड है जो आर्थ्रोपोड्स में विभिन्न अंग प्रणालियों में सेल-भाग्य विनिर्देश के लिए मौलिक है और इसे ड्रोसोफिला दृश्य प्रणाली29में ग्लिया विकास से जोड़ा गया है। टी मार्मोरेटस भ्रूण में कट आरएनएआई के साथ हमारे अनुभव के आधार पर, हम भ्रूण में जानकारीपूर्ण आंख फेनोटाइप पैदा कर सकते हैं जो उनके भ्रूणीय आंखों के विकास (अप्रकाशित टिप्पणियों) को पूरा करने में सक्षम हैं। यहां, उच्च खुराक उच्च घातकता दरों का कारण बनते हैं, जबकि कम खुराक के परिणामस्वरूप नमूदार और जानकारीपूर्ण फेनोटाइप होते हैं।

हमारा प्रोटोकॉल न केवल एक शोधकर्ता के लिए टी मार्मोरेटसपर आरएनएआई प्रयोगों को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक कदमों को सूचीबद्ध करता है, जैसा कि सचित्र है, लेकिन आम तौर पर अन्य जीवों, विशेष रूप से जलीय जीवों पर भी लागू होता है। जलीय जीवों में, क्रस्टेसियन के भीतर पहले से ही कई उदाहरण हैं जैसे पानी पिस्सू डैफिनिया30 और झींगा (हाल की समीक्षा के लिए, संदर्भ31देखें)। जलीय कीटों के बीच पर्याप्त अवसर हैं, क्योंकि उनमें सभी कीट विविधता का लगभग 6% शामिल होने का अनुमान लगाया गया है, जिसमें 200,000 से अधिक प्रजातियां32हैं। इसके अलावा, आरएनएआई पहले से ही पानी के स्ट्राइडर्स पर किया जा चुका है जो जलीय वातावरण33की सतह पर निवास करते हैं। यदि कोई जीनोम मौजूद नहीं है, तो एक ट्रांसक्रिप्टोम को डी नोवो इकट्ठा किया जा सकता है। जब तक इस प्रक्रिया से पता चलता है कि कुछ सौ न्यूक्लियोटाइड्स के contigs, विशिष्ट जीन के खिलाफ dsRNA डिजाइन किया जा सकता है । एगर उठे में कीड़ों को स्थिर करने के लिए हमारा प्रोटोकॉल अन्य प्रक्रियाओं के लिए भी उपयोगी होगा, विशेष रूप से नरम, निंदनीय और जलीय जीवों के लिए। एक साथ लिया, RNAi जीवों के एक विविध समूह में जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर के लिए एक शक्तिशाली तकनीक बनी हुई है, यहां तक कि जब कोई अंय आणविक और आनुवंशिक उपकरण उपलब्ध हैं ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम डॉ जोश बेनोत को बायोइन्फॉर्मेटिक्स हैले टोबलर के साथ उनकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं ताकि संपादकीय सहायता के लिए सनबर्स्ट डाइविंग बीटल और तमारा पेस को बढ़ाने में उनकी मदद की जा सके । इस शोध को नेशनल साइंस फाउंडेशन ने ग्रांट आईओएस-1456757 और आईओएस-1856341 से ईकेबी और आईओएस1557936 को वाईटी के तहत सपोर्ट किया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. RNA isolation and de novo transcriptome assembly
liquid nitrogen University Stockroom Typically locally available at research institutions
pipette tips Fisher Scientific size dependent Products from other vendors would work equally well
RNeasy lipid tissue mini kit (RNA isolation kit) Qiagen 74804 Detailed specific protocol is provided with the kit
spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
1.2. De novo transcriptome assembly.
BUSCO.v3 https://busco.ezlab.org/ Any freely available software for assessing trasncriptome completeness can be used.
CLC Genomics workbench Qiagen 832021 Other equivalent software packages are also available
Galaxy workbench https://usegalaxy.org/ An open source online transcriptome assembly & annotation pipeline
NCBI BLASTx https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?LINK_LOC=blasthome&PAGE_TYPE=BlastSearch&PROGRAM=blastx An open source online alignment and annotation pipeline
2. cDNA synthesis, Cloning & Miniprep isolation
ampicillin sodium salt Gibco 11593-027 Products from other vendors would work equally well
glycerol Fisher Scientific G33-500 Products from other vendors would work equally well
LB broth Fisher Scientific BP1426-500 Products from other vendors would work equally well
Omniscript RT (reverse trasncription) kit Qiagen 205111 Detailed specific protocol is provided with the kit
One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010 Detailed specific protocol is provided with the kit
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
PureLink Quick Plasmid Miniprep Kit ThermoFischer 771471 Detailed specific protocol is provided with the kit
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Detailed specific protocol is provided with the kit
shaker-incubator Labnet 211DS Other models would work equally well
spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
thermal cycler for PCR BioRad T100 Other models would work equally well
TOPO TA Cloning kit Invitrogen 1845069 Detailed specific protocol is provided with the kit
X-Gal Solution Thermo Scientific R0941 Products from other vendors would work equally well
2.2 PCR amplification & in vitro dsRNA synthesis
Centrifuge Fisher Scientific accuSpin Micro 17R Other models would work equally well
ethanol Fisher Scientific A4094 Products from other vendors would work equally well
FastTaq DNA Polymerase, dNTPack Roche 13873432 This kit contains all the reagents necessary for a PCR
MEGAclear Transcriiption clean up kit ThermoFischer AM1908 Detailed specific protocol is provided with the kit
MEGAscript T7 Transcription kit ThermoFischer AM1334 Detailed specific protocol is provided with the kit
nuclease-free water Fisher Scientific AM9932 Products from other vendors would work equally well
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104 Detailed specific protocol is provided with the kit
sodium acetate Fisher Scientific BP333-500 Make 3M working solution
Spectrophotometer (NnanoDrop) Thermo Fisher 9836674 Other models would work equally well
3. Collecting and preparing early stage T. marmoratus embryos for dsRNA injections
agarose Fisher Scientific 9012-36-6 Products from other vendors would work equally well
distilled water Fisher Scientific 9180 Products from other vendors would work equally well
forceps (Dumon #4 Biology) Fine Science Tools 11242-40 Products from other vendors would work equally well
glass cavity dish (3 well-dish) Fisher Scientific 50-243-43 Products from other vendors would work equally well
microwave Welbilt turn-table Other models would work equally well
natural hair paintbrush Amazon Any fine brush will do
P1000 micro-pipetter Gilson F123602 Other models would work equally well
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work
transfer pipettes Fisher Scientific 21-200-109 Products from other vendors would work equally well
4. dsRNA micro-injections in early stage T. marmoratus embryos
digital camera Edmund optics (Qimaging) Retiga 2000R Other models would work equally well
ethanol Fisher Scientific A4094 Products from other vendors would work equally well
food dye Kroger Any available food dye should work fine
humidity chamber take any plastic box with a lid, sterilize it with 70% ethanol and let it dry
incubator Labline 203 Other models would work equally well
injection buffer Prepared for 1 mL following reference #22 : Mix 10 µL of 0.1 M sodium phosphate buffer, 100 µL of 0.5 M potassium chloride solution, 100 µL of food dye and 790 µL of double-distilled water. Store in 4 °C.
intracellular Microinjection Systems (Picospritzer) Parker 052-0500-900 Currently the model III is available, but older models work also
micro needle holder A-M Systems 672441 Other products would work equally well
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) A-M Systems 603000 Other models would work equally well
micromanipulator Drummond Scientific Company 3-000-024-R Any quality micromanipulator will work
monosodium phosphate Fischer scientific 7558-80-7 To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.2 g of monosodium phosphate powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000 Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.
P10 micro-pipetter Gilson F144802 Other models would work equally well
P1000 micro-pipetter Gilson F123602 Other models would work equally well
potassium chloride Fischer scientific 7447-40-7 To make 100 mL of 0.5 M potassium chloride solution: Add 3.73 g of potassium chloride crystals to 100 mL of double distilled water and mix until clear solution is obtained.
sodium phosphate buffer (0.1M) To make 10 mL of 0.1 M of this buffer: Mix 8.5 mL of 1 M sodium phosphate dibasic solution with 1.5 mL of 1 M monosodium phosphate solution. Check the pH with a pH meter and adjust accordingly to pH 7.6 at room temprature.
sodium phosphate dibasic Fischer scientific 7558-79-4 To make 10 mL of 1 M working solution: Add 1.42 g of sodium phosphate dibasic powder to 10 mL of Double distilled water and mix until clear solution is obtained
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work
5. Preparing T. marmoratus larvae for dsRNA injections
agarose Fisher Scientific 9012-36-6 Products from other vendors would work equally well
forceps (Dumon #4 Biology) Fine Science Tools 11242-40 Products from other vendors would work equally well
Petri dishes Fisher Scientific FB0875713 Products from other vendors would work equally well
6. dsRNA micro-injections in T. marmoratus larvae
injection buffer (10x) See section 4
microinjection needles (1.2 mm x 0.68 mm, 4 inches) A-M Systems 603000 Other models would work equally well
microinjection syringe A-M Systems 603000 Other models would work equally well
micro needle holder A-M Systems 672441 Other products would work equally well
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instrument P-1000 Puller settings:Heat 575, Pull 60, Velocity 75 Delay 110, Pressure 700.
stereomicroscope Microsocope Central 10446293 Any good stereomicroscope will work

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References

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Rathore, S., Hassert, J., Clark-Hachtel, C. M., Stahl, A., Tomoyasu, Y., Bushbeck, E. K. RNA Interference in Aquatic Beetles as a Powerful Tool for Manipulating Gene Expression at Specific Developmental Time Points. J. Vis. Exp. (159), e61477, doi:10.3791/61477 (2020).

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