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Bioengineering

Síntese de Nanopartículas de Óxido de Manganês por Decomposição Térmica de Acetilado de Manganês(II) Acetillacetonato

Published: June 18, 2020 doi: 10.3791/61572
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemical and Biomedical Engineering, West Virginia University

Summary

Este protocolo detalha uma síntese fácil de um pote de nanopartículas de óxido de manganês (MnO) por decomposição térmica de acetilado de manganês (II) na presença de éter de oleylamina e dibenzyl. As nanopartículas MnO têm sido utilizadas em diversas aplicações, incluindo ressonância magnética, biosenso, catálise, baterias e tratamento de águas residuais.

Abstract

Para aplicações biomédicas, as nanopartículas de óxido de metal, como óxido de ferro e óxido de manganês (MnO), têm sido usadas como biosensores e agentes de contraste em ressonância magnética (RM). Enquanto as nanopartículas de óxido de ferro fornecem contraste negativo constante na ressonância magnética em tempos experimentais típicos, o MnO gera contraste positivo comutação na ressonância magnética através da dissolução de MnO para Mn2+ em pH baixo dentro de endosários celulares para 'ligar' o contraste de ressonância magnética. Este protocolo descreve uma síntese de um pote de nanopartículas MnO formadas pela decomposição térmica de acetilado de manganês(II) em oleylamina e éter dibenzyl. Embora executar a síntese de nanopartículas MnO seja simples, a configuração experimental inicial pode ser difícil de reproduzir se instruções detalhadas não forem fornecidas. Assim, o conjunto de vidros e tubos é descrito pela primeira vez para permitir que outros investigadores reproduzam facilmente a configuração. O método de síntese incorpora um controlador de temperatura para obter manipulação automatizada e precisa do perfil de temperatura desejado, o que impactará o tamanho e a química das nanopartículas resultantes. O protocolo de decomposição térmica pode ser prontamente adaptado para gerar outras nanopartículas de óxido de metal (por exemplo, óxido de ferro) e incluir solventes orgânicos alternativos e estabilizadores (por exemplo, ácido oleico). Além disso, a razão entre solvente orgânico e estabilizador pode ser alterada para afetar ainda mais as propriedades das nanopartículas de impacto, o que é mostrado aqui. As nanopartículas MnO sintetizadas são caracterizadas para morfologia, tamanho, composição a granel e composição da superfície através de microscopia eletrônica de transmissão, difração de raios-X e espectroscopia infravermelha de quatro transformações, respectivamente. As nanopartículas MnO sintetizadas por este método serão hidrofóbicas e devem ser ainda mais manipuladas através de troca de ligantes, encapsulamento polimérico ou capping lipídico para incorporar grupos hidrofílicos para interação com fluidos biológicos e tecidos.

Introduction

As nanopartículas de óxido de metal possuem propriedades magnéticas, elétricas e catalíticas, que foram aplicadas no bioimagem1,,2,3, tecnologias de sensores4,,5,catálise6,,7,,8, armazenamento de energia9e purificação de água10. No campo biomédico, as nanopartículas de óxido de ferro e as nanopartículas de óxido de manganês (MnO) têm protiliidade comprovada como agentes de contraste na ressonância magnética (RM)1,2. As nanopartículas deóxidode ferro produzem contraste negativo robusto em T 2 * MRI e são poderosas o suficiente para visualizar células rotuladas únicas in vivo11,,12,,13; no entanto, o sinal de ressonância magnética negativo não pode ser modulado e permanece "ON" durante toda a duração dos experimentos típicos. Devido ao ferro endógeno presente no fígado, medula óssea, sangue e baço, o contraste negativo gerado a partir de nanopartículas de óxido de ferro pode ser difícil de interpretar. As nanopartículas MnO, por outro lado, respondem a uma queda no pH. O sinal de ressonância magnética para nanopartículas MnO pode passar de "OFF" para "ON" uma vez que as nanopartículas são internalizadas dentro dos endosomos baixos pH e lysosomes da célula-alvo, como uma célula cancerosa14,,15,,16,,17,,18,19. O contraste positivo na ressonância magnética T1 produzido a partir da dissolução de MnO para Mn2+ em pH baixo é inconfundível e pode melhorar a especificidade de detecção do câncer apenas acendendo no local alvo dentro de um tumor maligno. O controle sobre o tamanho da nanopartícula, morfologia e composição é crucial para obter o máximo de sinal de ressonância magnética das nanopartículas MnO. Aqui, descrevemos como sintetizar e caracterizar nanopartículas MnO usando o método de decomposição térmica e notamos diferentes estratégias para ajustar propriedades de nanopartículas alterando variáveis no processo de síntese. Este protocolo pode ser facilmente modificado para produzir outras nanopartículas magnéticas, como nanopartículas de óxido de ferro.

As nanopartículas MnO foram produzidas por uma variedade de técnicas, incluindo decomposição térmica20,21,22,23,24,25, hidro/solvothermal26,27,28,29, exfoli30,31,32,33,34, permanganas redução35,36,37,38, e adsorption-oxidação39,40,41,42. A decomposição térmica é a técnica mais utilizada que envolve dissolver precursores de manganês, solventes orgânicos e agentes estabilizadores a altas temperaturas (180 – 360 °C) sob a presença de uma atmosfera gasosa inerte para formar nanopartículas MnO43. De todas essas técnicas, a decomposição térmica é o método superior para gerar uma variedade de nanocristais MnO de fase pura (MnO, Mn3O4 e Mn2O3) com uma distribuição de tamanho estreito. Sua versatilidade é destacada pela capacidade de controlar firmemente o tamanho das nanopartículas, a morfologia e a composição alterando o tempo de reação44,45,46, temperatura44,,47,,48,,49tipos/proporções de reagentes20,,45,,47,,48,,50 e gás inerte47,,48,,50 utilizados. As principais limitações deste método são a exigência de altas temperaturas, a atmosfera livre de oxigênio e o revestimento hidrofóbico das nanopartículas sintetizadas, o que requer uma modificação adicional com polímeros, lipídios ou outros ligantes para aumentar a solubilidade para aplicações biológicas14,,51,,52,,53.

Além da decomposição térmica, o método hidro/solvothermal é a única outra técnica que pode produzir uma variedade de fases MnO, incluindo MnO, Mn3O4e MnO2; todas as outras estratégias só formam produtos MnO2. Durante a síntese hidro/solvotermal, precursores como o esteato Mn(II)54,55 e Mn(II) acetato27 são aquecidos entre 120-200 °C durante várias horas para alcançar nanopartículas com uma distribuição de tamanho estreito; no entanto, são necessários vasos de reação especializados e reações são realizadas em altas pressões. Em contraste, a estratégia de esfoliação envolve o tratamento de um material em camadas ou granel para promover a dissociação em camadas únicas 2D. Sua principal vantagem está na produção de nanofolhas MnO2, mas o processo de síntese é longo que requer vários dias e o tamanho resultante das folhas é difícil de controlar. Alternativamente, permanganatos como OTNO4 podem reagir com agentes redutores como ácido oleico56,57, óxido de grafeno58 ou cloridrato de polimina59 para criar nanopartículas MnO2. O uso de KMnO4 facilita a formação de nanopartículas à temperatura ambiente durante alguns minutos a horas dentro das condições aquosas43. Infelizmente, a rápida síntese e o crescimento das nanopartículas torna desafiador controlar finamente o tamanho das nanopartículas resultantes. As nanopartículas MnO2 também podem ser sintetizadas usando adsorção-oxidação pela qual os íons Mn2+ são adsorvidas e oxidados ao MnO2 por oxigênio em condições básicas. Este método produzirá pequenas nanopartículas MnO2 com uma distribuição de tamanho estreito à temperatura ambiente ao longo de várias horas em mídia aquosa; no entanto, a exigência de adsorção de íons Mn2+ e condições alcalinas limita sua aplicação generalizada43.

Dos métodos de síntese de nanopartículas MnO discutidos, a decomposição térmica é a mais versátil para gerar diferentes nanocristais de fase pura monodisperse com controle sobre o tamanho, forma e composição de nanopartículas sem exigir vasos especializados de síntese. Neste manuscrito, descrevemos como sintetizar as nanopartículas MnO por decomposição térmica a 280 °C usando o acetilado de manganês (II) (Mn(II) ACAC) como a fonte de íons Mn2+, oleylamina (OA) como o agente redutor e estabilizador, e éter dibenzyl (DE) como o solvente sob uma atmosfera de nitrogênio. A configuração de vidro e tubulação para síntese de nanopartículas é explicada em detalhes. Uma vantagem da técnica é a inclusão de um controlador de temperatura, sonda termopar e manto de aquecimento para permitir um controle preciso sobre a taxa de aquecimento, temperatura máxima e tempos de reação a cada temperatura para ajustar o tamanho e a composição das nanopartículas. Aqui, mostramos como o tamanho da nanopartícula também pode ser manipulado alterando a proporção de OA para DE. Além disso, demonstramos como preparar amostras de nanopartículas e medir o tamanho das nanopartículas, a composição a granel e a composição da superfície usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM), difração de raios-x (XRD) e espectroscopia infravermelha de quatro transformações (FTIR), respectivamente. Mais orientações são incluídas sobre como analisar as imagens coletadas e espectros de cada instrumento. Para gerar nanopartículas MnO uniformemente moldadas, deve estar presente um estabilizador e um fluxo adequado de nitrogênio; Os resultados de XRD e TEM são mostrados para produtos indesejados formados na ausência de OA e sob baixo fluxo de nitrogênio. Na seção Discussão, destacamos etapas cruciais no protocolo, métricas para determinar a síntese de nanopartículas bem sucedidas, maior variação do protocolo de decomposição para modificar propriedades de nanopartículas (tamanho, morfologia e composição), solução de problemas e limitações do método e aplicações de nanopartículas MnO como agentes de contraste para imagens biomédicas.

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Protocol

1. Vidros e conjunto de tubos – a ser realizado apenas pela primeira vez

NOTA: A Figura 1 mostra a configuração experimental para a síntese de nanopartículas MnO com conexões numeradas de tubulação. A Figura S1 mostra a mesma configuração com os principais componentes de vidro rotulados. Se houver uma incompatibilidade entre o tubo resistente químico e o tamanho da conexão de vidro, cubra a conexão de vidro primeiro com um pequeno pedaço de tubulação menor antes de adicionar o tubo resistente químico para tornar as conexões aconchegantes.

  1. Fixar o tanque de nitrogênio sem ar na parede perto de um capô de fumaça química usando restrições de correia aprovadas. Adicione o regulador de nitrogênio apropriado ao tanque.
    ATENÇÃO: Os cilindros de gás devem ser devidamente protegidos, pois podem ser muito perigosos se derrubados.
  2. Encha a coluna de secagem de gás com dessecante. Anexar tubos químicos resistentes do regulador de nitrogênio sem ar à entrada inferior da coluna de secagem de gás (#1 na Figura 1).
  3. Fixar o coletor de vidro contendo pelo menos 2 torneiras de saída até o topo do capô da fumaça usando dois grampos de garras de metal. Anexar tubos químicos resistentes à saída da coluna de secagem a gás (#2 na Figura 1) à entrada do coletor (#3 na Figura 1).
  4. Coloque e proteja 3 borbulhantes de óleo mineral no capô da fumaça usando grampos de garras metálicas de acordo com a Figura 1. Coloque dois borbulhantes para a esquerda e um bolha para a direita.
  5. Encha o borbulhador mais à esquerda (por #9 na Figura 1) com a menor quantidade de óleo de silicone (~1 polegada de óleo do fundo do borbulhador). Encha o bubbler médio (por #7,8 na Figura 1) com uma quantidade média de óleo de silicone (~1,5 polegadas de óleo do fundo do borbulhador). Encha o bubbler mais à direita (por #11 na Figura 1) com a maior quantidade de óleo de silicone (~2 polegadas de óleo do fundo do borbulhador).
    NOTA: A quantidade relativa de óleo de silicone entre os borbulhantes minerais é muito importante para alcançar o fluxo adequado do gás nitrogênio sem ar através do sistema. Não adicione muito óleo (mais de ~2,5 polegadas), pois o óleo vai borbulhar durante a reação e pode sair dos borbulhantes se estiver sobrecarregado.
  6. Conecte a tomada na torneira direita do coletor (#4 na Figura 1) à extremidade roscada de um adaptador de cotovelo de vidro (#5 na Figura 1) usando tubos químicos resistentes.
  7. Fixar a extremidade roscada de outro adaptador de cotovelo de vidro (#6 na Figura 1) à entrada do bolhador médio (#7 na Figura 1) utilizando tubos químicos resistentes. Conecte a saída do bolhar médio (#8 na Figura 1) à entrada do bolha mais à esquerda (#9 na Figura 1) utilizando tubos químicos resistentes.
  8. Conecte a tomada na torneira esquerda do coletor (#10 na Figura 1) à entrada do bolha mais à direita (#11 na Figura 1).
  9. Deixe a configuração preliminar no capô da fumaça se o espaço acomodar. Fixar os dois adaptadores de cotovelo de vidro com tubos ligados (#5,6 na Figura 1) à treliça metálica no capô da fumaça quando o experimento não estiver funcionando.

2. Configuração de equipamentos e vidros – a ser realizada durante cada experimento

ATENÇÃO: Todas as etapas envolvendo solventes requerem o uso de um capô de fumaça química, bem como equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados, incluindo óculos de segurança, jaleco e luvas. A configuração de fabricação de nanopartículas deve ser montada no capô da fumaça.

  1. Coloque a placa de mexida no capô da fumaça e coloque o manto de aquecimento em cima da placa de mexida.
    NOTA: O manto de aquecimento deve ser capaz de suportar temperaturas acima de 300 °C.
  2. Coloque o frasco de fundo redondo de 4 pescoços de 500 mL no manto de aquecimento e fixe o pescoço médio com um grampo de garra de metal. Adicione uma barra de agitação magnética ao frasco fundo redondo. Coloque o funil de vidro no pescoço médio do frasco traseiro redondo.
  3. Verifique o coletor: certifique-se de que a torneira de segurança (#10 na Figura 1) e a torneira de entrada (#4 na Figura 1) estejam abertas.
    ATENÇÃO: A torneira de segurança precisa estar sempre aberta para garantir que nenhuma pressão seja construída no sistema. Se a torneira estiver fechada, uma explosão pode ocorrer.
  4. Pese 1,51 g de acetilado de manganês (II) (Mn(II) ACAC) e coloque dentro do frasco de fundo redondo usando o funil de vidro.
  5. Adicione 20 mL de oleylamina e 40 mL de éter dibenzyl ao frasco fundo redondo usando uma pipeta de vidro e o funil de vidro. Retire o funil e limpe-o com hexano.
    ATENÇÃO: O experimento pode ser ampliado (por exemplo, 2 vezes), mas recomenda-se ser conservador ao usar quantidades maiores de reagentes. Grandes quantidades de reagentes podem fazer com que a reação se torne menos estável e, portanto, perigosa.
  6. Coloque o condensador no pescoço esquerdo do frasco traseiro redondo e fixe o condensador com um grampo de garra de metal. Adicione o adaptador de cotovelo de vidro (#6 na Figura 1) em cima do condensador.
    NOTA: O adaptador deve ser conectado com tubos resistentes químicos ao borbulhador de óleo mineral médio (#7 na Figura 1).
  7. Conecte a tubulação compatível com água do bico da saída de água no capô da fumaça (#12 na Figura 1) à entrada do condensador (#13 na Figura 1). Use também tubos compatíveis com água para conectar a saída do condensador (#14 na Figura 1) ao ralo da capa de fumaça (#15 na Figura 1). Fixar a tubulação nas conexões do condensador (#13,14 na Figura 1) com grampos de mangueira de metal de engrenagem de verme intertravados.
  8. Adicione a armadilha rotovap no pescoço direito do frasco fundo redondo. Coloque o adaptador de cotovelo de vidro (#5 na Figura 1) em cima da armadilha rotovap.
    NOTA: O adaptador deve ser conectado com tubos resistentes químicos à tomada de coletores de torneira direita (#4 na Figura 1).
  9. Coloque a rolha de borracha no pescoço médio do frasco traseiro redondo e dobre-a para que os lados cubram o pescoço do frasco. Adicione os clipes de articulação cônica de plástico (4 clipes verdes na Figura 1) para fixar as seguintes conexões de vidro do pescoço: adaptador de cotovelo e armadilha rotovap, armadilha rotovap e frasco traseiro redondo, frasco traseiro redondo e condensador, e adaptador condensador e cotovelo.
  10. Coloque a sonda de temperatura no menor pescoço no frasco fundo redondo, apertando e protegendo a sonda com a tampa do pescoço e o anel o. Sele a conexão com filme plástico parafina.
    NOTA: Certifique-se de que a sonda de temperatura está imersa dentro da mistura de fluidos, mas não toque na parte inferior do vidro. Se a sonda estiver em contato com a superfície de vidro, a temperatura medida será imprecisa em comparação com a temperatura real do fluido, o que fará com que o controlador de temperatura forneça uma quantidade incorreta de calor à reação.
  11. Conecte a sonda de temperatura à entrada do controlador de temperatura. Conecte o manto de aquecimento à saída do controlador de temperatura.
  12. Ligue a placa de mexida e comece a mexer vigorosamente.
  13. Abra o tanque de nitrogênio sem ar e lentamente comece a fluir nitrogênio para o sistema (isso removerá o ar). Ajuste o fluxo de nitrogênio usando o regulador até que um fluxo lento constante de bolhas se forme no borbulhador de óleo mineral médio (#7 na Figura 1).
  14. Ligue a água fria no capô da fumaça (#12 na Figura 1) ao condensador e verifique se não há vazamento de água da tubulação.
  15. Abaixe a faixa do capô da fumaça antes que a reação comece.

3. Síntese de nanopartículas

  1. Ligue o controlador de temperatura (alimentação e alimentação de aquecimento) para iniciar a reação. Observe e grave a cor da mistura de reação em cada etapa. A reação começará como uma cor marrom escura nos estágios 1 a 3 e ficará verde durante a fase 4.
    NOTA: Cada controlador de temperatura funcionará de forma diferente. Certifique-se de usar o manual e o programa corretos.
  2. Estágio 1: Observe o visor do controlador de temperatura para confirmar o aumento da temperatura ambiente para 60 °C ao longo de 30 minutos.
  3. Estágio 2: Certifique-se de que o controlador de temperatura se estabilize a 60 °C por 1 min enquanto se prepara para uma taxa de aquecimento mais rápida no estágio 3.
  4. Estágio 3: Verifique o visor do controlador de temperatura à medida que a temperatura sobe para 280 °C a 10 °C por minuto ao longo de 22 min. Certifique-se de que o fluxo de água através do condensador é suficiente, pois a mistura começará a evaporar durante esta fase.
  5. Estágio 4: Confirme se o controlador de temperatura exibe uma temperatura de reação constante de 280 °C por 30 minutos. Observe a mudança de cor de reação para um tom verde, o que indica a formação de MnO. Uma vez que a reação atinja 280 °C, desligue o tanque de nitrogênio e feche a torneira direita para a entrada da reação no coletor (#4 na Figura 1).
    ATENÇÃO: Mantenha aberta a torneira de segurança (#10 na Figura 1).
  6. Estágio 5: Verifique o visor do controlador de temperatura para garantir que o aquecimento pare automaticamente. Mantenha a sonda de temperatura dentro (não abra o frasco fundo redondo) e espere até que a temperatura atinja a temperatura ambiente para prosseguir com a coleta de nanopartículas.
    ATENÇÃO: O frasco será extremamente quente. Luvas resistentes ao calor devem ser usadas para remover o manto de aquecimento se uma taxa de resfriamento mais rápida for desejada.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. Coleção de nanopartículas

  1. Desligue o controlador de temperatura, a placa de agitação e a água fria. Remova o tubo compatível com água do condensador, torneira de água no capô da fumaça e o ralo. Remova todos os clipes de articulação cônica de plástico das conexões de vidro.
  2. Remova os adaptadores de cotovelo de vidro da armadilha rotovap (#5 na Figura 1) e do condensador (#6 na Figura 1). Fixar os adaptadores de cotovelo à rede metálica no capô para usar para um experimento futuro.
  3. Retire o condensador e a armadilha rotovap do frasco fundo redondo e enxágue o interior do condensador e da armadilha rotovap com hexano.
  4. Remova a rolha de borracha e a sonda de temperatura, e limpe com 70% de etanol.
  5. Despeje a solução de nanopartículas MnO do frasco fundo redondo em um béquer limpo de 500 mL. Use hexano (~5 mL) para enxaguar o frasco fundo redondo e adicionar o hexano com nanopartículas MnO residuais no béquer de 500 mL.
    NOTA: A hexana resususpenda as nanopartículas MnO, enquanto 200 etanol à prova agirá como o agente precipitante.
  6. Observe o volume atual da mistura de nanopartículas MnO. Adicione 200 etanol à prova de etanol à mistura de nanopartículas MnO usando uma razão de volume de 2:1 (por exemplo, adicione 150 mL de etanol se a mistura de nanopartículas for de 75 mL).
  7. Despeje a mistura de nanopartículas igualmente em quatro tubos de centrífuga, cerca de 3/4 cheios. Enrosque as tampas apropriadas. Verifique se os níveis de fluido estão equilibrados.
    NOTA: Qualquer mistura extra de nanopartículas será adicionada aos tubos na próxima rodada de centrifugação.
  8. Nanopartículas centrífugas por 10 min a 17.400 x g a 10 °C.
    NOTA: Tempos de centrifugação mais longos e/ou velocidades de centrifugação mais altas podem ser usados para aumentar a coleta de frações menores de nanopartículas, mas a agregação de nanopartículas pode ser aumentada.
  9. Descarte o supernatante em um béquer, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Se necessário, use uma pipeta de transferência para coletar o supernatante.
    NOTA: É normal que as primeiras rodadas de centrifugação produzam um supernatante de cor marrom. O supernaspe deve ser marrom e claro, mas não nublado. Qualquer nebulosidade indica que as nanopartículas ainda estão presentes no supernasce. Se o sobrenatante estiver nublado, centrifufique os tubos novamente antes de descartar o sobrenante; centrifugação novamente reduzirá a perda das nanopartículas sintetizadas, mas pode causar mais aglomeração.
  10. Adicione 5 mL de hexano e qualquer solução extra de nanopartículas deixada a cada tubo de centrífuga contendo as pelotas de nanopartículas MnO. Resuspend as nanopartículas usando um sonicator de banho e/ou vórtice. Continue até que a solução fique nublada e a pelota desapareça, o que indica uma ressuspensão nanopartícula bem sucedida.
  11. Adicione mais 200 etanol à prova nos tubos de centrífuga até 3/4 cheios.
  12. Repetir as etapas 4.8-4.10. Em seguida, combine as nanopartículas resuspended de quatro tubos centrífugas a dois tubos de centrífuga. Em seguida, repita o passo 4.11.
  13. Repita os passos 4.8-4.10 mais uma vez, o que fará um total de três lavagens com hexano e 200 etanol à prova. Não adicione nenhum etanol à prova de 200 tubos de centrífuga.
  14. Combine e transfira as nanopartículas MnO resuspended em hexano em um frasco de cintilação de vidro de 20 mL pré-varrido. Deixe a tampa do frasco desligada para permitir que o hexano evapore durante a noite no capô da fumaça.
  15. No dia seguinte, transfira o frasco de cintilação de vidro descoberto contendo as nanopartículas em um forno a vácuo. Mantenha a tampa do frasco em um lugar seguro fora do forno. Seque as nanopartículas a 100 °C durante 24 horas.
  16. Uma vez que as nanopartículas estejam secas, use uma espátula para quebrar o pó dentro do frasco. Pesar o frasco contendo nanopartículas MnO secas e subtrair o peso conhecido do frasco de cintilação de vidro para determinar o rendimento da nanopartícula.
    ATENÇÃO: As nanopartículas secas podem facilmente se tornar transmitidas pelo ar e devem ser manuseadas pelo pessoal usando um respirador de partículas como N95 ou P100.
  17. Armazene nanopartículas à temperatura ambiente dentro do frasco de cintilação de vidro com a tampa ligada. Enrole a tampa com filme plástico de parafina.

5. Tamanho de nanopartículas e morfologia superficial (TEM)

  1. Pulverize as nanopartículas MnO em um pó fino usando uma argamassa e pilão.
  2. Adicione 5 mg de nanopartículas MnO a um tubo de centrífuga cônica de 15 mL. Adicione 10 mL de 200 etanol à prova.
    NOTA: 200 etanol à prova evapora rapidamente para obter uma propagação mais homogênea de nanopartículas na rede TEM. Outro solvente poderia ter melhor suspensão de nanopartículas, mas levaria mais tempo para evaporar, e devido à tensão superficial, as nanopartículas se acumulariam nas bordas das redes TEM.
  3. Sonicar a mistura de nanopartículas por 5 min ou até a ressuspensão total das nanopartículas.
  4. Imediatamente após a ressuspensão, adicione três gotas de 5 μL da mistura de nanopartículas em uma grade de cobre de 300 malha de suporte à rede de carbono tipo B. Deixe o ar secar.
    1. Use pinças inversas para facilitar a preparação da amostra. Posicione a grade sobre a pinça com o lado mais escuro para cima antes de adicionar as gotas contendo nanopartículas.
      NOTA: As grades são frágeis, por isso tenha cuidado para não dobrar e danificar as grades para uma melhor imagem. Uma vez secas, as grades devem ser mantidas dentro de caixas de armazenamento de grade TEM disponíveis comercialmente para proteção.
  5. Avalie a forma e o tamanho das nanopartículas usando microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Aplique parâmetros típicos para TEM, incluindo uma resistência de feixe de 200 kV, um tamanho spot de 1 e uma ampliação de 300x.
  6. Coletar imagens em áreas da grade onde nanopartículas suficientes (10 - 30 nanopartículas) são distribuídas uniformemente. Evite áreas que contenham agregações de nanopartículas, pois o dimensionamento preciso não pode ser feito se as nanopartículas não estiverem visivelmente separadas.
    1. Áreas de imagem de diferentes quadrados de grade para garantir uma distribuição uniforme. Para uma distribuição de tamanho ideal, pegue entre 25 a 30 imagens de cada amostra para obter um tamanho amostral suficiente.

6. Análise quantitativa do diâmetro das nanopartículas

  1. Para analisar imagens TEM com ImageJ, primeiro abra uma das imagens clicando em Arquivo | Aberto. Selecione a imagem desejada e clique em Abrir.
  2. Para calibrar a medição de distância no ImageJ de pixels a nanômetros, clique primeiro na ferramenta de linha reta. Segure a tecla Shift e trace o comprimento da barra de escala. Em seguida, clique em Analisar | Escala definida.
  3. Na janela pop-up Set Scale, digite a medição da barra de escala verdadeira na caixa de distância Conhecida (por exemplo, tipo 50 se a barra de escala for de 50 nm). Altere a unidade de comprimento para as unidades correspondentes (por exemplo, tipo nm para nanômetros). Verifique a caixa Global para manter a escala consistente em todas as imagens e clique em OK.
  4. Após definir a escala, use a ferramenta de linha reta para rastrear o diâmetro de uma nanopartícula. Em seguida, clique em Analisar | Meça ou clique nas teclas Ctrl+M.
  5. Procure uma janela pop-up de resultados para aparecer com informações diferentes sobre a medição. Confirme se a coluna Comprimento está presente, pois fornecerá o diâmetro das nanopartículas com as unidades especificadas durante a etapa 6.3.
  6. Repita o passo 6.4 até que todas as nanopartículas da imagem sejam dimensionadas. Para passar para a próxima imagem, clique em Arquivo | Abra asteclas Next , ou Ctrl+Shift+O.
  7. Afinal, as nanopartículas são dimensionadas em todas as imagens, vá para a janela Resultados e clique em Arquivo | Salve Como. Renomeie o arquivo de resultados e clique em Salvar. Visualize e analise todos os diâmetros das nanopartículas em um programa de planilha após a importação do arquivo de resultados.

7. Composição a granel de nanopartículas (XRD)

  1. Se não for feito durante a etapa 5.1, pulverize as nanopartículas MnO em um pó fino usando uma argamassa e pilão. Coloque o pó de nanopartícula fina no suporte da amostra usando uma espátula. Siga o procedimento de carregamento da amostra especificado para que a máquina de difração de raios-X (XRD) seja utilizada.
  2. Determine a composição em massa das nanopartículas MnO usando XRD. Coletar espectros XRD sobre uma faixa de 2φ de 10° a 110° para ver os picos de MnO (30° a 90°) e Mn3O4 (15° a 90°).
    NOTA: Outros parâmetros de configuração recomendados para XRD são um tamanho de passo de 0,05 s, uma máscara de feixe de 10 mm e um tempo de etapa de varredura de 64,77 s.
  3. Salve o gerado . Arquivo XRD e abra-o no programa de análise XRD.

8. Análise dos espectros XRD

  1. No programa de análise XRD, identifique todos os principais picos do espectro XRD medido da amostra clicando no botão IdeAll no software.
  2. Para salvar os dados, selecione Arquivo na barra de ferramentas, seguido de Salvar como... para salvar os dados como um arquivo ASC que pode ser aberto com um programa de planilha.
  3. Use o programa para padronizar o banco de dados XRD de compostos conhecidos para encontrar a melhor combinação de composição com a amostra. Para estreitar a pesquisa, especifique compostos antecipados (por exemplo, manganês e oxigênio).
    1. Para padronizar o espectro, selecione Análise | Pesquisa e Correspondência. Na janela pop-up, selecione Química e clique nos elementos químicos desejados para restringir a pesquisa do programa com base na amostra.
    2. Uma vez escolhidos todos os elementos, selecione Pesquisar. Aguarde que uma lista de composições químicas que correspondam ao espectro XRD apareça.
      NOTA: O programa fornecerá a probabilidade de que os espectros XRD conhecidos correspondam à composição da amostra. Se duas ou mais composições forem escolhidas, o programa daria a porcentagem de composição de cada uma delas (por exemplo, MnO versus Mn3O4).
  4. Se desejar, remova o fundo do espectro XRD clicando no botão Colocar fundo Equation 1 (). Em seguida, clique em Fundo na janela pop-up, seguido de Subtrair. Confirme se o espectro aparece começando com 0 no eixo y.
    1. Salve os dados novamente sem o plano de fundo, como mostrado na etapa 8.2.
  5. Ao traçar o espectro XRD, mostre os picos característicos de cada composto combinado (por exemplo, MnO e Mn3O4).
    1. Para obter a lista dos picos característicos para compostos combinados do banco de dados, primeiro clique com o botão direito do mouse no espectro de correspondência de padrão e, em seguida, selecione Mostrar padrão. Aguarde que uma janela pop-up apareça com todas as informações de pico correspondentes ao padrão selecionado.
    2. Selecione, copie e cole as informações desejadas desse composto e plote os picos característicos com o espectro XRD medido em um programa de planilha.

9. Composição da superfície da nanopartícula (FTIR)

  1. Adicione pó de nanopartícula mnO seco ao suporte de amostra para análise de espectroscopia infravermelha de transformação fourier (FTIR).
  2. Avalie a química da superfície da nanopartícula usando FTIR. Colete espectros FTIR entre uma faixa de comprimento de onda de 4000 e 400 cm-1 com resolução de 4 cm-1.
  3. Limpe o suporte de amostra FTIR e adicione oleylamina líquida. Repita o passo 9.2.

10. Análise dos espectros FTIR

  1. No programa de análise FTIR, remova o fundo do espectro FTIR coletado selecionando Transformações no menu suspenso, seguido pelo Corrigido da Linhade Base . Selecione Linear como o tipo de correção.
  2. Use o clique do mouse esquerdo para selecionar os pontos de linha de base no espectro original. Uma vez terminado, salve o espectro sob outro nome selecionando Adicionar ou substituir o espectro antigo selecionando Substituir.
    NOTA: A correção de fundo pode aumentar a prevalência de picos de juros ftir mais fracos.
  3. Para exportar o espectro FTIR, selecione primeiro o espectro específico da lista. Em seguida, clique em Arquivo na barra de ferramentas, seguido pelo espectro de exportação.
  4. Escolha o formato de arquivo csv na janela Salvar Como e clique em Salvar. Abra e faça um gráfico do arquivo csv usando um programa de planilha.
  5. Compare nanopartículas MnO adquiridas com espectro ftir de oleylamina como detalhado na seção Resultados Representativos para avaliar o capping de nanopartículas com oleylamina.

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Representative Results

Para confirmar a síntese bem sucedida, as nanopartículas MnO devem ser avaliadas para tamanho e morfologia (TEM), composição a granel (XRD) e composição de superfície (FTIR). A Figura 2 mostra imagens representativas de nanopartículas MnO sintetizadas usando proporções decrescentes de oleylamina (OA, o estabilizador) para éter dibenzyl (DE, o solvente orgânico): 60:0, 50:10, 40:20, 30:30, 20:40, 10:50. As imagens tem ideais consistem em nanopartículas individuais (mostradas como octógonos arredondados escuros na Figura 2), com sobreposição mínima. É crucial alcançar a separação adequada das nanopartículas para um dimensionamento manual preciso dos diâmetros das nanopartículas usando a ferramenta de traço de linha no ImageJ.

A Figura 3 mostra a preparação da amostra TEM subótima. Se uma alta concentração de nanopartículas MnO for suspensa no etanol ou muitas gotas de suspensão de nanopartículas forem adicionadas à rede TEM, cada imagem consistirá de grandes aglomerações de nanopartículas(Figura 3A,B). Devido à sobreposição substancial de nanopartículas, os limites de cada diâmetro de nanopartículas não podem ser distinguidos, o que impede uma medição precisa. Se uma baixa concentração de nanopartículas for preparada em etanol, as nanopartículas podem ser bem separadas, mas distribuídas de forma escassa na grade TEM(Figura 3C,D). Quando apenas uma ou duas nanopartículas aparecem em cada imagem TEM, mais imagens precisam ser tiradas para obter um tamanho amostral grande o suficiente e a distribuição em tamanho real pode não ser capturada com precisão. O protocolo de preparação TEM descrito aqui visa produzir imagens TEM com aproximadamente 10-30 nanopartículas por imagem (mais nanopartículas podem ser acomodadas por imagem se o diâmetro for pequeno).

O TEM pode ser usado para avaliar alterações no tamanho das nanopartículas com uma variação nos parâmetros de síntese. A Figura 4 mostra que os diâmetros médios das nanopartículas MnO sintetizadas com razões decrescentes de OA:DE. Os diâmetros para cada condição de síntese foram quantificados de 75 a 90 imagens TEM, com um total de 900 a 1100 nanopartículas MnO analisadas por condição. Para garantir a reprodutibilidade, 3 lotes de nanopartículas foram sintetizados para cada razão OA:DE. No geral, uma diminuição na proporção de OA:DE produziu nanopartículas MnO menores com menor variação de tamanho; a única exceção ocorreu quando só o OA foi utilizado durante a síntese, que produziu nanopartículas de tamanho semelhante à razão 30:30. Histogramas mostrando a distribuição em tamanho real de todos os grupos de nanopartículas MnO são exibidos na Figura S2.

Após a confirmação do tamanho da nanopartícula e da morfologia com TEM, a composição da nanopartícula a granel pode ser testada usando XRD. Através da medição do ângulo e intensidade do feixe de raios-X difundida pela amostra, o XRD pode ser usado para determinar a estrutura cristalina e a fase das nanopartículas. A Figura 5A-F mostra o espectro XRD coletado cru para cada amostra de nanopartículas MnO sintetizada com proporções decrescente de OA:DE. Os picos XRD obtidos em espectros de amostras são combinados com picos XRD de compostos conhecidos como MnO e Mn3O4 através do banco de dados do programa de análise XRD. Os picos padrão para MnO aparecem em 35°, 40°, 58°, 70°, 73°, e 87°, que são mostrados na Figura 5G. Ao comparar o espectro XRD nanopartícula com o conhecido MnO, é evidente que todos os espectros de nanopartículas possuem os 5 picos mais altos de MnO, indicando síntese bem sucedida de nanopartículas MnO. O XRD também pode ser utilizado para estimar o tamanho das nanopartículas usando a equação de Scherrer; picos mais largos no XRD indicam diâmetros menores de nanopartículas. Por exemplo, a Figura 5F com os picos XRD mais largos está associada com as menores nanopartículas, como mostrado pelo TEM (18,6 ± 5,5 nm).

A Figura 6 mostra espectros XRD de dois produtos indesejados na síntese de nanopartículas MnO. Para incentivar a formação da fase MnO a altas temperaturas (280 o C), onitrogênio é usado durante a síntese de nanopartículas para expurgar o ar do sistema. Se for aplicado fluxo de nitrogênio inadequado, uma composição de fase mista de Mn3O4 (51%) e MnO (49%) é produzido (Figura 6A). Através da comparação com os picos padrão de Mn3O4 (Figura 6C) e MnO(Figura 6D),o baixo fluxo de nitrogênio produz espectros XRD com os 8 picos mais altos para Mn3O4 e os 5 picos mais altos para MnO. TEM de nanopartículas sintetizadas sob baixo fluxo de nitrogênio revelou uma população mista de grandes nanopartículas cercadas por nanopartículas menores(Figura 6E). O fluxo de nitrogênio pode ser monitorado através da leitura do regulador de nitrogênio e da taxa de borbulha através do borbulhador de óleo mineral. Outro parâmetro crítico na síntese de nanopartículas MnO é a inclusão de um estabilizador. Na tentativa de produzir nanopartículas MnO ainda menores do que a razão 10:50 OA:DE, o DE puro foi usado sem qualquer OA. Uma pequena quantidade de pó desconhecido foi sintetizada na ausência de estabilizador. Como mostrado na Figura 6B,o espectro XRD para a razão 0:60 OA:DE foi barulhento e continha os 3 picos mais altos de Mn3O4. A partir da análise no banco de dados do programa XRD, o composto tinha uma composição química de 67% Mn3O4 e 33% MnO. Como suportado pelos grandes picos nos espectros XRD, o TEM confirmou que nanopartículas muito pequenas foram sintetizadas na ausência de estabilizador(Figura 6F). As nanopartículas também pareciam irregularmente moldadas e aglomeradas. Além disso, apenas um rendimento de 33% foi obtido sem qualquer estabilizador, o que significa que uma pequena quantidade de produto foi sintetizada. Portanto, o alto fluxo de nitrogênio e a inclusão de um estabilizador como o OA ou ácido oleico são necessários para a síntese de nanopartículas MnO.

Para complementar a composição das nanopartículas a granel com XRD, a composição da superfície pode ser avaliada utilizando FTIR. A Figura 7 mostra o espectro FTIR das nanopartículas MnO após a correção de fundo. Todos os espectros mostram os picos simétricos e assimétricos ch2 (2850-2854 e 2918-2926 cm-1, marcados por asteriscos) associados com oleyl agrupa60, além dos picos de vibração de dobra NH2 (1593 cm-1 e 3300 cm-1, marcados por quadrados) associados aos grupos de amina61. Uma vez que as nanopartículas MnO compartilham os mesmos picos para grupos de oleyl e grupos de amina presentes no espectro FTIR de OA (Figura S3), pode-se concluir que as nanopartículas são revestidas com uma camada superficial de OA. Além disso, todos os espectros ftir de nanopartículas contêm vibrações de ligação Mn-O e Mn-O-Mn em torno de 600 cm-1 (marcadas por triângulos), que confirmam a composição encontrada através de XRD62.

Figure 1
Figura 1: Nitrogênio e água fluem através da configuração da síntese de nanopartículas MnO.
As conexões de tubulação são rotuladas de 1-15. O nitrogênio sem ar entra (1) e sai (2) da coluna de secagem e é alimentado na entrada do coletor (3). Durante a reação, o nitrogênio expurga o ar do sistema entrando na torneira direita no coletor (4). O nitrogênio flui da torneira para o adaptador de cotovelo de vidro (5), armadilha rotovap, frasco de fundo redondo, condensador, adaptador de cotovelo de vidro (6) e através de uma série de dois borbulhadores de óleo mineral (7-9). No coletor, o excesso de nitrogênio que não flui através da reação deixará o sistema através da torneira esquerda (10), que está conectada ao borbulhador de óleo mineral com a maior quantidade de óleo de silicone (11). Stopcock #10 é permanecer sempre aberto. A água fluirá da torneira (12) através da entrada do condensador (13) e da saída (14) e para o ralo do capô da fumaça (15). A tubulação é presa ao condensador com grampos metálicos. Todas as tubulações devem ser tubulações resistentes a produtos químicos, exceto para a tubulação compatível com água usada para o condensador. Os vidros principais e os equipamentos são rotulados na Figura S1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagens TEM de nanopartículas MnO sintetizadas com proporções decrescentes de OA:DE.
Foram utilizadas as seguintes razões: (A) 60:0, (B) 50:10, (C) 40:20, (D) 30:30, (E) 20:40, (F)10:50. As nanopartículas MnO aparecem como octógonos separados e arredondados com sobreposição mínima para permitir a delimitação clara das bordas das nanopartículas. A razão de reação foi observada para afetar o tamanho geral das nanopartículas, com 50:10 sintetizando as maiores nanopartículas e 10:50 produzindo as menores nanopartículas. Barras de escala são 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagens TEM subótimas resultantes da preparação incorreta da grade TEM.
(A,B) Se a suspensão da nanopartícula estiver muito concentrada ou se as gotas de excesso de suspensão de nanopartículas forem carregadas na grade TEM, as nanopartículas se agregarão em grandes massas com sobreposição substancial. Nanopartículas individuais não podem ser observadas na maioria das áreas da rede. (C,D) Alternativamente, uma baixa concentração de nanopartículas poderia resultar em grades TEM povoadas com uma quantidade escassa de nanopartículas. As nanopartículas individuais estão espalhadas distantes, mas requerem mais imagens para capturar a distribuição do tamanho populacional da amostra. Barras de escala são 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Diâmetros médios de nanopartículas MnO medidos a partir de imagens TEM.
Em geral, uma menor quantidade de estabilizador (OA) com maior quantidade de solvente orgânico (DE) resultou em nanopartículas MnO menores e mais uniformes. Um total de 900 a 1100 diâmetros de nanopartículas foram calculados em imagens TEM usando a ferramenta de rastreamento de linha no ImageJ para cada grupo. As barras de erro mostram desvio padrão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Espectro xrd de nanopartículas MnO sintetizadas com proporções decrescentes de OA:DE.
Foram utilizadas as seguintes razões: (A) 60:0, (B) 50:10, (C) 40:20, (D) 30:30, (E) 20:40, (F)10:50. (G) Os picos de difração padrão para MnO são mostrados no banco de dados do programa de análise XRD. Todas as nanopartículas produzidas exibem os 5 picos XRD de maior intensidade para MnO, indicando síntese bem sucedida de nanopartículas MnO. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Espectro XRD e imagens TEM de nanopartículas indesejadas.
Os espectros XRD são mostrados para a síntese de nanopartículas MnO usando (A) baixo fluxo de nitrogênio e (B) uma razão de 0:60 de OA:DE (nenhum estabilizador está presente). Os picos de difração padrão para(C) Mn3O4 e(D) MnO são exibidos a partir do banco de dados do programa de análise XRD. Através da comparação com espectros padrão, o fluxo de nitrogênio inadequado(A) criou nanopartículas com uma mistura de Mn3O4 (51%) e MnO (49%). Na ausência de oleylamina(B),é obtido um espectro XRD mais amplo, que corresponde aos 3 picos mais altos de Mn3O4. Com base na análise realizada pela base de dados do programa XRD, essas nanopartículas sintetizadas são 67% Mn3O4 e 33% MnO. Imagens TEM de(E)nanopartículas sintetizadas com baixo fluxo de nitrogênio mostram grandes nanopartículas cercadas por menores. Imagens TEM de(F)nanopartículas sintetizadas com uma razão de 0:60 de OA:DE exibem nanopartículas agregadas muito pequenas com forma irregular. Barras de escala são 50 nm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Espectro FTIR de nanopartículas MnO sintetizadas com proporções decrescentes de OA:DE.
Foram utilizadas as seguintes razões: (A) 60:0, (B) 50:10, (C) 40:20, (D) 30:30, (E) 20:40, (F)10:50. Asteriscos e quadrados correspondem a grupos oleyl e grupos de amina, respectivamente, enquanto triângulos indicam a vibração dos laços Mn-O e Mn-O-Mn. Os insets encaixotados destacam os dois picos distintos de grupos oleyl. Os espectros FTIR indicam que as nanopartículas MnO são revestidas com oleylamina, conforme confirmado através de comparação com o espectro ftir de oleylamina apenas na Figura S3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura S1: Principais vidros e equipamentos da configuração de síntese de nanopartículas MnO. O coletor é fixado na rede metálica por grampos de garras metálicas e dispersa nitrogênio na reação. Mn(II) ACAC, éter dibenzyl, oleylamine e uma barra de agitação são adicionados ao frasco fundo redondo com quatro pescoços. O pescoço direito do frasco é anexado à armadilha rotovap e a um adaptador de cotovelo, enquanto o pescoço esquerdo está preso a um condensador e um adaptador de cotovelo. O pescoço médio do frasco fundo redondo está coberto com uma rolha de borracha. A sonda de temperatura é inserida na menor abertura do frasco fundo redondo, e é cercada por um filme de plástico o-ring e parafina para formar uma vedação apertada no ar. O frasco traseiro redondo fica em cima de um manto de aquecimento e uma placa de agitação para agitar vigorosamente a reação durante o aquecimento. A sonda de temperatura e o manto de aquecimento estão conectados ao controlador de temperatura para fornecer regulação automatizada em tempo real do perfil de temperatura. O frasco fundo redondo e o condensador são fixados na rede metálica com grampos de garras metálicas. Há três borbulhadores de óleo mineral, dois à esquerda e um à direita, cheios de quantidades crescentes de óleo de silicone do borbulhador esquerdo para o borbulhador direito na imagem. Os borbulhantes também estão presos à rede metálica com grampos de garras. Os clipes articulares cônicos de plástico verde são anexados para proteger as conexões de vidro antes que a reação comece. As conexões de tubulação estão detalhadas na Figura 1. Clique aqui para baixar este número.

Figura S2: Histogramas mostrando distribuição do tamanho da nanopartícula MnO para diminuir as proporções de OA:DE. Foram utilizadas as seguintes razões: (A) 60:0, (B) 50:10, (C) 40:20, (D) 30:30, (E) 20:40, (F)10:50. No geral, à medida que a proporção se aproxima das 10:50, a distribuição do tamanho da nanopartícula muda para a esquerda (indicando diâmetros menores) e torna-se mais compacta (indicando tamanho de nanopartícula mais uniforme). O diâmetro médio para cada distribuição é mostrado na Figura 4. Clique aqui para baixar este número.

Figura S3: Espectro FTIR de oleylamina. Asteriscos e praças representam os grupos oleyl e amina de oleylamina, respectivamente. Clique aqui para baixar este número.

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Discussion

O protocolo aqui descreve uma síntese fácil de um pote de nanopartículas MnO usando Mn(II) ACAC, DE e OA. Mn(II) ACAC é utilizado como o material inicial para fornecer uma fonte de Mn2+ para a formação de nanopartículas MnO. O material inicial pode ser facilmente substituído para permitir a produção de outras nanopartículas de óxido de metal. Por exemplo, quando o ACAC de ferro (III) é aplicado, nanopartículas Fe3O4 podem ser geradas usando o mesmo equipamento de síntese de nanopartículas e protocolo descrito63. O DE serve como um solvente orgânico ideal para reações de decomposição térmica, pois possui um ponto de ebulição elevado de 295-298 °C. OA é um agente de redução de estabilizador/leve comumente usado, que auxilia na cobertura e coordenação da nucleação e crescimento de nanopartículas de óxido de metal61,,63. Semelhante ao DE, o OA tem um ponto de ebulição elevado de 350 °C para suportar as altas temperaturas de decomposição térmica. As duas observações a seguir podem ser usadas como evidência de geração bem sucedida de nanopartículas MnO durante a síntese: 1) o aparecimento de uma tonalidade verde à mistura de reação durante a decomposição térmica a 280 °C e 2) a formação de uma pelota marrom escura na parte inferior dos tubos centrífugas após centrifugação em hexano e etanol. As nanopartículas resultantes devem ser ainda caracterizadas por TEM, XRD e FTIR para avaliar tamanho/morfologia, composição a granel e composição da superfície, respectivamente.

Durante a síntese de nanopartículas, várias variáveis devem ser notadas e controladas para garantir a produção de nanopartículas uniformes com a fase cristalina MnO. Em primeiro lugar, a razão de todos os materiais iniciais deve permanecer a mesma, como mostramos que as razões decrescente de OA para DE diminuem o tamanho das nanopartículas(Figura 4). Em segundo lugar, a reação deve ser vigorosamente agitada para permitir a dispersão adequada de nanopartículas nucleantes, aquecimento uniforme e redução da variação de tamanho. Em terceiro lugar, como a temperatura desempenha um grande papel no controle do tamanho da nanopartícula de óxido de metaltamanho 47,48,50 e composição de fase47,48,50, é fundamental imergir adequadamente a ponta da sonda de temperatura na mistura de reação enquanto não entra em contato com o vidro do frasco fundo redondo que lerá uma temperatura imprecisa. Em quarto lugar, o fluxo de nitrogênio deve ser alto o suficiente para limpar todo o ar da reação para incentivar a formação da fase cristalina MnO sobre Mn3O4. Como mostrado na Figura 6A,o baixo fluxo de nitrogênio resultará em nanopartículas com uma composição MnO/Mn3O4 mista. O enchimento correto dos borbulhadores de óleo mineral com quantidades crescentes de óleo de silicone do borbulhador esquerdo (1 polegada de óleo) para o bolha médio (1,5 polegadas de óleo) para o borbulhador direito (2 polegadas de óleo) definirá a resistência para que o fluxo de nitrogênio seja menor através da reação (#4 na Figura 1). A taxa borbulhante do borbulhante do borbulhador de óleo mineral médio (por #7,8 na Figura 1) pode ser usada para medir a taxa de nitrogênio que flui através da reação. Finalmente, um estabilizador como o OA deve ser adicionado à mistura de reação para coordenar a nucleação e o crescimento da nanopartícula. Como mostrado na Figura 6B, DE sem OA criou uma pequena quantidade de produto, principalmente de um Mn3O4 (67%) Composição. Este produto também foi observado com forma irregular com nanopartículas agregadas pelo TEM, o que não ocorreu quando o OA estava presente na reação (Figura 6F).

Várias variáveis da reação de decomposição térmica podem ser modificadas para otimizar o tamanho das nanopartículas, morfologia, e composição incluindo o tipo de gás inerte47,48,50, temperatura de reação máxima44,47,48,49, tempo de reação total44,45,,46, e tipos/proporções de compostos químicos iniciais utilizados na reação20,45,,47,,48,50. Salazar-Alvarez et al.50 e Seo et al.48 mostraram que o fluxo de argônio durante a decomposição térmica de Mn(II) forma Mn3O4 em temperaturas de reação máxima mais baixas variando de 150 °C a 200 °C. Ao usar nitrogênio ou ar, Nolis et al.47 obtiveram resultados semelhantes para a decomposição de ACAC Mn(III) onde as nanopartículas Mn3O4 foram produzidas a temperaturas mais baixas (150 oC ou 200 oC) e as nanopartículas MnO foram geradas apenas a temperaturas mais altas (250 °C e 300 °C)47. Temperaturas de reação máxima mais altas e tempos mais longos mantidos na temperatura máxima de reação, também conhecida como tempo de envelhecimento, também foram associadas a um aumento no tamanho das nanopartículas44,45,,46,,47,48,,49. Além disso, a taxa de aquecimento da reação pode impactar o tamanho das nanopartículas. Schladt et al.44 descobriram que o aumento da taxa de aquecimento de 1,5 °C/min até 90 oC/min caiu o tamanho da nanopartícula de 18,9 nm para 6,5 nm, respectivamente. Finalmente, diferentes produtos químicos podem ser adicionados como agentes e estabilizadores redutores em reações de decomposição térmica de manganês; no entanto, OA20,47,48,50 e ácido oleico20,45 são mais comumente utilizados. A razão entre o ácido OA e oleico tem sido comprovada a afetar a química e a forma das nanopartículas MnO sintetizadas. De acordo com Zhang et al.20, OA só resultou na formação de nanopartículas Mn3O4, uma combinação de OA e ácido oleico levou a uma mistura de nanopartículas Mn3O4 e MnO, e o ácido oleico só produziu nanopartículas MnO. Curiosamente, a experiência mostra que as nanopartículas MnO podem ser fabricadas apenas com OA, e que o ácido oleico não é necessário para promover a formação da fase cristalina do MnO. Além disso, o uso de OA por si só fabricou nanopartículas esféricas, enquanto o ácido oleico sozinho gerou nanopartículas em forma de estrela20,64. Claramente, há muita flexibilidade na alteração dos parâmetros de síntese para impactar as propriedades físicas e químicas resultantes das nanopartículas MnO.

Apesar do protocolo detalhado, podem surgir casos que requerem solução de problemas. O parágrafo a seguir detalha algumas questões e soluções comuns. Durante a reação, se a temperatura parece estabilizar em torno de 100 °C, alguma água pode ter vazado para o manto de aquecimento. Inspecione visivelmente a área circundante para vazamento de água do condensador. Não toque diretamente no manto ou no frasco traseiro redondo sem luvas resistentes ao calor, pois elas estarão muito quentes. Se a água for observada, desligue imediatamente o controlador de temperatura, desligue o manto de aquecimento e deixe-o secar durante a noite. Para evitar vazamentos futuros, use um grampo de mangueira de engrenagem de verme intertravado para fixar a tubulação de água no condensador. No caso de o produto desejado ser MnO, mas apenas Mn3O4 é produzido, é importante verificar o fluxo de nitrogênio durante a reação. O bolha do meio deve ter um fluxo constante de bolhas (veja o vídeo para a taxa de borbulhação correta), enquanto o bolhar direito deve ter apenas uma ou duas bolhas se formando nele. O fluxo incorreto de nitrogênio pode ocorrer se os níveis diferenciais de óleo de silicone em cada bolha de óleo mineral não forem mantidos. Verifique os níveis de óleo antes de cada experimento e encha os borbulhantes de acordo com o passo 1.5, se necessário. Durante a coleta de nanopartículas, o protocolo especifica para derramar o supernatante sem perturbar a pelota de nanopartículas. A melhor maneira de descartar o supernante é despejá-lo com um movimento contínuo rápido em vez de lento. No entanto, se a pelota se descolar facilmente do tubo centrífuga, recomenda-se o uso de uma pipeta de transferência para remover o supernascedor. Durante a coleta de nanopartículas e a preparação da grade TEM, a sônica do banho é um passo fundamental. Se as nanopartículas não estiverem reutilizando corretamente, mova o tubo ao redor do sônico do banho de água até que uma área esteja localizada onde a sônica pode ser sentida pela mão segurando o tubo. A pelota de nanopartículas também pode ser visivelmente vista se desintegrando sob forte sônica de banho se o tubo estiver no local correto. Após a ressurreição da nanopartícula, é importante que a grade TEM seja suspensa no ar com pinças inversas em vez de colocada em uma limpeza ou diretamente em uma superfície de banco absorvente. A superfície do banco de limpeza ou absorvente irá tirar a suspensão da nanopartícula da grade TEM antes de secar, resultando em deposição insuficiente de nanopartículas na grade para imagem.

Embora a reação de decomposição térmica seja bastante simples e simples de seguir para sintetizar as nanopartículas MnO, existem algumas limitações associadas ao método. Embora seja possível controlar as propriedades físicas e químicas das nanopartículas até certo ponto, algumas variáveis como temperatura e tempo de envelhecimento impactam tanto o tamanho das nanopartículas quanto a composição de fase simultaneamente. Portanto, é difícil ter sempre um controle independente preciso das propriedades das nanopartículas usando este método. Além disso, o dimensionamento da síntese de nanopartículas triplicando ou quadruplicando as quantidades de materiais iniciais pode fazer com que a reação se torne instável e violenta. O tamanho maior do lote também está associado a uma diminuição do rendimento. Além disso, apesar do armazenamento de nanopartículas MnO dentro de frascos de cintilação tampados envoltos em filme plástico parafina, vimos a oxidação da superfície da nanopartícula para Mn3O4, conforme avaliado pela espectroscopia de fotoeletrons de raios-X. Por fim, as nanopartículas MnO geradas por essa técnica serão hidrofóbicas e tampadas com OA(Figura 7). Outra modificação superficial para transição de nanopartículas para um estado hidrofílico precisará ser aplicada para permitir a suspensão de nanopartículas em mídia aquosa. Vários métodos foram estabelecidos para promover a dispersão de nanopartículas em soluções biológicas, incluindo encapsulamento de nanopartículas dentro de polímeros14,revestimento da superfície da nanopartícula com lipídios52, ou troca de ligantes para substituir o OA na superfície das nanopartículas por ligantes hidrofílicos como o poli (ácido acrílico)20. Para alcançar o encapsulamento das nanopartículas MnO dentro do polímero poli (ácido cótico-coglicólico) (PLGA), siga o protocolo JoVE detalhado de McCall e Sirianni65; As nanopartículas MnO podem ser adicionadas diretamente à solução de polímero PLGA, conforme descrito para drogas hidrofóbicas na etapa 8 da seção de Preparação de Nanopartículas. A distribuição nanocristal MnO dentro das nanopartículas PLGA pode ser avaliada utilizando-se tem e o carregamento de Mn dentro do polímero PLGA pode ser determinado por análise termogravimétrica, conforme mostrado em Bennewitz et al.14.

Embora as nanopartículas MnO possam ser utilizadas para uma grande variedade de aplicações devido às suas propriedades magnéticas, eletrônicas e catalíticas, estamos interessados em aplicar nanopartículas MnO como comutadores, agentes de contraste T1 MRI. Anteriormente, nosso grupo e outros mostraram que as nanopartículas MnO intactas têm contraste de ressonância magnética T1 insignificante (o sinal de ressonância magnética é "OFF") em pH fisiológico 7.4 imitando o sangue14,,15,,16,,17,,18,19. No entanto, o MnO dissolve-se para criar íons Mn2+ substanciais em pH 5 baixo imitando endossóis celulares; Mn2+ liberado coordenará com moléculas de água circundantes para ligar o sinal de ressonância magnética "ON" em pHbaixo 14,,15,,16,,17,,18,,19. As nanopartículas MnO podem ser localizadas para diferentes células de interesse, como células cancerosas, através da adição de peptídeos ou anticorpos direcionados à superfície das nanopartículas51,,66. Aqui, descrevemos a síntese de nanopartículas MnO com diâmetro médio variando de 18,6 nm a 38,8 nm. O controle do tamanho das nanopartículas pode ser útil para melhorar a eficácia do agente de contraste de ressonância magnética. Especificamente, prevê-se que nanopartículas maiores terão mais área de superfície para fixação de ligantes de alvo para aumentar o acúmulo de nanopartículas no local de interesse, como tumores. No entanto, o tamanho geral da nanopartícula com grupos de superfície adicionados deve ser limitado a 50-100 nm para maximizar o acúmulo de tumores67,68. Nanopartículas menores, por outro lado, têm uma maior relação superfície-volume para facilitar a liberação mais rápida de Mn2+ em ambientes ácidos e devem permitir volumes aprimorados de embalagem de nanopartículas dentro de sistemas de entrega polimérica. A síntese de MnO sobre Mn3O4 também deve melhorar o contraste da ressonância magnética, pois mnO tem se mostrado mais rápido que Mn3O4 em soluções ácidas concentradas para gerar mais íons Mn2+ 69. Em resumo, descrevemos um protocolo de decomposição térmica para fabricação de nanopartículas MnO relativamente simples e personalizável para permitir a otimização do design de nanopartículas para uso futuro em aplicações como agentes inteligentes de contraste de ressonância magnética, biosensores, catalisadores, baterias e purificação de água.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelos fundos de startup do Departamento de Engenharia Química e Biomédica da WVU (M.F.B.). Os autores gostariam de agradecer à Dra Marcela Redigolo pela orientação sobre preparação da grade e captura de imagens de nanopartículas com TEM, Dr. Qiang Wang pelo apoio na avaliação dos espectros XRD e FTIR, Dr. John Zondlo e Hunter Snoderly pela programação e integração do controlador de temperatura ao protocolo de síntese de nanopartículas, James Hall por sua ajuda na montagem da síntese de nanopartículas , Alexander Pueschel e Jenna Vito por ajudar na quantificação dos diâmetros das nanopartículas MnO a partir de imagens TEM, e do WVU Shared Research Facility para uso do TEM, XRD e FTIR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chemicals and Gases
Benzyl ether (DE) Acros Organics AC14840-0010 Concentration: 99%, 1 L
Drierite W. A. Hammond Drierite Co. LTD 23001 Drierite 8 mesh, 1 lb
Ethanol Decon Laboratories  2701 200 proof, 4 x 3.7 L
Hexane Macron Fine Chemicals 5189-08 Concentration:  ≥98.5%, 4 L
Hydrochloric acid VWR BDH3030-2.5LPC Concentration: 36.5 - 38.0 % ACS, 2.5 L
Manganese (II) acetyl acetonate (Mn(II)ACAC) Sigma Aldrich 245763-100G 100 g
Nitrogen gas tank Airgas NI R300 Research 5.7 grade nitrogen, size 300 cylinder
Nitrogen regulator Airgas Y11244D580-AG Single stage brass 0-100 psi analytical cylinder regulator CGA-580 with needle outlet
Oleylamine (OA) Sigma Aldrich O7805-500G Concentration: 70%, technical grade, 500 g
Silicone oil Beantown Chemical 221590-100G 100 g
Equipment
Centrifuge Beckman-Coulter Avanti J-E JA-20 fixed-angle aluminum rotor, 8 x 50 mL, 48,400 x g
Hemisphere mantle Ace Glass Inc. 12035-17 115 V, 270 W, 500 mL, temperature up to 450 °C
Hot plate stirrer VWR 97042-642 120 V, 1000 W, 8.3 A, ceramic top
Temperature controller Yokogawa Electric Corporation UP351
Temperature probe Omega KMQXL-040G-12 Immersion probe, temperature up to 1335 °C
Vacuum oven Fisher Scientific 282A 120 V, 1800 W, temperature up to 280 °C
Vortex mixer Fisher Scientific 02-215-365 120 V, 50/60 Hz, 150 W
Water bath sonicator Fisher Scientific FS30H Ultrasonic power 130 W, 3.7 L tank
Tools and Materials
Dumont tweezer Electron Microscopy Sciences 72703D Style 5/45, Dumoxel, 109 mm, for picking up TEM grids
Dumont reverse tweezer Ted Pella 5748 Style N2a, 118 mm, NM-SS, self-closing, holding TEM grids in place for sample preparation
Mortar and pestle Amazon BS0007 BIPEE agate mortar and pestle, 70 X 60 X 15 mm labware
Nalgene™ Oak Ridge tubes ThermoFisher Scientific 3139-0050 Polypropylene copolymer, 50,000 x g, 50 mL, pack of 10
Scintillation vials Fisher Scientific 03-337-4 20 mL vials with white caps, case of 500
TEM grids Ted Pella 01813-F Carbon Type-B, 300 mesh, copper, pack of 50
Glassware Setup
4-neck round bottom flask Chemglass Life Sciences CG-1534-01 24/40 joint, 500 mL, #7 chem thread for thermometers
6-port vacuum manifold Chemglass Life Sciences CG-4430-02 480 nm, 6 ports, 4 mm PTFE stopcocks
Adapter Chemglass Life Sciences CG-1014-01 24/40 inner joint, 90°
Condenser Chemglass Life Sciences CG-1216-03 24/40 joint, 365 mm, 250 mm jacket length
Drierite 26800 drying column Cole-Parmer  EW-07193-00 200 L/hr, 90 psi
Funnel Chemglass Life Sciences CG-1720-L-02 24/40 joint, 100 powder funnel, 195 mm OAL
Interlocked worm gear hose clamp Grainger 16P292 1/2" wide stainless steel clamp, 3/8" to 7/8" diameter, to secure condenser tubing, 10 pack 
Keck clips Kemtech America Inc CS002440 24/40 joint
Metal claw clamp Fisher Scientific 05-769-7Q 22cm, three-prong extension clamps
Metal claw clamp holder Fisher Scientific 05-754Q Clamp regular holder
Mineral oil bubbler Kemtech America Inc B257040 185 mm
Rotovap trap Chemglass Life Sciences CG-1319-02 24/40 joints, 100 mL, self washing rotary evaporator
Rubber stopper Chemglass Life Sciences CG-3022-98 24/40 joints, red rubber
Tubing for air/water  McMaster-Carr 6516T21 Clear Tygon PVC for air/water, B-44-3, 1/4" ID, 1/16" wall, 25 ft
Tubing for air/water  McMaster-Carr 6516T26 Clear Tygon PVC for air/water, B-44-3, 3/8" ID, 1/16" wall, 25 ft
Tubing for chemicals McMaster-Carr 5155T34 Clear Tygon PVC for chemicals, E-3603, 3/8" ID, 1/16" wall, 50 ft
Analysis Programs
XRD analysis program Malvern Panalytical N/A X'Pert HighScore Plus
FTIR analysis program Varian, Inc. N/A Varian Resolutions Pro

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Síntese de Nanopartículas de Óxido de Manganês por Decomposição Térmica de Acetilado de Manganês(II) Acetillacetonato
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Martinez de la Torre, C., Bennewitz, M. F. Manganese Oxide Nanoparticle Synthesis by Thermal Decomposition of Manganese(II) Acetylacetonate. J. Vis. Exp. (160), e61572, doi:10.3791/61572 (2020).

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