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Bioengineering

विच्छेदित प्रत्यारोपण ऊतकों के प्रतिरक्षा समारोह विश्लेषण के लिए उच्च-आयामीता प्रवाह साइटोमेट्री

Published: September 15, 2021 doi: 10.3791/61767
Automatic Translation
1, 1
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

Summary

विच्छेदित प्रत्यारोपण से कोशिकाओं का अलगाव और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा उनके लक्षण वर्णन प्रत्यारोपण के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के पैटर्न को समझने में महत्वपूर्ण योगदान दे सकते हैं। यह पेपर विच्छेदित प्रत्यारोपण से कोशिकाओं के अलगाव और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उनके धुंधला होने के लिए एक सटीक विधि का वर्णन करता है।

Abstract

किसी व्यक्ति में प्रयोगशाला में विकसित ऊतक या चिकित्सा उपकरण को प्रत्यारोपित करने की सफलता प्राप्तकर्ता मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के अधीन है। एक इम्प्लांट को एक विदेशी शरीर के रूप में मानते हुए, एक शत्रुतापूर्ण और अनियमित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप प्रत्यारोपण की अस्वीकृति हो सकती है, जबकि एक विनियमित प्रतिक्रिया और होमियोस्टैसिस को पुनः प्राप्त करने से इसकी स्वीकृति हो सकती है। विवो या एक्स विवो सेटिंग्स में विच्छेदित प्रत्यारोपण के माइक्रोएन्वायरमेंट का विश्लेषण करने से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के पैटर्न को समझने में मदद मिल सकती है, जो अंततः बायोमटेरियल्स की नई पीढ़ियों को विकसित करने में मदद कर सकती है। फ्लो साइटोमेट्री प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके सेल सतह मार्करों के आधार पर उनके उप-समूहों को चिह्नित करने के लिए एक प्रसिद्ध तकनीक है। यह समीक्षा विच्छेदित प्रत्यारोपण ऊतक से समान सेल निलंबन के अलगाव के लिए सेल छन्नी के माध्यम से मैनुअल डाइकिंग, एंजाइमेटिक पाचन और निस्पंदन पर आधारित एक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है। इसके अलावा, फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इन पृथक कोशिकाओं को चिह्नित करने और निर्धारित करने के लिए प्रारंभिक साइटोमीटर सेटिंग्स के चरणों के साथ-साथ एक मल्टीकलर फ्लो साइटोमेट्री स्टेनिंग प्रोटोकॉल को समझाया गया है।

Introduction

चिकित्सा के क्षेत्र में प्रगति ने क्षतिग्रस्त ऊतक 1,2 के कार्य या पुन: विकास का समर्थन करने के लिए प्रत्यारोपित सामग्रियों के लगातार उपयोग को जन्म दिया है। इनमें पेसमेकर, पुनर्निर्माण कॉस्मेटिक प्रत्यारोपण और हड्डी फ्रैक्चर निर्धारण 3,4 के लिए उपयोग किए जाने वाले आर्थोपेडिक प्लेट जैसे उपकरण शामिल हैं। हालांकि, इन प्रत्यारोपणों को बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली सामग्री और जिन स्थानों में उन्हें प्रत्यारोपित किया जाता है, वेइन प्रत्यारोपणों की सफलता को निर्धारित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। विदेशी निकायों के रूप में, ये प्रत्यारोपण मेजबान से एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया उत्पन्न कर सकते हैं जो या तो अस्वीकृतिया सहिष्णुता का कारण बन सकता है। इस कारक ने बायोमटेरियल अनुसंधान को उन सामग्रियों को उत्पन्न करने के लिए प्रेरित किया है जो आरोपण 9,10,11,12 के बाद वांछित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को आकर्षित कर सकते हैं।

पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक आवश्यक आवश्यकता है, जहां क्षतिग्रस्त ऊतक या अंग 13,14,15,16 के प्रतिस्थापन के लिए एक प्रयोगशाला में एक बायोमटेरियल कंकाल (मचान) के आसपास एक ऊतक या एक अंग उगाया जाता है। पुनर्योजी चिकित्सा में, लक्ष्य कोशिकाओं, संकेतों और मचानों के उपयोग के माध्यम से लापता या क्षतिग्रस्त ऊतक को प्रतिस्थापित करना है, जिनमें से प्रत्येक कोप्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं द्वारा बहुत संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, यहां तक कि जब प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की कमी वांछित होती है, तो यह एक नियामक प्रोफ़ाइल की उपस्थिति के बजाय प्रतिरक्षा गतिविधि की अनुपस्थिति बहुत कम होती है जो वांछितहै। फ्लो साइटोमेट्री जैसी तकनीकें कोटिंग इम्प्लांट उपकरणों के लिए उपयोग किए जाने वाले विभिन्न बायोमैटेरियल्स के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के पैटर्न को चिह्नित करने याऊतक इंजीनियरिंग के लिए मचान विकसित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकती हैं।

यह जानकारी, बदले में, अंततः प्रत्यारोपण के लिए बायोमैटेरियल्स विकसित करने में मदद करेगी जिसे प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा अच्छी तरह से सहन किया जा सकता है या मचानों को विकसित करने में जो ऊतक इंजीनियरिंग में रचनात्मक भूमिका निभा सकते हैं। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए नमूनों की उचित तैयारी प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग20,21 के माध्यम से प्रतिरक्षा लक्षण वर्णन में गलत परिणामों से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। इसलिए, यह समीक्षा एक विस्तृत पद्धति प्रस्तुत करती है जिसका उपयोग मचान ऊतक से कोशिकाओं के अलगाव, सेल निलंबन को धुंधला करने और फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

नोट: चित्रा 1 फ्लो साइटोमेट्री प्रोटोकॉल का अवलोकन देता है।

1) अभिकर्मक तैयारी

  1. एंजाइमों को पतला करने और ऊतक संवर्धन के लिए मीडिया तैयार करें।
    1. आरपीएमआई माध्यम के 500 एमएल में 4-(2-हाइड्रॉक्सीथाइल)-1-पिपेराज़िनेथेनसल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस) बफर समाधान के 5 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से हिलाएं। आगे के उपयोग तक माध्यम को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एंजाइम समाधान की मात्रा की गणना करें।
    नोट: एंजाइम समाधान की मात्रा एंजाइम (कोलेजनेस और डीनेस आई) युक्त माध्यम की मात्रा है जो 6-वेल प्लेटों में कटे हुए ऊतक को पचाने के लिए आवश्यक होगी; यह नमूनों की संख्या पर निर्भर करता है।
    1. आवश्यक मात्रा की गणना करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें:
      (पचाने वाले नमूनों की संख्या) 10 एमएम एचईपीईएस बफर के साथ सीरम मुक्त आरपीएमआई के 5 एमएल ×
      नोट: उदाहरण के लिए, विच्छेदित प्लीहा के 0.1 से 0.3 ग्राम के लिए, एंजाइम समाधान तैयार करने के लिए 5 एमएल माध्यम का उपयोग करें। इस पांडुलिपि में वर्णित एंजाइमेटिक पाचन प्रोटोकॉल मुख्य रूप से चूहों से विच्छेदित नरम ऊतकों (0.1 से 1 ग्राम तक) के लिए है जिसमें मस्तिष्क, गुर्दे, त्वचा, यकृत, फेफड़े, प्लीहा, मांसपेशियां, साथ ही सिंथेटिक सामग्री या बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन से बने चमड़े के नीचे के प्रत्यारोपण के आसपास कैप्सूल शामिल हैं। कठोर कार्टिलाजिनस ऊतकों को पचाने के लिए विभिन्न स्थितियों और पाचन एंजाइमों की मात्रा की आवश्यकता हो सकती है, जिसे केवल अनुकूलन द्वारा पता लगाया जा सकता है।
    2. एंजाइम समाधान के लिए आवश्यक कोलेजनेज और डीनेस की मात्रा की गणना करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, 0.25 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस और 0.2 मिलीग्राम / एमएल डीनेस आई का उपयोग किया गया था। कोलेजनेस और डीनेस के लिए आवश्यक कामकाजी सांद्रता विभिन्न प्रकार के ऊतकों के लिए भिन्न होसकती है।
  3. फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) के 999 μL में व्यवहार्यता डाई ( सामग्री की तालिका देखें) के 1 μL को जोड़कर 1: 1000 व्यवहार्यता डाई समाधान तैयार करें और घोल को भंवर करें। समाधान को आगे के उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
  4. पीबीएस के 100 एमएल में 1 ग्राम गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) जोड़कर धुंधला बफर तैयार करें, और बीएसए के पूरी तरह से भंग होने तक घोल को भंवर करें। आगे उपयोग तक समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2) एंजाइमेटिक पाचन प्लेटों की स्थापना

  1. प्रत्येक कुएं में 70 μm सेल छन्नी के साथ एक 6-वेल प्लेट सेट करें। प्रत्येक कुएं में चरण 1.1.1 से तैयार माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
  2. कोलेजनेस और डीनेस आई (चरण 1.2.2) की गणना की गई मात्रा को निलंबित करने के लिए शेष मीडिया (2 एमएल / वेल) को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर या पानी के स्नान में स्टोर करें।

3) कोशिकाओं का अलगाव

  1. विच्छेदित प्रत्यारोपण / ऊतक को प्लेटों में रखें, और कैंची का उपयोग करके बारीक पासा करें। वैकल्पिक रूप से, ऊतक डिस्सोसिएटर या हैंड-हेल्ड होमोजिनाइज़र का उपयोग करके एक यांत्रिक व्यवधान विधि का उपयोग करें। ल्यूकोसाइट्स की उच्च संख्या के कारण, प्रत्येक रन में धुंधला नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए प्लीहा को विच्छेदित करें।
    नोट: चूंकि कुछ सामग्रियां फाइब्रोसिस के उच्च स्तर को प्रेरित करती हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल अत्यधिक फाइब्रोटिक और न्यूनतम फाइब्रोटिक सामग्री दोनों के लिए लागू होता है। हालांकि, धुंधला होने से पहले पाचन के बाद सेल उपज और व्यवहार्यता दोनों के लिए प्रत्येक प्रसंस्करण विधि का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। विच्छेदन के दौरान परिधीय रक्त संदूषण से बचें।
  2. शेष आरपीएमआई (2 एमएल) में कोलेजनेस और डीनेस आई (चरण 1.2.2 में गणना की गई मात्रा) जोड़ें जिसे 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया गया है। प्रत्येक कुएं में पूर्ण एंजाइम समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस और 100 आरपीएम पर 45 मिनट के लिए इनक्यूबेट शेकर में रखें।
    नोट: प्लेटों को ढेर करते समय सतर्क रहें क्योंकि यह उचित गर्मी हस्तांतरण को रोक सकता है।
  4. इस बीच, कैंची के साथ 1000 μL टिप के अंत से 3-4 मिमी काटकर एक सस्पेंशन-डिस्पेंसिंग टिप तैयार करें। इनक्यूबेशन के बाद, कटे हुए सिरे का उपयोग करके इसे अच्छी तरह से मिलाने के लिए कुओं में सस्पेंशन को ऊपर और नीचे पिपेट करें। सेल स्ट्रेनर को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर रखें और सेल स्ट्रेनर के माध्यम से पचे हुए घोल को पारित करें।
    नोट: 70 μm सेल छन्नी प्रत्यारोपित बायोमटेरियल से कोशिकाओं को अलग करने के लिए पर्याप्त है, जैसे कि एल्गिनेट। यदि अधिक शुद्धता की आवश्यकता होती है, तो ल्यूकोसाइट्स की समृद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए घनत्व ढाल पृथक्करण जैसी प्रक्रियाओं का उपयोग करें।
  5. कुओं को 1x PBS घोल से धोएं, और छन्नी के माध्यम से कुल्ला मात्रा को स्थानांतरित करें, इसके बाद 1x PBS घोल के साथ छन्नी के वॉश को जोड़ें जब तक कि ट्यूब में मात्रा 50 एमएल तक न पहुंच जाए।
    नोट: 1x PBS को कमरे के तापमान पर होना चाहिए ताकि पाचन की चिपचिपाहट में किसी भी वृद्धि को रोका जा सके और सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान सेल पेलेटिंग की अनुमति मिल सके।
  6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें। सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद, गोली को परेशान किए बिना एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाले को सावधानी पूर्वक एस्पिरेट करें। 1x PBS के 1000 μL में गोली को फिर से निलंबित करें, और निलंबन को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. सेल सस्पेंशन के 10 μL को ट्राइपैन ब्लू के 10 μL के साथ मिलाएं, और एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग करके या माइक्रोस्कोप के तहत पारंपरिक विधि के माध्यम से गिनती करने के लिए हेमोसाइटोमीटर पर कोशिकाओं की गिनती के लिए काउंटिंग चैंबर स्लाइड पर निलंबन लोड करें। वैकल्पिक रूप से, फ्लो साइटोमेट्री सेल काउंटिंग बीड्स का उपयोग करें।

4) फ्लो साइटोमेट्री के लिए धुंधलापन

  1. 45 नमूने, फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण, मुआवजा नियंत्रण और पूरी तरह से सना हुआ प्लीहा नमूना नियंत्रण के साथ 14-रंग प्रयोग के लिए एक उदाहरण प्लेट लेआउट के लिए चित्रा 2 देखें। कोशिकाओं की कुल संख्या का अनुमान लगाने के बाद, प्रत्येक नमूने के लिए 1 × 10 6 कोशिकाओं को धुंधला करने के लिए आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना करें, और प्रत्येक मुआवजे और एफएमओ नियंत्रण के लिए 0.5 × 106 कोशिकाएं। सेल सस्पेंशन की आवश्यक मात्रा को वी-बॉटम 96-वेल प्लेट के कुओं में वितरित करें, और 1x PBS के साथ वॉल्यूम को 100 μL तक बनाएं।
    नोट: एक उदाहरण के रूप में, यदि चरण 3.6 पर प्राप्त सेल निलंबन के 1000 μL में 40 × 10 6 कोशिकाएं होती हैं, तो 1 × 106 कोशिकाओं के लिए, 1000/40 × 106 = 25 μL सेल निलंबन की आवश्यकता होगी।
  2. प्लेट को 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें, सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और फिर व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए नमूना कुओं में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें और व्यवहार्यता डाई के 1: 1000 समाधान के 100 μL के साथ एक मुआवजा नियंत्रण अच्छी तरह से ( सामग्री की तालिका देखें)।
  3. अन्य क्षतिपूर्ति कुओं के साथ-साथ एफएमओ और बिना दाग वाले कुओं में कोशिकाओं के लिए, उन्हें 1x पीबीएस के 100 μL के साथ फिर से निलंबित करें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. इस बीच, नमूना और एफएमओ नियंत्रण को धुंधला करने के लिए एक सतह एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें: 50 μL प्रति नमूना या एफएमओ। एंटीबॉडी कॉकटेल के एक उदाहरण के लिए तालिका 1 देखें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में 1x PBS के 100 μl जोड़ें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × g पर स्पिन करें।
  7. सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें और 200 μL धुंधला बफर (1x PBS + 1% BSA) में पुन: निलंबित करें; 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  8. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और मुआवजे, एफएमओ और बिना दाग वाले कुओं में कोशिकाओं को 1x पीबीएस के 50 μL के साथ फिर से निलंबित करें। संबंधित नमूना कुओं और एफएमओ कुओं में एंटीबॉडी कॉकटेल के 50 μL जोड़ें। विभिन्न मुआवजा कुओं में संबंधित एंटीबॉडी जोड़ें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 45 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक कुएं में 150 μL धुंधला बफर जोड़ें, और सेल निलंबन को 300 × ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।
  10. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, कोशिकाओं को 200 μL धुंधला बफर के साथ फिर से निलंबित करें, और सेल निलंबन को 300 × ग्राम पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  11. यदि निर्धारण के बिना नमूनों का विश्लेषण किया जाता है, तो उन्हें धुंधला बफर के 200 μL में पुन: निलंबित करें, और साइटोमीटर सेटअप और नमूना विश्लेषण पर अनुभाग 6 पर आगे बढ़ें। यदि कोशिकाओं को ठीक किया जाता है, तो धोने के बाद सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें, और 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जैसे फिक्सेटिव के 100 μL जोड़ें। यदि इंट्रासेल्युलर मार्करों के लिए धुंधला हो रहा है, तो इंट्रासेल्युलर धुंधलापन पर खंड 5 पर आगे बढ़ें, और कोशिकाओं को ठीक करें और प्रतिरक्षित करें ( सामग्री की तालिका देखें)। 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: चूंकि निर्धारण कुछ फ्लोरोफोरे की प्रतिदीप्ति तीव्रता को प्रभावित कर सकता है, निर्धारण के साथ और बिना प्रत्येक पैनल का मूल्यांकन करें।
  12. इनक्यूबेशन के बाद, 1x PBS के 100 μL जोड़ें, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें। सतह पर तैरनेवाला को एस्पिरेट करें, 1x पीबीएस में पुन: निलंबित करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  13. 200 μL धुंधला बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

5) इंट्रासेल्युलर धुंधलापन

  1. इंट्रासेल्युलर मार्करों के लिए निर्धारण और परमेबिलाइजेशन के लिए चरण 4.11 से जारी रखते हुए, उपयुक्त बफर के 100 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और फिक्सेटिव-परमेबिलाइजिंग एजेंट समाधान के 200 μL में छर्रों को फिर से निलंबित करें; 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 350 × ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और उपयुक्त बफर में पतला इंट्रासेल्युलर एंटीबॉडी के साथ छर्रों को फिर से निलंबित करें।
    नोट: एंटीबॉडी प्रकार और कमजोर पड़ने लक्ष्य कोशिकाओं पर निर्भर करेगा। उदाहरण के लिए, एक आम इंट्रासेल्युलर मार्कर नियामक टी कोशिकाओं के लिए फोर्कहेड बॉक्स पी 3 है, जिसका उपयोग अक्सर 1: 100 कमजोर पड़ने पर किया जाता है।
  2. सेल सस्पेंशन को 4 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, उपयुक्त बफर के 150 μL जोड़ें, और निलंबन को 350 × g पर 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रीफ्यूज करें।
  3. सतह पर तैरने वाले को एस्पिरेट करें, और कोशिकाओं को 200 μL धुंधला बफर में फिर से निलंबित करें, इसके बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन करें। प्रवाह साइटोमेट्रिक विश्लेषण के लिए 200 μL धुंधला बफर में कोशिकाओं को एस्पिरेट और फिर से निलंबित करें।

6) साइटोमीटर और मुआवजा सेटअप

  1. नमूने चलाने से तुरंत पहले, सेल-आधारित मुआवजे के विपरीत मोती-आधारित मुआवजे का उपयोग करते समय मुआवजा मोती ( सामग्री की तालिका देखें) तैयार करें।
    1. प्रत्येक फ्लोरोक्रोम-संयुग्मित एंटीबॉडी के लिए अलग-अलग माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब लेबल करें, और 1x PBS के 100 μL जोड़ें, इसके बाद एंटी-माउस नकारात्मक नियंत्रण मुआवजा मोतियों की एक पूरी बूंद और प्रत्येक ट्यूब में सकारात्मक नियंत्रण मुआवजा मोतियों की एक बूंद जोड़ें। प्रत्येक अलग ट्यूब में उपयुक्त एंटीबॉडी का 1 μL जोड़ें। अधिग्रहण से पहले 5 मिनट के लिए भंवर और इनक्यूबेट करें।
      नोट: चूंकि कुछ रंग, जैसे कि बीयूवी 737, मोतियों से बंधे नहीं हो सकते हैं, सेल-आधारित नियंत्रण का उपयोग करें।
  2. ट्रैकिंग बीड्स के साथ साइटोमीटर सेटअप चलाकर प्रत्येक प्रयोग से पहले फ्लो साइटोमीटर को कैलिब्रेट करें, और प्रत्येक प्रयोग के लिए फ्लो साइटोमीटर सेटिंग्स बनाए रखें।
  3. नमूने का विश्लेषण करने से पहले, एक साइड स्कैटर (एसएससी) बनाम फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) प्लॉट पर सेल आबादी को समायोजित करने के लिए एक बिना दाग वाला नमूना चलाकर फ्लो साइटोमीटर को समायोजित करें ताकि सेल आबादी प्लॉट के केंद्र में आ जाए और ऑफ-स्केल न हो।
  4. एफएससी और एसएससी के लिए वोल्टेज को समायोजित करने के लिए और प्रत्येक चैनल के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोई भी घटना प्रत्येक चैनल के लघुगणकीय पैमाने के बाहर नहीं आती है, दाग वाले नमूने को संक्षेप में चलाएं। प्रत्येक मुआवजा नियंत्रण के लिए रिकॉर्ड 5,000 घटनाएं हैं, इसके बाद सकारात्मक और नकारात्मक आबादी की गणना की जाती है। मुआवजा मैट्रिक्स की गणना करें और फिर नमूने चलाएं, रुचि की आबादी के लिए कम से कम 1,000 घटनाओं को इकट्ठा करें।
    नोट: बड़े रंग के पैनलों पर मुआवजे को सत्यापित किया जाना चाहिए, क्योंकि स्वचालित मुआवजे से अधिक या कम मुआवजे का खतरा हो सकता है। प्रत्येक पैरामीटर को ओवर-या अंडर-कंपनसेशन के संकेतों की निगरानी के लिए हर दूसरे पैरामीटर के खिलाफ ग्राफ किया जाना चाहिए, और प्रत्येक एकल-रंग नियंत्रण का मूल्यांकन किया जाना चाहिए। बड़े रंग के प्रयोगों का जटिल मुआवजा एक सहयोगी या व्यापक प्रवाह साइटोमेट्री अनुभव के साथ एक कोर सुविधा की सहायता से किया जाना चाहिए। वर्णक्रमीय साइटोमीटर जैसे नए प्रकार के प्रवाह साइटोमीटर वर्णक्रमीय अनमिक्सिंग नामक प्रक्रिया के माध्यम से फ्लोरोफोरे के पूर्ण स्पेक्ट्रम का उपयोग करते हैं,जो अकेले मानक मुआवजे की तुलना में फ्लोरोसेंट ओवरलैप का एक क्लीनर अंतर उत्पन्न कर सकता है।

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Representative Results

प्रतिरक्षा विश्लेषण के लिए फ्लो साइटोमेट्री पैनलों के विकास की प्रक्रिया अक्सर मौजूदा डेटा और क्षेत्र में साहित्य के परिणामों की तुलना पर निर्भर करती है। फ्लो साइटोमेट्री में आबादी कैसे मौजूद हो सकती है, इसका ज्ञान डेटा की उचित व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है। भले ही, आबादी और सेल प्रकार विभिन्न ऊतकों में अलग-अलग दिखाई दे सकते हैं, इसलिए कुछ परिवर्तनशीलता की उम्मीद की जानी चाहिए। अच्छी तरह से परिभाषित नियंत्रण ऊतकों के संदर्भ में, इस तरह के धुंधला अनुकूलन का मूल्यांकन ज्ञात ऊतक के खिलाफ किया जा सकता है जिसमें अच्छी तरह से शोध ति सेल प्रकार हैं। चित्रा 3 नियंत्रण माउस ऊतक पर 14-रंग एफएसीएस के परिणाम दिखाता है। इस मामले में, प्लीहा का उपयोग उन सभी मार्करों की पहचान करने के लिए किया गया था जिनके लिए दाग थे, और यह दिखाने के लिए कि धुंधला तकनीकी रूप से कार्यात्मक था। इस बिंदु से, अज्ञात परिस्थितियों में परीक्षण करना आसान हो गया, फ्लोरोफोरे चयन के बारे में आश्वस्त रहें, और विभिन्न ऊतक स्रोतों के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन करें। चित्रा 3 भी एक मुराइन प्लीहा19 से अलग विभिन्न सेल प्रकारों की आबादी को दर्शाता है।

यहां, कई स्पष्ट आबादी, जैसे कि Ly6G + न्यूट्रोफिल, और विभिन्न मोनोसाइट वर्गों पर Ly6C के विभिन्न अभिव्यक्ति स्तर देखे जा सकते हैं। सीडी 11 सीहायएमएचसीआईआई + डेंड्राइटिक कोशिकाएं आसानी से स्पष्ट थीं जब सीडी 11 बी के खिलाफ मैक्रोफेज और अन्य माइलॉयड वंश कोशिकाओं जैसे न्यूट्रोफिल और मोनोसाइट्स को नियंत्रित करने के लिए गेट किया गया था। सीडी 206 + सीडी 86 + डेंड्राइटिक कोशिकाओं का एक उप-समूह इस सीडी 11 सी + आबादी पर ध्यान केंद्रित करके पाया जा सकता है। सीडी 86 और सीडी 206 को फेनोटाइप माइलॉयड कोशिकाओं में शामिल किया गया था क्योंकि वे अधिक एम 1-जैसे (सीडी 86 एचआई) बनाम अधिक एम 2-जैसे (सीडी 206 एचआई) ध्रुवीकरण अवस्था में थे। एफ 4/80 ने अभिव्यक्ति की एक ढाल दिखाई, जिसे आमतौर पर विभिन्न मैक्रोफेज आबादी में देखा जा सकता है। सिगलेक-एफ दो आबादी, एफ 4/80+ और एफ 4/80-में मौजूद था, जो क्रमशः मैक्रोफेज उप-समूह और ईोसिनोफिल के अनुरूप था। यद्यपि सेल प्रकारों के ये पदनाम किए जा सकते हैं, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि विभिन्न मार्करों को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को अधिक द्विआधारी वर्गीकरण के विपरीत कार्यात्मक तरीके से देखा जाना चाहिए। यह स्वीकार करना कि जिसे मैक्रोफेज माना जाता है, वह प्रत्यारोपण के आसपास प्लीहा और विदेशी शरीर कैप्सूल में भिन्न हो सकता है, महत्वपूर्ण है और परिणामों की संभावित गलत व्याख्या से बचता है।

Figure 1
चित्रा 1: फ्लो साइटोमेट्री धुंधला प्रोटोकॉल का अवलोकन। तैयारी में रुचि के ऊतक का विच्छेदन शामिल है, जिसके बाद 1) मैनुअल डाइसिंग, 2) एंजाइमेटिक पाचन, 3) सेल तनाव और धोना, और 4) फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण के बाद फ्लोरोसेंटली टैग किए गए एंटीबॉडी के साथ धुंधला होना। चित्रण बायोरेंडर के साथ बनाया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो साइटोमेट्री धुंधला होने के लिए एक प्लेट लेआउट का उदाहरण। इस लेआउट में नमूने, फ्लोरेसेंस माइनस वन (एफएमओ) नियंत्रण, मुआवजा नियंत्रण और एक नियंत्रण ऊतक नमूना (प्लीहा) शामिल हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: नियंत्रण माउस ऊतक पर 14-रंग एफएसीएस धुंधला होने से प्रतिनिधि परिणाम। डेटा डिस्प्ले के लिए हैंड-गेटिंग और स्वचालित टी-स्टोकेस्टिक पड़ोसी-एम्बेडिंग (टी-एसएनई) क्लस्टरिंग एल्गोरिदम के उदाहरणों के साथ मुराइन प्लीहा कोशिकाओं के माइलॉयड सेल फेनोटाइपिंग। यह आंकड़ा सैडलर और एलिसेफ19 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। संक्षेप: एफएसीएस = प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग; एसएससी = साइड स्कैटर; सीडी = भेदभाव का समूह; पीई = फाइकोएरिथ्रिन; सीसीआर = सी-सी केमोकाइन रिसेप्टर प्रकार; एमएचसी = प्रमुख हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स; पेरसीपी = पेरिडिनिन क्लोरोफिल प्रोटीन कॉम्प्लेक्स। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अभिकर्मक/एंटीबॉडी μL प्रति नमूना
CD86 BUV395 0.25
CD45 BUV737 0.5
CD8a BV421 0.25
Ly6g BV510 0.125
Siglec F BV605 0.25
MHCII BV786 0.25
Ly6c AF488 0.125
CD11c PerCP/Cy5.5 0.2
CD206 PE 0.2
CD197 PE / Dazzle594 0.125
F4/80 PE/Cy7 0.25
CD200R3 एपीसी 0.25
CD11b AF700 0.25
एफसी ब्लॉक 1
बीडी ब्रिलिएंट स्टेन बफर प्लस 10
1x PBS 35.975
कुल मात्रा: 50 μL

तालिका 1: सतह एंटीबॉडी कॉकटेल का उदाहरण। माउस ऊतक के माइलॉयड फेनोटाइपिंग के लिए एक उदाहरण एंटीबॉडी कॉकटेल।

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Discussion

यह समीक्षा एक समान सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए बायोमटेरियल प्रत्यारोपण से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक विस्तृत पद्धति का वर्णन करती है। इसके अलावा, इष्टतम परिणामों के लिए फ्लो साइटोमीटर को कॉन्फ़िगर करने के चरणों के साथ-साथ मल्टीकलर फ्लो साइटोमेट्री के लिए सेल सस्पेंशन को धुंधला करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किया गया है। सेल अलगाव विधियों में कई चरण शामिल हो सकते हैं, अक्सर ऊतक में बाह्य मैट्रिक्स को अलग करने और ऊतक से अलग-अलग कोशिकाओं को मुक्त करने के लिए सेल-सेल जंक्शनों को बाधित करने के लिए प्रोटियोलिटिक एंजाइमों के साथ एंजाइमेटिक पाचन के बाद मैनुअल ऊतक विच्छेदन का उपयोग किया जाता है। पाचन के बाद, शेष मलबे को हटाने और एकल-सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए सेल तनाव जैसे आगे के प्रसंस्करण की आवश्यकता होती है। कुछ नमूने जिनके पास मलबे या अन्य सेल प्रकारों (जैसे ट्यूमर) के उच्च स्तर हैं, उन्हें घनत्व पृथक्करण मीडिया23 के उपयोग के माध्यम से अधिक गहन सफाई की आवश्यकता हो सकती है। उचित नमूना सफाई के बिना, मलबे या अन्य सेल आबादी के कारण डेटा विषम हो सकता है। अतिरिक्त मलबे से साइटोमीटर फ्लुइडिक्स का पूर्ण या आंशिक जमाव भी हो सकता है।

जबकि प्रतिरक्षा कोशिकाओं का लक्षण वर्णन अन्य तरीकों से भी किया जा सकता है, जैसे कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी, सेल साइटोस्पिन तैयारी पर एक अंतर सेल गिनती करके, फ्लो साइटोमेट्री सेल सतह मार्करों के आधार पर कोशिकाओं का अधिक सटीक लक्षण वर्णन प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, फ्लो साइटोमेट्री डेटा अधिक सटीक हैं क्योंकि वे निलंबन में लाखों कोशिकाओं को चिह्नित और निर्धारित कर सकते हैं और केवल 400कोशिकाओं के आधार पर मैनुअल अंतर गिनती की तुलना में बहुत तेजी से अलग-अलग सेल उपसमुच्चय के सटीक अनुमान प्रदान कर सकते हैं। इस पेपर में दिखाए गए परिणाम साइटोमीटर कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा और सैद्धांतिक ओवरलैप की तुलना करने के लिए कई ऑनलाइन उपकरणों के उपयोग से किए गए एंटीबॉडी चयन के साथ एक पुनरावृत्ति पैनल डिजाइन पर भरोसा करते हैं। बड़े रंग प्रयोगों को डिजाइन करते समय, एक छोटे रंग पैनल के अलावा एक साफ स्लेट से शुरू करना सबसे अच्छा है, ताकि एंटीजन बहुतायत, फ्लोरोफोरे चमक और वर्णक्रमीय ओवरलैप पर पूरी तरह से विचार किया जा सके।

विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अलग-अलग उपसमुच्चय का विश्लेषण करने वाले अध्ययनों में फ्लो साइटोमेट्री करने के लिए पर्याप्त संख्या में समग्र कोशिकाओं की आवश्यकता होती है, क्योंकि कोशिकाओं की एक छोटी संख्या होने से सेल सॉर्टिंग या सटीक अनुमान प्राप्त करके उनके अलगाव में एक महत्वपूर्ण चुनौती पैदा हो सकती है। न्यूट्रोफिल जैसे विशिष्ट प्रतिरक्षा कोशिकाओं को अलग करने और समृद्ध करने के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग करके इस चुनौती को कम अवधि में औरसीमित धोने के साथ दूर किया जा सकता है। फेफड़ों जैसे अंगों के ऊतकों से पृथक कोशिकाओं में महत्वपूर्ण मात्रा में बलगम हो सकता है, जो सेल निलंबन को "चिपचिपा" बना सकता है और इसके परिणामस्वरूप फ्लो साइटोमेट्री26,27 के दौरान दोहरी घटनाओं की संख्या बढ़ सकती है। धुंधला बफर में 2 एमएम एथिलीनडायमाइन टेट्राएसिटिक एसिड जैसे चेलटिंग एजेंटों को जोड़ने से ऐसे नमूनों में कोशिकाओं के एकत्रीकरण को रोका जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, बफर की बढ़ी हुई मात्रा में कोशिकाओं को निलंबित करने से सेल-सेल इंटरैक्शन को कम करके दोहरे निर्माण को भी सीमित किया जा सकता है। धुंधला प्रक्रियाओं को प्रत्येक अलग-अलग ऊतक, धुंधला प्रोटोकॉल, फ्लो साइटोमीटर और एंटीबॉडी पैनल के लिए पूरी तरह से अनुकूलित किया जाना चाहिए। कुछ फ्लोरोफोरफिक्सेटिव के प्रति अधिक संवेदनशील हो सकते हैं, कुछ सेल प्रकार विभिन्न सेल अलगाव और प्रसंस्करण विधियों के प्रति अधिक संवेदनशील होते हैं, और कई सेल प्रकार विभिन्न ऊतकों और विभिन्न स्थानों में अलग-अलग व्यवहार करते हैं। उचित तैयारी और मेहनती विश्लेषण के साथ, फ्लो साइटोमेट्री मचान और बायोमटेरियल प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट को चिह्नित करने के लिए एक विस्तृत सेलुलर और प्रोटीन-स्तरीय विश्लेषण दे सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को एनआईएच के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था, जिसमें नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल इमेजिंग एंड बायोइंजीनियरिंग भी शामिल है। अस्वीकरण: एनआईएच, उसके अधिकारी और कर्मचारी किसी भी कंपनी, उत्पाद या सेवा की सिफारिश या समर्थन नहीं करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL conical tubes Fisher Scientific 14-432-22
6 Well Plate Fisher Scientific 07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer Plus BD Biosciences 566385
BD Cytofix BD Biosciences 554655 For only fixing cells
Bovine serum albumin Millipore Sigma A7906 For preparing FACS staining buffer
CD11b AF700 Biolegend 101222 Clone: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5 Biolegend 117325 Clone: N418
CD197 PE/Dazzle594 Biolegend 120121 Clone: 4B12
CD200R3 APC Biolegend 142207 Clone: Ba13
CD206 PE Biolegend 141705 Clone: C068C2
CD45 BUV737 BD Biosciences 612778 Clone: 104/A20
CD86 BUV395 BD Biosciences 564199 Clone: GL1
CD8a BV421 Biolegend 100737 Clone: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse BD Biosciences 552843 For compensation control
DNase I Millipore Sigma 11284932001 Bovine pancreatic deoxyribonuclease I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7 Biolegend 123113 Clone: BM8
Fc Block Biolegend 101301 Clone: 93
Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 For fixing and permeabilization of cells.
HEPES buffer Thermo Fisher 15630080 Buffer to supplement cell media
Liberase Millipore Sigma 5401127001 Blend of purified Collagenase I and Collagenase II
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher L23105 Viability dye
Ly6c AF488 Biolegend 128015 Clone: HK1.4
Ly6g BV510 Biolegend 127633 Clone: 1A8
MHCII BV786 BD Biosciences 742894 Clone: M5/114.15.2
Phosphate buffer saline Thermo Fisher D8537
RPMI Thermo Fisher 11875176 Cell culture media
Siglec F BV605 BD Biosciences 740388 Clone: E50-2440
V-bottom 96-well plate

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References

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Lokwani, R., Sadtler, K.… More

Lokwani, R., Sadtler, K. High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues. J. Vis. Exp. (175), e61767, doi:10.3791/61767 (2021).

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