Summary
Describimos un método modificado basado en agar diseñado para cuantificar los efectos antifúngicos de los productos derivados de plantas. Las contribuciones volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica se pueden evaluar a través de este protocolo. Además, la eficacia contra hongos se puede medir en etapas clave del desarrollo en una sola configuración experimental.
Abstract
El protocolo descrito se basa en una técnica de transferencia plug-transfer que permite la determinación precisa de las cantidades de microorganismos y sus etapas de desarrollo. Un número especificado de esporas se extienden en una placa de agar. Esta placa de agar se incuba durante un período definido para permitir que los hongos lleguen a la etapa de desarrollo esperada, excepto para las esporas donde no se requiere incubación. Los tapones de agar cubiertos por esporas, hifas o micelio se retiran y transfieren a continuación a los medios de agar que contienen el compuesto antifúngico para ser probados a distancia de los hongos o en contacto. Este método es aplicable para probar extractos líquidos y muestras sólidas (polvos). Es particularmente adecuado para cuantificar las contribuciones relativas de los agentes volátiles y no volátiles en las mezclas bioactivas y para determinar sus efectos, específicamente en esporas, hifas tempranas y micelio.
El método es altamente relevante para la caracterización de la actividad antifúngica de los productos de biocontrol, en particular los productos derivados de plantas. De hecho, para el tratamiento de plantas, los resultados se pueden utilizar para guiar la elección del modo de aplicación y para establecer los umbrales de activación.
Introduction
Las pérdidas globales de frutas y verduras pueden alcanzar hasta el 50% de la producción1 y resultar principalmente de la descomposición de los alimentos causada por el deterioro de hongos en el campo o durante el almacenamiento posterior a la cosecha2,3,a pesar del amplio empleo de fungicidas sintéticos desde mediados del siglo XX4. El uso de estas sustancias se está reconsiderando, ya que representa graves riesgos ambientales y para la salud. A medida que las consecuencias dañinas de su uso están apareciendo en todos los ecosistemas y la evidencia de posibles impactos en la salud ha acumulado5,6,nuevas alternativas a las viejas estrategias profilácticas se están desarrollando para los tratamientos pre y post-cosecha7,8,9. De ahí que el reto al que nos enfrentamos sea doble. En primer lugar, las nuevas estrategias fungicidas deben mantener los niveles de eficacia de la protección alimentaria contra los fitopatógenos y, en segundo lugar, contribuir a reducir drásticamente la huella ambiental de las prácticas agrícolas. Para cumplir con este ambicioso objetivo, se están proponiendo estrategias inspiradas en las defensas naturales evolucionadas en las plantas, ya que se han destacado más de 1000 especies de plantas por sus propiedades antimicrobianas8. Por ejemplo, las plantas que han desarrollado fungicidas naturales para luchar contra los fitopatógenos son un recurso novedoso para explorar el desarrollo de nuevos productos de biocontrol2. Los aceites esenciales son moléculas emblemáticas de este tipo. Por ejemplo, el aceite esencial origanum protege las plantas de tomate contra el moho gris en invernaderos 10 y se ha demostrado que los aceites esenciales de solidago canadensis L. y cassia preservan las fresas postcosechadas de daños en el moho gris11,12. Estos ejemplos ilustran que el biocontrol y, en particular, los productos derivados de plantas representan una solución que combina eficacia biológica y sostenibilidad ambiental.
Por lo tanto, las plantas son un recurso importante de moléculas de interés potencial para la industria de protección de cultivos. Sin embargo, sólo se ha propuesto que un puñado de productos vegetales se utilicen como productos de biocontrol, aunque generalmente se les reconoce como seguros, no fitotóxicos y respetuosos con el medio ambiente2. Se han observado algunas dificultades en la transposición desde el laboratorio al campo, como la disminución de la eficacia una vez aplicada in vivo2,9. Por lo tanto, se vuelve importante mejorar la capacidad de las pruebas de laboratorio para predecir mejor la eficacia del campo. En este contexto, los métodos de ensayo antifúngicos para productos derivados de plantas son necesarios tanto para evaluar su eficacia antifúngica como para definir sus condiciones óptimas de uso. Específicamente, los productos de biocontrol son generalmente menos eficientes que los fungicidas químicos, por lo que es importante una mejor comprensión de su modo de acción para proponer formulaciones adecuadas, identificar el modo de aplicación en los campos y definir qué etapa de desarrollo del patógeno es vulnerable al bioproducto candidato.
Los enfoques actuales que abordan las actividades antibacterianas y antifúngicas incluyen métodos de difusión como la difusión de agar-disco, dilución, bioautografía y citometría de flujo13. La mayoría de estas técnicas, y más específicamente, las pruebas estándar de susceptibilidad antifúnggica - ensayos de difusión y dilución de disco de agar - están bien adaptadas para evaluar la actividad antimicrobiana de compuestos solubles en esporas bacterianas y fúngicas en suspensiones líquidas14. Sin embargo, estos métodos generalmente no son adecuados para probar compuestos sólidos como el polvo vegetal seco o cuantificar la actividad antifúngica durante el crecimiento del micelio, ya que requieren dilución de esporas o esporas que se extienden en placas de agar y/o dilución de compuestos antifúngicos13. En el método envenenado por alimentos, las placas de agar que contienen el agente antifúngico se inoculan con un disco de 5-7 mm de diámetro muestreado a partir de un cultivo de hongos de 7 días de antigüedad sin tener en cuenta la cantidad precisa de micelio inicial. Después de la incubación, la actividad antifúngica se determina como un porcentaje de la inhibición del crecimiento radial17,18,19. Con este enfoque podemos evaluar la actividad antifúnggica en el crecimiento micelial. Por el contrario, se realiza el método de dilución del agar para determinar la actividad antifúngica en esporas directamente inoculadas en la superficie de la placa de agar que contiene los compuestos antifúngicos13,20,21. Estos dos enfoques dan resultados complementarios sobre la actividad antifúnggica. Sin embargo, se trata de dos técnicas independientes utilizadas en paralelo que no proporcionan una comparación precisa en paralelo de la eficacia relativa de los compuestos antifúngicos en esporas y micelio17,20,22 a medida que la cantidad de material fúngico inicial difiere en los dos enfoques. Además, la actividad antifúngica de un producto derivado de la planta a menudo es el resultado de la combinación de moléculas antifúngicas sintetizadas por las plantas para hacer frente a patógenos. Estas moléculas abarcan proteínas, péptidos23,24, y metabolitos con amplia diversidad química y pertenecientes a diferentes clases de moléculas como polifenoles, terpenos, alcaloïds25, glucosinolatos8, y compuestos de organosulfur26. Algunas de estas moléculas son volátiles o se vuelven volátiles durante el ataque de patógenos27. Estos agentes suelen ser compuestos solubles en agua y de alta presión de vapor que deben recuperarse a través de la destilación de agua como aceites esenciales, algunas de cuyas actividades antimicrobianas han sido bien establecidas28. Se han desarrollado ensayos de susceptibilidad mediada en fase de vapor para medir la actividad antimicrobiana de compuestos volátiles después de la evaporación y migración a través de la fase de vapor29. Estos métodos se basan en la introducción de compuestos antifúngicos a distancia del cultivo microbiano29,30,31,32,33. En el ensayo de agar de fase de vapor comúnmente utilizado, los aceites esenciales se depositan en un disco de papel y se colocan en el centro de la cubierta de la placa De Petri a distancia de la suspensión de esporas bacterianas o fúngicas, que se propaga en medio de agar. El diámetro de la zona de inhibición del crecimiento se mide de la misma manera que para el método de difusión del agar-disco20,24. Se han desarrollado otros enfoques para proporcionar medición cuantitativa de la susceptibilidad antifúngica de la fase de vapor de los aceites esenciales, derivada del método de dilución de caldos a partir del cual se calculó una actividad antimicrobiana mediada en fase de vapor inhibitorio32, o derivado de ensayos de difusión de agar-disco31. Estos métodos son generalmente específicos de los estudios de actividad de fase de vapor y no son apropiados para los ensayos de inhibición de contacto. Esto excluye la determinación de la contribución relativa de agentes volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica de una mezcla bioactiva compleja.
El método cuantitativo que hemos desarrollado tiene como objetivo medir el efecto antifúngico del polvo de planta seca en cantidades controladas de esporas y micelio cultivado depositado en la superficie de un medio de agar para reproducir el crecimiento aéreo de fitopatógenos durante la infección de las plantas15, así como una red micelial interconectada16. El enfoque es una configuración experimental modificada basada en la dilución del agar y los métodos envenenados por alimentos que también permite, en la misma configuración experimental, cuantificar en paralelo la contribución de metabolitos antifúngicos volátiles y no volátiles. En este estudio, el método ha sido comparado con la actividad de tres preparaciones antifúngicas bien caracterizadas.
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Protocol
1. Preparación de Inocula
- Antes del experimento, poner 5 μL de Trichoderma spp. Esporas SBT10-2018 almacenadas a 4 °C en medio agar dextrosa de patata (PDA) e incubar durante 4 días a 30 °C con exposición a la luz regular para promover la formación de conidia42 (Figura 1,panel A).
NOTA: Trichoderma spp. SBT10-2018 ha sido aislado de la madera y se utiliza como modelo en este estudio por su rápido crecimiento y facilidad de recuperación de esporas. Esta cepa es preservada por nuestro laboratorio. - Recuperar conidia (Figura 1, panel A)
- Poner 3 ml de 0.05% Tween-20 en el micelio de Trichoderma.
- Utilice un rastrillo para liberar conidia de conidioforos; evitar presionar hacia abajo en el micelio para evitar que la hipófago sea arrancada.
- Recupere la solución rápidamente con un micropipette para evitar que sea absorbida por el medio del agar y transfiérala a un tubo de 15 ml.
- Cuente el número total de esporas utilizando un hemociclomómetro y prepare una solución que contenga 3 x 106 esporas/ml.
NOTA: Este paso debe realizarse cuidadosamente para evitar que se extraigan hifas. La preparación de esporas se comprueba en el microscopio. Eventualmente, para las cepas que presentan micelio altamente aéreo y esponjoso, se puede añadir un paso de filtración usando filtro colador de 40 μM para eliminar el fragmento residual de micelio.
2. Preparación de placas fúngicas(Figura 1,panel B)
- Deposite 100 μL de 3 x 106 esporas/ml con un micropipette en una placa Petri de 9 cm de diámetro que contenga PDA medium para obtener 4.800 esporas/cm2 correspondientes a 925 esporas/5 mm de diámetro-enchufe de agar.
- Añadir 10 g de cuentas de vidrio de 2 mm de diámetro con una espátula estéril y realizar movimientos hacia adelante y hacia atrás paralelos y perpendiculares al brazo del operador para distribuir uniformemente las esporas en la superficie del agar.
- Gire la placa 90° y repita los movimientos giratorios (como en la sección 2.2); repetir estos pasos hasta que la placa se haya girado por completo.
- Utilice la placa inmediatamente para configurar experimentos que requieran esporas o incubar las placas a 30 °C durante 17 h o 24 h cuando se necesiten hifas o micelio tempranos, respectivamente.
NOTA: Para comparar la actividad antifúngica medida después de la transferencia de micolio y la transferencia de disco de micelio, utilice pinzas estériles y coloque discos estériles de celulosa de 5 mm al azar en la superficie de la placa de agar después de la propagación de esporas.
3. Preparación de compuestos antifúngicos
- Preparación de productos derivados de la planta: preparación del ajo en polvo
- Pelar los dientes de ajo fresco y cortar los clavos en rodajas de 2-3 mm de ancho usando una hoja de bisturí.
- Seque al aire las rodajas durante 2 días a 40 °C.
- Moler las rodajas durante 3 x 15 segundos usando un molino de cuchillos para obtener un polvo fino.
- Guarde el ajo en polvo a 4 °C en tubos de 50 ml antes de usarlo.
NOTA: Como el ajo no está autoclavado (para evitar la degradación de compuestos antifúngicos sensibles a la temperatura) limpie la amoladora, el bisturí y el secador de aire con un 70% de etanol antes de su uso.
- Preparación esencial del aceite
- Preparar 0.5%, 1%, 2.5%, 5% y 20% Thymus vulgaris soluciones de aceite esencial en 0.5% Tween-80.
- Mezcle bien para formar una emulsión antes de agregarla al medio PDA (ver sección 4.2).
- Preparación de carbendazim
- Pesar carbendazim para preparar una solución de etanol de 200 mg/L (carbendazim es poco soluble en agua).
- Almacene la solución a temperatura ambiente antes de agregarla al medio PDA (ver sección 4.2).
PRECAUCIÓN: Carbendazim presenta un riesgo para la salud y el medio ambiente. Use guantes y máscara al manipular este producto. Guárdalo en un espacio ventilado.
4. Ensayo de inhibición de contacto
- Preparación de platos de agar que contengan ajo en polvo
- Preparar y autoclave medio PDA.
- Pesar la cantidad deseada de ajo en polvo en un tubo de 50 ml utilizando una espátula estéril, para obtener concentraciones que generalmente van desde 0,25 mg/ml hasta 16 mg/ml.
- Añadir 10 ml de PDA después de haber comprobado la temperatura del medio en el interior de la muñeca. La temperatura debe ser lo más baja posible para evitar la degradación de moléculas sensibles. Idealmente, esta temperatura debe ser de 45 °C.
- Homogeneice cuidadosamente girando el tubo boca abajo para distribuir uniformemente el polvo en el medio PDA. Vierta rápidamente 10 ml en una placa Petri de 5 cm de diámetro(Figura 1,panel C).
- Con la placa De Petri colocada a temperatura ambiente, espere hasta que el agar se solidifique.
- Preparación de placas de agar que contengan aceite esencial o carbendazim
- Introduzca 10 ml de PDA en un tubo de 50 ml. Compruebe la temperatura en cuanto a la sección 4.1.3.
- Añadir 100 μL de las diferentes soluciones de aceite esencial Thymus vulgaris en PDA para obtener soluciones de 0,005%, 0,01%, 0,025%, 0,05% y 0,2% (ver sección 3.2.1).
- Añada el volumen requerido de carbendazim de la solución de 200 mg/L para obtener soluciones que van desde 0,0625-2 mg/L (ver sección 3.3.1).
- Homogeneizar cuidadosamente girando el tubo al revés, verter rápidamente 10 mL en una placa Petri de 5 cm de diámetro(Figura 1,panel C).
- Con la placa De Petri colocada a temperatura ambiente, espere hasta que el agar se solidifique.
- Ensayo de inhibición de contacto (Figura 1)
- Con un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm de diámetro, traza un círculo en el centro de las placas Petri que contienen PDA o PDA, incluyendo compuestos antifúngicos. Deseche el cilindro del agar con un palillo estéril (panel C).
- Con un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm de diámetro, la parcela gira aleatoriamente en las placas fúngicas de la sección 2. Trazado entre 15-20 círculos por placa (panel B).
- Retire cuidadosamente los cilindros de agar cubiertos por esporas, hifas tempranas o micelio con un palillo de dientes estéril y coloque los tapones en el espacio vacío de las placas Petri que contengan PDA o PDA, incluidos compuestos antifúngicos (panel C).
- Incubar las placas que contienen esporas durante 48 h a 30 °C, 31 h para las placas que contienen hifas tempranas y, 24 h para las placas cubiertas con micelio (panel C).
- Medir el diámetro del crecimiento radial y calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento fúngico sobre el control utilizando la fórmula (panel D)
% inhibición del crecimiento fúngico = (C - A/C)* 100
donde C es el diámetro del crecimiento radial en PDA medio y A el diámetro del crecimiento radial en el medio PDA que contiene los compuestos antifúngicos.
NOTA: Para comparar la actividad antifúngica medida después de la transferencia de tapón de micelio y la transferencia de disco de micelio, utilizando pinzas estériles, transfiera un disco de 5 mm de diámetro previamente depositado en la superficie de las placas fúngicas (nota de la sección 2) en el centro de placas Petri que contengan PDA o PDA que contengan compuestos antifúngicos y proceda exactamente en cuanto a la transferencia de enchufe de agar
5. Ensayo de inhibición de fase de vapor
- Preparación de platos de agar que contengan ajo en polvo
- Proceda como en la sección 3.1.
- Preparación de placa de agar que contenga aceite esencial o carbendazim
- Proceda como en las secciones 3.2 y 3.3.
- Preparación de placas fúngicas
- Proceda como en la sección 2.
- Ensayo de inhibición antifúngico de fase de vapor (Figura 1)
- Vierta 10 ml de medio PDA en la tapa de las placas Petri de 5 cm de diámetro que contengan 10 ml de PDA medio o 10 ml de medio PDA que contenga compuestos antifúngicos en la parte inferior de los platos. Espere hasta la solidificación completa del agar a temperatura ambiente (panel C).
- Utilice un tubo centrífugo de 50 ml como herramienta de calibración para obtener un círculo de PDA en el centro de la tapa; retire el PDA alrededor del círculo con una espátula estéril (panel C).
- Trace un círculo en el centro del medio PDA colocado en la tapa con un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm de diámetro. Deseche el cilindro del agar con un palillo de dientes estéril (panel C).
- Enchufa los tapones de forma con un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm de diámetro al azar en las placas fúngicas como en la sección 4.3.2 (panel B).
- Usando un palillo de dientes estéril, transfiera cuidadosamente los enchufes cubiertos con esporas, hifas tempranas o micelio de placas fúngicas a las tapas de las placas de ensayo (panel C).
- Incubar a 30 °C como en la sección 4.3.4 (panel C).
- Mida el diámetro del crecimiento radial y calcule el porcentaje de inhibición del crecimiento fúngico utilizando la fórmula en la sección 4.3.5 (panel D).
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Representative Results
Para evaluar la capacidad del método cuantitativo para discriminar el modo de acción de diferentes tipos de compuestos antifúngicos, comparamos la eficacia de tres agentes antifúngicos conocidos. Carbendazim es un fungicida sintético no volátil que ha sido ampliamente utilizado para controlar una amplia gama de enfermedades fúngicas en las plantas39,40. El aceite esencial Thymus vulgaris ha sido descrito en gran medida por su actividad antibacteriana y antifúngica y se utiliza como agente conservante de alimentos naturales41. El ajo en polvo ha sido elegido como modelo de un bioproducto derivado de la planta. Tradicionalmente se ha utilizado como remedio natural con actividades antimicrobianas que se han atribuido en gran medida a la presencia de compuestos volátiles de organosulfuro, pero también a la presencia de saponinas no volátiles y compuestos fenólicos26,dando a este modelo una complejidad relevante en este estudio.
Este método cuantitativo se basa en la transferencia de tapones de agar que contienen cantidades controladas de hongos en diferentes etapas de desarrollo, desde esporas hasta micelio, mientras que en el método envenenado por alimentos, el micelio de 5 días a 7 días de edad se transfiere de discos de celulosa13. En el ensayo, se utilizaron esporas, hifas tempranas (incubación de 17 h) y micelio (incubación de 24 h) como material fúngico inicial. Es posible que el uso de la transferencia de disco no sea pertinente, ya que la conidia o la hisfa residual permanecen al menos parcialmente en el medio de agar después de la transferencia de disco, lo que posteriormente conduce a una medición inexacta de la inhibición del crecimiento como se ilustra en la Figura 2. Tras la transferencia de las zonas de agar situadas bajo discos de celulosa se han observado diferentes diámetros de crecimiento fúngico-radial, seguidos de incubación de 24 h(figura 2,paneles A, B y C) destacando la presencia de hifas fúngicas residuales en el agar después de la transferencia de disco. La cuantificación de la hipófada residual se ha confirmado mediante la medición del crecimiento que conduce a una variabilidad de hasta el 22% de diámetro(Figura 2,panel D). El efecto sobre la inhibición del crecimiento se evaluó a continuación utilizando aceite esencial Thymus vulgaris como compuesto antifúngico y en comparación con la inhibición obtenida después de la transferencia de enchufe de agar(Figura 2,panel E). La inhibición del crecimiento después de la transferencia de disco fue mayor que después de la transferencia de enchufe de agar para concentraciones bajas de aceite de Thymus, lo que llevó a una sobreestimación del efecto inhibitorio, que podría deberse a la transferencia incompleta de material fúngico y apoyar el enfoque basado en la transferencia de enchufe de agar.
Trichoderma spp. La inhibición del crecimiento SBT10-2018 provocada por los tres compuestos antifúngicos se evaluó a continuación utilizando los ensayos de inhibición de fase de contacto y vapor para cada etapa fúngica (Figura 3). Las esporas se extendieron cuidadosamente en placas de agar para obtener 4.800 esporas/cm2. Fueron transferidos directamente a placas de agar que contenían compuestos antifúngicos a través de extracción de tapones de agar utilizando un tubo estéril de acero inoxidable de 5 mm, lo que permitió que el experimento comenzara desde las esporas. Para las otras dos etapas de desarrollo, las placas de agar cubiertas con esporas se incubaron en primer lugar durante 17 h o 24 h a 30°C antes de transferir el tapón del agar para permitir la germinación y el desarrollo temprano de hifas (17 h) y formación de micelio (24 h)(Figura 3,panel A). Para cuantificar la contribución de las moléculas volátiles activas a la actividad antifúngica general, el ensayo de inhibición de contacto se ha adaptado y se han colocado esporas, hifas tempranas y micelio a una distancia de los compuestos antifúngicos vertidos en el medio PDA en cuanto al ensayo de inhibición de contacto. Trichoderma-crecimiento radial se midió durante 48 horas y el porcentaje de inhibición se ha determinado en comparación con las condiciones de control. La concentración mínima inhibitorio (MIC) se ha definido como la concentración más baja de compuestos antifúngicos que impiden el crecimiento visible después de 48 h de incubación a 30°C.
La Figura 3(panel B) muestra una mayor sensibilidad a la esporas a carbendazim en comparación con las redes tempranas de hifas y micelio con 50%, 22% y 30% de inhibición del crecimiento respectivamente a 0,25 μg/ml carbendazim cuando Trichoderma y compuestos antifúngicos estaban en contacto. Concomitantemente, se ha estimado un valor MIC de 0,5 μg/ml en la germinación de esporas, mientras que se ha obtenido un aumento a 0,75 μg/ml en el alargamiento temprano de la hipófago y el micelio. Por el contrario, carbendazim no tuvo ningún efecto antifúngico en Trichoderma cuando el hongo se colocó a distancia del fungicida de acuerdo con la baja volatilidad de esta sustancia. Los resultados obtenidos utilizando el aceite esencial Thymus vulgaris (TEO) como compuesto antifúngico(Figura 3,panel C) han mostrado una mayor sensibilidad a la esporas a TEO en comparación con la hifa temprana y el micelio con 65% y aproximadamente 50% de inhibición del crecimiento a 0.01% TEO respectivamente. Los valores MIC obtenidos fueron similares para la germinación de esporas y la alargamiento temprano de la hipófago (0,025% TEO) y superior para el crecimiento del micelio (0,05% TEO). Como era de esperar, el aceite esencial Thymus vulgaris presentaba idéntica actividad antifúngica independientemente de la distancia que se alemeciera en el hongo y el aceite. Valores MIC similares (0,025% TEO) se obtuvieron en germinación de esporas y alargamiento inicial de la hipófago para ensayos de contacto y fase de vapor, aunque en el porcentaje inferior se ha observado una mayor sensibilidad cuando las esporas de TEO y Trichoderma estaban en contacto (60% de inhibición del crecimiento en contacto frente a 45% de inhibición del crecimiento a distancia). Sorprendentemente, los valores MIC obtenidos en el micelio fueron diferentes en los ensayos de inhibición de fase de contacto y vapor (0,05% frente a 0,1%) lo que sugiere que alguna parte de las moléculas volátiles no está activa contra un micelio bien desarrollado. Por último, cuando se utiliza el ajo en polvo como compuesto antifúngico(Figura 3,panel D), se observó una mayor eficacia contra la germinación de esporas (50% de inhibición del crecimiento a 0,25 mg/ml de ajo en polvo y valor MIC de 0,5 mg/ml) y elongación temprana de hifas (5 9% inhibición del crecimiento a 0,25 mg/ml y valor MIC de 0,5 mg/ml) que para el crecimiento del micelio (29% inhibición del crecimiento a 0,5 mg/ml de ajo en polvo y valor MIC de 0,75 mg/ml). Cuando se compararon ensayos de fase de contacto y vapor, los resultados han mostrado una disminución significativa de la actividad antifúngica a distancia independientemente de la etapa de desarrollo del hongo. Los valores MIC pasaron de 0,5 mg/ml a 1 mg/ml para la germinación de esporas, de 0,5 mg/ml a 2 mg/ml para la alargamiento inicial de la hipófago, y de 0,75 mg/ml a 4 mg/ml para el crecimiento del micelio(Figura 3,panel D y Figura 4 para imágenes representativas). Por lo tanto, estos resultados sugieren que el ajo en polvo contiene una mezcla de compuestos volátiles y no volátiles que tienen propiedades antifúngicas.
En conjunto, estos resultados muestran que la contribución relativa de agentes volátiles y no volátiles contenidos en productos derivados de plantas puede determinarse en diferentes etapas de crecimiento fúngico, ya que las condiciones experimentales son comparables. Este enfoque es entonces particularmente adecuado para mezclas complejas de compuestos antifúngicos. El aceite esencial Thymus vulgaris es una mezcla de compuestos volátiles y muestra una actividad similar a distancia y en contacto para la germinación de esporas y la alargamiento temprano de la hipófago, apoyando la comparación de esta fase de vapor y el ensayo de inhibición de contacto y destacando que la migración a la fase de vapor no se ve afectada vertiendo en el medio del agar. Los resultados también subrayan que el polvo de ajo utilizado como modelo en este estudio contiene componentes activos no volátiles que tienen una contribución significativa en la actividad antifúnggica global y que han sido descuidados en favor de tiosulfinatos volátiles derivados de allium27,28.
Figura 1: Esquema sinóptico del protocolo para ensayos de contacto y fase de vapor Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Inexactitud asociada con la transferencia fúngica desde el disco de celulosa. A. Esquema que representa la transferencia de disco a placas de agar cubiertas por esporas y transferencia de disco a la superficie en placas de agar que contienen compuestos antifúngicos B. Esquema que representa la transferencia de agar de áreas bajo discos de celulosa seguidas de incubación y medición residual del crecimiento. C. Imagen representativa del crecimiento radial del micelio residual después de la transferencia de áreas bajo discos de celulosa. D. Medición radial del crecimiento del micelio residual. E. Efecto de Thymus vulgaris aceite esencial en el crecimiento de micelio transferido desde el disco de celulosa o agar-enchufe (N =2, media ± SD) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Comparación de actividades antifúngicas utilizando los ensayos de inhibición de vapor-fase y contacto en esporas, hifas tempranas y micelio. R. Fotos representativas de esporas de Trichoderma, hifas tempranas (crecimiento de 17 h) y micelio (crecimiento de 24 h). Inhibición del crecimiento de trichoderma por carbendazim (B), Thymus vulgaris aceite esencial (C) y ajo en polvo (D). (N=2, media ± SD) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes representativas de la actividad antifúngica del ajo en placas de agar en los ensayos de inhibición de contacto (A) o fase de vapor (B)Haga clic aquí para ver una versión más grande de estafigura.
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Discussion
El enfoque presentado aquí permite la evaluación de las propiedades antifúngicas de los productos derivados de plantas mínimamente procesados. En este protocolo, la distribución homogénea de esporas en la superficie del agar se logra utilizando cuentas de vidrio de 2 mm. Este paso requiere habilidades de manejo para distribuir correctamente las cuentas y obtener resultados reproducibles, permitiendo en última instancia la comparación de efectos antifúngicos en diferentes etapas de crecimiento fúngico. Encontramos que las cuentas de vidrio de 5 mm o la rotación excesiva mientras se homogeneiza durante la propagación pueden causar un diámetro de crecimiento variable. Por lo tanto, recomendamos capacitación para dominar la distribución de esporas antes de la experimentación. Además, cuando se deben probar los polvos vegetales, se debe prestar atención a la dispersión homogénea del producto en el medio del agar. Para evitar que el polvo se asiente en la parte inferior de la placa, el producto debe mezclarse en medio del agar cuando la temperatura del medio derretido alcanza los 45 °C (cuando la temperatura ambiente es de 24 °C). Esta temperatura debe ajustarse de acuerdo con la temperatura ambiente local para evitar la sedimentación.
Si bien el método que describimos aquí puede proporcionar información valiosa, se deben considerar algunos inconvenientes. Este método permite comparaciones precisas y paralelas en una sola configuración experimental a expensas de una cantidad significativa de tiempo de preparación, ya que el número de placas de agar que se deben preparar puede ser considerable dependiendo de las preguntas que deben responderse. Además, este ensayo es un ensayo a escala media diseñado para platos Petri de 5 cm. Por lo tanto, la cantidad de sustancias activas necesarias para probar todos los aspectos puede ser sustancial. Esto significa que las sustancias raras pueden no ser candidatos de prueba adecuados para este protocolo. Una reducción de escala del ensayo se puede considerar el uso de platos Petri más pequeños y la reducción del tamaño de los enchufes. Esto podría probarse utilizando el protocolo de benchmarking descrito aquí con especial atención a la extracción del enchufe del agar, que podría ser difícil. La precisión de las mediciones de crecimiento radial podría reducirse a esa escala más pequeña.
Los métodos actuales son adecuados para medir la actividad antifúngica de los compuestos en solución y menos aplicables al estudio de los polvos13. El enfoque que hemos establecido está bien adaptado tanto para compuestos líquidos como sólidos, lo que permite evaluar las propiedades antifúngicas de los productos derivados de plantas mínimamente procesados. Esto reduce el tiempo necesario para probar extractos y reduce las trampas relacionadas con sustancias activas que muestran una baja solubilidad. Como algunos productos derivados de plantas contienen moléculas activas sensibles a la alta temperatura43,esto ofrece la ventaja de limitar el riesgo de una pérdida de actividad de tales compuestos. Este enfoque se ha adaptado del método de difusión del agar y del método envenenado por alimentos15,16,17,18y19 para permitir además la comparación directa de actividades antifúngicas en diferentes etapas de crecimiento fúngicos utilizando entornos experimentales similares. La transferencia de enchufe de agar permite un control preciso de las cantidades de microorganismos dentro del ensayo. Esta es una ventaja sobre la transferencia de disco, lo que conduce a la sobreestimación de efectos antifúngicos asociados con la transferencia incompleta de esporas o hifas. Por último, mientras que los ensayos de fase de vapor generalmente no se aplican a los ensayos de inhibición de contacto27,28,29,30,31, el método que proponemos aborda las contribuciones relativas de agentes volátiles y no volátiles contenidos en mezclas complejas como polvos vegetales o extractos y, en última instancia, permite la evaluación de actividades antifúngicas en diferentes etapas de crecimiento fúngico.
El enfoque que describimos aquí podría ser particularmente relevante para apoyar la necesidad de métodos que evalúen las propiedades antifúngicas en productos derivados de plantas para el biocontrol. El método cuantitativo que proponemos permite a los operadores determinar las respectivas contribuciones de compuestos volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica de una mezcla bioactiva compleja. Esto proporciona información valiosa que puede guiar la elección de los modos de aplicación para el tratamiento y la relevancia de realizar la extracción de líquidos. Aplicaciones que podrían considerarse a distancia del fitopatógeno objetivo (por ejemplo, la inclusión del producto biocontrol en un envase) o que podrían necesitar contacto directo para optimizar la eficacia del producto biocontrol (nebulización en plantas o inmersión de fruta en una solución de biocontrol). También permite la comparación de la eficacia antifúngica en diferentes etapas de crecimiento fúngico, desde la germinación de esporas hasta el crecimiento posterior del micelio en etapas posteriores, lo que conduce a la definición de recomendaciones para establecer los umbrales de control necesarios para aplicar productos de biocontrol a los cultivos. De hecho, definir la eficacia de las sustancias en diferentes etapas fúngicas puede ayudar a categorizar si las sustancias pueden utilizarse como tratamientos preventivos o curativos y a planificar el calendario de tratamientos vegetales con productos de biocontrol. Esto es esencial para aprovechar la eficacia de los productos cuando se utilizan en el campo o después de la cosecha.
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Disclosures
ninguno
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos a Frank Yates por su precioso consejo. Este trabajo fue apoyado por Sup'Biotech.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave-vacuclav 24B+ | Melag | ||
| Carbendazim | Sigma | 378674-100G | |
| Distilled water | |||
| Eppendorf tubes | Sarstedt | 72.706 | 1.5 mL |
| Falcons tubes | Sarstedt | 547254 | 50 mL |
| Five millimeters diameter stainless steel tube | retail store | / | |
| Food dehydrator | Sancusto | six trays | |
| Garlic powder | Organic shop | ||
| Glass beads | CLOUP | 65020 |  2 mm |
| Hemocytometer counting cell | Jeulin | 713442 | / |
| Incubator | Memmert | UM400 | 30 °C |
| Knife mill | Bosch | TSM6A013B | |
| Manual cell counter | Labbox | HCNT-001-001 | / |
| Measuring ruler | retail store | ||
| Microbiological safety cabinets | FASTER | FASTER BHA36, TYPE II, Cat 2 | |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014407 | 100 - 1000 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014411 | 20 - 200 µL |
| Micropipette | Mettler-Toledo | 17014412 | 2 - 20 µL |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1194500 | 55 mm |
| Petri dish | Sarstedt | 82-1473 | 90 mm |
| Pipette Controllers-EASY 60 | Labbox | EASY-P60-001 | / |
| Potato Dextrose Agar | Sigma | 70139-500G | |
| Precision scale-RADWAG | Grosseron | B126698 | AS220.R2-ML 220g/0.1mg |
| Rake | Sarstedt | 86-1569001 | / |
| Reverse microscope AE31E trinocular | Grosseron | M097917 | / |
| Sterile graduated pipette | Sarstedt | 1254001 | 10 mL |
| Thymus essential oil | Drugstore | Essential oil 100% | |
| Tips 1000 µL | Sarstedt | 70.762010 | |
| Tips 20 µL | Sarstedt | 70.760012 | |
| Tips 200 µL | Sarstedt | 70.760002 | |
| Tooth pick | retail store | ||
| Trichoderma spp strain | Strain of LRPIA laboratory | ||
| Tween-20 | Sigma | P1379-250ML | |
| Tween-80 | Sigma | P1754-1L | |
| Tweezers | Labbox | FORS-001-002 | / |
References
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