Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים

Published: October 25, 2021 doi: 10.3791/61812
Automatic Translation
1, 3, 1,2
1Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Physiology, Temple University School of Medicine, 3Department of Pediatrics, Seattle Children’s Hospital

Summary

הפטוציטים ראשוניים הם כלי רב ערך לחקר תגובת הכבד ומטבוליזם במבחנה. תוך שימוש בריאגנטים הזמינים באופן מסחרי, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

Abstract

הפטוציטים ראשוניים נמצאים בשימוש נרחב במחקר במבחנה בכבד , במיוחד במחקרי חילוף חומרים של גלוקוז. טכניקת בסיס הותאמה על בסיס צרכים שונים, כמו זמן, עבודה, עלות ושימוש ראשוני בהפטוציטים, וכתוצאה מכך פרוטוקולי בידוד ראשוניים שונים של הפטוציטים. עם זאת, הצעדים הרבים וההכנות המגיבים הגוזלים זמן רב בבידוד הפטוציטים ראשוני הם חסרונות עיקריים ליעילות. לאחר השוואת פרוטוקולים שונים עבור היתרונות והחסרונות שלהם, היתרונות של כל אחד מהם שולבו, ונוצר פרוטוקול בידוד הפטוציטים ראשוני מהיר ויעיל. תוך כ-35 דקות בלבד, פרוטוקול זה יכול להניב הפטוציטים ראשוניים בריאים באותה מידה, אם לא יותר, כמו פרוטוקולים אחרים. יתר על כן, ניסויים במטבוליזם של גלוקוז שבוצעו באמצעות הפטוציטים ראשוניים מבודדים אימתו את התועלת של פרוטוקול זה במחקרי חילוף חומרים בכבד במבחנה . כמו כן, סקרנו וניתחנו בהרחבה את המשמעות והתכלית של כל שלב במחקר זה, כך שחוקרים עתידיים יוכלו לייעל עוד יותר את הפרוטוקול הזה על סמך הצרכים.

Introduction

הכבד משמש כאחד האיברים החשובים ביותר בגוף בעלי החוליות בשל התפקיד החיוני שהוא ממלא בתפקודים תומכי חיים רבים כמו עיכול מזון, זרימת דם וניקוי רעלים. השימוש בתרבית הפטוציטים ראשונית במבחנה של עכבר פופולרי יותר ויותר במחקרים על חילוף חומרים של פחמימות וקרצינומה בכבד. לכן, חשוב לפתח שיטה נוחה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכבר תוך שמירה על תפקודו הפיזיולוגי המולד. בשל תפקודו כמרכז של חילוף חומרים של גלוקוז, הכבד הוא גם מרכזי בייצור גלוקוז ואחסון1. ניסויים עם הפטוציטים ראשוניים במבחנה הם חובה לרוב מחקרי חילוף החומרים של גלוקוז. לכן, במשך שנים, קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולים לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים.

ההליך הכללי של בידוד הפטוציטים של עכברים הוא קודם כל לשטוף את הדם בכבד עם נוזל איזוסמוטי כגון מלח בחסימת פוספט (PBS) או תמיסת המלח המאוזנת של הנקס (HBSS) ולאחר מכן להשתמש בתמיסה המכילה קולגן כדי לנתק הפטוציטים. פרוטוקולים אלה חולקים הליך כללי אך נבדלים זה מזה בריאגנטים ובשלבים בהתאם לצרכים שונים. עם זאת, הכנת ריאגנטים נדרשים וביצוע צעדי בידוד לוקחים זמן. בפיתוח הפרוטוקול הנוכחי, היעילות נקבעה כעדיפות, כאשר כל הריאגנטים מוכנים לשימוש וזמינים מהשוק, וכמה שפחות צעדים. המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק שיטה מהירה ויעילה לעבודה כדי לבודד הפטוציטים ראשוניים מעכבר, מבלי לסכן את טוהר הפטוציטים ראשוני מבודדים ואת הכדאיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים נקבות C57BL/6 (בנות 8 שבועות).

1. הכנה:

  1. ערבבו את ה-E Medium של William 's (תוסף גלוטמקס) עם 10% FBS ו-1% תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקרוטיקוטית כדי להפוך את התרבית למדיום.
  2. סנן 25 מ"ל של מדיום פיזור קולגן (למשל, Liver Digest Medium) דרך מסנן מזרקים של 0.45 מיקרומטר כדי להסיר פסולת חלקיקים.
  3. חם 50 מ"ל של H2O מזוקק כפול (ddH2O), 35 מ"ל של מדיום פרפוזיה (למשל, מדיום פרפוזיה בכבד) (או 50 מ"ל בפעם הראשונה באמצעות פרוטוקול זה), ו-25 מ"ל של מדיום מסונן של קולגן-דיספוזיה באמבט מים של 45 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. בתוך מכסה מנוע תרבית רקמה סטרילי, יש לערבב 2 מ"ל של 10x HBSS ו-18 מ"ל של פרקול בצינור של 50 מ"ל כדי ליצור 20 מ"ל 1x Percoll-HBSS ולשמור על קרח או 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן לשמור 1x Percoll-HBSS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לפחות.
  5. בתוך קפוצ'ון תרבית רקמה סטרילי, יוצקים 30 מ"ל של מדיום שטיפה (למשל, Hepatocyte Wash Medium) לתוך צלחת פטרי נקייה, ושומרים על קרח.
  6. טבלו את צינור השאיבה במים של אמבט מים בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. התוצאות הן האמינות ביותר אם טמפרטורת החדר היא ב 25 °C (76 °F).
  7. הכן 2 מ"ל של 1x הרדמה על ידי ערבוב 225 μL של קטמין HCL, 93.75 μL של Xylazine, ו 1681 μL של 1x PBS.
  8. הרדמה עכבר אחד בשיטה מאושרת. כאן הוזרק לעכבר תוך-צפקית 150 μL של הרדמה של 1x. בצע את הבדיקות לאובדן רפלקסים כגון תגובה לצביטת הבוהן כדי להבטיח הרדמה מלאה.
  9. הצמידו את העכבר שעל גבו אל משטח הנתיחה על ידי ארבע גפיים, על ידי הצמדה או שימוש בנייר דבק חסין מים או בשיטות אחרות שאושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסד (או מקבילות).
  10. הכן מלקחיים ומספריים מעוקרים לניתוח. כדי למנוע זיהום אפשרי, לבצע את כל הצעדים בתוך מכסה המנוע סטרילי.

2. נוהל:

  1. באמצעות משאבה פריסטלטית, התחילו לשאוב ddH2O מחומם במהירות של 4 מ"ל/דקה למשך 5 דקות. משנים את צינור השאיבה ממים למדיום זלעפות מחומם.
  2. יש לחטא את בטנו של העכבר המרדים ב-70% EtOH ולחתוך עם מספריים כדי לחשוף את הכבד, את וריד הפורטל ואת הווריד הנבוב התחתון (IVC).
  3. עצרו את המשאבה הפריסטלטית. הכנס צנתר 24 G (לדוגמה, קטטר IV סגור, 24 G, 0.75 IN) לתוך IVC. התחילו לשאוב וחתכו את וריד הפורטל פתוח.
  4. ממשיכים לשאוב עד שהנוזל השטוף מתבהר (בסביבות 3-5 דקות). לחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד. היזהרו לא לתת לבועות אוויר להיכנס ל-IVC.
    הערה: שלב זה הוא לשטוף כמה שיותר דם מהכבד.
  5. שנה את צינור השאיבה ממדיום הזלוף למדיום הפיזור של הקולג'נאז. ממשיכים לשאוב עד שכל 25 מ"ל של מדיום הקולגנאז-דיספוזה מתרוקן תוך כדי ביצוע שלב 2.6.
  6. לחץ על וריד הפורטל בכל דקה כדי לאפשר לנוזל להגיע לכל פינה בכבד.
    הערה: בשלב זה, אובדן מוחלט של דם הוא קטלני לעכבר. מותו של העכבר יכול להיות מאושר על ידי חוסר פעימות לב לאחר הניסוי. השליכו את הפגר בהתאם למדיניות המתקן.
  7. מבודדים את כל הכבד החוצה ללא כיס המרה למדיום הכביסה של 30 מ"ל בצלחת פטרי על קרח.
  8. קרעו אותו לחתיכות עם מלקחיים כדי לשחרר הפטוציטים ראשוניים לתמיסה. שלב זה יהפוך את מדיום הכביסה לתמיסה עכורה מלאה בהפטוציטים ראשוניים משוחררים וחתיכות כבד קטנות.
  9. סנן את הפתרון המעונן בשלב 2.8 דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך 20 מ"ל 1x Percoll-HBSS בצינור 50 מ"ל על קרח. מערבבים על ידי היפוך הצינור 20 פעמים.
  10. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  11. בתוך מכסה התרבית רקמה, שאפו את הסופרנטנט. לשטוף את הכדור עם 30 מ"ל קר של מדיום לשטוף.
  12. צנטריפוגה ב 50 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  13. הסר את ה-supernatant והחזיר את הכדור ב-25 מ"ל של מדיום התרבית (או נפחים אחרים מתאימים) בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה.
  14. ספרו את מספר התאים וצלחו את התאים על גבי לוחות התרבית הרצויים על פי התכנון הניסיוני.
    הערה: הפטוציטים ראשוניים המבודדים כראוי מעכבר אחד בן 8 שבועות בדרך כלל מספיקים כדי להיות מצופים על ארבע צלחות של 6 בארות או ארבע צלחות של 12 בארות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת לבחון את היעילות, פרוטוקול הבידוד הראשוני הנוכחי של הפטוציטים בוצע על נקבות עכברי C57BL/6 בנות 8 שבועות. ההתקשרות והטוהר של הפטוציטים ראשוניים מבודדים נבדקו. בידוד ראשוני של הפטוציטים משמש למגוון רחב של ניסויים בפיזיולוגיה של הכבד, כגון השפעות תרופות בכבד ומטבוליזם של גלוקוז, פעילות סמנים ביולוגיים תרופתיים2, רגישות לאינסולין וייצור גלוקוז. לכן, הפעילות של hepatocytes הראשיים שבודדו עם פרוטוקול זה נבדקו בניסויים הבאים.

הציפוי לא היה נדרש להצמדת הפטוציטים ראשונית בפרוטוקול הנוכחי
הפטוציטים ראשוניים שבודדו היו מצופים ב 5 x 105 תאים / באר על צלחת 6 באר. לאחר שעה אחת נצפתה התקשרות איתנה, והפטוציטים ראשוניים התרחבו במלואם 12 שעות לאחר הציפוי (איור 3). זה הצביע על כך ש-12 שעות לאחר הציפוי, התאים היו מוכנים לשימוש לניסויים. בהתבסס על המורפולוגיה הגרעינית של הפטוציטים של עכברים בתוך הכבד, הפטוציטים חד-גרעיניים הועשרו בגבולות, בעוד שהפטוציטים בינוקליאריים/פולינו-גרעיניים, חתימה של התמיינות סופנית, היו באמצע 3,4. כמות משמעותית של תאים שצולמו הציגה מורפולוגיה טיפוסית של גרעין כפול (דיפלואידי), המעידה על הצלחתם של בידוד וטיהור הפטוציטים ראשוניים חיים. זה גם מצביע על כך שציפוי קולגן אינו דרישה לחיבור הפטוציטים ראשוני עם פרוטוקול זה.

הטוהר הועשר באוכלוסיית הפטוציטים הראשונית המבודדת
סמני גנים ספציפיים לסוג התאים השונים שימשו בפרוטוקולים קודמים לבדיקת טוהר הפטוציטים ראשוני מבודד (טבלה 1). TTR (טרנסתירטין), CD95 (אשכול של התמיינות 95, הידוע גם בשם Fas), ASGR1 (קולטן Asialoglycoprotein 1) ו- ASGR2 הם סמנים להפטוציטים. לאחר הבידוד, רמות ה-mRNA של סמני הפטוציטים אלה עלו באופן משמעותי, בהשוואה לכבד כולו (איור 4A-D,H).

פרוטוקול זה גם הפחית מאוד את ההפרעות מתאי כבד אחרים. הנוכחות של תאי מערכת החיסון, תאי סטלטים ותאי אנדותל הייתה נמוכה יותר, כפי שהוכחה על ידי ירידה חדה ברמות ה-mRNA של CD45 (סמן תאי מערכת החיסון), COL1A1 (קולגן, סוג I, אלפא 1, סמן תאי סטלטים) ו-TIE2 (Tunica interna endothelial Cell kinase, סמן תאי אנדותל), בהשוואה לכבד כולו (איור 4E-H ). אלה מצביעים על כך שפרוטוקול זה יכול לטהר את אוכלוסיית ההפטוציטים העיקרית מתאי הכבד ובכך להפחית את ההפרעה האפשרית מסוגי תאים אחרים בניסויים.

פעילותם של סמנים ביולוגיים פרמצבטיים נשמרה
סמנים ביולוגיים על הפטוציטים שימשו באופן נרחב למיקוד ואספקה של תרופות. שימור הפעילות של סמנים ביולוגיים פרמצבטיים הוא אפוא נקודת מפתח בבידוד הפטוציטים ראשוני והוא תקן לבדיקת התועלת של בידוד הפטוציטים ראשוני2. סמני הפטוציטים ASGR1 ו- ASGR2 משמשים באופן זה2. בדקנו לראשונה את רמת הביטוי של מהלך הזמן של שני סמנים אלה לפני ואחרי ציפוי הפטוציטים ראשוני. לאחר הציפוי, רמת ה-mRNA שלהם ירדה במידה ניכרת עם הזמן, אך הרמות נשארו משמעותיות בהשוואה לכבד כולו עד לנקודת הזמן של 12 שעות לאחר הציפוי, במיוחד עבור ASGR1 (איור 5A,B). מגמת הביטוי עלתה בקנה אחד עם דו"ח קודם2 והצביעה על בריאות הפטוציטים ראשונית דומה. פתוגנים שונים מתמקדים ב-CD81, חלבון הקשור לקרום הפטוציטים, כדי להקל על כניסתם לתאים ולזיהום, כמו נגיף הפטיטיס5, פלסמודיום פלציפרום ופלסמודיום יואלי6. חלבונים אחרים הממוקמים על ידי קרום הפטוציטים, כמו TLR4 (קולטן דמוי אגרה 4), ממוקדים גם הם על ידי פתוגנים וחשובים לתגובה החיסונית של הפטוציטים7. לאחר הציפוי, רמת הביטוי של CD81 הייתה עקבית עד 48 שעות (איור 5C). רמת הביטוי TLR4 עלתה בדרך כלל, אך לא עד אחרי 48 שעות, אז היא הגיעה לרמה גבוהה יותר מ-in vivo (איור 5D). אלה מצביעים על כך שהפטוציטים ראשוניים שבודדו על ידי פרוטוקול זה יכולים לשמש גם למחקרי CD81 ו- TLR4 תוך 48 שעות לפחות לאחר הציפוי. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך שהפטוציטים ראשוניים שבודדו תקפים לשימוש במחקרים הקשורים לסמנים ביולוגיים פרמצבטיים. ראוי לציין כי רמות הרנ"א והחלבון עשויות להיות לא עקביות בגלל השפעות של פעילויות פוסט-שעתוק כמו נדידת רנ"א המושרה על ידי פפטידי אותות, שינוי פוסט-טרנסלציוני ו/או פירוק חלבונים. לכן, רמת החלבון ואימות הפעילות הביולוגית של סמנים ביולוגיים פרמצבטיים שזוהו על ידי mRNA עשויים להיות נחוצים במידת הצורך על ידי הפרדיגמה הניסויית.

הפטוציטים ראשוניים מבודדים היו רגישים לאינסולין
כמו כן נותחו ביצועים ראשוניים של הפטוציטים בניסויים של חילוף חומרים של גלוקוז. אינסולין, הורמון הממלא תפקיד מרכזי בחילוף החומרים של הגלוקוז, מקטין את רמת הגלוקוז, ומקדם ספיגה ואחסון של גלוקוז בכבד באמצעות זרחון AKT ו-FOXO1 (תיבת מזלג O1). לכן, בדיקת רגישות לאינסולין בוצעה עם הפטוציטים ראשוניים מבודדים. לאחר 16 שעות, התאים הורעבו במשך 3 שעות, עם מדיום ללא סרום. ב-0.5 השעות האחרונות של הרעב, אינסולין של 100 ננומטר הופעל על ידי מדיום התרבית. כפי שניתן לראות באיור 6A-C, אינסולין קידם באופן משמעותי את הזרחון הן של AKT ב-Ser473 והן של FOXO1 ב-Ser256, מה שמעיד על הרגישות של הפטוציטים ראשוניים לאינסולין. זה מצביע על כך שההפטוציטים הראשוניים המבודדים מהפרוטוקול הנוכחי שימושיים במחקרי חילוף חומרים של אינסולין/גלוקוז.

הפטוציטים ראשוניים מבודדים היו מסוגלים לייצר גלוקוז
לא רק שהם מרכז לאחסון גלוקוז, אלא שהפטוציטים אחראים גם לייצור גלוקוז. כדי לבדוק אם ההפטוציטים העיקריים שבודדנו מועילים במחקרים על ייצור גלוקוז, התאים הורעבו במשך 10 שעות בנוכחות גלוקגון כדי לעורר את ייצור הגלוקוז. לאחר מכן נאסף מדיום הרעב לצורך בדיקת גלוקוז, בעוד שהתאים נקטפו לצורך כתם מערבי. Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) הוא מרכיב חיוני בייצור גלוקוז בכבד, השולט על קצב8 שלו. רמת החלבון של PEPCK עלתה באופן משמעותי לאחר טיפול בגלוקגון, מה שמרמז על כך שמסלול ייצור הגלוקוז הופעל (איור 7A,B). הפעלה זו אושרה עוד יותר על ידי רמה מוגברת של ייצור גלוקוז (איור 7C). תופעה זו אושרה גם עם ממריצים אחרים לייצור גלוקוז כמו פורסקולין ו-IBMX (איור 7A-C). עם זאת, בשל המגבלה של ניסוי זה, לא יכולנו לאמת אם ייצור הגלוקוז היה בלעדי באמצעות גלוקונאוגנזה או אם יש גם מרכיב בגליקוגנוליזה.

Figure 1
איור 1: הגדרת ספסל. (A) הגדרת הספסל לבידוד ראשוני של הפטוציטים. (B) מערך הספסל המצויר לבידוד הפטוציטים ראשוני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: כריתת עכבר, זלוף וטיהור הפטוציטים ראשוני. (A) העכבר המנותח, עם חיצים המצביעים על הכבד, ה-IVC והווריד הפורטלי. (B) החדרת קטטר לתוך IVC. (C) וריד פורטל לוחץ הגורם להגדלה ולנוקשות של לולאות כבד, מה שמעיד על זלוף מוצלח. (D) רפיון כבד מרוכך לאחר זלוף, מה שמעיד על הצלחת העיכול של קולגןאז. (E) מיקום כיס המרה בכבד המבודד (חץ המצביע על כיס המרה). (ו) הסרת כיס המרה. (G) כבד קרוע במדיום שטיפת הפטוציטים. (H) ערבוב 1x Percoll-HBSS עם הפטוציט ראשוני מסונן לפני צנטריפוגה. (I, J) כדור הפטוציטים ראשוני אחרי צנטריפוגה. (K) החייאה ראשונית של הפטוציטים בתוך מדיום שטיפת הפטוציטים. (ל, ז) גלולת הפטוציטים ראשונית שנוצרה בתוך מדיום שטיפת הפטוציטים לאחר צנטריפוגה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הפטוציטים ראשוניים לאחר ציפוי. התמונות צולמו לאחר (A)1 שעות, (B, C) 12 שעות, (D) 24 שעות, (E) 36 שעות, (F) 48 שעות, (G) 72 שעות, ו-(H) ציפוי הפטוציטים ראשוני של 96 שעות. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: טוהר הפטוציטים ראשוני משופר לאחר בידוד. RNA בודד לפני (מהכבד כולו) ואחרי (מהפטוציטים ראשוניים מבודדים) בידוד ראשוני של הפטוציטים, ואחריו PCR שעתוק הפוך, על פי פרוטוקולקודם 9. טוהר הפטוציטים העיקרי הוערך על ידי PCR בזמן אמת עם פריימרים לסמני הפטוציטים (A) TTR , (B) CD95, (C) ASGR1 ו- (D) ASGR2, בעוד גם עם סמן תאי מערכת החיסון (E) CD45, (F) סמן תאי סטלה COL1A1, ו-(G) סמן תאי האנדותל TIE2. (H) מפת חום נוצרה עבור שינויי ביטוי של סמני סוג התא לפני ואחרי בידוד הפטוציטים ראשוני. GAPDH (גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרוגנאז) שימש כבקרה פנימית. פריימרים המשמשים כאן היו עבור גנים (רצפי פריימרים נמצאים בטבלה 2. הפניות לרצף מצוטטות כאן): TTR10; CD9511; ASGR112; ASGR213; CD4514; COL1A115; TIE216; גאפדה17. גרפים ומפת חום נוצרו עם GraphPad פריזמה 8. סרגל השגיאות מציין סטיית תקן, ושני זנבות לא מזווגים (מכיוון שדגימות הפטוציטים ראשוניות וכבד שלם לא נצבעו מכיוון שפרוטוקול זה דורש כבד שלם מלכתחילה) משמעות הבדיקה של t מסומנת על ידי כוכביות (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). N =7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: ביטוי של סמנים ביולוגיים פרמצבטיים. RNA בודד מכל הכבד והפטוציטים ראשוניים לאחר הציפוי, ואחריו PCR של שעתוק הפוך. הביטוי של סמנים ביולוגיים פרמצבטיים הוערך על ידי PCR בזמן אמת עם פריימרים עבור (A) ASGR1, (B) ASGR2, (C) CD81 ו- (D) TLR4. GAPDH שימש כבקרה פנימית. פריימרים חדשים ששימשו כאן היו לגנים (רצפי פריימרים נמצאים בטבלה 2). הפניות לרצף מצוטטות כאן): CD8118; TLR419. גרפים נוצרו עם GraphPad פריזמה 8. N = 5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 6
איור 6: רגישות לאינסולין נשמרת לאחר בידוד ראשוני של הפטוציטים. (B) p-AKT (S473)/AKT בצפיפות של כתם מערבי. (C) p-FOXO1 (S256)/FOXO1 בצפיפות של כתם מערבי. בדיקת רגישות לאינסולין בוצעה 16 שעות לאחר ציפוי הפטוציטים ראשוני. הפטוציטים ראשוניים הורעבו במשך 3 שעות במדיום E של ויליאם (תוסף גלוטמקס) ללא FBS אך עם תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקרוטית של 1% ועם טיפול באינסולין של 100 ננומטר ב-30 הדקות האחרונות, לפני שנקצרו לתזה של חלבון עם 1x RIPA buffer. גרפים נוצרו עם GraphPad פריזמה 8. הדמיית כתם מערבית בוצעה באמצעות LI-COR Odyssey CLx. סרגל השגיאה מציין סטיית תקן, ומשמעות מבחן t זוגית דו-זנב מסומנת על ידי כוכביות (* p < 0.05; ** p < 0.01). N = 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 7
איור 7: בדיקת ייצור גלוקוז. (A) כתם מערבי של PEPCK ו-GAPDH לאחר טיפול בגלוקגון או פורסקולין+IBMX למשך 10 שעות (B) צפיפות של רמת החלבון PEPCK בהשוואה ל-GAPDH לאחר טיפול בגלוקגון או פורסקולין+IBMX במשך 10 שעות (C) רמת גלוקוז בהשוואה לרמת החלבון לאחר טיפול בגלוקגון או פורסקולין+IBMX במשך 10 שעות. בדיקת ייצור גלוקוז בוצעה 16 שעות לאחר ציפוי הפטוציטים ראשוני. הפטוציטים ראשוניים הורעבו במשך 10 שעות ב-DMEM ללא גלוקוז ופנול ללא אדום (נוסף עם 2 mM L-גלוטמין, 2 mM נתרן פירובט, 20 mM נתרן L-לקטט, 1% Pen Strep), עם גלוקגון 50nM או 20 μM פורסקולין ו-200 μM IBMX. המדיום נקטף למדידת ריכוז הגלוקוז באמצעות ערכת בדיקת גלוקוז, בעוד שהחלבון נקטף עבור כתם מערבי. הדמיית כתם מערבית בוצעה באמצעות LI-COR Odyssey CLx. סרגל השגיאה מציין סטיית תקן, ומשמעות מבחן t זוגית דו-זנבית מסומנת על ידי כוכביות (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001). N = 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

זמני צנטריפוגה הסרת כלוב צלעות מאגרי פרפוזיה ליצירה עצמית קשר כירורגי חימום מנורה ציפוי צלחת כמות תאים מבודדת/עכבר צנטריפוגה הדרגתית גנים של סמן טוהר
פרוטוקול נוכחי 2 לא לא לא לא לא 2.5–4 x 107 כן TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2
Severgnini et al.2. 4 כן כן כן כן כן 1.8–2 x 107 לא TTR, CD45, COL1A1, TIE2
Gonçalves et al.24. 5 או 6 לא לא לא לא כן 1–3 x 106 כן CD45, CD95
Li et al.20. 4 או 5 לא כן כן לא לא הוזכר 1–4 x 107 לא N/A
סאלם ואח' 21. 3 לא כן לא לא לא הוזכר 2 x 107 כן N/A
קברל ואח' 22. 3 או 6 (עם צנטריפוגה הדרגתית) לא כן כן לא כן/מומלץ N/A אופציונלי N/A (טוהר מוערך על ידי מיקרוסקופיית אור)
Korelova et al.23. 3 לא כן כן לא כן N/A כן N/A

טבלה 1: השוואה בין פרוטוקולי הפטוציטים ראשוניים.

פריימר (קדימה) פריימר (הפוך) הפניה
TTR קדימה 5'-3': AGCCCTTTGCCTCTGGGAAGAC TTR הפוך 5'-3': TGCGATGGTGTAGTGGCGATGG 10
CD95 קדימה 5'-3': ATGCACACTCTGCGATGAAG CD95 הפוך 5'-3': CAGTGTTCAGCAGCCAGGAGA 11
ASGR1 קדימה 5'-3': GAGTCGAAGCTGGAAAAACAG ASGR1 הפוך 5'-3': CCTTCATACTCCACCCAGTTG 12
ASGR2 קדימה 5'-3': CTACTGGTTTTCTCGGGATGG ASGR2 הפוך 5'-3': CAAATATGAAACTGGCTCCTGTG 13
CD45 קדימה 5'-3': GAACATGCTGCCAATGGTTCT CD45 הפוך 5'-3': TGTCCCACATGACTCCTTTCC 14
COL1A1 קדימה 5'-3': GAAGCACGTCTGGTTTGGA COL1A1 הפוך 5'-3': ACTCGAACGGGAATCCATC 15
TIE2 קדימה 5'-3': ATGTGGAAGTCGAGAGGCGAT TIE2 הפוך 5'-3': CGAATAGCCATCCACTATTGTCC 16
GAPDH קדימה 5'-3': CGACTTCAACAGCAACTCCCACTCTCTTCC GAPDH הפוך 5'-3': TGGGTGGTCCAGGGTTTCTTACTCCTT 17
CD81 קדימה 5'-3': CCAAGGCTGTGGTGAGACTTTC CD81 הפוך 5'-3': GGCTGTTCCTCAGTATGGTGGטאג 18
TLR4 קדימה 5'-3': ACCTGGCTGGTTTACACGTC TLR4 הפוך 5'-3': CTGCCAGAGACATTGCAGAA 19

טבלה 2: רשימת פריימרים: פריימרים המשמשים לגנים TTR, CD95, ASGR1, ASGR2, CD45, COL1A1, TIE2, GAPDH, CD81 ו- TLR4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פותחו פרוטוקולים שונים לבידוד הפטוציטים ראשוניים. הם גם נשמרו מותאמים ומותאמים בהתאם לצרכים שונים (טבלה 1). פרוטוקולי בידוד מורכבים בדרך כלל משני חלקים: פרפוזיה (כולל עיכול אנזים) וטיהור.

ניתן לבצע את הזלוף עם כל הכבד in vivo 2,20,21,22,23 או עם אונות כבד מנותחות 24. הזלוף של אונות מנותחות הוגבל בדרך כלל לאונות השמאליות והבינוניות לצורך קלות טכנית. תיאורטית, פרפוזיה in vivo אמורה להניב יותר הפטוציטים ראשוניים בשל השימוש בכבד כולו עם כל האונות. שמירה על הכבד במקומו במהלך ההזלפה עשויה גם להפחית את מוות התאים שכן הפטוציטים in vivo יכולים להיות שטופים בנוזל, או בדם או במאגרי פרפוזיה, בכל עת במהלך שלב זה.

שמירה על תנאים סטריליים גם משחקת תפקיד חשוב בשלב זה. אם המצב מאפשר, עדיף לבצע זלוף במכסה מנוע נקי. כל הכלים עם מגע ישיר לרקמות צריך להיות סטרילי, אשר ניתן להשיג על ידי autoclave. על מנת למנוע כל זיהום מחיידקים ופטריות, נוספה תמיסה אנטיביוטית-אנטי-מיקרומיקטית למדיום התרבית.

ה- IVC ו- portal vein הם שני כלים עיקריים המחברים את הכבד עם איברים אחרים. רוב הפרוטוקולים משתמשים בכל אחד מהוורידים האלה כדי להכניס מחטים לצורך פרפוזיה: IVC 2,20,21,23, וריד פורטל 22. מיקום וריד הפורטל הוא בזווית מוטה, מה שמוביל לקושי במיקום וייצוב המחט המוחדרת. לפיכך, בדרך כלל יש צורך בתפר כדי לקשור את המחט במקום עם קשר כירורגי, אשר חייב להיעשות בזהירות רבה מכיוון שהווריד נוטה לנזק. בדרך כלל, קוטר וריד הפורטל הוא גם קטן יותר מאשר IVC, מה שמסבך את החדרת המחט. בהתחשב בכך, השימוש ב- IVC יכול להיות נוח יותר, אם כי בפרוטוקולים מסוימים, המחט קשורה גם בניתוח ל- IVC20. דווח כי זלוף עם החדרת IVC הביא לפחות הפטוציטים ראשוניים בני קיימא מאשר וריד פורטל25. עם זאת, בפרוטוקול הנוכחי, השתמשנו בהצלחה בהחדרת IVC, והכדאיות הראשונית המבודדת של הפטוציטים (>96% בתנאים ממוטבים, שנמדדה עם צביעת Tripan Blue על פי פרוטוקול היצרן) הייתה גבוהה, אם לא יותר, כמו פרוטוקולים אחרים (משתנה בין 80% ל -96% בהתבסס על פרוטוקולים ותנאים 2,22,23,24).

ישנן שתי מטרות לשלב הזלוף: לשטוף דם מתוך אונות הכבד ולעכל את הכבד כדי לשחרר הפטוציטים ראשוניים. על מנת להשיג מטרות אלה, יש להשתמש לפחות בשני מאגרים, אחד לשטף דם (Flux Buffer), ואחד לעיכול (חיץ עיכול). רוב הפרוטוקולים מכינים מאגר שטף מבוסס HBSS ומוסיפים בתוכו קולגן כדי להפוך אותו למסוגל לעיכול, כחוצץ עיכול. ההכנה של מאגרים אלה גוזלת זמן רב, והמאגרים יכולים להשתנות מעט בתכונות עדינות מסוימות, כמו pH, מאצווה לאצווה, ולכן מציגים משתנים לא קרואים. בהתחשב בכך, שימוש במאגרים הזמינים באופן מסחרי חוסך עבודה וזמן יקרים תוך מזעור משתנים אלה. Gibco פיתחה פרוטוקול לבידוד ראשוני של הפטוציטים מחולדותבוגרות 26, המבוסס על שימוש במדיום זלוף כבד זמין מסחרית (כמאגר שטף), ובמדיום עיכול כבד (כחוצץ עיכול). עכבר וחולדה, כמכרסמים, חולקים קווי דמיון גבוהים בתכונות הגוף; אפשר לשלב את שני המאגרים הממוטבים לחולדות האלה בבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים. ואכן, גונסלבס ואחרים. 24, ביצע בהצלחה את הזלוף של אונות כבד מנותחות עם מאגרים אלה, מה שמעלה את ההבטחה של השימוש בהם בזלוף הכבד in vivo. כאן בדקנו בהצלחה את מדיום עיכול ההצפיה של הכבד ואת מדיום העיכול בכבד בפרוטוקול הפטוציטים הראשוני הנוכחי של העכבר, שהניב הפטוציטים ראשוניים באיכות גבוהה (איור 3 ואיור 4).

הטמפרטורה של מאגר הזלוף קובעת עד כמה הפטוציטים ראשוניים שורדים את הבידוד. אם הטמפרטורה גבוהה מדי, הקולגנאז בתוך מאגר העיכול עשוי להפחית את הפעילות; אם נמוך מדי, הפטוציטים העיקריים עלולים לסבול מהלם קר, מה שגורם לתפוקת בידוד אפשרית. הזמן שלוקח למאגר לזרום דרך צינורות זלעפות קובע גם את טמפרטורת החיץ כאשר הוא מגיע לכבד. בפרוטוקולים קודמים, 40 °C2 או 42 °C21 אמבטיית מים שימשה. טמפרטורה זו עשויה להיות כפופה לשינויים בהתאם לתנאי המעבדה, כמו טמפרטורת הסביבה, אורך צינור הזלוף וסוג המשאבה הפריסטלטית. בפרוטוקול הנוכחי, לאחר מספר פעמים של בדיקות, ביצענו אופטימיזציה של טמפרטורת אמבט המים כך שתהיה 45 מעלות צלזיוס כדי לחמם את המאגרים.

הטוהר של הפטוציטים ראשוניים מבודדים ממלא תפקיד חשוב בניסויים הבאים, שכן ככל שיחס הטוהר גבוה יותר, כך פחות הפרעה אפשרית. למרות שהכבד מורכב בעיקר מהפטוציטים, המהווים 60%-80% במסה27, קיימים גם סוגים שונים של תאים אחרים, כמו תאי מערכת החיסון, תאי סטלטים ותאי אנדותל, החשובים לפעילות אימונולוגית של הכבד. כל אחד מהתאים האלה יכול לפרסם הפרעה פוטנציאלית בניסויים מאוחרים יותר28. לדוגמה, תאי סטלה בכבד מגיבים גם הם לפלישות של פתוגנים ולפגיעות בכבד, הכרוכות ביצירתצלקת 29. במספרים, 5%-8% מכלל אוכלוסיית תאי הכבד נתרמת על ידי תאי סטלאט30. בדרך כלל, תאי סטלה נמצאים במצב שקט, אך מצב זה יכול להישבר כאשר קיימים לחצים. לכן, פעילות תאי סטלטים עשויה להיות מופעלת על ידי לחצים שהוכנסו במהלך הבידוד או הטיפול שלאחר מכן אם חלק מהתאים האלה יישארו במאגר הפטוציטים הראשוני המבודד הסופי. סוגים אחרים של תאים תורמים גם הם לחלק ניכר מאוכלוסיית תאי הכבד, כמו תאי אנדותל סינוסואידליים בכבד (LSECs), המהווים 20% מכלל אוכלוסיית תאי הכבד31. כיצד לחסל את נוכחותם של תאים אלה היה חלק תמוה בתהליך בידוד הפטוציטים ראשוני. לכן, טיהור הוא חלק מרכזי בבידוד הפטוציטים ראשוני, אשר בדרך כלל מנצל את ההבדלים במשקל ובגודל בין סוגים שונים של תאים. על ידי אופטימיזציה של מהירות הצנטריפוגה ו/או מאגר הטיהור, ניתן להפיל הפטוציטים ראשוניים לתחתית הצינור.

הפרדת תאים חיים מתאים מתים היא גם קריטית בהשגת הפטוציטים ראשוניים בריאים וספירת תאים מדויקת. בדרך כלל, ספירת מספר התא היא חובה לאחר טיהור מכיוון שתוצאות הניסויים הרבים משתנות ככל שמפגש התאים משתנה. ניתן להשתמש בריאגנטים צנטריפוגות הדרגתיות בשלב זה כדי למלא משימה זו, כמו פרקול. 36%-40% מהפרקול בצנטריפוגה מפיל תאים חיים ושומר על תאים מתים בסופרנטנט. ביצענו בהצלחה אופטימיזציה של מהירות וזמן הצנטריפוגה כדי להפחית את אוכלוסיית תאי הפטוציטים הלא ראשוניים בפרוטוקול הנוכחי. סמנים ספציפיים לסוג התא שימשו לבדיקת הטוהר של הפטוציטים ראשוניים מבודדים כאן, כמו פרוטוקולים אחרים. סמני הפטוציטים ששימשו כאן היו TTR2, CD9524,32, ASGR133 ו- ASGR234. סמנים לסוגים אחרים של תאים כוללים CD45 (סמן תאי מערכת החיסון), COL1A1 (סמן תאי סטלה), TIE2 (סמן תאי אנדותל)2,35. עם הסמנים האלה, ההפטוציטים העיקריים שבודדו עם הפרוטוקול הנוכחי הראו רמה גבוהה של טוהר (איור 4), בדומה לפרוטוקולים הקודמים 2,24.

במהלך זלוף, קולגןאז ב-Digestion Buffer משחרר את החיבור בין התאים על-ידי פירוק הקולגן בתוך המטריצה החוץ-תאית. זה מוביל לקושי בהשגת תאים במהלך הציפוי. רוב הפרוטוקולים הקודמים דורשים/ממליצים על ציפוי מקדים של צלחות עם קולגן2,22 או ג'לטין24 לחיבור טוב יותר של הפטוציטים ראשוניים. למיטב ידיעתנו, בעוד סאלם ואחרים. 21 ולי ואח'. 20 לא דנו בשלב זה, פרוטוקולים אחרים שנבדקו במחקר זה ציינו/המליצו בבירור על שימוש בצלחות מצופות מראש 2,22,23,24. בפרוטוקול הנוכחי מצאנו כי ציפוי הצלחת אינו נדרש ללוחות מסוגים מסוימים. אמנם איננו בטוחים אם הסיבה לכך הייתה שסוגים שונים של צלחות, במיוחד אם הן מיצרנים שונים, הן בעלות חלקות פני שטח שונה, והאם החלקות המגוונת הזו, אם קיימת אי פעם, ממלאת תפקיד חשוב בהצמדה ראשונית של הפטוציטים, אך כדאי לציין כך שניתן יהיה לדלג על שלב נוסף (ציפוי צלחת) ליעילות. חשוב גם לציין כי פרוטוקול זה מייצר שיעור משמעותי של הפטוציטים מובחנות סופנית, למשל, הפטוציטים דיפלואידים, יחד עם הפטוציטים חד-גרעיניים, בדומה לסינוסואידים כבדיים in vivo.

במחקר זה, היתרונות של פרוטוקולי בידוד הפטוציטים ראשוניים קודמים שולבו, והתהליך היה פשוט ככל האפשר, תוך שימוש בריאגנטים זמינים מסחרית וביטול צעדים מיותרים. שלבי הצנטריפוגה צומצמו בהצלחה לשניים, שהם, למיטב ידיעתנו, המעט ביותר בפרוטוקולים שפורסמו. כדי לאשר את הטוהר והפעילות הביולוגית של הפטוציטים ראשוניים מבודדים, הוערכה רמת הסמנים השונים של תאי הכבד, המאשרים כי הפרוטוקול הנוכחי יכול לשפר מאוד את טוהר הפטוציטים הראשוני ולהפחית אוכלוסיות אחרות של תאי כבד, כגון תאי מערכת החיסון, תאי סטלטים ותאי אנדותל. הפעילות של סמנים ביולוגיים פרמצבטיים כמו ASGR1, ASGR2, CD81 ו-TLR4 השתמרה היטב בהפטוציטים ראשוניים שבודדו עם פרוטוקול עדכני, שאישר גם את הרגישות לאינסולין ואת פעילות ייצור הגלוקוז. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא ההוצאה מכיוון שכל הריאגנטים נרכשו באופן מסחרי ליעילות. לא וידאנו באופן ספציפי שגליקוגנוזה הייתה שלמה בהפטוציטים ראשוניים שבודדו באמצעות הפרוטוקול הנוכחי, וייתכן שהדבר ידרוש מחקר נוסף למחקרים קשורים. לפרוטוקול זה יש שלבי זלוף דומים לאלה הקודמים, כמו Salem et al.21, Severgnini et al.2 ו- Li et al.20, ו- Korelova et al.23, באמצעות הכנסת IVC. מאגרי הזלוף והעיכול שלהם, שעשויים לדרוש עבודה נוספת כדי להתכונן, עשויים גם לעבוד עם הפרוטוקול הנוכחי עם שינוי מועט של זמן העיכול של האנזים. לכן, שילוב ריאגנטים של פרוטוקולים קודמים עם שלבים של הפרוטוקול הנוכחי עשוי גם הוא להיות מועיל, הן ידידותי בזמן והן מבחינה כלכלית.

לסיכום, פותח פרוטוקול משופר ויעיל בזמן ובעבודה לבידוד ראשוני של הפטוציטים מכבד עכברים. פרוטוקול זה משתמש כולו בריאגנטים הזמינים מסחרית וניתן להשלימו תוך כ-35 דקות, החל מניתוח עכבר ועד ציפוי הפטוציטים ראשוניים, ובכך מספק טכניקה שימושית למחקרים ראשוניים הקשורים להפטוציטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 5R01HD095512-02 ל- S.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1x PBS Gibco 10010023
10x HBSS Gibco 14065-056
12-well Plate FALCON 353043 Coating not required
6-well Plate FALCON 353046 Coating not required
anti-AKT Cell Signaling 2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized Sigma-Aldrich A5955
anti-FOXO1 Cell Signaling 97635S
anti-GAPDH Cell Signaling 2118S
anti-p-AKT (S473) Cell Signaling 9271L
anti-PEPCK Santa Cruz SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256) Cell Signaling 84192S
Cell Strainer, 70 µm CELLTREAT 229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN Becton Dickinson 383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red ThermoFisher Scientific A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit BioAssay Systems EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Forskolin MilliporeSigma F3917-10MG
Glucagon Sigma-Aldrich G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211
GraphPad Prism 8 GraphPad Software NA
Hepatocyte Wash Medium Gibco 17704-024
IBMX Cell Signaling 13630S
Insulin Lilly NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL) Hospira Inc NDC 0409-2051-05
L-Glutamine Gibco 25030081
Liver Digest Medium Gibco 17703-034 Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium Gibco 17701-038
Pen Strep Gibco 15140122
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Peristaltic Pump Gilson Minipuls 2 Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish Fisherbrand 08-757-12
Refrigerated Centrifuge Sorvall Legend RT Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate Sigma-Aldrich L7022
Sodium Pyruvate Gibco 11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter CELLTREAT 229745
Syringe, 0.5 mL Becton Dickinson 329461
Syringe, 60 mL Becton Dickinson 309653
Trypan Blue Solution, 0.4% Gibco 15250061
Tube, 15 mL Corning 430052
Tube, 50 mL Corning 430290
Water Bath Tank Corning CLS6783 Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) Gibco 32551020
Xylozine (100 mg/mL) Vetone Anased LA NDC13985-704-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. Hepatocyte media, Thermofisher. , Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021).
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Tags

ביולוגיה גיליון 176 הפטוציטים ראשוניים כבד מטבוליזם עכבר בידוד כבד גלוקוז
פרוטוקול יעיל יותר בזמן ובעבודה לבידוד הפטוציטים ראשוני של עכברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feng, M., Divall, S., Wu, S. An… More

Feng, M., Divall, S., Wu, S. An Improved Time- and Labor- Efficient Protocol for Mouse Primary Hepatocyte Isolation. J. Vis. Exp. (176), e61812, doi:10.3791/61812 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter