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स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन-ट्रांस संक्रमित मानव रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव का प्रेरण और विश्लेषण

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

हम एच 2 ओ2के साथ रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं का इलाज करके, सेल आकृति विज्ञान, व्यवहार्यता, घनत्व, ग्लूटाथिएक और यूसीपी-2 स्तर का विश्लेषण करके एलन ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस-मॉडल के विकास और उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह न्यूरोरेटिनल अध: पतन के इलाज के लिए ट्रांसपोसन-संक्रमित कोशिकाओं द्वारा स्रावित प्रोटीन के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव की जांच करने के लिए एक उपयोगी मॉडल है।

Abstract

ऑक्सीडेटिव तनाव कई अपक्षयी रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जिसमें उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी), एक विकृति शामिल है जो दुनिया भर में ~ 30 मिलियन रोगियों को प्रभावित करती है। यह रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) में कमी की ओर जाता है, उदाहरण के लिए, वर्णक एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ) और ग्रैनुलोसिटे-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ), इसके बाद आरपीई कोशिकाओं का नुकसान, और अंततः फोटोरिसेप्टर और रेटिनल गैंगलियन सेल (आरजीसी) मृत्यु। हम परिकल्पना करते हैं कि पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ को अधिक प्रसारित करने वाली संक्रमित आरपीई कोशिकाओं के उपरेटिनल प्रत्यारोपण द्वारा न्यूरोप्रोटेक्टिव और न्यूरोजेनिक रेटिना पर्यावरण के पुनर्गठन में ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव को कम करके रेटिना अव पतन को रोकने, सूजन को रोकना और सेल अस्तित्व का समर्थन करने की क्षमता है। स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन सिस्टम(SB100X)मानव आरपीई कोशिकाओं का उपयोग पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ जीन से संक्रमित किया गया है और क्यूपीसीआर, पश्चिमी दाग, एलिसा और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके स्थिर जीन एकीकरण, दीर्घकालिक जीन अभिव्यक्ति, और प्रोटीन स्राव दिखाया गया है। कार्यक्षमता और पीडीएफ और जीएम-CSF की शक्ति की पुष्टि करने के लिए संक्रमित आरपीई कोशिकाओं द्वारा स्रावित, हमने संस्कृति में आरपीई कोशिकाओं पर एच 2ओ2-प्रेरितऑक्सीडेटिव तनाव की कमी की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक इन विट्रो परख विकसित की है। सेल संरक्षण सेल आकृति विज्ञान, घनत्व, ग्लूटाथिएक के इंट्रासेलुलर स्तर, UCP2 जीन अभिव्यक्ति, और सेल व्यवहार्यता का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया गया था। दोनों, संक्रमित आरपीई कोशिकाओं ने पीडीएफ और/या जीएम-सीएसएफ और कोशिकाओं को गैर-संक्रमित लेकिन पीडीएफ और/या जीएम-सीएसएफ (व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या संक्रमित कोशिकाओं से शुद्ध) के साथ पूर्वउपचारित किया, गैर-उपचारित नियंत्रणों की तुलना में महत्वपूर्ण एंटीऑक्सीडेंट सेल संरक्षण दिखाया । वर्तमान एच2ओ2-मॉडल कारकों के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल और प्रभावी दृष्टिकोण है जो एएमडी या इसी तरह के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों के इलाज के लिए प्रभावी हो सकता है।

Introduction

यहां वर्णित मॉडल, कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करने के लिएबायोफार्मास्यूटिकल एजेंटों की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण प्रदान करता है। हमने ई-2ओ2-मध्यस्थताऑक्सीडेटिव तनाव पर पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करने के लिए मॉडल का उपयोग किया है, जो ओ2के उच्च स्तर और दृश्यमान प्रकाश के संपर्क में हैं, और फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड झिल्ली के फागोसिटोसिस, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)1,के महत्वपूर्ण स्तर पैदा करते हैं 2. उन्हें आवस्कुलर आयु से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएएमडी)3, 4, 5,6,7,8 के रोगजननों में प्रमुख योगदान मानाजाताहै। इसके अलावा, आरपीई-संश्लेषित न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों में कमी आई है, विशेष रूप से वर्णक एपिथेलियम-व्युत्पन्न कारक (पीईडीएफ), इंसुलिन जैसे विकास कारक (आईजीएफ), और ग्रेनुलोसिट मैक्रोफेज-कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) आरपीई कोशिकाओं की शिथिलता और हानि के लिए अग्रणी, इसके बाद फोटोरिसेप्टर और रेटिनल गैंगलियन सेल (आरजीसी) मृत्यु3,45, 4, 4, 4, . एएमडी एक जटिल बीमारी है जो मेटाबोलिक, कार्यात्मक, आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों के बीच बातचीत से परिणाम देती है4। औद्योगिक देशों में 60 वर्ष से अधिक आयु के रोगियों में9,10वर्ष से अधिक आयु के रोगियों में अएमडी के लिए उपचार की कमी प्रमुख कारण है . पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ को ओवरएक्सपेरिंग करने वाली आनुवंशिक रूप से संशोधित आरपीई कोशिकाओं के सबरेजिनल प्रत्यारोपण द्वारा न्यूरोप्रोटेक्टिव और न्यूरोजेनिक रेटिना पर्यावरण का पुनर्गठन ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव को कम करके रेटिना पतन को रोकने, सूजन को बाधित करने और सेल के अस्तित्व को समर्थन देने की क्षमता रखता है11,12,13,14,15,16 . हालांकि कोशिकाओं को जीन देने के लिए कई तरीके हैं, हमने पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ जीन को अपनी सुरक्षा प्रोफ़ाइल के कारण आरपीई कोशिकाओं को वितरित करने के लिए गैर-वायरल अतिसक्रिय स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन प्रणाली को चुना है, मेजबान कोशिकाओं के जीनोम में जीन का एकीकरण, और गैर-ट्रांसक्रिप्शनल सक्रिय साइटों में वितरित जीन को एकीकृत करने की इसकी प्रवृत्ति जैसा कि हमने पहले17,दिखाया है 18,19.

सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव को हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 ओ2),4-हाइड्रोनोनल (एचएनई), टर्टबुटिल्हेड्रोपेरोक्साइड (एचबीएच), उच्च ऑक्सीजन तनाव, और दृश्यमान प्रकाश (पूर्ण स्पेक्ट्रम या यूवी विकिरण)20,21सहित कई ऑक्सीडेटिव एजेंटों द्वारा विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रेरित किया जा सकता है। उच्च ऑक्सीजन तनाव और प्रकाश के लिए विशेष उपकरणों और शर्तों की आवश्यकता होती है, जो अन्य प्रणालियों के लिए हस्तांतरणीयता को सीमित करता है। एच 2 ओ2,एचएनई औरएचबीएचजैसे एजेंट ऑक्सीडेटिव तनाव आणविक और सेलुलर परिवर्तनों को ओवरलैपिंग करने के लिए प्रेरित करते हैं। हमने पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ की एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि का परीक्षण करने के लिए एच2ओ2 को चुना क्योंकि यह सुविधाजनक और जैविक रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह आरपीई कोशिकाओं द्वारा फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड फैगोसाइटोसिस22 के दौरान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन मध्यवर्ती के रूप में उत्पादित किया जाता है और यह वीवो23में नेत्र ऊतकों में पाया जाता है। चूंकि ग्लूटाथिएक का ऑक्सीकरण आंखों में एच2ओ2 के उत्पादन के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार हो सकता है, इसलिए हमने अपने अध्ययनों में जीएसएच/ग्लूटाथिएक के स्तर का विश्लेषण किया है, जो एच 2 ओ2-प्रेरितऑक्सीडेटिव तनाव और कोशिकाओं की पुनर्योजी क्षमता21, 22से जुड़ेहुएहैं। ग्लूटाथिएक स्तरों का विश्लेषण विशेष रूप से प्रासंगिक है क्योंकि यह आंख24में एंटी-ऑक्सीडेटिव सुरक्षात्मक तंत्र में भाग लेता है। एच 2 ओ2के संपर्क में अक्सर एक मॉडल के रूप में इसका उपयोग आरपीई कोशिकाओं 1,25, 26, 27,28, 29,30की ऑक्सीडेटिव तनाव संवेदनशीलता और एंटीऑक्सीडेंट गतिविधि की जांच करने के लिए किया जाता है, और इसके अतिरिक्त, यह प्रकाश-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति, ऑक्सीडेटिव तनाव21के "शारीरिक" स्रोत के लिए समानताएं दिखाता है।

कार्यक्षमता और न्यूरोप्रोटेक्टिव कारकों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने एक इन विट्रो मॉडल विकसित किया है जो विश्लेषण के लिए पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ को अतिएक्सप्रेस करने के लिए आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं द्वारा व्यक्त किए गए विकास कारकों के एंटी-ऑक्सीडेटिव प्रभाव की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है। यहां, हम बताते हैं कि पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के लिए जीन से संक्रमित आरपीई कोशिकाएं गैर-संक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में एच2ओ2 के हानिकारक प्रभावों के लिए अधिक प्रतिरोधी हैं, जैसा कि सेल आकृति विज्ञान, घनत्व, व्यवहार्यता, ग्लूटाथिएक का इंट्रासेलुलर स्तर, और UCP2 जीन की अभिव्यक्ति से पता चलता है, जो माइटोकॉन्ड्रियल अनकोपलिंग प्रोटीन 2 के लिए कोड है जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस)31को कम करने के लिए दिखाया गया है ।

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Protocol

मानव आंखों के संग्रह और उपयोग के लिए प्रक्रियाओं को कैंटोनल एथिकल कमीशन फॉर रिसर्च (संख्या 2016-01726) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. सेल अलगाव और संस्कृति की स्थिति

  1. मानव ARPE-19 सेल लाइन
    1. संस्कृति 5 x 105 ARPE-19 कोशिकाओं, एक मानव RPE सेल लाइन, Dulbecco संशोधित ईगल के मध्यम/पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 हैम (DMEM/हैम एफ-12) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), ८० यू/एमएलए पेनीसिलिन, के साथ पूरक 80 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2.5 μg/ml एम्फोटेट्रीसिन बी (पूरा माध्यम) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक T75 फ्लास्क में 5% सीओ2 और 95% हवा के आर्द्र वातावरण में (अन्य सेल घनत्व के लिए तालिका 1 देखें)।
    2. प्रति सप्ताह तीन बार माध्यम बदलें।
    3. एक बार कोशिकाओं को लगभग 90% संगम (गुणात्मक मूल्यांकन) में विकसित किया जाता है, तो माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को बाँझ 1x पीबीएस से धोएं।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 7-10 मिनट के लिए 5% ट्राइप्सिन-2% ईडीटीए समाधान के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें (वॉल्यूम के लिए टेबल 1देखें)। नेत्रहीन टुकड़ी की निगरानी करें।
    5. 10% एफबीएस युक्त पूर्ण माध्यम जोड़कर ट्राइपिनाइजेशन बंद करें (वॉल्यूम के लिए तालिका 1देखें)।
    6. कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट करें (प्रोटोकॉल के चरण 2 देखें), कोशिकाओं को 1:10 (प्रति सप्ताह एक बार) के अनुपात में उप-खेती करें, या नीचे विस्तृत के रूप में 96-अच्छी प्लेट में बीज (प्रोटोकॉल के चरण 3.3 और 3.4 देखें)।
मध्यम (एमएल)
क्षेत्र (सेमी ²) ARPE-19 कोशिकाओं के लिए सीडिंग घनत्व (कोशिकाओं/ अनुप्रयोग सेल संस्कृति के लिए ट्राइपसिन को रोकने के लिए ट्राइप्सिन (एमएल) की मात्रा
फ्लास्क T75 75 5,00,000 ARPE-19 सेल वृद्धि 10 7 3
6 अच्छी तरह से थाली 9.6 1,00,000 संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं की सीडिंग 3 1 0.5
24 अच्छी तरह से थाली 2 50,000 संक्रमित एचआरपीई कोशिकाओं की सीडिंग 1 0.8 0.2
96 अच्छी तरह से थाली 0.32 संक्रमित कोशिकाओं के साथ ऑक्सीडेटिव तनाव प्रयोगों के लिए 5,000 (अंजीर 1) ऑक्सीडेटिव तनाव प्रयोग 0.2
गैर-संक्रमित कोशिकाओं के साथ ऑक्सीडेटिव तनाव प्रयोगों के लिए 3,000 प्लस प्रोटीन (चित्र 1)

तालिका 1: सेल संस्कृति की मात्रा। सेल संस्कृति प्लेटों और ARPE-19 और प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं की संस्कृति के लिए फ्लास्क के लिए अनुशंसित मीडिया की मात्रा।

  1. प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाएं
    1. थुमान एट अल17द्वारा वर्णित प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं को अलग करें, और संस्कृति कोशिकाओं को 20% एफबीएस के साथ पूरक पूर्ण रूप से पूरा किया जाता है।
    2. प्रति सप्ताह दो बार माध्यम बदलें। एक बार जब कोशिकाएं अधिक वृद्धि से बचने के लिए एफबीएस को 1% तक कम कर देती हैं, तो वे उदारता (निगरानी नेत्रहीन) तक पहुंच जाते हैं।
    3. कोशिकाओं को पार करें (प्रोटोकॉल के चरण 2 देखें), या 96-अच्छी प्लेट में बीज के रूप में नीचे विस्तृत (प्रोटोकॉल के चरण 3.3 और 3.4 देखें)।
      नोट: यहां प्रस्तुत डेटा चार मानव दाताओं की आंखों से प्राप्त RPE कोशिकाओं की संस्कृति से एकत्र किया गया था । तालिका 2 विवरण दृष्टि नेत्र बैंक (सेंट पॉल, एमएन) के लायंस उपहार से दानदाताओं की जनसांख्यिकी । हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार सूचित सहमति प्राप्त होने के बाद आंखों को १२.७ ± ५.७ घंटे (मतलब ± एसडी) पोस्टमार्टम किया गया ।
नहीं उम्र लिंग संरक्षण के लिए मौत (घंटे) अलगाव के लिए मौत खेती खेती ग्राफ में प्रतीक
(दिन) ट्रांसफेक्शन से पहले (दिन) ट्रांसफेक्शन के बाद (दिन)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
औसत 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
एसडी 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

तालिका 2: रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए मानव दाताओं की जनसांख्यिकी।

2. ARPE-19 और प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं का विद्युतप्रण

  1. आर्पीई-19 कोशिकाओं या प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं को प्रोटोकॉल के चरण 1.1.3-1.1.5 में वर्णित किया गया है।
  2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसफैक्शन किट (सामग्रियों की तालिकादेखें) के साथ इलेक्ट्रोपाउरेशन करें।
    1. ARPE-19 कोशिकाओं के ट्रांसफेक्शन के लिए जॉनेन एट अल32 और प्राथमिक एचआरपीई के लिए थुमान एट अल17को संदर्भित करता है। संक्षेप में, resuspend 1 x 105 ARPE-19 कोशिकाओं या 5 x 104 प्राथमिक hRPE कोशिकाओं में 11 μL आर बफर के 11μl में और 0.03 μg युक्त प्लाज्मिड मिश्रण के 2 माइक्रोन जोड़ें pSB100X ट्रांसपोसेज33 और 0.47 μg pT2-CMV-PEDF-अपने या pT2-CMV-GMCSF-अपने ट्रांसपोसन (अनुपात ट्रांसपोसेस: ट्रांसपोसन 1:16) । पीईडीएफ और जीएम-सीएसएफ डबल संक्रमित कोशिकाओं के लिए, 1:16:16 (0.03 माइक्रोग्राम पीएसबी 100X,0.47 माइक्रोग्राम पीटी 2-सीएमवी-पीईडीएफ-उसके, और 0.47 माइक्रोग्राम पीटी 2-जीएमसीएसएफ-उसके) के अनुपात का उपयोग करें। निम्नलिखित इलेक्ट्रोपॉरेशन मापदंडों का उपयोग करें: ARPE-19 कोशिकाओं के लिए 20 एमएस (पल्स चौड़ाई) के लिए 1,350 वी की दो दालें; प्राथमिक कोशिकाओं के लिए 20 एमएस के लिए 1,100 वी की दो दालें।
  3. बीज 1 x 105 संक्रमित ARPE-19 या 5 x 104 संक्रमित प्राथमिक hRPE कोशिकाओं में क्रमशः 6-अच्छी तरह से और 24-अच्छी तरह से प्लेटों में, मध्यम में एंटीबायोटिक दवाओं या एंटीमाइकोटिक्स के बिना 10% एफबीएस के साथ पूरक । ट्रांसफेक्शन के 3 दिन बाद पहले मीडियम एक्सचेंज के साथ पेनिसिलिन (80 यू/एमएल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (80 माइक्रोग्राम/एमएल), और एम्फोटेरिन बी (2.5 माइक्रोग्राम/एमएल) जोड़ें।
  4. कोशिकाओं की साप्ताहिक सूक्ष्म निगरानी द्वारा कोशिका विकास का निर्धारण करें। ट्रांसफेक्शन दक्षता की निगरानी आरटी-पीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण और एलिसा और पश्चिम बंगाल द्वारा प्रोटीन स्राव (अनुपूरक सामग्रीमें समझाई गई विधियां) द्वारा की जाती है।
    नोट: ट्रांसफैक्शन दक्षता का मूल्यांकन पहली बार किया जा सकता है एक बार कोशिकाओं को संकुचन तक पहुंचने के बाद, यानी, ~ 7 दिनों और 4 सप्ताह के बाद ARPE-19 कोशिकाओं और प्राथमिक hRPE कोशिकाओं के लिए ट्रांसफैक्शन, क्रमशः ।
  5. नीचे विस्तृत के रूप में एक ९६ अच्छी तरह से थाली में बीज कोशिकाओं (प्रोटोकॉल के चरण ३.५ देखें) ।

3. ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस इंडक्शन (एच2ओ2 उपचार) और न्यूरोप्रोटेक्शन (पीडीएफ और/या जीएम-सीएसएफ उपचार)

  1. संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं के वातानुकूलित माध्यम की तैयारी
    1. जीन पीडीएफ, जीएम-सीएसएफ, या दोनों से संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं का उपयोग करें (प्रोटोकॉल के चरण 2 देखें); प्रोटोकॉल के चरण 1.1 में वर्णित 28 दिनों के लिए संस्कृति कोशिकाएं।
    2. 28 दिनों के बाद ट्रांसफैक्शन, कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें (प्रोटोकॉल के चरण 1.1.3-1.1.5 देखें), एक न्यूबॉयर चैंबर34,35और बीज 5 x 105 कोशिकाओं का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें, जो प्रोटोकॉल के चरण 1.1.1 में वर्णित है। माध्यम का आदान-प्रदान करें जब सेल संस्कृति लगभग 80% कॉन्फ्लूंट (लगभग 1 सप्ताह के बाद; गुणात्मक रूप से सत्यापित) हो। 24 घंटे के बाद माध्यम ले लीजिए।
    3. उपयोग होने तक माध्यम को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: वातानुकूलित माध्यम में पुनर्संयोजन पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ की पर्याप्त सांद्रता को पश्चिम बंगाल द्वारा सत्यापित किया गया था और एलिसा द्वारा मात्रा निर्धारित की गई थी जैसा कि अनुपूरक सामग्रीमें वर्णित है ।
  2. संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं के वातानुकूलित माध्यम से पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ का शुद्धिकरण
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर चरण 3.1.2 से एकत्र किए गए माध्यम को सेंट्रलाइज करें।
    2. नीचे वर्णित अपने टैग किए गए प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार नी-एनटीए सुपरफ्लो (सामग्रियोंकी तालिका देखें) का उपयोग करें।
      1. नी-एनटीए मिश्रण के पिपेट 30 माइक्रोन को 1.5 एमएल ट्यूब में और 30 एस के लिए 2,600 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। 1x इनक्यूबेशन बफर के 200 माइक्रोन के साथ दो बार गोली धोएं।
      2. 30 एस के लिए 2,600 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें। बफर और रिसिपेंड इनक्यूबेशन 40 माइक्रोन जोड़ें।
      3. 1 मिनट के लिए 2,600 x ग्राम पर 1 घंटे के लिए 70 आरपीएम (कक्षीय शेखर) पर अपकेंद्रित्र वातानुकूलित मध्यम और इनक्यूबेट के 900 माइक्रोन जोड़ें और डिस्कार्ड फ्लो-थ्रू करें।
      4. 1x इनक्यूबेशन बफर के 175 माइक्रोन के साथ दो बार गोली धोएं। 30 एस के लिए 2,600 x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
      5. अपने टैग पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ प्रोटीन को स्पष्ट करने के लिए, 30 एस के लिए 20 मिलियन पर आरटी सेंटींजर में 20 मिनट के लिए एल्यूशन बफर और 70 आरपीएम (कक्षीय शेखर) पर 20 माइक्रोन जोड़ें। सुपरनेट युक्त रीकॉम्बिनेंट पीडीएफ या जीएम-सीएसएफ रखें।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध बीसीए प्रोटीन परख किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके कुल प्रोटीन की मात्रा निर्धारित करें।
    4. उपयोग होने तक प्रोटीन समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: इनक्यूबेशन बफर (4x) में 200 mMNaH 2पीओ4,1.2 एम एनएसीएल, और 40 एमएम इमिडाजोल शामिल हैं; एल्यूशन बफर में 50 m M NaH2पीओ4,300 mm NaCl, और 250 mM इमिडाजोल होता है।
  3. वातानुकूलित मध्यम प्लस एच 2 ओ2(चित्रा 1A) के साथ गैर-संक्रमित ARPE-19/प्राथमिक hRPE कोशिकाओंका उपचार
    1. बीज 3,000 गैर-संक्रमित ARPE-19 (प्रोटोकॉल के चरण 1.1.6 से) या प्राथमिक एचआरपीई (प्रोटोकॉल के चरण 1.2.3 से) कोशिकाओं को अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से प्लेट और संस्कृति में 200 में संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं से वातानुकूलित माध्यम के μL।
    2. संस्कृति 10 दिनों के लिए 10 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 और 95% हवा के आर्द्र वातावरण में। हर दिन वातानुकूलित माध्यम बदलें। 24 घंटे के लिए 350 माइक्रोन एच2O2 करने के लिए कोशिकाओं का पर्दाफाश करें।
    3. ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति का मूल्यांकन करें और ग्लूटाथिएक स्तरों (प्रोटोकॉल के चरण 4.1 देखें), माइक्रोस्कोपी (प्रोटोकॉल के चरण 4.2 देखें), और साइटोटॉक्सीसिटी परख (प्रोटोकॉल के चरण 4.2 देखें) के मात्राकरण द्वारा पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव का निर्धारण करें।
      नोट: प्रयोग की अवधि 12 दिन है. स्पष्ट फ्लैट बॉटम माइक्रोवेल प्लेटों का उपयोग ल्यूमिनेसेंस के साथ-साथ सेल आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है। एक साथ साइटोटॉक्सिकिटी और ग्लूटाथिएक परख करने के लिए, एक ही दिन में कोशिकाओं के साथ दो प्लेटों को वरीयता दी जानी चाहिए।
  4. पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ विकास कारकों के साथ गैर-संक्रमित ARPE-19/प्राथमिक hRPE कोशिकाओं का उपचार प्लस एच2ओ2 (चित्रा1B)
    1. बीज 3,000 गैर-संक्रमित ARPE-19 (प्रोटोकॉल के चरण 1.1.6 से) या प्राथमिक एचआरपीई (प्रोटोकॉल के चरण 1.2.3 से) कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से (96-अच्छी तरह से प्लेटें एक स्पष्ट फ्लैट नीचे के साथ) 500 एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट पीडीएफ और/या ५० एनजी/एमएल रिकॉम्बिनेंट जीएम-सीएसएफ युक्त पूर्ण संस्कृति माध्यम का २०० माइक्रोन, ट्रांस संक्रमित एआरपीई-19 कोशिकाओं या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध के माध्यम से शुद्ध । 5% सीओ2 और 95% हवा के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाएं। पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ विकास कारकों सहित माध्यम को दैनिक रूप से नवीनीकृत करें।
      नोट: विकास कारकों को माध्यम में ताजा जोड़ें।
    2. विकास कारकों के साथ कोशिकाओं के इलाज के ४८ घंटे के बाद, माध्यम को हटा दें और ३५० μM एच2O2 प्लस ५०० एनजी/एमएल पीडीएफ और/या ५० एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ युक्त पूरा माध्यम जोड़ें ।
    3. ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति का मूल्यांकन करें और ग्लूटाथिएक स्तरों (प्रोटोकॉल के चरण 4.1 देखें), माइक्रोस्कोपी (प्रोटोकॉल के चरण 4.2 देखें), और साइटोटॉक्सीसिटी परख (प्रोटोकॉल के चरण 4.2 देखें) के मात्राकरण द्वारा पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव का निर्धारण करें।
      नोट: प्रयोग की अवधि 3 दिन है.
  5. एच 2 ओ2(चित्रा 1C) के साथ संक्रमित ARPE-19/प्राथमिक hRPE कोशिकाओं का उपचार
    1. उत्तर - पश्चिम बंगाल और एलिसा द्वारा संक्रमित कोशिकाओं के पर्याप्त जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्राव को सत्यापित करें जैसा कि अनुपूरक सामग्रीमें वर्णित है .
    2. संक्रमित कोशिकाओं वाले कुओं से माध्यम निकालें (प्रोटोकॉल का चरण 2 देखें)।
    3. प्रोटोकॉल के चरण 1.1.3-1.1.5 में वर्णित कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें। 34,35के न्यूबॉयर कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें .
    4. बीज 5,000 संक्रमित कोशिकाओं/अच्छी तरह से 96-अच्छी तरह से थाली में 200 पूर्ण माध्यम के μL में. 5% सीओ 2 और 95% हवा के आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर24 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाएं। 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को24घंटे के लिए 350 माइक्रोन एच 2 O2 पर बेनकाब करें।
    5. ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति का मूल्यांकन करें और ग्लूटाथिएक स्तरों की मात्रा के मात्राकरण द्वारा पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव का निर्धारण करें (प्रोटोकॉल का चरण 4.1 देखें), माइक्रोस्कोपी (प्रोटोकॉल का चरण 4.2 देखें), साइटोटोक्सीसिटी परख (प्रोटोकॉल के चरण 4.2 देखें), और UCP2 जीन अभिव्यक्ति का निर्धारण (प्रोटोकॉल के चरण 4.3 देखें)।
      नोट: प्रयोग की अवधि 2 दिन है.

Figure 1
चित्रा 1:तीन अलग-अलग प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों में एच2ओ2 परख की समयसीमा। वातानुकूलित मध्यम/पुनर्संयोजन प्रोटीन या ५,० संक्रमित कोशिकाओं के साथ इलाज किए गए ३,००० गैर-संक्रमित कोशिकाओं को एच 2ओ2 के साथ उपचार के लिए ९६-अच्छीप्लेटोंमें वरीयता दी गई थी । वातानुकूलित माध्यम के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं को लगातार 10 दिनों के लिए 100% सुसंस्कृत माध्यम में सुसंस्कृत किया गया था, हर दिन माध्यम बदल रहा है। पुनर्संयोजन विकास कारकों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए, कोशिकाओं को लगातार 3 दिनों के लिए प्रत्येक दिन विकास कारकों की उचित राशि जोड़कर सुसंस्कृत किया गया था । ध्यान दें कि गैर-संक्रमित कोशिकाओं को संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में लंबी संस्कृति अवधि के दौरान अधिक वृद्धि से बचने के लिए प्रति अच्छी तरह से 3,000 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

4. ऑक्सीडेटिव तनाव स्तर और एंटीऑक्सीडेंट क्षमता का विश्लेषण

  1. ग्लूटाथिएक परख
    1. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके ग्लूटाथिएक (जीएसएच) के स्तर को मापें। संक्षेप में, 1x रीएजेंट मिक्स (100 माइक्रोल रिएजेंट/वेल) की तैयार और उपयुक्त मात्रा: लूसिफ़ेरिन-एनटी सब्सट्रेट और ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेस ने रिएक्शन बफर में 1:100 पतला किया।
      नोट: एक 96-अच्छी प्लेट को 1x रीएजेंट मिक्स के 10 एमएल की आवश्यकता होती है, जिसे लूसिफ़ेरिन-एनटी सब्सट्रेट के 100 माइक्रोन और ग्लूटाथिएक एस-ट्रांसफरेज के 10 मिलियन μL को रिएक्शन बफर के 10 मिलियन में जोड़कर तैयार किया जाता है। उपयोग से तुरंत पहले 1x रीएजेंट मिक्स तैयार करें। भविष्य के उपयोग के लिए तैयार रिएजेंट मिक्स स्टोर न करें।
    2. ल्योफिलाइज्ड लूसिफ़ेरिन डिटेक्शन रिएजेंट को रिकंस्ट्रेशन बफर की एक बोतल ट्रांसफर करके लूसिफ़ेरिन डिटेक्शन रिएजेंट तैयार करें।
    3. ग्लूटाथिएक (जीएसएच) मानक समाधान (5 mM) का उपयोग करके एक मानक वक्र तैयार करें। डीएच 2 ओ के साथ पतला 5 m GSH समाधान 1:100 (डीएच2ओ के 990 माइक्रोन में 5 एमएम जीएसएच समाधान के10माइक्रोल जोड़ें)। डीएच 2 ओ के 500 माइक्रोन में 7 धारावाहिक1:1कमजोर करें। प्रत्येक पतला मानक के 10 माइक्रोन को डुप्लिकेट में एक उपयुक्त कुएं में स्थानांतरित करें।
      नोट: ग्लूटाथिएक की अंतिम एकाग्रता 0.039 माइक्रोन से 5 माइक्रोन तक होगी।
    4. खाली (1x रीएजेंट मिक्स) तैयार करें और उपयुक्त कुओं में 10 माइक्रोन (डुप्लिकेट) स्थानांतरित करें।
    5. एच2ओ2- प्रॉप्ड कोशिकाओं को इनक्यूबेटर से हटा दें।
      नोट: ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी (40x) द्वारा एच2ओ2-इलाजकोशिकाओं की आकृति विज्ञान दस्तावेज़।
      जब कोशिकाएं ऑक्सीडेटेड होती हैं, तो वे अधिक गोलाकार और कम फैलती हुई दिखती हैं।
    6. संस्कृति माध्यम को सावधानीपूर्वक आकांक्षी करें। प्रत्येक अच्छी तरह से तैयार 1x रीएजेंट मिश्रण के 100 माइक्रोन जोड़ें। एक कक्षीय शेखर पर 500 आरपीएम पर 15 एस के लिए रिएजेंट के साथ कोशिकाओं को मिलाएं।
    7. 30 मिनट के लिए आरटी में थाली इनक्यूबेट । प्रत्येक अच्छी तरह से पुनर्गठित लूसिफ़ेरिन डिटेक्शन रिएजेंट के 100 माइक्रोल जोड़ें।
    8. एक कक्षीय शेखर पर 500 आरपीएम पर 15 एस के लिए समाधान मिलाएं। आरटी में 15 मिनट के लिए थाली इनक्यूबेट ।
    9. पूर्व-स्थापित कार्यक्रम एडीपी-ग्लो का उपयोग करके प्लेट रीडर का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस निर्धारित करें।
      नोट: ढक्कन के बिना प्लेट रीडर के अंदर प्लेट रखो।
      1. चेंज लेआउट पर क्लिक करें और बेसिक पैरामीटर्समें निम्नलिखित सेटिंग्स चुनें: कोस्टार 96-वेल प्लेट; शीर्ष ऑप्टिक; स्थिति में देरी: 0.1; माप शुरू समय: 0.0; माप अंतराल समय: 1.0; परिणामों को सामान्य करने का समय: 0.0; लाभ डिवाइस द्वारा स्वचालित रूप से समायोजित किया जाता है। रिक्त स्थान, मानकों और नमूनों को परिभाषित करें। स्टार्ट मेजरमेंटपर क्लिक करें ।
      2. एक्सेल फाइल के रूप में डेटा का निर्यात करें। मानक वक्र के इंटरपोलेशन द्वारा प्रत्येक नमूने में जीएसएच की एकाग्रता की गणना करें।
  2. साइटोटॉक्सिकिटी परख और सूक्ष्म विश्लेषण
    1. कोशिकाओं से माध्यम को एस्पिरेट करें और प्रत्येक अच्छी तरह से 1% एफबीएस युक्त पूर्ण माध्यम के 100 माइक्रोन जोड़ें। कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में वापस करें।
      नोट: 1% एफबीएस का उपयोग किया जाता है क्योंकि एफबीएस का उच्च प्रतिशत ल्यूमिनेसेंस के माप में हस्तक्षेप कर सकता है, इसलिए इस मामले में 1% एफबीएस का उपयोग किया जाता है।
    2. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध साइटोटॉक्सिकिटी परख किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता को मापें। संक्षेप में, रिएजेंट मिश्रण तैयार करें जो ल्योफिलाइज्ड सब्सट्रेट में परख बफर को जोड़ते हैं। 5 एमएल परख बफर (एक 96-वेल प्लेट के लिए) में 33 माइक्रोन डिजिऑनिन जोड़कर लाइसिस रिएजेंट तैयार करें। एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, ताजा तैयार रिएजेंट मिश्रण का उपयोग करें। यदि आरटी पर संग्रहीत किया जाता है तो 12 घंटे के भीतर उपयोग करें। 7 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रीएजेंट मिक्स को संग्रहीत किया जा सकता है और इसे -70 डिग्री सेल्सियस पर 4 महीने तक एकल उपयोग वाले एलिकोट्स में संग्रहीत किया जा सकता है। ठंड और विगलन से बचना चाहिए। लाइसिस रिएजेंट को 7 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    3. अनुपचारित ARPE-19 कोशिकाओं के साथ एक मानक वक्र तैयार करें।
      1. प्रोटोकॉल के चरणों 1.1.3-1.1.5 में वर्णित कोशिकाओं को ट्रिप्सिनाइज करें और न्यूबॉयर चैंबर34,35का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। आर टी में 10 मिनट के लिए १२० ग्राम पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें । सुपरनेट को एस्पिरेट करें और डीएमईएम/हैम के एफ12 माध्यम में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें जिसमें 1% एफबीएस 1 x 105 कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए है ।
      2. 1% एफबीएस युक्त 200 माइक्रोन माध्यम में 7 धारावाहिक 1:1 कमजोर पड़ने की तैयारी करें। प्रत्येक मानक के 100 माइक्रोन को उपयुक्त कुओं (डुप्लिकेट) में स्थानांतरित करें। सभी कुओं में 50 माइक्रोन रीएजेंट मिक्स जोड़ें।
    4. एक कक्षीय शेखर पर 500 आरपीएम पर 15 एस के लिए रिएजेंट के साथ कोशिकाओं को मिलाएं। आरटी में 15 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें। प्रोटोकॉल के चरण 4.1.9 में वर्णित प्लेट रीडर का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस को मापें। 15 मिनट के लिए लाइसिस रिएजेंट और इनक्यूबेट के 50 माइक्रोन जोड़ें। प्रोटोकॉल के चरण 4.1.9 में वर्णित प्लेट रीडर का उपयोग करके ल्यूमिनेसेंस को मापें।
    5. व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत की गणना करें: (100 -% मृत कोशिकाएं) और मृत कोशिकाओं का प्रतिशत = [पहला ल्यूमिनेसेंस माप ((नमूने में मृत कोशिकाएं)))/दूसरा ल्यूमिनेसेंस माप (डिजाइनिन उपचार के बाद मृत सभी कोशिकाएं)] x 100।
  3. आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा UCP2 अभिव्यक्ति विश्लेषण
    1. ऊपर वर्णित ट्रांससाइनाइज संक्रमित कोशिकाओं (प्रोटोकॉल के चरण 1.1.3-1.1.5)।
    2. 34,35के न्यूबॉयर कक्ष का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें .
    3. बीज ५,००० संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं/अच्छी तरह से ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में ।
    4. संस्कृति के 24 घंटे के बाद,24घंटे के लिए 350 माइक्रोन एच 2 O2 के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
    5. निर्माता के निर्देश का पालन करने वाली कोशिकाओं की कम संख्या (सामग्रीकी तालिका देखें) से आरएनए के अलगाव के लिए एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके कुल आरएनए को अलग करें।
    6. अनुपूरक सामग्रीमें वर्णित वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) करें। संक्षेप में, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मिश्रण का उपयोग करके रेट्रोट्रांसक्रिप्शन द्वारा सीडीएनए उत्पन्न करें जिसमें एक अनुकूलित एम-एमएलवी रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (सामग्रियों की तालिकादेखें)।
    7. क्यूपीसीआर के लिए प्राइमर (अनुपूरक सामग्रीकी तालिका S1 देखें) और डीएनए टेम्पलेट को छोड़कर सभी घटकों (SYBR ग्रीन सहित) युक्त एक तैयार करने वाली प्रतिक्रिया कॉकटेल को नियोजित करें। निम्नलिखित थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों का उपयोग करें: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर प्रारंभिक डेनैचुरेशन, 15 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर डेनैचेशन के साथ 40 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एनीलिंग, और 32 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर विस्तार।
    8. विश्लेषण36के लिए 2 ^(-ΤCT) विधि का उपयोग करें।
  4. एसडीएस-पेज और पीएटी (Ser473) के पश्चिम बंगाल विश्लेषण के लिए सेल lysate की तैयारी
    1. बीज 3 x 105 जीएम-CSF-संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं/अच्छी तरह से 6-अच्छी तरह से प्लेटों में (≥21 दिन के बाद ट्रांसफैक्शन) निर्धारित करने के लिए कि जीएम-CSF Akt अस्तित्व मार्ग15के सक्रियण के माध्यम से एच2O2 द्वारा नुकसान से आरपीई कोशिकाओं की रक्षा करता है ।
    2. संस्कृति कोशिकाओं के 24 घंटे के बाद24घंटे के लिए 350 माइक्रोन एच 2 O2 के संपर्क में हैं।
    3. रिपा बफर के 1 मिलील को प्रोटीज फॉस्फेटे अवरोधक कॉकटेल के 10 माइक्रोन, 0.5 एम ईडीटीए के 10 माइक्रोन और 8 एम यूरिया के 25 माइक्रोन (एक कुएं के लिए उपयोग की जाने वाली मात्रा) के साथ मिलाएं।
    4. ध्यान से मध्यम आकांक्षी और 1x PBS के साथ कोशिकाओं को धोते हैं।
    5. कोशिकाओं में रिपा बफर मिश्रण की पूरी मात्रा जोड़ें।
    6. पिपेट ऊपर और नीचे।
    7. 1.5 एमएल ट्यूब में lysate ले लीजिए।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    9. सुपरनैंट को एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    10. अनुपूरक सामग्रीमें वर्णित पश्चिम बंगाल द्वारा 15 माइक्रोन में पीएटी के स्तर का निर्धारण करें ।

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Representative Results

मानव रेटिना वर्णक एपिथेलियल कोशिकाओं में ऑक्सीडेटिव तनाव का शामिल करना
ARPE-19 और प्राथमिक hRPE कोशिकाओं को24घंटे के लिए एच 2 O2 की अलग सांद्रता के साथ इलाज किया गया और एंटीऑक्सीडेंट ग्लूटाथिएक के इंट्रासेलुलर स्तर को मात्रा निर्धारित किया गया था(चित्रा 2 ए,बी)। 50 माइक्रोन और 100 माइक्रोनएम पर एच2ओ2 ने ग्लूटाथिएक उत्पादन को प्रभावित नहीं किया, जबकि 350 माइक्रोनएम पर एआरपीई-19 और प्राथमिक एचआरपीई कोशिकाओं में ग्लूटाथिएक की काफी कमी थी। साइटोटॉक्सिकिटी के विश्लेषण से पता चला है कि 350 माइक्रोन एच2ओ2 की सबसे कम एकाग्रता है जो सेल व्यवहार्यता(चित्रा 2 सी)में उल्लेखनीय कमी का कारण बनती है। रूपात्मक रूप से, एआरपीई-19 कोशिकाओं का इलाज एच 2 ओ2 के साथ किया जाता है, जो एच2ओ 2एकाग्रता(चित्र 3)में वृद्धि के साथ अधिक स्पष्ट हो जाते हैं, कम प्रसार और अधिक गोल, विशेषताएं दिखाई देती हैं। पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ-ट्रांस संक्रमित कोशिकाओं के लिए एच 2 ओ2(चित्रा 3)के साथ इलाज किया गया प्रभाव कम प्रमुख था। एच 2O2-मध्यस्थताऑक्सीडेटिव तनाव पर सेल संख्या के प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए, 5,000 और 10,000 ARPE-19 कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से एक सफेद 96-अच्छी तरह की प्लेट में वरीयता दी गई थी; दिन के बाद, कोशिकाओं को24घंटे के लिए 350 μM H 2 O2 के साथ इलाज किया गया और ग्लूटाथिएक के स्तर का निर्धारण किया गया। चित्रा 4 से पता चलता है कि ग्लूटाथिएक का स्तर केवल 5,000 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त कुओं (एन = 3) में कम हो गया था। एच 2ओ2-जनितआरओएस के एंटीऑक्सीडेंट के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए प्रयोगों के लिए, कोशिकाओं की संख्या पर विचार करना आवश्यक है; इस रिपोर्ट में प्रस्तुत विशिष्ट प्रोटोकॉल के लिए 3,000-5,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से (९६-अच्छी तरह सेप्लेटें) ३५० माइक्रोन एच2 2के साथ 24 घंटे के लिए इलाज के लिए महत्वपूर्ण सेल क्षति दिखाने के लिए उपयुक्त हैं, जबकि ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरित सेल क्षति के लिए एक उप तीव्र प्रतिक्रिया नकल उतार ठीक करने की क्षमता को बनाए रखने ।

Figure 2
चित्रा 2:ऑक्सीडेटिव तनाव स्तर ग्लूटाथिएक स्तर और कोशिका व्यवहार्यता के रूप में सबूत, मानव आरपीई कोशिकाओं में एच 2 O2के साथ इलाज किया . (A)ARPE-19 एच2O2 की कई सांद्रता के संपर्क में कोशिकाओं को काफी कम ग्लूटाथिएक स्तर (कोष्ठक में) ३५० माइक्रोनएम (०.६ 6 माइक्रोनएम), 500 माइक्रोन (0.022 माइक्रोनएम), और 700 माइक्रोनएम (0.002 माइक्रोन) की तुलना में एच2ओ-गैर-उपचारित कोशिकाएं (2.9 माइक्रोन) (पी < 0.0001 350 के लिए, 500, और 700 माइक्रोन एच2O2)। (ख)प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं ने ग्लूटाथिएक के स्तर में कमी दिखाई; हालांकि, प्रभाव ARPE-19 की तुलना में कम प्रमुख था, लेकिन अभी भी सांख्यिकीय ३५०, ५००, और ७०० μM एच2O2पर नियंत्रण की तुलना में महत्वपूर्ण है । 350 माइक्रोन सबसे कम एच 2 ओ2एकाग्रता थी जिसने गैर-उपचारित नियंत्रण कोशिकाओं (पी = 0.0022) की तुलना में कम ग्लूटाथिएक स्तरों द्वारा दिखाए गए महत्वपूर्ण ऑक्सीडेटिव क्षति का उत्पादन किया। ग्लूटाथिएक का स्तर बढ़ते एच2ओ2 सांद्रता (500 माइक्रोन: पी = 0.022; 700 माइक्रोन: पी = 0.0005) के साथ कम हो गया। (ग)साइटोटॉक्सिकिटी विश्लेषण से पता चला है कि 350 माइक्रोन एच2ओ2 सबसे कम एकाग्रता थी जिसने व्यवहार्य कोशिकाओं के प्रतिशत में महत्वपूर्ण कमी पैदा की (पी < 0.0001 के लिए 350, 500, और 700 माइक्रोन) । डेटा को एसडी (एन = 3 प्रतिकृति) ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है और महत्वपूर्ण अंतर (*); ANOVA के बाद हॉक गणना है Tukey बहु तुलना परीक्षण का उपयोग कर किया गया सी की तुलना-एच 2 O2-उपचारसमूहों के साथ । सी-: एच2O2 गैर-उपचारित कोशिकाएं। इस आंकड़े को बसुस एट अल37से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:गैर-संक्रमित और पीडीएफ-या जीएम-सीएसएफ-संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं की आकृति विज्ञान एच 2 ओ2के साथ इलाज किया जाता है। एच 2O 2की बढ़ती सांद्रता के साथ इलाज कोशिकाओं संस्कृति कुओं में कम कोशिकाओं को दिखाने के लिए और एक अधिक गोल, कम फैल आकृति विज्ञान, सेलुलर तनाव का एक ज्ञात संकेत प्रदर्शित करते हैं । ध्यान दें कि पीडीएफ-या जीएम-सीएसएफ-संक्रमित कोशिकाओं के लिए, सेलुलर तनाव कम प्रमुख है और गैर-उपचारित नियंत्रण कोशिकाओं के समान बढ़ता है। सी-: गैर-उपचारित नियंत्रण कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एच 2 O2-प्रेरित ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव पर सेल संख्या का प्रभाव। ५,००० और १०,००० ARPE-19 कोशिकाओं/अच्छी तरह से ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में वरीयता प्राप्त किया गया । 24 घंटे के बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 350 माइक्रोन एच2O2 के साथ इलाज किया गया। ग्लूटाथिएक स्तरों में महत्वपूर्ण अंतर 5,000 कोशिकाओं (पी = 0.031, टी-टेस्ट)के साथ वरीयता प्राप्त कुओं में देखा गया था, लेकिन 10,000 कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त कुओं में नहीं। सी-: गैर-उपचारित कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

ऑक्सीडेटिव तनाव की स्थिति में SB100X-संक्रमितमानव आरपीई कोशिकाओं द्वारा वितरित पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव का विश्लेषण
सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, ARPE-19 और प्राथमिक मानव आरपीई कोशिकाओं 5, ५०, या ५०० एनजी/mL व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीडीएफ या जीएम-CSF के साथ 2 दिनों के लिए पहले और 24 एच एच2O2 उपचार के दौरान इलाज किया गया । ARPE-19 कोशिकाओं के साथ इलाज ५०० एनजी/एमएल पीडीएफ या ५० एनजी/एमएल जीएम-CSF ऑक्सीडेटिव शर्तों के तहत अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में काफी अधिक ग्लूटाथिएक का उत्पादन (एच2ओ-2-इलाज)(चित्रा 5A); तुलनीय पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं के संस्कृति मीडिया से शुद्ध एक समान प्रभाव(चित्रा 5B) दिखाया। प्राथमिक एचआरपीई कोशिकाओं में, ५०० एनजी/एमएल पीडीएफ, ५० एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ, या ५०० एनजी/एमएल पीडीएफ प्लस ५० एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ के अलावा चाहे पीईडीएफ द्वारा वातानुकूलित मीडिया से वाणिज्यिक या शुद्ध हो-या जीएम-सीएसएफ संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं ने ग्लूटेशन के स्तर(चित्रा 5C)में महत्वपूर्ण वृद्धि से परिलक्षित कोशिका क्षति को कम किया । संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं से वातानुकूलित माध्यम के साथ 10 दिनों के लिए इलाज प्राथमिक hRPE कोशिकाओं को भी नियंत्रण कोशिकाओं(चित्रा 5D)की तुलना में उच्च ग्लूटाथिएक स्तर दिखाया । इन परिणामों के आधार पर पीडीएफ के लिए 500 एनजी/एमएल और जीएम-सीएसएफ के लिए 50 एनजी/एमएल के साथ आगे के प्रयोग किए गए हैं।

ARPE-19 और प्राथमिक hRPE कोशिकाओं पीईडीएफ के लिए कोडिंग जीन के साथ संक्रमित थे और/या जीएम-CSF स्लीपिंग ब्यूटी ट्रांसपोसन प्रणाली इलेक्ट्रोपॉशन के साथ संयुक्त का उपयोग कर । आरटी-क्यूपीसीआर द्वारा जीन अभिव्यक्ति के ट्रांसफेक्शन और विश्लेषण के बाद, डब्ल्यूबी, एलिसा, और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (पूरक सामग्री, चित्रा S1,और चित्रा S2देखें), 24 घंटे के लिए 350 माइक्रोन एच2ओ2 के संपर्क में आने वाली संक्रमित एआरपीई-19 कोशिकाओं ने गैर-संक्रमित एच 2 ओ-ट्रीटेड कोशिकाओं की तुलना में महत्वपूर्ण उच्चग्लूटाथिएकस्तरदिखाया (चित्रा 6A ). प्राथमिक एचआरपीई कोशिकाओं के लिए, एच 2ओ 2 के साथ इलाज किए गए गैर-संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में पीडीएफ-संक्रमित कोशिकाओं में ग्लूटाथिएक स्तरों में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है जब सभी दानदाताओं को विश्लेषण में शामिल किया गया था। इसके अलावा, दानदाताओं 2 और 3 सभी संक्रमित समूहों (पीडीएफ, जीएम-सीएसएफ, पीडीएफ, और जीएम-सीएसएफ) (डेटा नहीं दिखाए गए) के लिए ग्लूटाथिएक स्तरों में उल्लेखनीय वृद्धि दिखाते हैं।

UCP2 जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव तनाव की परीक्षा से विश्लेषण पूरा किया। 24 घंटे के लिए 350 माइक्रोन एच 2 ओ2 के साथ इलाज किए गए संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं में एक प्रूफ-ऑफ-कॉन्सेप्ट श्रृंखला की गई थी। जैसा कि चित्रा 7में दिखाया गया है, संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं में, एच2ओ2 उपचार के बाद UCP2 जीन अभिव्यक्ति के स्तर में वृद्धि हुई है लेकिन वृद्धि सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं है । चित्रा 8 एच2O2 के संपर्क में जीएम-CSF-संक्रमित कोशिकाओं के एक lysate से फॉस्फोरिलेटेड Akt (pAkt) का एक पश्चिम बंगाल से पता चलता है; सामान्यीकृत डेटा अनुपचारित नियंत्रण की तुलना में केवल एक छोटी सी कमी दिखाता है, यह दर्शाता है कि जीएम-सीएसएफ कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव तनाव क्षति से बचा सकता है।

Figure 5
चित्रा 5:पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ की एंटीऑक्सीडेंट क्षमता के मार्कर के रूप में ग्लूटाथिएक स्तर। (A)500 एनजी/एमएल पीडीएफ या 50 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ के साथ एआरपीई-19 कोशिकाओं के उपचार से पहले और 24 घंटे एच2ओ2 एक्सपोजर के दौरान ग्लूटाथिएक का स्तर 0.83 माइक्रोन (सी) से बढ़कर 1.83 एम (पीडीएफ) और 1.3 एम माइक्रोन (पीडीएफ) हो गया। पी = 0.026 और पी = 0.031, क्रमशः। ग्लूटाथिएक में 5 एनजी/एमएल की एकाग्रता में कोई वृद्धि नहीं देखी गई; ५० और ५०० एनजी/एमएल के बीच ग्लूटाथिएक के स्तर में अंतर या तो पीडीएफ या जीएम-सीएसएफ के लिए महत्वपूर्ण नहीं था । (B)पीडीएफ (५०० एनजी/एमएल) और जीएम-सीएसएफ (५० एनजी/एमएल) संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं के वातानुकूलित मीडिया से शुद्ध व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीडीएफ या जीएम-सीएसएफ (पी = ०.०१८, एनोवा) के समान प्रभाव दिखाया । (ग)500 एनजी/एमएल पीडीएफ का जोड़, ५० एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ, या ५०० एनजी/एमएल पीडीएफ प्लस ५० एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ के लिए 3 दिन पहले और 24 एच एच2O 2 उपचार केदौरान प्राथमिक hRPE कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम के लिए काफी पीडीएफ (२.६ μM [वाणिज्यिक] के साथ इलाज कोशिकाओं में ग्लूटाथिएक के स्तर में वृद्धि हुई 2.5 माइक्रोन [शुद्ध]), जीएम-सीएसएफ (2.9 माइक्रोन [वाणिज्यिक], 3.3 माइक्रोनएम [शुद्ध]), और पीईडीएफ प्लस जीएम-सीएसएफ (3.0 माइक्रोन [वाणिज्यिक], 2.9 माइक्रोन [शुद्ध]) गैर-उपचारित कोशिकाओं (1.9 माइक्रोन) (पी = 0.006, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण) की तुलना में। (घ)पीडीएफ-, जीएम-सीएसएफ-, या पीडीएफ-जीएम-सीएसएफ-संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं से वातानुकूलित माध्यम में 10 दिनों के लिए सुसंस्कृत HRPE कोशिकाओं के लिए ग्लूटाथिएक स्तरों में उल्लेखनीय वृद्धि देखी गई थी इससे पहले कि कोशिकाओं का इलाज एच2ओ2 (पी = ०.००३, Kruskal-Wallis परीक्षण) (एक दाताओं के लिए दिखाया गया डेटा) से । डेटा को डीडी (एन = 3 प्रतिकृति) ± मतलब के रूप में व्यक्त किया जाता है। महत्वपूर्ण मतभेदों के साथ संकेत दिया जाता है (*); विचरण के विश्लेषणों की पोस्ट-हॉक गणनाएं तुकी या डुनेट के बहु-तुलना परीक्षणों की गणना करके की गई थीं, जो पीडीएफ-/जीएम-सीएसएफ-इलाज समूहों के साथ "सी" की तुलना करते थे । सी: केवल एच 2 ओ2,पी के साथ इलाज की कोशिकाएं: पीडीएफ, जी के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं: जीएम-सीएसएफ, पी + जी के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं: पीईडीएफ प्लस जीएम-सीएसएफ के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं। इस आंकड़े को बसुस एट अल37से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ-संक्रमित मानव आरपीई कोशिकाओं की एंटीऑक्सीडेंट क्षमता के मार्कर के रूप में ग्लूटाथिएक स्तर। (क)संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं के ग्लूटाथिएक का स्तर 24 घंटे(56दिनों के बाद ट्रांसफैक्शन) के लिए 350 माइक्रोन एच 2 ओ2 के संपर्क में आने से गैर-संक्रमित कोशिकाओं (1.9 माइक्रोन) की तुलना में काफी अधिक था, यानी पीडीएफ के लिए 3.0 एम- और जीएम-सीएसएफ-ट्रांस संक्रमित सेल, माइक्रोन और डबल संक्रमित कोशिकाओं के लिए 3.4 माइक्रोनएम (पी = 0.0001, इनोवा)। डेटा को डीडी (एन = 3 प्रतिकृति) ± मतलब के रूप में व्यक्त किया जाता है। (ख)डॉट प्लॉट चार अलग-अलग दानदाताओं के लिए मतलब ग्लूटाथिएक मूल्यों को दिखाता है (सी: 0.77 माइक्रोन; पी: 1.45 माइक्रोन; जी: 1.16 माइक्रोन; पी + जी: 1.2 माइक्रोन), जो गैर-संक्रमित और पीडीएफ-संक्रमित कोशिकाओं (पी = 0.028, एवीओए की पोस्ट-हॉक गणनाओं के बीच काफी भिन्न है, तुकी के बहु-तुलना परीक्षणों का उपयोग करके "सी" की तुलना पीडीएफ-जीएम-सीएसएफ-उपचारित समूहों के साथ किया गया था)। जब दानदाताओं का अलग से विश्लेषण किया जाता है, तो दाता एन ° 2 और N ° 3 (ग्राफ में प्रतीक के लिए तालिका 2 देखें) गैर-संक्रमित नियंत्रण (महत्व नहीं दिखाए जाते हैं) की तुलना में सभी संक्रमित समूहों के लिए महत्वपूर्ण अंतर दिखाते हैं) एच2ओ2के साथ इलाज किया जाता है। सी: गैर-संक्रमित कोशिकाएं, पी: पीडीएफ-संक्रमित कोशिकाएं, जी: जीएम-सीएसएफ-संक्रमित कोशिकाएं, पी + जी: पीडीएफ- और जीएम-सीएसएफ-संक्रमित कोशिकाएं। इस आंकड़े को बसुस एट अल37से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7:संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं में UCP2 जीन अभिव्यक्ति एच2O2के साथ इलाज किया । चूंकि UCP2 जीन अभिव्यक्ति का उपयोग माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव क्षति की जांच करने के लिए किया जा सकता है, इसलिए हमने संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं द्वारा पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के अतिउपृष्णता के प्रभाव की जांच की। एच 2 ओ2के साथ इलाज किए गए संक्रमित ARPE-19 कोशिकाओं, भले ही सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं है, ऑक्सीडेटिव तनाव में कमी का संकेत गैर-संक्रमित नियंत्रण की तुलना में बढ़ी हुई UCP2 जीन अभिव्यक्ति दिखाएं, गुना-वृद्धि पीडीएफ-के लिए १.५७, जीएम-सीएसएफ के लिए १.५१ और पीडीएफ के लिए २.३६-प्लस जीएम-सीएसएफ-संक्रमित कोशिकाओं के लिए गैर-संक्रमित नियंत्रण की तुलना में थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8:जीएम-सीएसएफ-ट्रांसफ्रेड एआरपीई-19 कोशिकाओं के सेल lysate से फॉस्फोरिलेटेड अक्ट (Ser473) का पश्चिमी दाग। पश्चिम बंगाल ने प्रदर्शन किया कि जीएम-सीएसएफ दोनों में अक के फॉस्फोरिलेशन को बढ़ाता है, अनुपचारित और एच2ओ2-इलाजसंस्कृतियों (यूटी: ३.३२; एच2O2:2.69)। मानों को गैर-संक्रमित गैर-एच2 ओ-उपचारितकोशिकाओं (सी/यूटी) में सामान्यीकृत कियाजाताहै । सी: गैर-संक्रमित, जी: जीएम-सीएसएफ-संक्रमित कोशिकाएं, यूटी: एच2 ओ 2,एच 2 ओ2:एच2ओ2के साथ इलाज की जाने वाली कोशिकाएं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका S1: प्राइमर जोड़ी दृश्यों और एनीलिंग समय/तापमान आरटी-qPCR के लिए इस्तेमाल किया । कृपया इस टेबल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। 

चित्रा S1: संक्रमित hRPE कोशिकाओं में पीडीएफ और जीएम-CSF जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण। आरटी-क्यूपीसीआर ने सत्यापित किया कि संक्रमित प्राथमिक एचआरपीई कोशिकाओं ने गैर-संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में पीडीएफ (पी = 0.003, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण) और जीएम-सीएसएफ (पी = 0.013, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण) जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई। 2 ^(-1सीटी) विधि का उपयोग इस मामले में किया गया था36. डेटा को ± एसडी (एन = 4 दानदाता) के रूप में व्यक्त किया जाता है। प्रत्येक डॉट तीन प्रतिकृति के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। इस आंकड़े को बसुस एट अल37से संशोधित किया गया है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा S2: संक्रमित प्राथमिक hRPE और ARPE-19 कोशिकाओं में प्रोटीन स्राव। (क)एलिसा द्वारा स्रावित प्रोटीन के परिमाणीकरण से पता चला है कि संक्रमित एचआरपीई कोशिकाओं ने गैर-संक्रमित कोशिकाओं की तुलना में काफी अधिक पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ (पीडीएफ के लिए पी = 0.014, और जीएम-सीएसएफ, क्रुस्कल-वालिस परीक्षण के लिए पी = 0.006) को गुप्त किया। डेटा को डीडी (एन = 4 दानदाताओं) ± मतलब के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। प्रत्येक डॉट तीन प्रतिकृति के औसत का प्रतिनिधित्व करता है। (ख)पीडीएफ-जीएम-सीएसएफ डबल स्टेनिंग ने डबल-ट्रांस्फ संक्रमित एआरपीई-19 कोशिकाओं (मर्ज फिगर) में पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के सह-स्राव की पुष्टि की । इस आंकड़े को बसुस एट अल37से संशोधित किया गया है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल संक्रमित कोशिकाओं द्वारा उत्पादित पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के एंटी-ऑक्सीडेटिव और सुरक्षात्मक कार्य का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसे किसी भी ख्यात लाभकारी जीन से संक्रमित कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है । जीन चिकित्सीय रणनीतियों में, जिनका उद्देश्य आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करके ऊतक को प्रोटीन वितरित करना है, प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर, अभिव्यक्ति की दीर्घायु और रोग के मॉडल में व्यक्त प्रोटीन की प्रभावशीलता के बारे में जानकारी प्राप्त करना महत्वपूर्ण है। हमारी प्रयोगशाला में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऑक्सीडेटिव तनाव पर पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ की प्रभावशीलता को परिभाषित करने के लिए उपयोगी रहा है, जिसे एएएमडी6,7के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण तत्व के रूप में परिकल्पना की गई है। विशेष रूप से, हमने SB100X-मध्यस्थतापीडीएफ/जीएम-सीएसएफ-संक्रमित प्राथमिक hRPE कोशिकाओं के एंटी-ऑक्सीडेटिव प्रभाव को परिभाषित करने के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग किया है । कई जांचकर्ताओं ने दिखाया है कि एच2ओ2 ऑक्सीडेटिव तनाव के महत्वपूर्ण लक्षणों को प्रेरित करता है, लेकिन फिर भी सेल पुनर्जनन28,29,38की अनुमति देता है, जो हमारे प्रयोगों के परिणामों के समान है, जिसने दिखाया है कि 24 एच के लिए 350 माइक्रोन मानव ARPE-19 और प्राथमिक आरपीई कोशिकाओं में प्रभावी ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रेरित करता है जिसका उपयोग पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के सुरक्षात्मक प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। एच2O2 ऑक्सीडेटिव एजेंट के रूप में आंखों और इसी रक्षा तंत्र में अपनी शारीरिक उपस्थिति के कारण अध्ययन के लिए चुना गया है, उदाहरण के लिए, ग्लूटाथिएक मेटाबोलिज्म20,21। हमारी प्रयोगशाला ने ऑक्सीडेटिव तनाव के अन्य मॉडलों की जांच की है जैसे टीबीएच के साथ कोशिकाओं का उपचार, जो रेडॉक्स-एक्टिव मेटल आयनों1की उपस्थिति में लिपिड पेरोक्सिडेशन शुरू करता है; हालांकि, ऑक्सीडेटिव तनाव नगण्य था। यहां प्रस्तुत प्रयोगों में, कोशिकाओं को24घंटे के लिए एच 2 O2 के साथ इलाज किया गया क्योंकि हमने पाया कि 2-6 घंटे का छोटा उपचार समय जीन अभिव्यक्ति20में परिवर्तन को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है, लेकिन बाद के परिणाम, जैसे, सेल प्रसार, सेल व्यवहार्यता, और ग्लूटाथिएक स्तर, अभी तक दिखाई नहीं दे सकते हैं। अन्यथा, कुओं का छोटा आकार, साइटोटॉक्सिकिटी और ग्लूटाथिएक परख के लिए आवश्यक है, तेजी से एक कॉन्फ्लोटेंट संस्कृति को अच्छी तरह से ले जाता है; इससे संपर्क अवरोध और ऑक्सीडेटिव एजेंट के प्रभाव का मास्किंग हो सकता है। इसलिए, एच2ओ 2 के साथ एक लंबा इनक्यूबेशन उपयोगी नहीं लगता है, हालांकि AAMD में देखा गया पतन क्रोनिक ऑक्सीडेटिव तनाव6,7के कारण होता है।

यहां प्रस्तुत प्रयोगों की एक सीमा यह है कि वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की संख्या एच2ओ2के ऑक्सीडेटिव प्रभाव को प्रभावित करती है, अर्थात एक ही एच2O2 उपचार के लिए, एच 2 O2-इलाजऔर गैर-उपचारित कोशिकाओं के बीच ग्लूटाथिएक स्तर में महत्वपूर्ण अंतर तबदेखागया जब 5,000 कोशिकाएं लेकिन तब नहीं जब 10,000 कोशिकाओं को वरीयता दी गई(चित्रा 4 ). हमारे द्वारा प्रस्तुत प्रोटोकॉल में कम संख्या में कोशिकाओं को सीडिंग की आवश्यकता होती है, यानी, 3,000 जब कोशिकाओं को 3 दिनों और 5,000 के लिए सुसंस्कृत किया जाता है जब कोशिकाओं को 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है(चित्रा 1)। एक और सीमा यह है कि एच2ओ2 की एकाग्रता समय के साथ समाप्त हो जाती है; कज़ारा एट अल39 ने एआरपीई-19 सेल संस्कृतियों में कुछ घंटों में एच2ओ2 की कमी दिखाई है, जो क्रोनिक ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस मॉडल के विकास को प्रभावित करता है। इन जांचकर्ताओं ने निरंतर एच 2ओ 2उपचार के लिए एक वैकल्पिक विधि का प्रस्ताव किया है, विशेष रूप से ग्लूकोज ऑक्सीडेस का उपयोग करके माध्यम में ग्लूकोज सेएच2 ओ2 को लगातार उत्पन्न करता है, लेकिन एच2ओ2 की मानकीकृत एकाग्रता की गारंटी नहीं दी जा सकती है। दूसरी ओर, एक ही नाड़ी में ऑक्सीडेंट एजेंट की डिलीवरी के साथ हमने जो प्रोटोकॉल स्थापित किया है, उसका लाभ पुराने मॉडलों की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए तेज और सरल होने का लाभ है जिसमें एच2ओ2 उपचार को कई दिनों तक दोहराया जाना चाहिए38।

ऑक्सीडेटिव क्षति का प्रतिकार करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता आरओएस उत्पादन और एंटीऑक्सीडेंट उत्पन्न करने की क्षमता के बीच संतुलन द्वारा निर्धारित की जाती है। सेल में, ट्रिपेप्टाइड ग्लूटाथिएक (जीएसएच) प्रमुख कमीकरण एजेंट है, जिसे ग्लूटाथिएक डिफ्लाइड (जीएसएसजी) में ऑक्सीकृत किया जा सकता है और एनएडीपीएच40का उपयोग करते हुए ग्लूटाथिएक रिडक्शन द्वारा पुनर्जीवित किया जा सकता है। स्वस्थ कोशिकाओं में, कुल ग्लूटाथिएक पूल का 90% से अधिक कम रूप में मौजूद है। जब कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव तनाव के बढ़े हुए स्तर के संपर्क में आता है, तो जीएसएसजी जमा होता है और जीएसएसजी से जीएसएसएच का अनुपात बढ़ जाता है । नतीजतन, जैविक नमूनों में ग्लूटाथिएक रेडॉक्स राज्य की निगरानी ऑक्सीडेटिव तनाव और कोशिका की चोट के दौरान उत्पन्न मुक्त कणों से कोशिकाओं और ऊतकों की विषहरण स्थिति के मूल्यांकन के लिए आवश्यक है। ग्लूटाथिएक के परिमाणीकरण के लिए यहां विस्तृत प्रोटोकॉल पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के एंटीऑक्सीडेंट प्रभाव का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील है जो आरपीई कोशिकाओं द्वारा आनुवंशिक रूप से संशोधित किया गया है।

चूंकि ऑक्सीडेटिव तनाव माइटोकॉन्ड्रियल गतिविधियों को प्रभावित करताहै,इसलिए यह विशेष रूप से दिलचस्प है कि पीडीएफ द्वारा आरओएस के स्तर का नियंत्रण माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग प्रोटीन 2 (यूसीपी2) के नियमन से संबंधित है, और पीडीएफ UCP2 अभिव्यक्ति11,41में वृद्धि करके ऑक्सीडेटिव तनाव के प्रभाव को कम करता है। यूसीपी 2 का मुख्य कार्य माइटोकॉन्ड्रिया-व्युत्पन्न आरओएस को नियंत्रित करना और माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव तनाव41,42के सेंसर के रूप में कार्य करना है। यहां, ग्लूटाथिएक स्तरों पर पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ के प्रभाव की जांच करने के अलावा, हमारे पास यूसीपी 2 की जीन अभिव्यक्ति(चित्र 7)में वृद्धि होती है; UCP2 जीन अभिव्यक्ति पर पीडीएफ और जीएम-सीएसएफ की भूमिका स्थापित करने के लिए अतिरिक्त अध्ययन आवश्यक हैं।

कुल मिलाकर, वर्तमान एच2ओ-मॉडलट्रांसपोसन-आधारित जीन उपचारों के लाभकारी प्रभाव की जांच करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रदान करता है जिसका उद्देश्य रोगी की कोशिकाओं को एंटीऑक्सीडेंट चिकित्सीय जीन प्रदान करना है ताकि न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग का इलाज एएमडी के रूप में किया जा सके।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए ग्रेग सीली और एलेन कोंटी और बर्लिन में मैक्स-डेल्बर्क सेंटर से प्रो जसुस्बाना इज़स्वाक को धन्यवाद देना चाहते हैं ताकि कृपया पीएसबी100X और pT2-CAGGS-वीनस प्लाज्मिड्स प्रदान किया जा सके। इस काम को सातवें फ्रेमवर्क प्रोग्राम के संदर्भ में स्विस नेशनल साइंसेज फाउंडेशन और यूरोपियन कमिशन ने सपोर्ट किया था । Z.I को यूरोपीय अनुसंधान परिषद, ईआरसी एडवांस्ड [ईआरसी-2011-एडीजी 294742] द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

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References

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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

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