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Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

Published: December 11, 2020 doi: 10.3791/61957
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1, 3, 1,2
1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Max Delbrück Center for Molecular Medicine

Summary

Presentiamo un protocollo per lo sviluppo e l'uso di un modello di stress ossidativo trattando le cellule epiteliali pigmentate retiniche con H2O2, analizzando la morfologia cellulare, la vitalità, la densità, il glutatione e il livello di UCP-2. È un modello utile per studiare l'effetto antiossidante delle proteine secrete dalle cellule trasfettate con trasposone per trattare la degenerazione neuroretinica.

Abstract

Lo stress ossidativo svolge un ruolo fondamentale in diverse malattie degenerative, tra cui la degenerazione maculare legata all'età (AMD), una patologia che colpisce circa 30 milioni di pazienti in tutto il mondo. Porta ad una diminuzione dei fattori neuroprotettivi sintetizzati dall'epitelio pigmentato retinico (RPE), ad esempio il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) e il fattore stimolante le colonie di granulociti-macrofagi (GM-CSF), seguiti dalla perdita di cellule RPE e infine dalla morte dei fotorecettori e delle cellule gangliari retiniche (RGC). Ipotizziamo che la ricostituzione dell'ambiente retinico neuroprotettivo e neurogenico mediante trapianto subretinico di cellule RPE trasfettate sovraesprimendo PEDF e GM-CSF abbia il potenziale per prevenire la degenerazione retinica mitigando gli effetti dello stress ossidativo, inibendo l'infiammazione e sostenendo la sopravvivenza cellulare. Utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata nel Bosco(SB100X)le cellule RPE umane sono state trasfettate con i geni PEDF e GM-CSF e hanno mostrato un'integrazione genica stabile, un'espressione genica a lungo termine e una secrezione proteica utilizzando qPCR, western blot, ELISA e immunofluorescenza. Per confermare la funzionalità e la potenza del PEDF e del GM-CSF secreti dalle cellule RPE trasfettate, abbiamo sviluppato un test in vitro per quantificare la riduzione dello stress ossidativo indotto da H2O2sulle cellule RPE in coltura. La protezione cellulare è stata valutata analizzando la morfologia cellulare, la densità, il livello intracellulare di glutatione, l'espressione genica UCP2 e la vitalità cellulare. Sia le cellule RPE trasfettate che sovraesprimono PEDF e/o GM-CSF che le cellule non trasfettate ma pretrattate con PEDF e/o GM-CSF (disponibili in commercio o purificate da cellule trasfettate) hanno mostrato una significativa protezione delle cellule antiossidanti rispetto ai controlli non trattati. L'attuale modello H2O2è un approccio semplice ed efficace per valutare l'effetto antiossidante di fattori che possono essere efficaci per il trattamento di AMD o malattie neurodegenerative simili.

Introduction

Il modello qui descritto, offre un approccio utile per valutare l'efficienza degli agenti biofarmaceutici per ridurre lo stress ossidativo nelle cellule. Abbiamo utilizzato il modello per studiare gli effetti protettivi di PEDF e GM-CSF sullo stress ossidativo mediato da H2O2sulle cellule epiteliali pigmentate retiniche, che sono esposte ad alti livelli di O2e luce visibile, e la fagocitosi delle membrane del segmento esterno dei fotorecettori, generando livelli significativi di specie reattive dell'ossigeno (ROS)1, 2. Sono considerati un importante contributo alla patogenesi della degenerazione maculare avascolare legata all'età (aAMD)3,4,5,6,7,8. Inoltre, vi è una diminuzione dei fattori neuroprotettivi sintetizzati RPE, in particolare il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF), i fattori di crescita insulino-simili (IGF) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi dei granulociti (GM-CSF) che porta alla disfunzione e alla perdita delle cellule RPE, seguito dalla morte dei fotorecettori e delle cellule gangliari retiniche (RGC)3,4,5 . L'AMD è una malattia complessa che deriva dall'interazione tra fattori metabolici, funzionali, genetici e ambientali4. La mancanza di trattamenti per l'aAMD è la principale causa di cecità nei pazienti di età superiore ai 60 anni nei paesiindustrializzati9,10. La ricostituzione dell'ambiente retinico neuroprotettivo e neurogeno mediante trapianto subretinico di cellule RPE geneticamente modificate sovraesprimendo PEDF e GM-CSF ha il potenziale per prevenire la degenerazione retinica mitigando gli effetti dello stress ossidativo, inibendo l'infiammazione e sostenendo la sopravvivenza cellulare11,12,13,14,15,16 . Anche se ci sono diverse metodologie per fornire geni alle cellule, abbiamo scelto il sistema di trasposoni iperattivi non virali della Bella Addormentata per fornire i geni PEDF e GM-CSF alle cellule RPE a causa del suo profilo di sicurezza, dell'integrazione dei geni nel genoma delle cellule ospiti e della sua propensione a integrare i geni consegnati in siti non trascrizionalmente attivi come abbiamo mostrato in precedenza17, 18,19.

Lo stress ossidativo cellulare può essere indotto in cellule coltivate in vitro da diversi agenti ossidativi, tra cui perossido di idrogeno (H2O2), 4-idronetonale (HNE), terzbutilidroperossido (tBH), alte tensioni di ossigeno e luce visibile (spettro completo o irradiazione UV)20,21. Le elevate tensioni di ossigeno e la luce richiedono attrezzature e condizioni speciali, che limitano la trasferibilità ad altri sistemi. Agenti come H2O2, HNE e tBH inducono cambiamenti molecolari e cellulari da stress ossidativo sovrapposti. Abbiamo scelto H2O2 per testare l'attività antiossidante di PEDF e GM-CSF perché è conveniente e biologicamente rilevante poiché è prodotto dalle cellule RPE come intermedio reattivo dell'ossigeno durante la fagocitosi del segmento esterno dei fotorecettori22 e si trova nei tessuti oculari in vivo23. Poiché l'ossidazione del glutatione può essere parzialmente responsabile della produzione di H2O2 nell'occhio, abbiamo analizzato i livelli di GSH / glutatione nei nostri studi, che sono legati allo stress ossidativo indotto da H2O2e alla capacità rigenerativa delle cellule21,22. L'analisi dei livelli di glutatione è particolarmente rilevante poiché partecipa ai meccanismi protettivi antiossidanti nell'occhio24. L'esposizione a H2O2 è usata frequentemente come modello per esaminare la suscettibilità allo stress ossidativo e l'attività antiossidante dellecellule RPE1,25,26, 27,28, 29,30e, inoltre, mostra somiglianze con il danno da stress ossidativo indotto dalla luce, una fonte "fisiologica" di stress ossidativo21.

Per valutare la funzionalità e l'efficacia dei fattori neuroprotettivi, abbiamo sviluppato un modello in vitro che consente l'analisi per quantificare l'effetto antiossidante dei fattori di crescita espressi da cellule geneticamente modificate per sovraesprimere PEDF e GM-CSF. Qui, mostriamo che le cellule RPE trasfettate con i geni per PEDF e GM-CSF sono più resistenti agli effetti dannosi di H2O2 rispetto alle cellule di controllo non trasfettate, come evidenziato dalla morfologia cellulare, densità, vitalità, livello intracellulare di glutatione ed espressione del gene UCP2, che codifica per la proteina di disaccoppiamento mitocondriale 2 che ha dimostrato di ridurre le specie reattive dell'ossigeno (ROS)31.

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Protocol

Le procedure per la raccolta e l'uso degli occhi umani sono state approvate dalla Commissione etica cantonale per la ricerca (n. 2016-01726).

1. Isolamento cellulare e condizioni di coltura

  1. Linea cellulare umana ARPE-19
    1. Coltura 5 x 105 cellule ARPE-19, una linea cellulare RPE umana, nella miscela media/nutritiva F-12 di Dulbecco Modified Eagle (DMEM/Ham's F-12) integrata con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 80 U/mL di penicillina, 80 μg/mL di streptomicina e 2,5 μg/mL di amfotericina B (mezzo completo) a 37 °C in un'atmosfera umidificata di 5% DI CO2 e 95% di aria in un matraccio T75 (per altre densità cellulari vedere Tabella 1).
    2. Cambia il mezzo tre volte a settimana.
    3. Una volta che le cellule sono cresciute a circa il 90% di confluenza (valutata qualitativamente), aspirare il mezzo e lavare le cellule con 1x PBS sterile.
    4. Incubare le cellule con una soluzione di TRIPSINA-2% EDTA al 5% per 7-10 minuti a 37 °C (per i volumi vedere Tabella 1). Monitora visivamente il distacco.
    5. Interrompere la tripsinizzazione aggiungendo un supporto completo contenente il 10% di FBS (per i volumi vedere Tabella 1).
    6. Trasfettate le cellule (vedi fase 2. del protocollo), sottocoltivate le cellule con un rapporto di 1:10 (una volta alla settimana) o seminate in una piastra a 96 pozzetti come descritto di seguito (vedere i passaggi 3.3 e 3.4 del protocollo).
Medio (mL)
Superficie (cm²) Densità di semina per cellule ARPE-19 (cellule/pozzetto) Applicazione Per colture cellulari Per fermare la tripsina Volume di tripsina (mL)
Pallone T75 75 5,00,000 Crescita cellulare ARPE-19 10 7 3
6 Piastra del pozzo 9.6 1,00,000 Semina di cellule ARPE-19 trasfettate 3 1 0.5
Piatto da 24 pozzetti 2 50,000 Semina di cellule hRPE trasfettate 1 0.8 0.2
96 Piastra pozzo 0.32 5.000 per esperimenti di stress ossidativo con cellule trasfettate (Fig. 1) Esperimenti di stress ossidativo 0.2
3.000 per esperimenti di stress ossidativo con cellule non trasfettate più proteine (Fig. 1)

Tabella 1: Volumi di coltura cellulare. Volumi di media raccomandati per piastre di coltura cellulare e palloni per la coltura di ARPE-19 e cellule RPE umane primarie.

  1. Cellule RPE umane primarie
    1. Isolare le cellule RPE umane primarie come descritto da Thumann et al.17e le cellule di coltura in mezzo completo integrate con il 20% di FBS.
    2. Cambia il mezzo due volte a settimana. Una volta che le cellule raggiungono la confluenza (monitorate visivamente), ridurre l'FBS all'1% per evitare una crescita eccessiva.
    3. Trasfettare le cellule (vedere il passaggio 2 del protocollo) o seminare in una piastra a 96 pozzetti come descritto di seguito (vedere i passaggi 3.3 e 3.4 del protocollo).
      NOTA: I dati qui presentati sono stati raccolti dalla coltura di cellule RPE ottenute dagli occhi di quattro donatori umani. La Tabella 2 descrive in dettaglio i dati demografici dei donatori della Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN). Gli occhi sono stati enucleati 12,7 ± 5,7 ore (media ± SD) post-mortem dopo che il consenso informato è stato ottenuto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki.
No età genere morte alla conservazione (ore) morte all'isolamento coltivazione coltivazione Simbolo nel grafico
(giorni) prima della trasfezione (giorni) dopo la trasfezione (giorni)
2 80 M 20.7 8 140 36 Symbol 1
3 86 F 12.8 8 85 45 Symbol 2
4 86 F 8.5 5 26 133 Symbol 3
8 83 F 8.9 6 18 27 Symbol 4
Significare 83.8 12.7 6.8 67.3 60.3
SD 2.9 5.7 1.5 57.0 49.1

Tabella 2: Dati demografici dei donatori umani per le cellule epiteliali pigmentate retiniche.

2. Elettroporazione di ARPE-19 e cellule RPE umane primarie

  1. Tripsinizzare le cellule ARPE-19 o le cellule RPE umane primarie come descritto nei passaggi 1.1.3-1.1.5 del protocollo.
  2. Eseguire l'elettroporazione con il kit di trasfezione disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali).
    1. Per la trasfezione delle cellule ARPE-19 fare riferimento a Johnen et al.32 e per hRPE primario a Thumann et al.17. In breve, sospendere 1 x 105 cellule ARPE-19 o 5 x 104 cellule hRPE primarie in 11 μL di tampone R e aggiungere 2 μL di miscela di plasmidi contenenti 0,03 μg pSB100X trasposasi33 e 0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His o pT2-CMV-GMCSF-Il suo trasposone (rapporto trasposasi:trasposone 1:16). Per le cellule a doppia trasfezione PEDF e GM-CSF, utilizzare un rapporto di 1:16:16 (0,03 μg pSB100X,0,47 μg pT2-CMV-PEDF-His e 0,47 μg pT2-CMV-GMCSF-His). Utilizzare i seguenti parametri di elettroporazione: due impulsi di 1.350 V per 20 ms (larghezza di impulso) per celle ARPE-19; due impulsi di 1.100 V per 20 ms per le cellule primarie.
  3. Seme 1 x 105 ARPE-19 trasfettato o 5 x 104 cellule hRPE primarie trasfettate in piastre a 6 pozzetti e 24 pozzetti, rispettivamente, in mezzo integrato con FBS al 10% senza antibiotici o antimicotici. Aggiungere penicillina (80 U/mL), streptomicina (80 μg/mL) e amfotericina B (2,5 μg/mL) con il primo scambio medio 3 giorni dopo la trasfezione.
  4. Determinare la crescita cellulare mediante monitoraggio microscopico settimanale delle cellule. L'efficienza della trasfezione è monitorata dall'analisi dell'espressione genica mediante RT-PCR e della secrezione proteica mediante ELISA e WB (metodi spiegati in Materiale supplementare).
    NOTA: L'efficienza della trasfezione può essere valutata per la prima volta che le cellule raggiungono la confluenza, cioè a ~ 7 giorni e 4 settimane dopo la trasfezione rispettivamente per le cellule ARPE-19 e le cellule hRPE primarie.
  5. Cellule seme in una piastra a 96 pozzetti come descritto di seguito (vedere il passaggio 3.5 del protocollo).

3. Induzione da stress ossidativo (trattamento H2O2) e neuroprotezione (trattamento PEDF e/o GM-CSF)

  1. Preparazione del mezzo condizionato di cellule ARPE-19 trasfettate
    1. Utilizzare cellule ARPE-19 trasfettate con i geni PEDF, GM-CSF, o entrambi (vedere fase 2 del protocollo); cellule di coltura per 28 giorni come descritto nel passaggio 1.1 del protocollo.
    2. A 28 giorni dopo la trasfezione, tripsinare le cellule (vedere i passaggi 1.1.3-1.1.5 del protocollo), contare le cellule usando una camera Neubauer34,35e seminare 5 x 105 cellule in palloni T75 in mezzo completo come descritto nel passaggio 1.1.1 del protocollo. Scambiare il mezzo quando la coltura cellulare è confluente all'80% circa (circa dopo 1 settimana; verificata qualitativamente). Raccogliere il mezzo dopo 24 ore.
    3. Conservare il mezzo a -20 °C fino all'uso.
      NOTA: La concentrazione sufficiente del PEDF ricombinante e del liquido GM-CSF nel mezzo condizionato è stata verificata da WB e quantificata da ELISA come descritto in Materiale supplementare.
  2. Purificazione di PEDF e GM-CSF da mezzo condizionato di cellule ARPE-19 trasfettate
    1. Centrifugare il mezzo raccolto dal punto 3.1.2 a 10.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
    2. Utilizzare il superflusso Ni-NTA (vedi Tabella dei materiali)secondo i protocolli del produttore per purificare le proteine his-tagged come descritto di seguito.
      1. Pipettare 30 μL di miscela Ni-NTA in un tubo da 1,5 mL e centrifugare a 2.600 x g per 30 s ed eliminare il flusso attraverso. Lavare il pellet due volte con 200 μL di 1x tampone di incubazione.
      2. Centrifugare a 2.600 x g per 30 s ed eliminare il flusso attraverso. Aggiungere 40 μL di 4x tampone di incubazione e risospendare.
      3. Aggiungere 900 μL di mezzo condizionato centrifugato e incubare a 70 rpm (agitatore orbitale) per 1 ora a RT. Centrifugare a 2.600 x g per 1 minuto e il flusso di scarto.
      4. Lavare il pellet due volte con 175 μL di 1x tampone di incubazione. Centrifugare a 2.600 x g per 30 s ed eliminare il flusso attraverso.
      5. Per eluire le proteine PEDF e GM-CSF marcate con His, aggiungere 20 μL di tampone di eluizione e incubare a 70 rpm (agitatore orbitale) per 20 minuti a RT. Centrifuga a 2.600 x g per 30 s. Conservare il surnatante contenente PEDF ricombinante o GM-CSF.
    3. Quantificare la proteina totale utilizzando il kit di analisi delle proteine BCA disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali)secondo le istruzioni del produttore.
    4. Conservare la soluzione proteica a -20 °C fino all'uso.
      NOTA: tampone di incubazione (4x) contiene 200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl e 40 mM Imidazol; Il tampone di eluizione contiene 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl e 250 mM Imidazol.
  3. Trattamento di cellule ARPE-19/hRPE primarie non trasfettate con mezzo condizionato più H2O2 (Figura 1A)
    1. Seminare 3.000 cellule ARPE-19 non trasfettate (dal passo 1.1.6 del protocollo) o hRPE primarie (dal passo 1.2.3 del protocollo) cellule per pozzetto in piastra a 96 pozzetti e coltura in 200 μL di mezzo condizionato da cellule ARPE-19 trasfettate.
    2. Coltivare le cellule per 10 giorni a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 e del 95% di aria. Cambia il mezzo condizionato ogni giorno. Esporre le celle a 350 μM H2O2 per 24 ore.
    3. Valutare il danno da stress ossidativo e determinare l'effetto antiossidante di PEDF e GM-CSF mediante quantificazione dei livelli di glutatione (vedere il punto 4.1 del protocollo), la microscopia (vedere il punto 4.2 del protocollo) e il test di citotossicità (vedere il punto 4.2 del protocollo).
      NOTA: la durata dell'esperimento è di 12 giorni. Le piastre microwell a fondo piatto trasparente vengono utilizzate per valutare la luminescenza e la morfologia cellulare. Per eseguire contemporaneamente il test di citotossicità e glutatione, due piastre devono essere seminate con cellule nello stesso giorno.
  4. Trattamento di cellule ARPE-19/hRPE primarie non trasfettate con fattori di crescita PEDF e GM-CSF più H2O2 (Figura 1B)
    1. Seminare 3.000 cellule ARPE-19 non trasfettate (dal punto 1.1.6 del protocollo) o hRPE primarie (dal punto 1.2.3 del protocollo) per pozzetto (piastre a 96 pozzetti con fondo piatto chiaro) in 200 μL di terreno di coltura completo contenente 500 ng/mL PEDF ricombinante e/o 50 ng/mL di GM-CSF ricombinante, purificato dal mezzo delle cellule ARPE-19 trasfettate o disponibile in commercio. Celle di coltura per 48 ore a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% CO2 e al 95% aria. Rinnovare quotidianamente il mezzo, compresi i fattori di crescita PEDF e GM-CSF.
      NOTA: aggiungere i fattori di crescita freschi al mezzo.
    2. Dopo 48 ore di trattamento delle cellule con i fattori di crescita, rimuovere il mezzo e aggiungere un mezzo completo contenente 350 μM H2O2 più 500 ng / mL PEDF e / o 50 ng / mL GM-CSF.
    3. Valutare il danno da stress ossidativo e determinare l'effetto antiossidante di PEDF e GM-CSF mediante quantificazione dei livelli di glutatione (vedere il punto 4.1 del protocollo), la microscopia (vedere il punto 4.2 del protocollo) e il test di citotossicità (vedere il punto 4.2 del protocollo).
      NOTA: la durata dell'esperimento è di 3 giorni.
  5. Trattamento delle cellule ARPE-19/hRPE primarie trasfettate con H2O2 (Figura 1C)
    1. Verificare una sufficiente espressione genica e secrezione proteica delle cellule trasfettate da WB ed ELISA come descritto nel Materiale supplementare.
    2. Rimuovere il mezzo dai pozzetti contenenti le cellule trasfettate (vedere il passaggio 2 del protocollo).
    3. Tripsinizzare le cellule come descritto nei passaggi 1.1.3-1.1.5 del protocollo. Contare le cellule usando una camera neubauer34,35.
    4. Semina 5.000 cellule trasfettate/pozzetto in piastra a 96 pozzetti in 200 μL di mezzo completo. Celle di coltura per 24 ore a 37 °C in atmosfera umidificata del 5% di CO2 e del 95% di aria. Dopo 24 ore, esporre le cellule a 350 μM H2O2 per 24 ore.
    5. Valutare il danno da stress ossidativo e determinare l'effetto antiossidante di PEDF e GM-CSF mediante quantificazione dei livelli di glutatione (vedere fase 4.1 del protocollo), microscopia (vedere fase 4.2 del protocollo), test di citotossicità (vedere passo 4.2 del protocollo) e determinazione dell'espressione genica UCP2 (vedere passo 4.3 del protocollo).
      NOTA: la durata dell'esperimento è di 2 giorni.

Figure 1
Figura 1: Tempistiche del saggio H2O2 nei tre diversi approcci sperimentali. 3.000 cellule non trasfettate trattate con proteine medie/ricombinanti condizionate o 5.000 cellule trasfettate sono state seminate in piastre a 96 pozzetti per il trattamento con H2O2. Per determinare l'effetto del mezzo condizionato, le cellule sono state coltivate in terreno coltivato al 100% per 10 giorni consecutivi, cambiando mezzo ogni giorno. Per determinare l'effetto dei fattori di crescita ricombinanti, le cellule sono state coltivate aggiungendo la quantità appropriata di fattori di crescita ogni giorno per 3 giorni consecutivi. Si noti che le cellule non trasfettate sono state seminate a 3.000 cellule per pozzetto per evitare la crescita eccessiva durante la durata della coltura più lunga rispetto alle cellule trasfettate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Analisi del livello di stress ossidativo e della capacità antiossidante

  1. Saggio del glutatione
    1. Misurare i livelli di glutatione (GSH) utilizzando il kit disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali)seguendo le istruzioni del produttore. In breve, preparare e volume appropriato di 1x miscela di reagenti (100 μL reagente/ pozzetto): substrato di luciferina-NT e glutatione S-transferasi diluita 1:100 nel tampone di reazione.
      NOTA: una piastra a 96 pozzetti richiede 10 mL di 1x miscela di reagenti, che viene preparata aggiungendo 100 μL di substrato di luciferina-NT e 100 μL di glutatione S-transferasi a 10 mL di tampone di reazione. Preparare la miscela di reagenti 1x immediatamente prima dell'uso. Non conservare la miscela di reagenti preparata per un uso futuro.
    2. Preparare il reagente di rilevamento della luciferina trasferendo una bottiglia di tampone di ricostituzione al reagente di rilevamento della luciferina liofilizzato.
    3. Preparare una curva standard utilizzando una soluzione standard di glutatione (GSH) (5 mM). Diluire 5 mM GSH soluzione 1:100 con dH2O (aggiungere 10 μL di 5 mM GSH soluzione a 990 μL di dH2O). Eseguire 7 diluizioni seriali 1:1 in 500 μL di dH2O. Trasferire 10 μL di ogni standard diluito in un pozzo appropriato in duplice copia.
      NOTA: La concentrazione finale di glutatione sarà compresa tra 0,039 μM e 5 μM.
    4. Preparare il bianco (1x miscela di reagenti) e trasferire 10 μL (duplicati) nei pozzetti appropriati.
    5. Rimuovere le cellule trattate H2O2dall'incubatore.
      NOTA: Documentare la morfologia delle cellule trattate con H2O2mediante microscopia a campo luminoso (40x).
      Quando le cellule sono ossidate, sembrano più arrotondate e meno diffuse.
    6. Aspirare accuratamente il terreno di coltura. Aggiungere 100 μL di 1x miscela di reagenti preparata a ciascun pozzetto. Mescolare le celle con il reagente per 15 s a 500 giri / min su uno shaker orbitale.
    7. Incubare la piastra a RT per 30 min. Aggiungere 100 μL di reagente ricostituito per il rilevamento della luciferina a ciascun pozzetto.
    8. Mescolare la soluzione per 15 s a 500 giri / min su uno shaker orbitale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT.
    9. Determinare la luminescenza utilizzando un lettore di piastre utilizzando un programma preinstallato ADP-Glo.
      NOTA: Inserire la piastra all'interno del lettore di piastre senza coperchio.
      1. Fare clic su Cambia layout e scegliere le seguenti impostazioni in Parametri di base:Piastra Costar da 96 pozzetti; ottica superiore; ritardo di posizionamento: 0,1; tempo di inizio della misurazione: 0,0; tempo intervallo di misurazione: 1.0; tempo per normalizzare i risultati: 0.0; il guadagno viene regolato automaticamente dal dispositivo. Definire spazi vuoti, standard ed esempi. Fare clic su Avvia misurazione.
      2. Esportare i dati come file Excel. Calcolare la concentrazione di GSH in ciascun campione mediante interpolazione della curva standard.
  2. Saggio di citotossicità e analisi microscopica
    1. Aspirare il mezzo dalle celle e aggiungere 100 μL di mezzo completo contenente l'1% di FBS a ciascun pozzetto. Restituire le cellule all'incubatore.
      NOTA: l'1% FBS viene utilizzato perché percentuali più elevate di FBS possono interferire con la misurazione della luminescenza, quindi in questo caso viene utilizzato l'1% FBS.
    2. Misurare la vitalità cellulare utilizzando il kit per il dosaggio della citotossicità disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali)seguendo le istruzioni del produttore. In breve, preparare la miscela di reagenti aggiungendo il tampone di analisi al substrato liofilizzato. Preparare il reagente di lisi aggiungendo 33 μL di digitonina a 5 mL di tampone di saggio (per una piastra da 96 pozzetti). Mescolare bene pipettando su e giù per garantire omogeneità.
      NOTA: per risultati ottimali, utilizzare una miscela di reagenti preparata al momento. Utilizzare entro 12 ore se conservato a RT. La miscela di reagenti può essere conservata a 4 °C per un massimo di 7 giorni e può essere conservata in aliquote monouso per un massimo di 4 mesi a -70 °C. Il congelamento e lo scongelamento devono essere evitati. Il reagente di lisi può essere conservato a 4 °C per un massimo di 7 giorni.
    3. Preparare una curva standard con cellule ARPE-19 non trattate.
      1. Tripsinizzare le cellule come descritto nei passaggi 1.1.3-1.1.5 del protocollo e contare le cellule usando una camera neubauer34,35. Centrifugare le cellule a 120 g per 10 minuti a RT. Aspirare il surnatante e risospesere il pellet cellulare nel mezzo F12 di DMEM/Ham contenente 1% FBS fino ad una concentrazione finale di 1 x 105 celle/ml.
      2. Preparare 7 diluizioni seriali 1:1 in mezzo da 200 μL contenente l'1% di FBS. Trasferire 100 μL di ogni standard ai pozzetti appropriati (duplicati). Aggiungere 50 μL di miscela di reagenti a tutti i pozzetti.
    4. Mescolare le celle con il reagente per 15 s a 500 giri / min su uno shaker orbitale. Incubare la piastra per 15 minuti a RT. Misurare la luminescenza utilizzando il lettore di piastre come descritto nel punto 4.1.9 del protocollo. Aggiungere 50 μL del reagente di lisi e incubare per 15 min. Misurare la luminescenza utilizzando il lettore di piastre come descritto al punto 4.1.9 del protocollo.
    5. Calcolare la percentuale di cellule vitali: (100 - % cellule morte) e la percentuale di cellule morte = [1a misurazione della luminescenza ((cellule morte nel campione))/ 2a misurazione della luminescenza (tutte le cellule morte dopo il trattamento con digitonina)] x 100.
  3. Analisi dell'espressione UCP2 mediante RT-qPCR
    1. Tripsinizzare le cellule trasfettate come descritto sopra (passi 1.1.3-1.1.5 del protocollo).
    2. Contare le cellule usando una camera neubauer34,35.
    3. Seme 5.000 cellule ARPE-19 trasfettate / pozzetto in piastre da 96 pozzetti.
    4. Dopo 24 ore di coltura, trattare le cellule con 350 μM H2O2 per 24 ore.
    5. Isolare l'RNA totale utilizzando un kit commerciale per l'isolamento dell'RNA da un basso numero di cellule (vedere Tabella dei materiali)seguendo le istruzioni del produttore.
    6. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) come descritto in Materiale supplementare. In breve, generare cDNA per retrotrascrizione utilizzando un mix disponibile in commercio contenente una trascrittasi inversa M-MLV ottimizzata (vedere Tabella dei materiali).
    7. Per qPCR utilizzare un cocktail di reazione pronto all'uso contenente tutti i componenti (incluso SYBR Green) ad eccezione dei primer (vedere Tabella S1 del materiale supplementare)e del modello di DNA. Utilizzare le seguenti condizioni di termociclizzazione: denaturazione iniziale a 95 °C per 10 min, 40 cicli con denaturazione a 95 °C per 15 s, ricottura a 60 °C per 30 s e allungamento a 72 °C per 32 s.
    8. Utilizzare il metodo 2^(-ΔΔCT) per l'analisi36.
  4. Preparazione del lisato cellulare per l'analisi SDS-PAGE e WB di pAkt (Ser473)
    1. Seme 3 x 105 cellule ARPE-19 trasfettate con GM-CSF/pozzetto in piastre a 6 pozzetti (≥21 giorni dopo la trasfezione) per determinare se GM-CSF protegge le cellule RPE dal danno da H2O2 attraverso l'attivazione della via di sopravvivenza Akt15.
    2. Dopo 24 ore di coltura le cellule sono esposte a 350 μM H2O2 per 24 ore.
    3. Mescolare 1 mL di tampone RIPA con 10 μL di cocktail inibitore della proteasi fosfatasi, 10 μL di 0,5 M EDTA e 25 μL di 8 M di urea (volumi utilizzati per un pozzo).
    4. Aspirare accuratamente il mezzo e lavare le celle con 1x PBS.
    5. Aggiungere l'intero volume della miscela tampone RIPA alle celle.
    6. Pipetta su e giù.
    7. Raccogliere il lisato in tubi da 1,5 ml.
    8. Centrifugare a 20.000 x g per 30 min a 4 °C.
    9. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 ml.
    10. Determinare i livelli di pAkt in 15 μL di lisato cellulare non diluito da WB come descritto in Materiale supplementare.

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Representative Results

Induzione dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali pigmentate retiniche umane
ARPE-19 e cellule hRPE primarie sono state trattate con concentrazioni variabili di H2O2 per 24 ore ed è stato quantificato il livello intracellulare del glutatione antiossidante (Figura 2A,B). H2O2 a 50 μM e 100 μM non ha influenzato la produzione di glutatione, mentre a 350 μM c'è stata una significativa diminuzione del glutatione nelle cellule ARPE-19 e HRPE primarie. L'analisi della citotossicità ha mostrato che 350 μM è la concentrazione più bassa di H2O2 che causa una significativa diminuzione della vitalità cellulare (Figura 2C). Morfologicamente, le cellule ARPE-19 trattate con H2O2 appaiono meno diffuse e più arrotondate, caratteristiche che diventano più evidenti con l'aumentare della concentrazione di H2O2 (Figura 3). L'effetto è stato meno evidente per le cellule trasfettate da PEDF e GM-CSF trattate con H2O2 (Figura 3). Per dimostrare l'effetto del numero di cellule sullo stress ossidativo H2O2-mediato,5.000 e 10.000 cellule ARPE-19 per pozzetto sono state seminate in una piastra bianca a 96 pozzetti; il giorno dopo, le cellule sono state trattate con 350 μM H2O2 per 24 ore e sono stati determinati i livelli di glutatione. La Figura 4 mostra che il livello di glutatione è diminuito solo nei pozzetti (n = 3) seminati con 5.000 cellule. Per gli esperimenti per determinare l'effetto degli antiossidanti dei ROS generati da H2O2,è essenziale considerare il numero di cellule; per il protocollo specifico presentato in questo rapporto 3.000-5.000 cellule/pozzetto (piastre a 96 pozzetti) trattate per 24 ore con 350 μM H2O2 sono appropriate per mostrare un danno cellulare significativo pur mantenendo la capacità di recuperare imitando una risposta sub-acuta al danno cellulare indotto da stress ossidativo.

Figure 2
Figura 2: Livello di stress ossidativo evidenziato come livello diglutatione e vitalità cellulare, nelle cellule RPE umane trattate con cellule H2O2. (A) ARPE-19 esposte a diverse concentrazioni di H2O2 ha mostrato una significativa diminuzione dei livelli di glutatione (tra parentesi) a 350 μM (0,66 μM), 500 μM (0,022 μM) e 700 μM (0,002 μM) rispetto a H2O2-cellule non trattate (2,9 μM) (p < 0,0001 per 350, 500 e 700 μM H2O2). (B) Le cellule RPE umane primarie hanno mostrato una diminuzione dei livelli di glutatione; tuttavia, l'effetto era meno prominente rispetto a ARPE-19 ma comunque statisticamente significativo rispetto ai controlli a 350, 500 e 700 μM H2O2. 350 μM è stata la più bassa concentrazione di H2O2 che ha prodotto un danno ossidativo significativo, come dimostrato dalla diminuzione dei livelli di glutatione rispetto alle cellule di controllo non trattate (p = 0,0022). I livelli di glutatione sono diminuiti con l'aumentare delle concentrazionidiH 2 O2 (500 μM: p = 0,022; 700 μM: p = 0,0005). (C) L'analisi di citotossicità ha mostrato che 350 μMH2 O2 era la concentrazione più bassa che produceva una significativa diminuzione della percentuale di cellule vitali (p < 0,0001 per 350, 500 e 700 μM). I dati sono presentati come medie ± SD (n = 3 repliche) e le differenze significative sono indicate con (*); i calcoli post-hoc dell'ANOVA sono stati eseguiti utilizzando il test multi-confronto di Tukey confrontando C- con i gruppi di trattamento H2O2. C-: H2O2 cellule non trattate. Questa cifra è stata modificata da Bascuas et al.37. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Morfologia di cellule ARPE-19 non trasfettate e trasfettate con PEDF o GM-CSF trattate con H2O2. Le cellule trattate con concentrazioni crescenti di H2O 2 mostrano meno cellule nei pozzetti dicoltura e mostrano una morfologia più arrotondata e meno diffusa, un segno noto di stress cellulare. Si noti che per le cellule trasfettate da PEDF o GM-CSF, lo stress cellulare è meno prominente e cresce in modo simile alle cellule di controllo non trattate. C-: cellule di controllo non trattate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Influenza del numero di cellule sull'effetto dello stress ossidativo indotto da H2O2. 5.000 e 10.000 cellule ARPE-19 / pozzetto sono stati seminati in piastre a 96 pozzetti. Dopo 24 ore, le cellule sono state trattate con 350 μM H2O2 per 24 ore. Differenze significative nei livelli di glutatione sono state osservate nei pozzetti seminati con 5.000 cellule (p = 0,031, t-test)ma non nei pozzetti seminati con 10.000 cellule. C-: cellule non trattate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi dell'effetto antiossidante di PEDF e GM-CSF forniti da cellule RPE umane trasfettate SB100Xin condizioni di stress ossidativo
Come controlli positivi, ARPE-19 e le cellule RPE umane primarie sono state trattate con 5, 50 o 500 ng / mL peDF o GM-CSF disponibili in commercio per 2 giorni prima e durante il trattamento di 24 ore H2O2. Le cellule ARPE-19 trattate con 500 ng/mL PEDF o 50 ng/mL GM-CSF hanno prodotto significativamente più glutatione rispetto ai controlli non trattati in condizioni ossidative (H2O2-trattati) (Figura 5A); PEDF e GM-CSF comparabili purificati da terreni di coltura di cellule ARPE-19 trasfettate hanno mostrato un effetto simile (Figura 5B). Nelle cellule hRPE primarie, l'aggiunta di 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF o 500 ng/mL PEDF più 50 ng/mL GM-CSF sia commerciale che purificato da mezzi condizionati da cellule ARPE-19 trasfettate PEDF o GM-CSF ha ridotto il danno cellulare come riflesso da un significativo aumento dei livelli di glutatione (Figura 5C). Le cellule hRPE primarie trattate per 10 giorni con mezzo condizionato da cellule ARPE-19 trasfettate hanno anche mostrato livelli di glutatione più elevati rispetto alle cellule di controllo (Figura 5D). Sulla base di questi risultati, sono stati condotti ulteriori esperimenti con 500 ng/mL per PEDF e 50 ng/mL per GM-CSF.

ARPE-19 e le cellule hRPE primarie sono state trasfettate con i geni che codificano per PEDF e / o GM-CSF utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata combinato con l'elettroporazione. A seguito della trasfezione e dell'analisi dell'espressione genica mediante RT-qPCR, WB, ELISA e immunoistochimica (vedere Materiale supplementare, Figura S1e Figura S2),le cellule ARPE-19 trasfettate esposte a 350 μM H2O2 per 24 ore hanno mostrato livelli di glutatione significativamente più elevati rispetto alle cellule trattate con H2O2non trasfettate (Figura 6A ). Per le cellule hRPE primarie, vi è un aumento significativo dei livelli di glutatione nelle cellule trasfettate da PEDF rispetto alle cellule non trasfettate trattate con H2O2 quando tutti i donatori sono stati inclusi nell'analisi. Inoltre, i donatori 2 e 3 mostrano un aumento significativo dei livelli di glutatione per tutti i gruppi trasfettati (PEDF, GM-CSF, PEDF e GM-CSF) (dati non mostrati).

Lo studio dell'espressione genica UCP2 ha completato l'analisi mediante l'esame dello stress ossidativo mitocondriale. Una serie proof-of-concept è stata effettuata in cellule ARPE-19 trasfettate trattate con 350 μM H2O2 per 24 ore. Come mostrato nella Figura 7,nelle cellule ARPE-19 trasfettate, i livelli di espressione genica di UCP2 dopo il trattamento con H2O2 sono aumentati, ma l'aumento non è statisticamente significativo. La Figura 8 mostra un WB di Akt fosforilato (pAkt) da un lisato di cellule trasfettate GM-CSF esposte a H2O2; i dati normalizzati mostrano solo una piccola diminuzione rispetto al controllo non trattato, indicando che GM-CSF può proteggere le cellule dal danno da stress ossidativo.

Figure 5
Figura 5: Il livello di glutatione come marcatore della capacità antiossidante di PEDF e GM-CSF. (A) Il trattamento delle cellule ARPE-19 con 500 ng/mL PEDF o 50 ng/mL GM-CSF per 3 giorni prima e durante 24 ore H2O2 l'esposizione ha aumentato il livello di glutatione da 0,83 μM (C) a 1,83 μM (PEDF) e 1,3 μM (GM-CSF), p = 0,026 e p = 0,031, rispettivamente. Ad una concentrazione di 5 ng/mL non è stato osservato alcun aumento del glutatione; la differenza nel livello di glutatione tra 50 e 500 ng/mL non era significativa né per PEDF né per GM-CSF. (B) PEDF (500 ng/mL) e GM-CSF (50 ng/mL) purificati da mezzi condizionati di cellule ARPE-19 trasfettate hanno mostrato un effetto simile a PEDF o GM-CSF disponibili in commercio (p = 0,018, ANOVA). (C) L'aggiunta di 500 ng/mL PEDF, 50 ng/mL GM-CSF o 500 ng/mL PEDF più 50 ng/mL GM-CSF per 3 giorni prima e durante il trattamento 24 h H2O2 al terreno di coltura delle cellule hRPE primarie ha aumentato significativamente i livelli di glutatione nelle cellule trattate con PEDF (2,6 μM [commerciale], 2,5 μM [purificato]), GM-CSF (2,9 μM [commerciale], 3,3 μM [purificato]) e PEDF più GM-CSF (3,0 μM [commerciale], 2,9 μM [purificato]) rispetto alle cellule non trattate (1,9 μM) (p = 0,006, test kruskal-Wallis). (D) Un aumento significativo dei livelli di glutatione è stato osservato per le cellule hRPE coltivate per 10 giorni in terreno condizionato da cellule ARPE-19 trasfettate peDF, GM-CSF o PEDF-GM-CSF prima che le cellule fossero trattate con H2O2 (p = 0,003, test di Kruskal-Wallis) (dati mostrati per un donatore). I dati sono espressi come media ± SD (n = 3 repliche). Le differenze significative sono indicate con (*); i calcoli post-hoc delle analisi della varianza sono stati eseguiti calcolando i test multi-confronto di Tukey o Dunnett confrontando "C" con i gruppi trattati con PEDF-/GM-CSF. C: cellule trattate solo con H2O2, P: cellule trattate con PEDF, G: cellule trattate con GM-CSF, P + G: cellule trattate con PEDF più GM-CSF. Questa cifra è stata modificata da Bascuas et al.37. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Livello di glutatione come marcatore della capacità antiossidante delle cellule RPE umane trasfettate con PEDF e GM-CSF. (A) I livelli di glutatione delle cellule ARPE-19 trasfettate esposte a 350 μM H2O2 per 24 ore (56 giorni dopo la trasfezione) erano significativamente più alti rispetto alle cellule non trasfettate (1,9 μM), cioè 3,0 μM per le cellule trasfettate da PEDF e GM-CSF, e 3,4 μM per le cellule a doppia trasfezione (p = 0,0001, ANOVA). I dati sono espressi come ± SD media (n = 3 repliche). (B) Il dot plot mostra i valori medi di glutatione per quattro diversi donatori (C: 0,77 μM; P: 1,45 μM; G: 1,16 μM; P + G: 1,2 μM), che differisce significativamente tra cellule non trasfettate e pedf-trasfettate (p = 0,028, i calcoli post-hoc dell'ANOVA sono stati eseguiti utilizzando i test multi-confronto di Tukey confrontando "C" con i gruppi trattati con PEDF- / GM-CSF). Quando i donatori vengono analizzati separatamente, il donatore N°2 e n°3 (vedi Tabella 2 per il simbolo nel grafico) mostrano differenze significative per tutti i gruppi trasfettati rispetto al controllo non trasfettato (i significati non sono mostrati) trattati con H2O2. C: cellule non trasfettate, P: cellule trasfettate da PEDF, G: cellule trasfettate da GM-CSF, P+G: cellule trasfettate da PEDF e GM-CSF. Questa cifra è stata modificata da Bascuas et al.37. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Espressione genica UCP2 in cellule ARPE-19 trasfettate trattate con H2O2. Poiché l'espressione genica UCP2 può essere utilizzata per esaminare il danno ossidativo mitocondriale, abbiamo esaminato l'effetto della sovraespressione di PEDF e GM-CSF da parte di cellule ARPE-19 trasfettate. Le cellule ARPE-19 trasfettate trattate con H2O2, anche se non statisticamente significative, mostrano un aumento dell'espressione genica UCP2 rispetto al controllo non trasfettato che indica una riduzione dello stress ossidativo, l'aumento di piega è stato di 1,57 per PEDF-, 1,51 per GM-CSF-, e 2,36 per PEDF- più cellule trasfettate GM-CSF rispetto al controllo non trasfettato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Western Blot di Akt fosforilato (Ser473) da un lisato cellulare di cellule ARPE-19 trasfettate con GM-CSF. La WB ha dimostrato che GM-CSF migliora la fosforilazione di Akt in entrambe le colture non trattate e H2O2-trattate (UT: 3.32; H2O2: 2,69). I valori sono normalizzati a cellule non trasfettate non trattate con H2O2(C/UT). C: non trasfettate, G: cellule trasfettate GM-CSF, UT: cellule non trattate con H2O2, H2O2: cellule trattate con H2O2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella S1: Sequenze di coppie di primer e tempo/temperatura di ricottura utilizzati per RT-qPCR. Fare clic qui per scaricare questa tabella. 

Figura S1: Analisi dell'espressione genica PEDF e GM-CSF in cellule hRPE trasfettate. L'RT-qPCR ha verificato che le cellule hRPE primarie trasfettate hanno mostrato un aumento significativo dell'espressione genica PEDF (p = 0,003, test di Kruskal-Wallis) e GM-CSF (p = 0,013, test di Kruskal-Wallis) rispetto alle cellule non trasfettate. Il metodo 2^(-ΔΔCT) è stato usato in questo caso36. I dati sono espressi come ± SD (n = 4 donatori). Ogni punto rappresenta la media di tre repliche. Questa cifra è stata modificata da Bascuas et al.37. Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura S2: Secrezione proteica in cellule primarie hRPE e ARPE-19 trasfettate. (A) La quantificazione delle proteine secrete da parte di ELISA ha mostrato che le cellule hRPE trasfettate secernevano significativamente più PEDF e GM-CSF rispetto alle cellule non trasfettate (p = 0,014 per PEDF e p = 0,006 per GM-CSF, test di Kruskal-Wallis). I dati sono presentati come ± SD (n = 4 donatori). Ogni punto rappresenta la media di tre repliche. (B) La doppia colorazione PEDF-GM-CSF ha confermato la co-secrezione di PEDF e GM-CSF in cellule ARPE-19 a doppia trasfezione (figura unita). Questa cifra è stata modificata da Bascuas et al.37. Fare clic qui per scaricare questo file.

Materiale supplementare. Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Il protocollo qui presentato offre un approccio per analizzare la funzione antiossidante e protettiva di PEDF e GM-CSF prodotti da cellule trasfettate, che possono essere applicate a cellule trasfettate con qualsiasi gene benefico putativo. Nelle strategie terapeutiche geniche che hanno l'obiettivo di fornire proteine ai tessuti trapiantando cellule geneticamente modificate, è fondamentale ottenere informazioni sul livello di espressione proteica, sulla longevità dell'espressione e sull'efficacia della proteina espressa in un modello della malattia. Nel nostro laboratorio, il protocollo qui presentato è stato utile per definire l'efficacia di PEDF e GM-CSF sullo stress ossidativo, che è stato ipotizzato come un elemento importante nella patogenesi di aAMD6,7. In particolare, abbiamo utilizzato il protocollo per definire l'effetto antiossidante delle cellule hRPE primarie trasfettate PEDF/GM-CSF mediate da SB100X. Diversi ricercatori hanno dimostrato che H2O2 induce sintomi significativi di stress ossidativo ma consente comunque la rigenerazione cellulare28,29,38,simile ai risultati dei nostri esperimenti che hanno dimostrato che 350 μM per 24 ore induce uno stress ossidativo efficace nelle cellule umane ARPE-19 e RPE primarie che possono essere utilizzate per analizzare l'effetto protettivo del PEDF e del GM-CSF. H2O2 come agente ossidativo è stato scelto per lo studio a causa della sua presenza fisiologica nell'occhio e dei corrispondenti meccanismi di difesa, ad esempio il metabolismo del glutatione20,21. Il nostro laboratorio ha esaminato altri modelli di stress ossidativo come il trattamento delle cellule con tBH, che avvia la perossidazione lipidica in presenza di ioni metallici redox-attivi1; tuttavia, lo stress ossidativo era trascurabile. Negli esperimenti qui presentati, le cellule sono state trattate con H2O2 per 24 ore perché abbiamo scoperto che tempi di trattamento più brevi di 2-6 ore sono sufficienti per indurre cambiamenti nell'espressionegenica 20, ma le conseguenze successive, ad esempio la proliferazione cellulare, la vitalità cellulare e i livelli di glutatione, potrebbero non essere ancora visibili. Altrimenti, le piccole dimensioni dei pozzetti, necessarie per i saggi di citotossicità e glutatione, portano rapidamente a un pozzo di coltura confluente; ciò potrebbe portare all'inibizione del contatto e ad un mascheramento dell'effetto dell'agente ossidativo. Pertanto, una lunga incubazione con H2O2 non sembra utile, sebbene la degenerazione osservata in aAMD sia causata da stress ossidativo cronico6,7.

Una limitazione degli esperimenti qui presentati è che il numero di cellule seminate influenza l'effetto ossidativo di H2O2, cioè, per lo stesso trattamento H2O2, differenze significative nei livelli di glutatione tra H2O2-cellule trattate e non trattate sono state osservate quando 5.000 cellule ma non quando 10.000 cellule sono state seminate (Figura 4 ). Il protocollo che presentiamo richiede la semina di un basso numero di cellule, cioè 3.000 quando le cellule vengono coltivate per 3 giorni e 5.000 quando le cellule vengono coltivate per 2 giorni (Figura 1). Un'altra limitazione è che la concentrazione di H2O2 si esaurisce con il tempo; Kaczara et al.39 hanno mostrato l'esaurimento di H2O2 in poche ore in colture cellulari ARPE-19, che influenza lo sviluppo di modelli di stress ossidativo cronico. Questi ricercatori hanno proposto un metodo alternativo per il trattamento prolungato di H2O2, in particolare la generazione continua di H2O2 dal glucosio nel mezzo utilizzando la glucosio ossidasi, ma una concentrazione standardizzata di H2O2 non può essere garantita. D'altra parte, il protocollo che abbiamo stabilito con la consegna dell'agente ossidante in un singolo impulso, ha il vantaggio di essere più veloce e più semplice da eseguire rispetto ai modelli cronici in cui il trattamento H2O2 deve essere ripetuto per diversi giorni38.

La capacità delle cellule di contrastare il danno ossidativo è determinata dall'equilibrio tra la produzione di ROS e la capacità di generare antiossidanti. Nella cellula, il tripeptide glutatione (GSH) è l'agente riducente predominante, che può essere ossidato a glutatione disolfuro (GSSG) e rigenerato dalla glutatione reduttasi utilizzando NADPH40. Nelle cellule sane, oltre il 90% del pool totale di glutatione è presente nella forma ridotta. Quando le cellule sono esposte ad un aumento del livello di stress ossidativo, GSSG si accumula e il rapporto tra GSSG e GSH aumenta. Di conseguenza, il monitoraggio dello stato redox del glutatione in campioni biologici è essenziale per la valutazione dello stato di disintossicazione di cellule e tessuti dai radicali liberi generati durante lo stress ossidativo e il danno cellulare. Il protocollo qui dettagliato per la quantificazione del glutatione è abbastanza sensibile da rilevare l'effetto antiossidante di PEDF e GM-CSF espresso da cellule RPE geneticamente modificate.

Poiché lo stress ossidativo influisce sulle attività mitocondriali40, è particolarmente interessante che il controllo dei livelli di ROS da parte del PEDF sia correlato alla regolazione della proteina di disaccoppiamento mitocondriale 2 (UCP2) e il PEDF attenua gli effetti dello stress ossidativo aumentando l'espressione di UCP211,41. La funzione principale di UCP2 è il controllo dei ROS derivati dai mitocondri e l'azione come sensore dello stress ossidativo mitocondriale41,42. Qui, oltre ad esaminare l'effetto di PEDF e GM-CSF sui livelli di glutatione, abbiamo l'espressione genica di UCP2 che tende ad aumentare (Figura 7); sono necessari ulteriori studi per stabilire il ruolo del PEDF e del GM-CSF sull'espressione genica UCP2.

Nel complesso, l'attuale modello H2O2offre un approccio completo per studiare l'effetto benefico delle terapie geniche a base di trasposoni che mirano a fornire geni terapeutici antiossidanti alle cellule del paziente per trattare la malattia neurodegenerativa come AMD.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Gregg Sealy e Alain Conti per l'eccellente assistenza tecnica e il Prof. Zsuzsanna Izsvák del Max-Delbrück Center di Berlino per aver gentilmente fornito i plasmidi pSB100X e pT2-CAGGS-Venus. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale svizzera per le scienze e dalla Commissione europea nell'ambito del Settimo programma quadro. Z.I è stato finanziato dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plates Corning 353047
6-well plates Greiner 7657160
96-well culture plate white with clear flat bottom  Costar 3610 Allows to check the cells before measuring the luminescence (GSH-Glo Assay)
96-well plates Corning  353072
Acrylamid 40% Biorad 161-0144
Amphotericin B AMIMED 4-05F00-H
Antibody anti-GMCSF ThermoFisher Scientific PA5-24184
Antibody anti-mouse IgG/IgA/IgM  Agilent P0260
Antibody anti-PEDF  Santa Cruz Biotechnology Inc sc-390172
Antibody anti-penta-His  Qiagen 34660
Antibody anti-phospho-Akt Cell Signaling Technology 9271
Antibody anti-rabbit IgG H&L-HRP Abcam ab6721
Antibody donkey anti-rabbit Alexa Fluor 594  ThermoFisher Scientific  A11034
Antibody goat anti-mouse Alexa 488 ThermoFisher Scientific A-11029
ARPE-19 cell line ATCC CRL-2302
BSA  Sigma-Aldrich A9418-500G
chamber culture glass slides Corning 354118
CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay  Promega G9291
DAPI Sigma-Aldrich D9542-5MG
DMEM/Ham`s F12  Sigma-Aldrich D8062
Duo Set ELISA kit R&D Systems  DY215-05
EDTA ThermoFisher Scientific 78440
ELISAquant kit BioProducts MD PED613-10-Human
Eyes (human) Lions Gift of Sight Eye Bank (Saint Paul, MN)
FBS  Brunschwig P40-37500
Fluoromount Aqueous Mounting Medium Sigma-Aldrich F4680-25ML
FLUOstar Omega plate reader  BMG Labtech
GraphPad Prism software (version 8.0) GraphPad Software, Inc.
GSH-Glo Glutathione Assay Promega V6912
hydrogen peroxide (H2O2) Merck 107209
ImageJ software (image processing program) W.S. Rasband, NIH, Bethesda, MD, USA; https://imagej.nih.gov/ij/; 1997–2014
Imidazol  Axonlab A1378.0010
Leica DMI4000B microscope  Leica Microsystems
LightCycler 480 Instrument II  Roche Molecular Systems
LightCycler 480 SW1.5.1 software Roche Molecular Systems
NaCl Sigma-Aldrich 71376-1000
NaH2PO4 Axonlab 3468.1000
Neon Transfection System  ThermoFisher Scientific MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit ThermoFisher Scientific MPK1096
Neubauer chamber Marienfeld-superior 640010
Ni-NTA superflow  Qiagen 30410
Nitrocellulose  VWR 732-3197
Omega Lum G Gel Imaging System Aplegen Life Science
PBS 1X Sigma-Aldrich D8537
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781-100
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quantabio 95072-012
PFA  Sigma-Aldrich 158127-100G
Pierce BCA Protein Assay Kit  ThermoFisher Scientific 23227
Primers  Invitrogen  See Table 1 in Supplementary Materials
pSB100X (250 ng/µL) Mátés et al., 2009. Provide by Prof. Zsuzsanna Izsvak
pT2-CMV-GMCSF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
pT2-CMV-PEDF-His plasmid DNA (250 ng/µL) Constructed using the existing pT2-CMV-PEDF-EGFP plasmid reported in Johnen, S. et al. (2012) IOVS, 53 (8), 4787-4796.
QIAamp DNA Mini Kit QIAGEN 51304
recombinant hGM-CSF  Peprotech 100-11
recombinant hPEDF   BioProductsMD 004-096
ReliaPrep RNA Cell Miniprep System Promega Z6011
RIPA buffer ThermoFisher Scientific 89901
RNase-free DNase Set QIAGEN 79254
RNeasy Mini Kit QIAGEN 74204
SDS Applichem A2572
Semi-dry transfer system for WB  Bio-Rad
SuperMix qScript Quantabio 95048-025
Tris-buffered saline (TBS)  ThermoFisher Scientific 15504020
Triton X-100 AppliChem A4975
Trypsin/EDTA Sigma-Aldrich T4174
Tween AppliChem  A1390
Urea ThermoFisher Scientific 29700
WesternBright ECL HRP substrate Advansta K-12045-D50
Whatman nitrocellulose membrane Chemie Brunschwig MNSC04530301

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References

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Medicina Numero 166 terapia genica oculare degenerazione maculare legata all'età danno da stress ossidativo trasposone della Bella Addormentata, consegna genica non virale cellule RPE PEDF GM-CSF
Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla <em>bella addormentata</em> nel bosco
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Bascuas, T., Kropp, M., Harmening,… More

Bascuas, T., Kropp, M., Harmening, N., Asrih, M., Izsvák, Z., Thumann, G. Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (166), e61957, doi:10.3791/61957 (2020).

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