Summary
我们开发了一种方案，通过使用 睡美人 （SB）转座子系统，通过编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因电穿孔来转染原代人色素上皮细胞。定量聚合酶链反应（qPCR）、免疫印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA）证明了成功的转染。
Abstract
我们日益老龄化的社会导致神经退行性疾病的发病率上升。到目前为止，病理机制尚未得到充分了解，从而阻碍了确定的治疗方法的建立。用于增加保护因子表达的基于细胞的添加剂基因疗法被认为是治疗神经退行性疾病（如年龄相关性黄斑变性（AMD））的有前途的选择。我们开发了一种使用 睡美人 （SB）转座子系统将编码色素上皮衍生因子（PEDF）的基因稳定表达到原代人色素上皮（PE）细胞基因组中的方法，该因子的特征是神经系统中的神经保护和抗血管生成蛋白。从人类供体的眼睛中分离原代PE细胞并保持培养。达到汇合后，将1 x 104 个细胞悬浮在11 μL重悬缓冲液中，并与含有30 ng高活性 SB （SB100X）转座酶质粒和470 ng PEDF 转座子质粒的2 μL纯化溶液合并。使用以下参数使用毛细管电穿孔系统进行基因改造：两个电压为1，100 V，宽度为20 ms的脉冲。将转染的细胞转移到含有补充有胎牛血清的培养基的培养板中;在第一次培养基交换时加入抗生素和抗真菌药。在独立进行的实验中证明了成功的转染。定量聚合酶链反应（qPCR）显示 PEDF 转基因的表达增加。通过免疫印迹评估，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量，PEDF分泌显着升高并保持稳定。 SB100X介导的转移允许稳定的PEDF基因整合到PE细胞的基因组中，并确保 PEDF 的连续分泌，这对于开发基于细胞的基因添加疗法以治疗AMD或其他视网膜退行性疾病至关重要。此外，对 PEDF 转座子与人PE细胞的整合谱的分析表明，基因组分布几乎是随机的。
Introduction
高龄被描述为神经退行性疾病的主要风险。年龄相关性黄斑变性（AMD）是一种导致60岁以上患者严重视力丧失的多基因疾病，属于失明和视力障碍的四个最常见原因1，预计到2040年将增加到2.88亿人2。视网膜色素上皮（RPE）功能障碍，即位于绒毛细血管和视网膜光感受器之间的单层紧密堆积的细胞，有助于AMD的发病机制。RPE完成对正常视网膜功能3至关重要的多项任务，并分泌多种生长因子和维持视网膜和脉络膜毛细血管结构完整性所必需的因子，从而支持光感受器存活并为循环和营养供应提供基础。
在健康的眼睛中，色素上皮衍生因子（PEDF）负责平衡血管内皮生长因子（VEGF）的作用，保护神经元免受细胞凋亡，防止内皮细胞增殖，并稳定毛细血管内皮。VEGF与PEDF比值的转移与眼部新生血管形成有关，在动物模型4，5以及AMD和增殖性糖尿病视网膜病变引起的脉络膜新生血管（CNV）患者样本中观察到6，7，8，9，10.提高的VEGF浓度是当前标准处理的目标。抗VEGF药物贝伐珠单抗，雷珠单抗，阿柏西普以及最近的brolucizumab改善了约三分之一CNV患者的视力，或者更确切地说，在90%的病例中稳定了视力11，12，13。然而，频繁的玻璃体内注射通常会带来不良事件的风险14，损害患者的依从性，并对医疗保健系统造成重大的经济负担15。此外，一定比例的患者（2%-20%）对抗VEGF治疗无反应或反应不佳16，17，18，19。这些阴性伴随因素需要开发替代疗法，例如眼内植入物、细胞和/或基因治疗方法。
基因疗法已经发展成为遗传性和非遗传性疾病的有前途的治疗方法，并打算恢复非功能性基因序列或抑制功能障碍的基因序列。对于几乎不可能识别和替代致病因素的多基因疾病，策略旨在持续提供保护因素。在AMD的情况下，已经开发了各种添加剂疗法，例如内皮抑素和血管抑素20的稳定表达，VEGF拮抗剂可溶性FMS样酪氨酸激酶-1（sFLT-1）21，22，补体调节蛋白簇分化59（CD59）23或PEDF24，25.眼睛，尤其是视网膜，是基因药物的绝佳靶标，因为它具有封闭的结构、良好的可及性、小尺寸和免疫特权，因此允许局部递送低治疗剂量并使移植不易产生排斥反应。此外，眼睛可以进行无创监测，并且可以通过不同的成像技术检查视网膜。
由于其高转导效率，病毒载体是将治疗基因递送到靶细胞的主要载体。然而，根据所使用的病毒载体，已经描述了不同的不良反应，例如免疫和炎症反应26，诱变和致癌作用27，28，或在其他组织中的播散29。实际限制包括包装尺寸限制30以及与生产临床级批次31，32相关的困难和成本。这些缺点促进了通过脂质体/多链体、超声或电穿孔转移的非病毒、基于质粒的载体的进一步发展。然而，质粒载体通常不会促进转基因与宿主基因组的基因组整合，从而导致瞬时表达。
转座子是天然存在的DNA片段，可以改变它们在基因组中的位置，这一特征已被用于基因治疗。由于具有主动整合机制，基于转座子的载体系统允许插入的转基因的连续和恒定表达。睡美人（SB）转座子由鱼类33中发现的古代Tc1/mariner型转座子重组而成，并通过分子进化进一步改进，从而产生过度活跃的变体SB100X34，能够在各种原代细胞中实现有效转座，并用于不同疾病模型中的表型校正35。目前，使用SB转座子系统已启动13项临床试验。SB100X转座子系统由两部分组成：转座子，其包含目的基因，两侧是末端倒置重复序列（TIR））和转座酶，其动员转座子。在质粒DNA递送到细胞后，转座酶结合TIR并催化转座子的切除和整合到细胞基因组中。
我们开发了一种基于非病毒细胞的添加剂疗法，用于治疗新生血管性AMD。该方法包括通过SB100X转座子系统36，37，38将基于电穿孔的PEDF基因插入原代色素上皮（PE）细胞中。转座酶和PEDF的遗传信息在单独的质粒上提供，从而能够调整理想的SB100X与PEDF转座子比。电穿孔使用基于移液器的毛细管转染系统进行，其特点是电极之间的间隙尺寸最大化，同时最小化其表面积。该装置被证明在广泛的哺乳动物细胞中实现了出色的转染率39，40，41。小电极表面积提供均匀的电场并减少电解的各种副作用42。
转染色素上皮细胞分泌的PEDF的抗血管生成功能在分析人脐静脉内皮细胞发芽，迁移和凋亡的各种体外实验中显示43。此外，在角膜新生血管形成的兔模型44和CNV43，45，46的大鼠模型中移植PEDF转染的细胞显示出新生血管的下降。
在这里，我们描述了使用毛细管转染系统通过SB100X转座子系统将PEDF基因稳定插入原代人RPE细胞的详细方案。将转染的细胞在培养物中保持21天，随后通过定量聚合酶链反应（qPCR）分析PEDF基因表达，并通过免疫印迹和酶联免疫吸附测定分析PEDF蛋白分泌（ELISA，图1）。
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Protocol
根据《赫尔辛基宣言议定书》获得知情同意后，从亚琛工业大学医院眼科亚琛角膜库获得人类供体眼睛。收集和使用人体样本的程序已得到机构伦理委员会的批准。
1. 原代人RPE细胞的分离
- 摆好无菌防护服和手套。将无菌窗帘置于层流下。
- 将无菌制备仪器和其他必要的无菌设备置于层流下。
- 记录眼球的接收，准备的开始以及可能的异常。登记捐赠者的年龄、性别、死因以及死亡时间和摘除眼睛之间的时间。
- 将眼球放在无菌纱布敷中，并用一只手握住。
- 使用手术刀和一把超细尖眼剪刀，在角膜缘后方约 3.5 毫米处通过圆周切口将前段与后段分开。
- 将后段向下倾斜后，使用大肠镊子小心地取出玻璃体和视网膜。
- 使用直虹膜钳谨慎地重新排列折叠的 RPE/choroidea 复合体，然后用弯曲的虹膜钳将其固定到位。
- 在后眼杯中填充 1 mL Dulbecco 改良 Eagle's 培养基/火腿 F-12 营养混合物 （DMEM/F12），并补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、80 U/mL 青霉素和 80 μg/mL 链霉素（笔/链球菌）和 2.5 μg/mL 两性霉素 B （AmphoB）。
注意：与从猪或牛眼中分离原代RPE细胞相反36，37，后眼杯不必填充并用胰蛋白酶孵育。 - 通过用火抛光曲面玻璃巴斯德移液管将视神经的视网膜色素上皮轻轻刷向角膜缘来收获 RPE 细胞，同时使用大肠杆菌钳将 RPE/舞蹈复合体固定在角膜缘处。将细胞悬液转移到培养皿中。
- 重复步骤1.8和1.9并收集培养皿中的所有细胞。使用单通道移液器（100-1，000 μL）上下移液，小心重悬细胞悬液。
- 将每个眼球的 RPE 细胞悬液接种到 24 孔细胞培养板的三个孔中，并用补充有 FBS、笔/链球菌和 AmphoB 的 DMEM/F12 填充至 1 mL。
- 将RPE细胞培养物保持在37°C，在95%空气和5%CO2 的潮湿气氛中，直到达到汇合。每周更换两次细胞培养基。
2. 原代人RPE细胞的电穿孔
- SB100X转座酶/PEDF转座子质粒混合物的制备
- 根据制造商的方案，使用常规质粒纯化试剂盒纯化 SB100X 转座酶和 PEDF 转座子质粒DNA，这些试剂盒被确定适用于转染等应用。
- 使用微量分光光度计定量质粒DNA含量，并用10 mM Tris-HCl（pH 8.5）将其调节至250 ng / μL的浓度。
- 将一份 250 ng/μL SB100X 转座酶质粒 DNA（例如 2.5 μL）与 16 份 250 ng/μL PEDF 转座子质粒 DNA（例如 40 μL）混合。残留质粒混合物可储存在-20°C。
注意：应避免质粒混合物的多次重复冻融循环。 - 将 2 μL 含有 29.4 ng SB100X 转座酶质粒和 470.6 ng PEDF 转座子质粒的 SB100X 转座酶/PEDF 转座子质粒混合物放入无菌 1.5 mL 安全锁定微量离心管中。保持冰上，直到与细胞混合。
- 毛细管转染系统的设置
注意：原代人RPE细胞的电穿孔已根据制造商的方案使用10μL试剂盒通过毛细管转染系统进行。该系统包括转染装置、转染移液器和移液站。该试剂盒包含 10 μL 转染吸头、缓冲管、电解缓冲液 E（缓冲液 E）和重悬缓冲液 R（缓冲液 R）。- 将移液器站连接到转染设备。
- 用 3 mL 缓冲液 E 填充缓冲管，并将其插入移液器站，直到听到咔嗒声。
注意：确保缓冲管的侧电极连接到移液器站的侧球柱塞。 - 对于原代人RPE细胞的电穿孔，在转染设备上设置以下脉冲条件：1，100 V（脉冲电压），20 ms（脉冲宽度），两个脉冲（脉冲数）。
- 培养的原代人RPE细胞的制备
- 通过相差显微镜记录原代RPE细胞培养物的形状和形态。使用低放大倍率显微照片来展示 RPE 细胞向汇合和集成的单层以及更高放大倍率的显微照片来指出 RPE 细胞的典型鹅卵石形态。
- 吸出细胞培养基，并用 1 mL 缓冲磷酸盐水 （PBS，pH 7.4） 洗涤细胞两次。
- 在95%空气和5%CO2 的潮湿气氛中，在37°C下用0.5mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化原代人RPE细胞7-15分钟（最长）。显微镜检查细胞脱离。
- 用补充有FBS的1 mL DMEM/F12停止胰蛋白酶消化。取 20 μL 等分试样使用血细胞计数器进行细胞计数。将RPE细胞悬液以106 x g 离心10分钟。
- 将 20 μL 等分试样与 20 μL 台盼蓝溶液混合。在血细胞计数器的每一半中吸取10μL，并在相差显微镜下计数细胞。
- 离心后，将RPE细胞沉淀重悬于1 mL PBS中。
- 每次转染反应取10，000-100，000个RPE细胞，并以106× g 离心10分钟。
注意：除了施加电场和添加质粒DNA的转染反应外，每种方法还包括两种不同的对照培养物：（1）无电场应用和无质粒DNA;（2）具有电场应用，但无质粒DNA。 - 将细胞沉淀重悬于 11 μL 缓冲液 R 中，并将其与 2 μL SB100X 转座酶/PEDF 转座子质粒混合物混合（参见步骤 2.1.4）。
注意：在缓冲液R中重悬后，必须在15分钟内处理细胞，以避免细胞活力和转染效率降低。 - 将转染移液器的头部插入10 μL转染吸头，直到夹子完全拾取活塞的安装杆。将细胞/质粒溶液抽取到转染尖端中。
注意：避免产生气泡及其吸入转染尖端。 - 将 1 mL 补充有 FBS 的 DMEM/F12 （不含笔/链球菌且不含 AmphoB）放入所需数量的 24 孔细胞培养板中。
- 电穿孔工艺
- 将转染移液器插入移液器站中的缓冲管中（参见步骤2.2.2），直到听到咔嗒声。
注意：确保转染移液器的金属头连接到移液器站内的球柱塞和缓冲管。 - 在转染设备的触摸屏上按 开始 。在施加电脉冲之前，设备会自动检查缓冲管和转染移液器是否正确插入。发送电脉冲后， “完成” 显示在触摸屏上。
- 小心地从移液器站上取出转染移液器，并将细胞/质粒溶液移液到细胞培养板的制备孔中，立即从10μL转染吸头中释放电穿孔细胞（参见步骤2.3.10）。
- 将转染的RPE细胞培养物保持在37°C的95%空气和5%CO2的潮湿气氛中。在电穿孔后 3 天加入笔/链球菌和 AmphoB，进行第一次培养基交换。
- 将转染移液器插入移液器站中的缓冲管中（参见步骤2.2.2），直到听到咔嗒声。
3. 转染原代人RPE细胞的分析
- 样品制备
- 培养 3 周后，最终将 RPE 细胞培养物在补充有 FBS、笔/链球菌和 AmphoB 的 1.0 mL DMEM/F12 的规定体积中孵育 24 小时。
- 取细胞培养上清液并将其储存在-20°C直至进一步接近时间处理或在-80°C下储存用于热不稳定样品和长期储存。
- 在95%空气和5%CO2 的潮湿气氛中，在37°C下用0.5mL的0.05%胰蛋白酶-EDTA转染的RPE细胞培养物胰蛋白酶消化10分钟。
- 用补充有FBS的1 mL DMEM/F12停止胰蛋白酶消化。取小等分试样使用血细胞计数器进行细胞计数（参见步骤2.3.5）。将RPE细胞悬液以106× g 离心10分钟。
- 将RPE细胞沉淀储存在-80°C直至进一步处理。
- 通过蛋白质印迹评估 PEDF 分泌
注意：为了进行定性评估，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和随后的蛋白质印迹分析细胞培养上清液（参见步骤3.1.2）。取决于 PEDF 使用转座子质粒DNA，上清液必须以不同的方式处理。- 从细胞培养上清液中纯化His标记的PEDF融合蛋白
- 使用斜面切割的尖端，每个样品取 30 μL 镍-次氮基三乙酸 （Ni-NTA） 浆液，并通过离心（2，660 x g 30 秒）沉淀 Ni-NTA 树脂。
- 用 200 μL 1x 孵育缓冲液（50 mM NaH 2 PO4、300 mM NaCl、10 mM 咪唑、pH 8.0）小心重悬 Ni-NTA 树脂，并通过离心（2，660 x g 30 秒）沉淀。
- 重复上一步。
- 用每个样品的 40 μL 4x 孵育缓冲液（200 mM NaH 2 PO4、1.2M NaCl、40 mM 咪唑、pH 8.0）小心重悬 Ni-NTA 树脂。
- 将 900 μL 细胞培养上清液与 260 μL 4x 孵育缓冲液和 55 μL 预处理的 Ni-NTA 浆液混合（参见步骤 3.2.1.4）。
- 将混合物在室温下在摇床上孵育60分钟。
- 通过离心（2660 x g 60秒）沉淀Ni-NTA树脂。
- 小心地将Ni-NTA树脂与175μL的1x孵育缓冲液和颗粒树脂离心（2，660 x g 60秒）重悬。
- 重复上一步。
- 小心地将Ni-NTA树脂与30μL洗脱缓冲液（50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0）重悬，并将混合物在室温下在摇床上孵育20分钟。
- 通过离心（2，660 x g 30秒）沉淀Ni-NTA树脂。
- 小心地取上清液并将其与2x SDS样品缓冲液47混合。
- 将混合物在95°C下加热5分钟，并在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离Ni-NTA纯化的蛋白质。
- 如前所述，使用抗Penta-His抗体（小鼠单克隆，1：500）和辣根过氧化物酶（HRP）偶联抗小鼠抗体（兔多克隆，1：1，000）进行蛋白质印迹36，37。
- 直接分析未标记的 PEDF 蛋白
- 取 15 μL 细胞培养上清液，与 2x SDS 样品缓冲液47 混合。
- 将混合物在95°C下加热5分钟，并在10%SDS - 聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质。
- 如前所述，使用抗人PEDF抗体（兔多克隆，1：4，000）和HRP偶联抗兔抗体（山羊多克隆，1：2，000）进行蛋白质印迹38。
- 通过酶联免疫吸附法定量 PEDF 分泌
- 根据制造商的方案，使用人PEDF ELISA试剂盒分析细胞培养上清液（参见步骤3.1.2）。
- 将分泌的PEDF量与每次转染反应确定的时间和细胞数相关联（参见步骤3.1.4）。
- 转染RPE细胞中 PEDF 基因表达的分析
- 根据制造商的方案，使用市售试剂盒从RPE细胞沉淀中分离总RNA（参见步骤3.1.5）。
- 使用微量分光光度计定量RNA含量。
- 根据制造商的方案，使用逆转录系统对 0.1 μg RNA 进行逆转录。
- 如前所述执行实时 qPCR38。
- 转染RPE细胞中转基因插入位点的分析
- 根据制造商的方案，使用市售试剂盒从RPE细胞沉淀中分离基因组DNA（参见步骤3.1.5）。
- 使用微量分光光度计定量DNA内容。
- 如前所述，使用计算辅助的半特异性PCR方案生成插入位点库38。
- 如前所述执行计算分析38.
- 从细胞培养上清液中纯化His标记的PEDF融合蛋白
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Representative Results
原代人RPE细胞的培养和电穿孔
我们已经表明，接种足够数量的动物源性原代RPE细胞可以培养和生长到色素沉着的六角形细胞的集成单层36，37，48。它们在体外形成紧密连接、表现出吞噬活性和表达特异性标记基因的能力48 反映了体内视网膜色素上皮的实质性任务。从人类供体眼睛分离的培养原代RPE细胞也显示出典型的鹅卵石形态，无论供体的年龄（65.3±9.94 a，最小：49 a，最大：83 a，n = 12），死后分离时间（37.3 ± 17.0 h，最小：16 h，最大：68 h，n = 12）和培养时间（27.6 ± 14.1 d，最小：13 d， 最大：61 d，n = 12）（图2，左图）。使用毛细管转染系统将短期电脉冲应用于原代人RPE细胞不会对上皮形态产生不利影响（图2，右图）。对各种电参数的测试表明，脉冲电压为1，200 V，脉冲宽度为20 ms的两个脉冲产生了良好且稳定的转染效率和最多的活RPE细胞数量（未发表的数据）。
SB100X 介导的将 PEDF 基因插入培养的原代人 RPE 细胞中
我们测试了 SB100X 与 PEDF 转座子的质粒 DNA 比率，范围从 250 ng （0.08 pmol） SB100X 转座酶加 250 ng （0.052 pmol） PEDF 转座子到 12.2 ng （0.0039 pmol） SB100X 转座酶加 487.8 ng （0.1 pmol） PEDF 转座子。 该方法确定29.4 ng（0.0094 pmol）SB100X转座酶加470.6 ng（0.098 pmol）PEDF转座子和23.8 ng（0.0076 pmol）加476.2 ng（0.099 pmol）两种组合获得最佳转位效率37。在培养的原代人RPE细胞中，使用SB100X转座子系统递送PEDF转基因允许持续增加PEDF基因表达和PEDF蛋白分泌。对于 His 标记的重组 PEDF，对转染原代人 RPE 细胞的细胞培养基进行蛋白质印迹分析表明，PEDF 分泌水平恒定，无需转基因沉默超过 500 天（图 3A）。对于未标记的PEDF，与非转染细胞相比，转染的原代人RPE细胞的分泌也显着增加38。对连续转染的细胞培养基进行的代表性蛋白质印迹分析清楚地表明，转染后21天PEDF分泌率普遍较高（图3B），并且在追求的培养中，长期升高的PEDF分泌被证明至少165天（图3C）。基于 ELISA 的定量显示，与相应的非转染对照细胞相比，转染的原代人 RPE 细胞中的 PEDF 总分泌增加了 20 倍（图 3D）。这种增加在基因表达水平上也得到了证实，其中总PEDF表达提高了30倍以上（图3E）。
图 1：通过 SB100X 转座子系统将 PEDF 基因基于电穿孔插入原代人 RPE 细胞的工作流程。该方案描述了（A）原代人RPE细胞的分离及其随后培养为汇合单层，（B）电穿孔过程的单个步骤，包括纯化SB100X转座酶和PEDF转座子质粒DNA，制备SB100X转座酶/ PEDF 转座子质粒混合物、毛细管转染系统的设置、培养的原代人 RPE 细胞的制备、电穿孔、接种和转染 RPE 细胞的培养，以及 （C） 转染的原代人 RPE 细胞的分析，包括细胞培养上清液和转染细胞样品的制备， PEDF分泌的评估和定量，以及PEDF基因表达的分析。请点击此处查看此图的大图。
图2：从不同供体眼睛分离的RPE细胞的相差显微照片。 原代人 RPE 细胞的培养物，在供体年龄、死后分离时间和应用电穿孔之前的培养时间方面有所不同（左图），以及使用毛细管转染系统（右图）暴露于电参数 1，100 V（脉冲电压）、20 ms（脉冲宽度）和 2 个脉冲（脉冲数）的转染原代人 RPE 细胞的培养物（右图）），展示了鹅卵石状图案的色素细胞的汇合集成单层（比例尺：500μm）。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：SB100X 介导的原代人 RPE 细胞转染后的 PEDF 分泌和 PEDF 基因表达。 （A-C） 使用毛细管转染系统转染 29.4 ng （0.0094 pmol） SB100X 转座酶质粒和 470.6 ng （0.098 pmol） PEDF 转座子质粒混合物转染培养的原代人 RPE 细胞中 PEDF 分泌稳定性的基于免疫印迹的分析。 （A）来自26岁供体的RPE细胞（女性，死后分离时间：26小时，电穿孔前培养时间：14天）转染并在培养物中维持500天以上。在不同时间点从细胞培养基中纯化His标记的重组PEDF（~48 kDa），并使用抗Penta-His抗体通过蛋白质印迹进行评估。（B）对于未标记的重组PEDF，来自53岁供体的RPE细胞（女性，死后分离时间：28小时，转染前培养时间：19天）在没有质粒DNA（对照培养物#1和#2）或添加质粒DNA（PEDF转染细胞培养物#3至#7）的情况下电穿孔并在培养物中保持21天。细胞培养上清液未纯化，而是使用抗PEDF抗体通过免疫印迹直接分析。细胞裂解物的蛋白质印迹分析显示对照（培养物#1和#2）和转染细胞（培养物#3和#4）中的细胞内PEDF水平。相似蛋白质量的上样量由GAPDH蛋白质条带的相同密度（~36 kDa）表示。（C）为了分析长期PEDF分泌，来自63岁供体（男性，死后分离时间：26小时，转染前培养时间：15天）的RPE细胞在没有质粒DNA（对照培养物#1和#2）或质粒DNA（PEDF转染细胞培养物#3）的情况下电穿孔，并在培养物中保持至少165天。细胞培养基未纯化，而是使用抗PEDF抗体通过免疫印迹直接分析。（D）基于ELISA的原代人RPE细胞（两个样本）和非转染对照细胞（四个样本）中总PEDF分泌的定量。将转染细胞的分泌与非转染细胞的分泌进行比较（*p = 0.0264，与韦尔奇校正的未配对t检验）。（E）转染原代人RPE细胞中的内源性和总（内源性加重组）PEDF基因表达与非转染对照细胞中的表达相关，其表达设置为1（虚线）。数据以盒须图表示（晶须：最小到最大）。将总PEDF基因表达与内源性PEDF基因表达进行比较（不显著，与Welch校正的未配对t检验）。非标记重组 PEDF （B-E） 的结果代表来自多达 27 个供体的整个原代 RPE 细胞数据集的两个单位，转染的 SB100X 与 PEDF 转座子比为 29.4 ng（0.0094 pmol）加上 470.6 ng （0.098 pmol），由 Thumann 等人描述 2017 38。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
在我们的项目中，我们的目标是非病毒生产转基因原代人类RPE细胞，这些细胞不断过表达并分泌有效因子，以便将转染的细胞用作建立和维持保护环境的长期治疗药物。我们已经建立了编码PEDF的基因的引入，PEDF是一种普遍表达的多功能蛋白质，具有抗血管生成和神经保护功能。此处描述的方案可用于使用 SB100X 转座子系统稳定且可重复地转染原代人RPE细胞。DNA递送和引入RPE细胞是使用基于移液器的毛细管转染系统进行的，该系统使用特定的尖端作为电穿孔室而不是比色皿。
由形态分化良好的细胞组成的原代RPE培养物的富集用于随后的转染受到与人类供体（年龄和一般健康状况）以及眼睛接收（细胞分离的死后时间）相关的几个因素的影响。新鲜分离和接种的原代 RPE 细胞至少需要 2 周才能形成单层六角形细胞。一般来说，在转染前需要更多时间才能达到汇合的细胞培养物在转染后也显示出减慢的粘附和扩散。在细胞分离或转染过程中受损的RPE细胞的游离色素沉积也阻碍了细胞粘附和扩散。
SB转座子系统是一种广泛使用的遗传工具，能够高效安全地将治疗相关的核苷酸序列递送到各种类型的细胞中，随后应用于基于基因的细胞治疗。特别是，其增强型变体SB100X结合了病毒载体和非病毒质粒DNA的优点。整合作用模式可确保表达盒的基因组稳定整合到宿主细胞的基因组中，并能够持续表达感兴趣的基因或序列。与逆转录病毒载体相比，逆转录病毒载体优先整合到具有潜在诱变和肿瘤发生高风险的活性转录单元中 27，28，基于 SB 的整合谱是随机的。使用各种培养和原代哺乳动物细胞（包括人类细胞49，50，51，52）以及原代大鼠和人RPE细胞38，46的大量研究中证明了这一点。此外，将SB转座子系统作为质粒DNA的应用降低了免疫原性并促进了制造过程。
SB100X转座酶和PEDF转基因的遗传信息在单独的质粒上传递是一个重要方面，因为它允许精确调整最佳的SB100X与PEDF转座子比。如前所述，SB转座子系统对过量的转座酶表达敏感，其导致转座活性53的抑制。我们还观察到ARPE-19细胞的这种效应，ARPE-19细胞是通过原代人RPE培养物54的选择性胰蛋白酶消化纯化的自发进化细胞系和原代RPE细胞。在这里，转染SB100X与PEDF转座子比高达55.6 ng（0.018 pmol）SB100X转座酶加444.4 ng（0.093 pmol）PEDF转座子导致PEDF分泌率明显降低37。 必须为每个新构建的转座子质粒确定理想的转座酶与转座子比值。
基于非病毒质粒的载体可以通过脂质/多链体、纳米颗粒、激光、超声或电穿孔进行转移。我们已经证明，基于脂质转染的原代PE细胞转染效率不高，因此切换到基于电穿孔的基因转移36。电穿孔被定义为向细胞施加短持续时间的电场，这导致膜的通透性和水孔的形成，质粒DNA可以通过这些孔进入细胞。通常，将细胞、质粒DNA和导电缓冲液的混合物填充到两个电极之间的特定电穿孔室中，这两个电极连接到产生电脉冲的电穿孔装置。在这种所谓的批量电穿孔装置中，传统的比色皿电穿孔室的特点是两个平行的板型电极，其距离是可变的（0.1-0.4 mm），具体取决于细胞类型和每次电穿孔反应使用的细胞数量。尽管转染效率良好，但不同的副作用可能会对转染细胞的存活产生负面影响，例如pH变化、热量产生、气泡产生和湍流。毛细管转染系统至少通过具有最小表面积和最大间隙尺寸的电极来减轻基于比色皿的副作用42 以及通过使用特定的重悬和电解缓冲液;但是，它们的成分没有公开。
尽管体电穿孔装置的增强导致细胞存活率增加，但对一定比例的细胞的不可逆转的损伤是不可避免的。此外，无法精确控制整合到细胞中的质粒量。小型化电穿孔系统的最新发展通过进一步减少与批量电穿孔相关的限制，实现了额外的改进。这些新器件基于微电极、微流体或纳米结构。它们在基因治疗，再生医学和原位细胞内研究领域提供了新的应用前景（由Chang等人和Shi等人审查）。55，56.
我们已经证明，电穿孔最初使用基于比色皿的系统进行，随后使用基于移液器的毛细管系统建立，是一种合适且有效的方法，可以转染色素上皮细胞系ARPE-19以及原代PE细胞36，37，38，57，58.根据所使用的细胞类型，重要的是定义适当的电穿孔方案，应用能够同时实现良好转染效率和细胞存活的参数。电场不足可防止细胞受损，但会导致转染效率低下。随着电场强度的增加，转染效率得以提高。然而，由于不可逆的细胞损伤，升高的电参数也会导致更高的死细胞百分比。对于ARPE-19细胞系，使用毛细管转染系统，电穿孔参数为1，350 V、20 ms和2个脉冲，初始转染效率为100%37。将这些参数应用于原代RPE细胞的转染也带来了良好的效率，但与1，100 V、20 ms和2脉冲的电穿孔参数相比，转染后的培养细胞数量也更少（数据未显示）。因此，决定选择较温和的电穿孔参数，以防止细胞损伤并接受较少转染的细胞。
该方法的总体目标是PEDF转染细胞在治疗新生血管性AMD患者的临床应用。该疗法包括基于SB100X转座子系统将PEDF转基因稳定地引入体外自体色素上皮细胞，然后将转染的细胞移植到患者的视网膜下空间。因此，重要的是要确保PEDF转染的细胞不会转分化，也不会获得成纤维细胞的形状和生长行为。同样重要的是要证明转染的细胞允许持续和一致的PEDF分泌。此外，了解特定数量的细胞在特定时间段内分泌的PEDF的精确量至关重要。
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Disclosures
Zoltán Ivics和Zsuzsanna Izsvák是SB转座子技术多项专利的发明者
Acknowledgments
这项工作得到了欧洲联盟第七研究、技术开发和示范框架方案（第305134号赠款协议）的支持。Zsuzsanna Izsvák由欧洲研究理事会ERC Advanced（ERC-2011-ADG 294742）资助。作者要感谢Anna Dobias和Antje Schiefer（亚琛工业大学医院眼科）的出色技术支持，以及亚琛角膜库（亚琛工业大学医院眼科）为人类捐赠者的眼睛提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation of primary human RPE cells | |||
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
| Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
| Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
| Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
| Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
| Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
| Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
| Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
| Electroporation of primary human RPE cells | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
| 12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
| Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
| 10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
| 1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| 2x SDS Sample Buffer | |||
| 4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
| Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
| Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
| LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
| LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
| LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |
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