Summary
Abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare le cellule epiteliali pigmentate umane primarie mediante elettroporazione con il gene che codifica il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Il successo della trasfezione è stato dimostrato mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR), immunoblotting e saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
Abstract
La nostra società sempre più anziana porta a una crescente incidenza di malattie neurodegenerative. Finora, i meccanismi patologici non sono adeguatamente compresi, impedendo così l'istituzione di trattamenti definiti. Le terapie geniche additive basate sulle cellule per l'aumentata espressione di un fattore protettivo sono considerate un'opzione promettente per medicare le malattie neurodegenerative, come la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Abbiamo sviluppato un metodo per l'espressione stabile del gene che codifica per il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF), che è caratterizzato come una proteina neuroprotettiva e anti-angiogenica nel sistema nervoso, nel genoma delle cellule epiteliali pigmentate umane primarie (PE) utilizzando il sistema di trasposone della Bella Addormentata (SB). Le cellule PE primarie sono state isolate dagli occhi dei donatori umani e mantenute in coltura. Dopo aver raggiunto la confluenza, 1 x 104 cellule sono state sospese in 11 μL di tampone di risospensione e combinate con 2 μL di una soluzione purificata contenente 30 ng di plasmide iperattivo SB (SB100X) trasposasi e 470 ng di plasmide trasposone PEDF . La modificazione genetica è stata effettuata con un sistema di elettroporazione capillare utilizzando i seguenti parametri: due impulsi con una tensione di 1.100 V e una larghezza di 20 ms. Le cellule trasfettate sono state trasferite in piastre di coltura contenenti terreno integrato con siero fetale bovino; Antibiotici e antimicotici sono stati aggiunti con il primo scambio di mezzo. La trasfezione di successo è stata dimostrata in esperimenti eseguiti in modo indipendente. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) ha mostrato l'aumentata espressione del transgene PEDF . La secrezione di PEDF era significativamente elevata e rimaneva stabile, come valutato mediante immunoblotting e quantificato mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Il trasferimento mediato da SB100X ha permesso un'integrazione stabile del gene PEDF nel genoma delle cellule PE e ha assicurato la secrezione continua di PEDF, che è fondamentale per lo sviluppo di una terapia di aggiunta genica basata su cellule per il trattamento di AMD o altre malattie degenerative della retina. Inoltre, l'analisi del profilo di integrazione del trasposone PEDF in cellule PE umane ha indicato una distribuzione genomica quasi casuale.
Introduction
L'età avanzata è descritta come il principale rischio di malattie neurodegenerative. La degenerazione maculare legata all'età (AMD), una malattia poligenica che porta a una grave perdita della vista nei pazienti di età superiore ai 60 anni, appartiene alle quattro cause più comuni di cecità e compromissione della vista1 e si prevede che aumenterà a 288 milioni di persone nel 20402. Le disfunzioni dell'epitelio pigmentato retinico (RPE), un singolo strato di cellule strettamente impacchettate situate tra il coriocapillare e i fotorecettori retinici, contribuiscono alla patogenesi dell'AMD. L'RPE svolge molteplici compiti essenziali per una normale funzione retinica3 e secerne una varietà di fattori di crescita e fattori essenziali per mantenere l'integrità strutturale della retina e del coriocapillare, supportando così la sopravvivenza dei fotorecettori e fornendo una base per la circolazione e l'apporto di nutrienti.
Negli occhi sani, il fattore derivato dall'epitelio pigmentato (PEDF) è responsabile del bilanciamento degli effetti del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e protegge i neuroni dall'apoptosi, previene la proliferazione delle cellule endoteliali e stabilizza l'endotelio capillare. Uno spostamento del rapporto VEGF-PEDF è correlato alla neovascolarizzazione oculare, che è stata osservata nei modelli animali4,5 e in campioni di pazienti con neovascolarizzazione coroideale (CNV) dovuta a AMD e retinopatia diabetica proliferativa 6,7,8,9,10 . L'aumento della concentrazione di VEGF è l'obiettivo per l'attuale trattamento standard. I farmaci anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept e, più recentemente, brolucizumab migliorano l'acuità visiva in circa un terzo dei pazienti con CNV o meglio stabilizzano la vista nel 90% dei casi11,12,13. Tuttavia, le frequenti iniezioni intravitreali, spesso mensili, comportano il rischio di eventi avversi14, compromettono la compliance del paziente e rappresentano un onere economico significativo per i sistemi sanitari15. Inoltre, una certa percentuale di pazienti (2%-20%) non risponde o reagisce solo male alla terapia anti-VEGF16,17,18,19. Questi concomitanti negativi richiedono lo sviluppo di trattamenti alternativi, ad esempio impianti intraoculari, approcci terapeutici cellulari e/o genici.
La terapia genica si è evoluta come trattamento promettente per le malattie ereditarie e non ereditarie e intende ripristinare sequenze geniche non funzionali o sopprimere quelle malfunzionanti. Per le malattie poligeniche, dove l'identificazione e la sostituzione dei fattori causali è difficilmente possibile, le strategie mirano alla fornitura continua di un fattore protettivo. Nel caso dell'AMD, sono state sviluppate varie terapie additive, come l'espressione stabile di endostatina e angiostatina20, l'antagonista VEGF tirosin-simile alla tirosin-chinasi-1 (sFLT-1)21,22, il cluster proteico regolatore del complemento della differenziazione 59 (CD59)23 o PEDF 24,25 . L'occhio, e in particolare la retina, è un bersaglio eccellente per un farmaco basato su geni a causa della struttura chiusa, della buona accessibilità, delle piccole dimensioni e del privilegio immunitario, consentendo così una consegna localizzata di basse dosi terapeutiche e rendendo i trapianti meno suscettibili al rigetto. Inoltre, l'occhio consente un monitoraggio non invasivo e la retina può essere esaminata con diverse tecniche di imaging.
I vettori virali sono, a causa della loro elevata efficienza di trasduzione, il veicolo principale per fornire geni terapeutici nelle cellule bersaglio. Tuttavia, a seconda del vettore virale utilizzato, sono state descritte diverse reazioni avverse, come risposte immunitarie e infiammatorie26, effetti mutageni e oncogeni 27,28 o disseminazione in altri tessuti29. Le limitazioni pratiche includono una dimensione di imballaggio limitata30, nonché difficoltà e costi associati alla produzione di lotti di grado clinico31,32. Questi inconvenienti hanno promosso l'ulteriore sviluppo di vettori non virali basati su plasmidi che vengono trasferiti tramite lipo / poliplex, ultrasuoni o elettroporazione. Tuttavia, l'integrazione genomica del transgene nel genoma dell'ospite di solito non è promossa con vettori plasmidici, risultando così in un'espressione transitoria.
I trasposoni sono frammenti di DNA presenti in natura che cambiano la loro posizione all'interno del genoma, una caratteristica che è stata adottata per la terapia genica. Grazie ad un meccanismo di integrazione attivo, i sistemi vettoriali basati su trasposoni consentono un'espressione continua e costante del transgene inserito. Il trasposone della Bella Addormentata (SB), ricostituito da un antico trasposone di tipo Tc1/marinaio trovato nel pesce33 e ulteriormente migliorato dall'evoluzione molecolare risultante nella variante iperattiva SB100X34, ha permesso una trasposizione efficiente in varie cellule primarie ed è stato utilizzato per la correzione fenotipica in diversi modelli di malattia35. Attualmente, 13 studi clinici sono stati avviati utilizzando il sistema di trasposone SB. Il sistema di trasposone SB100X è costituito da due componenti: il trasposone, che comprende il gene di interesse affiancato da ripetizioni invertite terminali (TIR), e la trasposasi, che mobilizza il trasposone. Dopo la consegna del DNA plasmidico alle cellule, la trasposasi lega i TIR e catalizza l'escissione e l'integrazione del trasposone nel genoma della cellula.
Abbiamo sviluppato una terapia additiva non virale basata su cellule per il trattamento dell'AMD neovascolare. L'approccio comprende l'inserimento basato sull'elettroporazione del gene PEDF in cellule epiteliali pigmentate primarie (PE) mediante il sistema di trasposone SB100X 36,37,38. Le informazioni genetiche della trasposasi e del PEDF sono fornite su plasmidi separati, consentendo così la regolazione del rapporto ideale tra trasposone SB100X e PEDF. L'elettroporazione viene eseguita utilizzando un sistema di trasfezione capillare basato su pipette caratterizzato da una dimensione massima dello spazio tra gli elettrodi, riducendo al minimo la loro superficie. Il dispositivo ha dimostrato di raggiungere eccellenti tassi di trasfezione in una vasta gamma di cellule di mammifero 39,40,41. La piccola superficie dell'elettrodo fornisce un campo elettrico uniforme e riduce i vari effetti collaterali dell'elettrolisi42.
La funzionalità anti-angiogenica del PEDF secreta dalle cellule epiteliali pigmentate trasfettate è stata dimostrata in vari esperimenti in vitro analizzando la germinazione, la migrazione e l'apoptosi delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana43. Inoltre, il trapianto di cellule trasfettate con PEDF in un modello di coniglio di neovascolarizzazione corneale44 e in un modello di ratto di CNV43,45,46 ha mostrato un declino della neovascolarizzazione.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l'inserimento stabile del gene PEDF in cellule RPE umane primarie tramite il sistema di trasposone SB100X utilizzando un sistema di trasfezione capillare. Le cellule trasfettate sono state tenute in coltura per 21 giorni e successivamente analizzate in termini di espressione genica PEDF mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi (qPCR) e in termini di secrezione proteica PEDF mediante immunoblotting e saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA, Figura 1).
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Protocol
Gli occhi dei donatori umani sono stati ottenuti dalla Banca della cornea di Aquisgrana del Dipartimento di Oftalmologia (Ospedale universitario RWTH di Aquisgrana) dopo aver ottenuto il consenso informato in conformità con i protocolli della Dichiarazione di Helsinki. Le procedure per la raccolta e l'uso di campioni umani sono state approvate dal comitato etico istituzionale.
1. Isolamento di cellule RPE umane primarie
- Stendere indumenti protettivi sterili e guanti. Posizionare un drappo sterile sotto un flusso laminare.
- Posizionare gli strumenti sterili di preparazione e altre attrezzature sterili necessarie sotto il flusso laminare.
- Registrare la ricezione dei globi oculari, l'inizio della preparazione e possibili anomalie. Registrare l'età del donatore, il sesso, la causa della morte e il periodo tra il momento della morte e la rimozione degli occhi.
- Posizionare il globo oculare in un impacco di garza sterile e tenerlo in una mano.
- Separare il segmento anteriore dal segmento posteriore con un taglio circonferenziale di circa 3,5 mm posteriormente al limbus usando un bisturi e una forbice per occhi appuntita extra fine.
- Dopo aver inclinato il segmento posteriore verso il basso, rimuovere con cura il vitreo e la retina usando una pinza colibri.
- Riorganizzare discretamente il complesso RPE/choroidea collassato usando una pinza a iride dritta e successivamente tenerlo in posizione con una pinza dell'iride curva.
- Riempire la coppa oculare posteriore con 1 mL di Modified Eagle's Medium/Ham's F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) di Dulbecco integrata con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 80 U/mL di penicillina e 80 μg/mL di streptomicina (Pen/Strep) e 2,5 μg/mL di amfotericina B (AmphoB).
NOTA: Contrariamente all'isolamento delle cellule RPE primarie dagli occhi di maiale o bovino36,37, la coppa oculare posteriore non deve essere riempita e incubata con tripsina. - Raccogliere le cellule RPE spazzolando delicatamente l'epitelio pigmentato retinico dal nervo ottico verso il limbus con una pipetta Pasteur in vetro curvo lucidato a fuoco, mentre si fissa il complesso RPE / choroidea al limbus usando una pinza colibri. Trasferire la sospensione cellulare in una capsula di Petri.
- Ripetere i passaggi 1.8 e 1.9 e raccogliere tutte le cellule nella capsula di Petri. Risospendere attentamente la sospensione della cella mediante pipettaggio su e giù utilizzando una pipetta a canale singolo (100-1.000 μL).
- Seminare la sospensione cellulare RPE di ciascun globo oculare in tre pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti e riempirli fino a 1 ml con DMEM / F12 integrato con FBS, Pen / Strep e AmphoB.
- Mantenere le colture cellulari RPE a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2 fino al raggiungimento della confluenza. Cambiare il terreno di coltura cellulare due volte a settimana.
2. Elettroporazione di cellule RPE umane primarie
- Preparazione della miscela di plasmidi SB100X trasposasi/PEDF trasposone
- Purificare il DNA plasmidico della trasposasi SB100X e del trasposone PEDF utilizzando i consueti kit di purificazione del plasmide, che sono identificati per essere adatti all'uso in applicazioni come la trasfezione, secondo il protocollo del produttore.
- Quantificare il contenuto di DNA plasmidico utilizzando uno spettrofotometro a microvolume e regolarlo a una concentrazione di 250 ng/μL con 10 mM Tris-HCl (pH 8,5).
- Mescolare una porzione di DNA plasmidico trasposasi SB100X da 250 ng/μL (ad esempio, 2,5 μL) con 16 porzioni di DNA plasmidico trasposone PEDF da 250 ng/μL (ad es. 40 μL). La miscela plasmidica residua può essere conservata a -20 °C.
NOTA: devono essere evitati cicli multipli di congelamento e scongelamento ripetuti della miscela plasmidica. - Introdurre 2 μL della miscela di plasmidi trasposasi/trasposone SB100X, contenente 29,4 ng di plasmide trasposasi SB100X e 470,6 ng di plasmide trasposone PEDF, in una provetta da microcentrifuga sterile da 1,5 mL con blocco sicuro. Conservare in ghiaccio fino a quando non si mescola con le cellule.
- Messa a punto del sistema di trasfezione capillare
NOTA: L'elettroporazione delle cellule RPE umane primarie è stata eseguita tramite un sistema di trasfezione capillare utilizzando il kit da 10 μL secondo il protocollo del produttore. Il sistema comprende il dispositivo di trasfezione, la pipetta di trasfezione e la stazione di pipetta. Il kit contiene punte di trasfezione da 10 μL, tubi tampone, tampone elettrolitico E (tampone E) e tampone di risospensione R (tampone R).- Collegare la stazione di pipetta al dispositivo di trasfezione.
- Riempire un tubo tampone con 3 mL di tampone E e inserirlo nella stazione di pipette fino a quando non si sente un clic.
NOTA: Assicurarsi che l'elettrodo laterale del tubo tampone sia collegato allo stantuffo a sfera laterale della stazione di pipetta. - Per l'elettroporazione delle celle RPE umane primarie, impostare le seguenti condizioni di impulso sul dispositivo di trasfezione: 1.100 V (tensione di impulso), 20 ms (larghezza dell'impulso), due impulsi (numero di impulso).
- Preparazione delle cellule RPE umane primarie coltivate
- Documentare la forma e la morfologia delle colture cellulari RPE primarie tramite microscopia a contrasto di fase. Prendi micrografie a basso ingrandimento per dimostrare la crescita delle celle RPE in un monostrato confluente e integrato, nonché micrografie a ingrandimento più elevato per evidenziare la tipica morfologia del ciottolo delle celle RPE.
- Aspirare il terreno di coltura cellulare e lavare le cellule due volte con 1 mL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS, pH 7,4).
- Tripsinizzare le cellule RPE umane primarie con 0,5 mL 0,05% di tripsina-EDTA a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2 per 7-15 minuti (massimo). Controllare il distacco della cellula al microscopio.
- Interrompere la tripsinizzazione con 1 mL di DMEM/F12 integrato con FBS. Prendere un'aliquota di 20 μL per il conteggio delle cellule utilizzando un emocitometro. Centrifugare la sospensione della cella RPE a 106 x g per 10 minuti.
- Mescolare l'aliquota da 20 μL con una soluzione di blu tripano da 20 μL. Pipettare 10 μL in ciascuna metà dell'emocitometro e contare le cellule al microscopio a contrasto di fase.
- Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet della cella RPE in 1 mL di PBS.
- Prelevare 10.000-100.000 cellule RPE per reazione di trasfezione e centrifugarle a 106 x g per 10 minuti.
NOTA: Oltre alle reazioni di trasfezione con applicazione di campo elettrico e aggiunta di DNA plasmide, ogni approccio include anche due diverse colture di controllo: (1) senza applicazione di campo elettrico e senza DNA plasmide; (2) con applicazione di campo elettrico, ma senza DNA plasmide. - Risospendere il pellet cellulare in 11 μL di tampone R e combinarlo con 2 μL della miscela di plasmide SB100X trasposasi/PEDF (vedere punto 2.1.4).
NOTA: Dopo la risospensione nel tampone R, le cellule devono essere elaborate entro 15 minuti per evitare una riduzione della vitalità cellulare e dell'efficienza di trasfezione. - Inserire la testa della pipetta di trasfezione nella punta di trasfezione da 10 μL fino a quando il morsetto non raccoglie completamente lo stelo di montaggio del pistone. Aspirare la soluzione cellulare/plasmidica nella punta di trasfezione.
NOTA: Evitare la generazione di bolle d'aria e la loro aspirazione nella punta di trasfezione. - Fornire 1 mL di DMEM/F12 integrato con FBS, ma senza Pen/Strep e senza AmphoB, nel numero richiesto di pozzetti di una piastra di coltura cellulare a 24 pozzetti.
- Processo di elettroporazione
- Inserire la pipetta di trasfezione nel tubo tampone posto nella stazione della pipetta (vedere punto 2.2.2) fino a quando non si sente un clic.
NOTA: Assicurarsi che la testa metallica della pipetta a trasfezione sia collegata allo stantuffo a sfera all'interno della stazione di pipetta e al tubo tampone. - Premere Start sul touchscreen del dispositivo di trasfezione. Prima dell'applicazione dell'impulso elettrico, il dispositivo controlla automaticamente se il tubo tampone e la pipetta di trasfezione sono inseriti correttamente. Dopo l'erogazione degli impulsi elettrici, Complete viene visualizzato sul touchscreen.
- Rimuovere con cautela la pipetta di trasfezione dalla stazione di pipetta e rilasciare immediatamente le cellule elettroporate dalla punta di trasfezione da 10 μL pipettando la soluzione cellulare/plasmidica nei pozzetti preparati della piastra di coltura cellulare (vedere punto 2.3.10).
- Mantenere le colture cellulari RPE trasfettate a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2. Aggiungere Pen/Strep e AmphoB con il primo mezzo di scambio 3 giorni dopo l'elettroporazione.
- Inserire la pipetta di trasfezione nel tubo tampone posto nella stazione della pipetta (vedere punto 2.2.2) fino a quando non si sente un clic.
3. Analisi di cellule RPE umane primarie trasfettate
- Preparazione del campione
- Dopo un tempo di coltivazione di 3 settimane, infine incubare le colture cellulari RPE in un volume definito di 1,0 mL DMEM / F12 integrato con FBS, Pen / Strep e AmphoB per un tempo definito di 24 ore.
- Prelevare i surnatanti di coltura cellulare e conservarli a -20 °C fino a un'ulteriore elaborazione o a -80 °C per campioni termicamente instabili e conservazione a lungo termine.
- Tripsinizzare colture cellulari RPE trasfettate con 0,5 ml di tripsina-EDTA allo 0,05% a 37 °C in atmosfera umidificata con il 95% di aria e il 5% di CO2 per 10 min.
- Interrompere la tripsinizzazione con 1 mL di DMEM/F12 integrato con FBS. Prendere piccole aliquote per il conteggio delle cellule usando un emocitometro (vedi punto 2.3.5). Centrifugare le sospensioni delle celle RPE a 106 x g per 10 min.
- Conservare i pellet della cella RPE a -80 °C fino a ulteriore lavorazione.
- Valutazione della secrezione di PEDF mediante western blotting
NOTA: Per una valutazione qualitativa, i surnatanti di coltura cellulare (vedere il punto 3.1.2) vengono analizzati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato poliacrilammide (SDS-PAGE) e successiva western blotting. A seconda del PEDF plasmide del DNA trasposone utilizzato, i surnatanti devono essere elaborati in modo diverso.- Purificazione di proteine di fusione PEDF marcate con His-da supernatanti di coltura cellulare
- Prelevare 30 μL di liquame di acido nichel-nitrilotriacetico (Ni-NTA) per campione utilizzando una punta smussata e pellettare la resina Ni-NTA mediante centrifugazione (2.660 x g per 30 s).
- Risospendere con cautela la resina Ni-NTA con 200 μL di tampone di incubazione 1x (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolo, pH 8,0) e pellettarla mediante centrifugazione (2.660 x g per 30 s).
- Ripetere il passaggio precedente.
- Risospendere accuratamente la resina Ni-NTA con 40 μL 4x tampone di incubazione (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazolo, pH 8,0) per campione.
- Miscelare 900 μL di coltura cellulare surnatante con 260 μL di tampone di incubazione 4x e 55 μL di liquame Ni-NTA pretrattato (cfr. punto 3.2.1.4).
- Incubare la miscela su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per 60 minuti.
- Pellettare la resina Ni-NTA per centrifugazione (2660 x g per 60 s).
- Risospendere accuratamente la resina Ni-NTA con 175 μL di tampone di incubazione 1x e resina pellet mediante centrifugazione (2.660 x g per 60 s).
- Ripetere il passaggio precedente.
- Risospendere accuratamente la resina Ni-NTA con 30 μL di tampone di eluizione (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazolo, pH 8,0) e incubare la miscela su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente per 20 minuti.
- Pellettare la resina Ni-NTA mediante centrifugazione (2.660 x g per 30 s).
- Prendere con cautela il surnatante e mescolarlo con 2x SDS sample buffer47.
- Riscaldare la miscela a 95 °C per 5 minuti e separare le proteine purificate Ni-NTA su un gel di poliacrilammide SDS al 10%.
- Eseguire western blotting utilizzando anticorpi anti-Penta-His (monoclonale di topo, 1:500) e anticorpi anti-topo coniugati con perossidasi di rafano (HRP) (policlonale di coniglio, 1:1.000) come descritto in precedenza36,37.
- Analisi diretta di proteine PEDF non marcate
- Prelevare 15 μL di coltura cellulare surnatante e mescolarla con 2x SDS sample buffer47.
- Riscaldare la miscela a 95 °C per 5 minuti e separare le proteine su un gel di poliacrilammide SDS al 10%.
- Eseguire western blotting utilizzando anticorpi PEDF anti-umani (policlonale di coniglio, 1:4.000) e anticorpi anti-coniglio coniugati con HRP (policlonale di capra, 1:2.000) come descritto in precedenza38.
- Quantificazione della secrezione di PEDF mediante ELISA
- Analizzare i surnatanti di coltura cellulare (vedere il punto 3.1.2) utilizzando un kit ELISA PEDF umano secondo il protocollo del produttore.
- Mettere in relazione la quantità di PEDF secreta con il tempo e il numero di cellule determinato per ciascuna reazione di trasfezione (vedere punto 3.1.4).
- Analisi dell'espressione genica PEDF in cellule RPE trasfettate
- Isolare l'RNA totale dai pellet delle cellule RPE (vedere il punto 3.1.5) utilizzando un kit disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
- Quantificare il contenuto di RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
- Effettuare la trascrizione inversa su 0,1 μg di RNA utilizzando un sistema di trascrizione inversa secondo il protocollo del produttore.
- Eseguire qPCR in tempo reale come descritto in precedenza38.
- Analisi dei siti di inserzione del transgene in cellule RPE trasfettate
- Isolare il DNA genomico dai pellet cellulari RPE (vedere il punto 3.1.5) utilizzando un kit disponibile in commercio secondo il protocollo del produttore.
- Quantificare il contenuto di DNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume.
- Generare librerie di siti di inserimento utilizzando uno schema di PCR emi-specifico assistito dal calcolo come descritto in precedenza38.
- Eseguire analisi computazionali come descritto in precedenza38.
- Purificazione di proteine di fusione PEDF marcate con His-da supernatanti di coltura cellulare
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Representative Results
Coltivazione ed elettroporazione di cellule RPE umane primarie
Abbiamo dimostrato che la semina di un numero sufficiente di cellule RPE primarie di origine animale consente la coltivazione e la crescita in un monostrato integrato di cellule pigmentate di forma esagonale36,37,48. La loro capacità di formare giunzioni strette, di esibire attività fagocitaria e di esprimere geni marcatori specifici in vitro48 riflette compiti sostanziali dell'epitelio pigmentato retinico in vivo. Le cellule RPE primarie coltivate isolate dagli occhi dei donatori umani hanno anche mostrato la tipica morfologia del ciottolo, indipendentemente dall'età del donatore (65,3 ± 9,94 a, min: 49 a, max: 83 a, n = 12), il tempo post-mortem di isolamento (37,3 ± 17,0 h, min: 16 h, max: 68 h, n = 12) e il tempo di coltivazione (27,6 ± 14,1 d, min: 13 d, max: 61 d, n = 12) (Figura 2, pannello di sinistra). L'applicazione di impulsi elettrici a breve termine alle cellule RPE umane primarie utilizzando il sistema di trasfezione capillare non ha influenzato negativamente la morfologia epiteliale (Figura 2, pannello di destra). Il test di vari parametri elettrici ha rivelato che due impulsi con una tensione di impulso di 1.200 V e una larghezza di impulso di 20 ms hanno prodotto efficienze di trasfezione buone e stabili e il maggior numero di celle RPE vitali (dati non pubblicati).
Inserimento del gene PEDF mediato da SB100X in cellule RPE umane primarie coltivate
Abbiamo testato rapporti di DNA plasmidico del trasposone SB100X-to-PEDF che vanno da 250 ng (0,08 pmol) SB100X transposasi più 250 ng (0,052 pmol) PEDF trasposone a 12,2 ng (0,0039 pmol) SB100X trasposasi più 487,8 ng (0,1 pmol) PEDF trasposone. Questo approccio ha identificato le due combinazioni 29,4 ng (0,0094 pmol) SB100X transposasi più 470,6 ng (0,098 pmol) PEDF trasposone e 23,8 ng (0,0076 pmol) più 476,2 ng (0,099 pmol) come quelle che hanno ottenuto le migliori efficienze di trasposizione37. Nelle cellule RPE umane primarie coltivate, la consegna del transgene PEDF utilizzando il sistema di trasposone SB100X ha permesso un continuo aumento dell'espressione genica PEDF e della secrezione della proteina PEDF. Per il PEDF ricombinante con tag His, l'analisi western blot dei terreni di coltura cellulare da cellule RPE umane primarie trasfettate ha dimostrato la secrezione di PEDF a livelli costanti senza silenziamento transgenico per più di 500 giorni (Figura 3A). Per il PEDF non marcato, anche la secrezione nelle cellule RPE umane primarie trasfettate ha dimostrato di essere significativamente aumentata rispetto alle cellule non trasfettate38. Un'analisi rappresentativa Western Blot dei terreni di coltura cellulare da trasfezioni eseguite in serie ha chiaramente indicato il tasso di secrezione PEDF universalmente più alto a 21 giorni dopo la trasfezione (Figura 3B), e in una coltura perseguita, la secrezione elevata di PEDF a lungo termine è stata dimostrata per almeno 165 giorni (Figura 3C). La quantificazione basata su ELISA ha dimostrato un aumento di 20 volte della secrezione totale di PEDF nelle cellule RPE umane primarie trasfettate rispetto alle rispettive cellule di controllo non trasfettate (Figura 3D). Questo incremento è stato confermato anche a livello di espressione genica, dove l'espressione totale di PEDF è stata aumentata di oltre 30 volte (Figura 3E).
Figura 1: Flusso di lavoro per l'inserimento basato sull'elettroporazione del gene PEDF in cellule RPE umane primarie mediante il sistema di trasposone SB100X. Lo schema descrive il corso cronologico di (A) l'isolamento delle cellule RPE umane primarie e la loro successiva coltivazione in un monostrato confluente, (B) le singole fasi del processo di elettroporazione, compresa la purificazione della trasposasi SB100X e del DNA plasmidico del trasposone PEDF, la preparazione della trasposasi/PEDF SB100X. la messa a punto del sistema di trasfezione capillare, la preparazione delle cellule RPE umane primarie coltivate, l'elettroporazione, la semina e la coltivazione delle cellule RPE trasfettate, nonché (C) le analisi delle cellule RPE umane trasfettate, comprendenti la preparazione dei surnatanti di coltura cellulare e dei campioni di cellule trasfettate, la valutazione e la quantificazione della secrezione di PEDF e l'analisi dell'espressione genica di PEDF. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Micrografie a contrasto di fase di cellule RPE isolate da diversi occhi di donatori. Colture di cellule RPE umane primarie, diverse per età del donatore, tempo di isolamento post-mortem e tempo di coltivazione prima della loro applicazione per elettroporazione (pannello di sinistra), nonché colture di cellule RPE umane primarie trasfettate, esposte ai parametri elettrici 1.100 V (tensione di impulso), 20 ms (larghezza dell'impulso) e 2 impulsi (numero di impulsi) utilizzando il sistema di trasfezione capillare (pannello di destra) ), esibiva un monostrato integrato confluente di cellule pigmentate in un modello simile a un ciottolo (barre di scala: 500 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Secrezione di PEDF ed espressione genica PEDF dopo trasfezione mediata da SB100X di cellule RPE umane primarie. (A-C) Analisi basate su immunoblot della stabilità della secrezione di PEDF in cellule RPE umane primarie coltivate trasfettate con una miscela di plasmide trasposasi SB100X da 29,4 ng (0,0094 pmol ) più plasmide trasposone PEDF da 470,6 ng (0,098 pmol) utilizzando il sistema di trasfezione capillare. (A) Le cellule RPE di un donatore di 26 anni (femmina, tempo di isolamento post-mortem: 26 ore, tempo di coltivazione prima dell'elettroporazione: 14 giorni) sono state trasfettate e mantenute in coltura per più di 500 giorni. Il PEDF ricombinante marcato con His (~48 kDa) è stato purificato da terreni di coltura cellulare in diversi punti temporali e valutato mediante western blotting utilizzando anticorpi anti-Penta-His (B) Per la PEDF ricombinante non marcata, le cellule RPE di un donatore di 53 anni (femmina, tempo post-mortem di isolamento: 28 ore, tempo di coltivazione prima della trasfezione: 19 giorni) sono state elettroporate senza DNA plasmidico (colture di controllo #1 e #2) o con l'aggiunta di DNA plasmidico (colture cellulari trasfettate con PEDF da #3 a #7) e mantenute in coltura per 21 giorni. I supernatanti di coltura cellulare non sono stati purificati, ma analizzati direttamente mediante immunoblotting utilizzando anticorpi anti-PEDF. L'analisi Western blot dei lisati cellulari ha mostrato il livello di PEDF intracellulare nei controlli (colture #1 e #2) e nelle cellule trasfettate (colture #3 e #4). Il carico di quantità proteiche simili è stato indicato dalla densità uguale delle bande proteiche GAPDH (~ 36 kDa). (C) Per l'analisi della secrezione di PEDF a lungo termine, le cellule RPE di un donatore di 63 anni (maschio, tempo post-mortem di isolamento: 26 ore, tempo di coltivazione prima della trasfezione: 15 giorni) sono state elettroporate senza DNA plasmidico (colture di controllo #1 e #2) o con DNA plasmidico (coltura cellulare trasfettata PEDF #3) e mantenute in coltura per almeno 165 giorni. I terreni di coltura cellulare non sono stati purificati, ma analizzati direttamente mediante immunoblotting utilizzando anticorpi anti-PEDF. (D) Quantificazione basata su ELISA della secrezione totale di PEDF in cellule RPE umane primarie trasfettate (due campioni) e cellule di controllo non trasfettate (quattro campioni). La secrezione delle cellule trasfettate è stata confrontata con la secrezione delle cellule non trasfettate (*p = 0,0264, test t spaiato con la correzione di Welch). (E) L'espressione genica PEDF endogena e totale (endogena più ricombinante) in cellule RPE umane primarie trasfettate era correlata all'espressione in cellule di controllo non trasfettate, la cui espressione era impostata su 1 (linea tratteggiata). I dati sono presentati come un grafico box-and-whisker (baffi: dal min al max). L'espressione genica totale del PEDF è stata confrontata con l'espressione genica endogena del gene PEDF (test t non significativo, spaiato con correzione di Welch). I risultati per il PEDF ricombinante non marcato (B-E) rappresentano due unità dell'intero set di dati di cellule RPE primarie da un massimo di 27 donatori trasfettati con un rapporto di trasposone SB100X-PEDF di 29,4 ng (0,0094 pmol) più 470,6 ng (0,098 pmol), che è stato descritto da Thumann et al. 201738. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Nel nostro progetto, miriamo alla produzione non virale di cellule RPE umane primarie geneticamente modificate che sovraesprimono continuamente e secernono un fattore efficace al fine di utilizzare le cellule trasfettate come terapia a lungo termine per la creazione e il mantenimento di un ambiente protettivo. Abbiamo stabilito l'introduzione del gene che codifica per il PEDF, una proteina multifunzionale ubiquitariamente espressa con funzioni anti-angiogeniche e neuroprotettive. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per trasfettare in modo stabile e riproducibile le cellule RPE umane primarie utilizzando il sistema di trasposone SB100X . La consegna e l'introduzione del DNA nelle cellule RPE viene eseguita con un sistema di trasfezione capillare basato su pipette, che utilizza punte specifiche come camera di elettroporazione anziché cuvette.
L'arricchimento di colture RPE primarie costituite da cellule morfologicamente ben differenziate da utilizzare per le successive trasfezioni è influenzato da diversi fattori legati al donatore umano (età e stato di salute generale) nonché alla ricezione degli occhi (tempo post-mortem di isolamento cellulare). Le cellule RPE primarie appena isolate e seminate hanno bisogno di almeno 2 settimane per sviluppare un monostrato di cellule di forma esagonale. Come regola generale, le colture cellulari che hanno avuto bisogno di più tempo per raggiungere la confluenza prima della trasfezione hanno anche mostrato un'aderenza rallentata e una diffusione dopo la trasfezione. L'aderenza e la diffusione delle cellule sono anche ostacolate dal deposito di pigmento libero dalle cellule RPE danneggiate durante l'isolamento cellulare o il processo di trasfezione.
Il sistema di trasposone SB è uno strumento genetico ampiamente utilizzato che consente la consegna efficiente e sicura di sequenze nucleotidiche terapeuticamente rilevanti in vari tipi di cellule da applicare successivamente nelle terapie cellulari basate sui geni. In particolare, la sua variante potenziata SB100X combina i vantaggi dei vettori virali e del DNA plasmidico non virale. La modalità d'azione di integrazione garantisce un'integrazione genomica stabile della cassetta di espressione nel genoma della cellula ospite e consente un'espressione sostenuta del gene o della sequenza di interesse. A differenza dei vettori retrovirali, che si integrano preferenzialmente in unità di trascrizione attive con un alto rischio di potenziale mutagenesi e oncogenesi27,28, il profilo di integrazione basato su SB è casuale. Ciò è stato dimostrato in un gran numero di studi utilizzando varie cellule di mammifero in coltura e primarie, comprese le cellule umane 49,50,51,52, nonché per le cellule RPE primarie di ratto e umano 38,46. Inoltre, l'applicazione del sistema di trasposone SB come DNA plasmidico fornisce una ridotta immunogenicità e facilita il processo di produzione.
La consegna delle informazioni genetiche della trasposasi SB100X e del transgene PEDF su plasmidi separati è un aspetto importante, in quanto consente una regolazione precisa del rapporto ottimale tra trasposone SB100X e PEDF. Come descritto in precedenza, il sistema di trasposone SB è sensibile ad un eccesso di espressione della trasposasi, che si traduce nell'inibizione dell'attività trasposizionale53. Abbiamo anche osservato questo effetto per le cellule ARPE-19, una linea cellulare evoluta spontaneamente purificata dalla tripsinizzazione selettiva di una coltura primaria di RPE umana54 e cellule RPE primarie. Qui, la trasfezione con rapporti di trasposone SB100X-PEDF fino a 55,6 ng (0,018 pmol) SB100X trasposasi più 444,4 ng (0,093 pmol) di trasposone PEDF ha portato a tassi di secrezione PEDF chiaramente ridotti37. Il rapporto ideale trasposasi-trasposone deve essere determinato per ogni plasmide trasposone di nuova costruzione.
I vettori non virali basati su plasmidi possono essere trasferiti tramite lipo / poliplex, nanoparticelle, laser, ultrasuoni o elettroporazione. Abbiamo già dimostrato che la trasfezione basata sulla lipofezione delle cellule PE primarie non era efficiente e quindi è passata al trasferimento genico basato sull'elettroporazione36. L'elettroporazione è definita come l'applicazione di un campo elettrico di breve durata alle cellule, che si traduce in un aumento della permeabilità della membrana e nella formazione di pori acquosi, attraverso i quali il DNA plasmidico può entrare nella cellula. In generale, una miscela di cellule, DNA plasmidico e tampone conduttore viene riempita in una camera di elettroporazione specifica tra due elettrodi, che sono collegati al dispositivo di elettroporazione che genera gli impulsi elettrici. In questa cosiddetta configurazione di elettroporazione di massa, una camera di elettroporazione a cuvetta convenzionale è caratterizzata da due elettrodi paralleli di tipo piastra, la cui distanza è variabile (0,1-0,4 mm), a seconda del tipo di cella e del numero di celle utilizzate per reazione di elettroporazione. Nonostante le buone efficienze di trasfezione, diversi effetti collaterali possono influenzare negativamente la sopravvivenza delle cellule trasfettate, ad esempio cambiamenti di pH, sviluppo di calore, generazione di bolle e flusso turbolento. Il sistema di trasfezione capillare attenua almeno gli effetti collaterali basati sulla cuvetta possedendo elettrodi con una superficie ridotta al minimo e una dimensione massimizzata dello spazio tra loro42 e utilizzando specifici tamponi di risospensione ed elettrolitici; tuttavia, le loro composizioni non sono divulgate.
Nonostante i miglioramenti all'interno del set-up di elettroporazione di massa, che ha portato ad un aumento della sopravvivenza cellulare, il danno irreversibile a una certa percentuale di cellule è inevitabile. Inoltre, non è possibile un controllo preciso della quantità di plasmide integrato nelle cellule. Lo sviluppo più recente di sistemi di elettroporazione miniaturizzati ha permesso ulteriori miglioramenti riducendo ulteriormente le limitazioni associate all'elettroporazione di massa. Questi nuovi dispositivi sono basati su microelettrodi, microfluidici o nanostrutture. Offrono nuove prospettive applicative nei campi della terapia genica, della medicina rigenerativa e dell'indagine intracellulare in situ (revisionata da Chang et al. e Shi et al.) 55,56.
Abbiamo dimostrato che l'elettroporazione, che è stata inizialmente eseguita utilizzando un sistema basato su cuvetta e successivamente stabilita utilizzando un sistema capillare basato su pipette, è un metodo adatto ed efficiente per trasfettare sia la linea cellulare epiteliale pigmentata ARPE-19 che le cellule PE primarie 36,37,38,57,58 . A seconda del tipo di cellula utilizzata, è importante definire protocolli di elettroporazione appropriati applicando parametri che consentano sia una buona efficienza di trasfezione che la sopravvivenza cellulare. Campi elettrici insufficienti impediscono alle cellule di danneggiarsi, ma si traducono in basse efficienze di trasfezione. Con l'aumento dell'intensità del campo elettrico, si ottengono maggiori efficienze di trasfezione. Tuttavia, parametri elettrici elevati portano anche a percentuali più elevate di cellule morte a causa del danno cellulare irreversibile. Per la linea cellulare ARPE-19, utilizzando il sistema di trasfezione capillare, i parametri di elettroporazione di 1.350 V, 20 ms e 2 impulsi hanno dimostrato di risultare in efficienze di trasfezione iniziali del 100%37. L'applicazione di questi parametri per la trasfezione delle cellule RPE primarie ha portato anche a buone efficienze, ma anche a un numero inferiore di cellule coltivate dopo la trasfezione rispetto ai parametri di elettroporazione di 1.100 V, 20 ms e 2 impulsi (dati non mostrati). Pertanto, è stata presa la decisione di scegliere i parametri di elettroporazione più lievi per prevenire il danno cellulare e accettare cellule meno trasfettate.
L'obiettivo generale di questo approccio risiede nell'applicazione clinica di cellule trasfettate con PEDF per il trattamento di pazienti affetti da AMD neovascolare. La terapia comprende l'introduzione stabile del transgene PEDF nelle cellule epiteliali pigmentate autologhe ex vivo sulla base del sistema trasposone SB100X , seguita dal trapianto delle cellule trasfettate nello spazio sottoretinico del paziente. Pertanto, è importante assicurarsi che le cellule trasfettate con PEDF non si transdifferenzino e non acquisiscano una forma fibroblastica e un comportamento di crescita. È anche importante dimostrare che le cellule trasfettate consentono una secrezione sostenuta e costante di PEDF. Inoltre, è fondamentale conoscere la quantità precisa di PEDF secreta da un determinato numero di cellule per un determinato periodo di tempo.
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Disclosures
Zoltán Ivics e Zsuzsanna Izsvák sono inventori di diversi brevetti sulla tecnologia di trasposone SB
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Settimo programma quadro dell'Unione europea per la ricerca, lo sviluppo tecnologico e la dimostrazione, convenzione di sovvenzione n. 305134. Zsuzsanna Izsvák è stata finanziata dal Consiglio europeo della ricerca, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Gli autori desiderano ringraziare Anna Dobias e Antje Schiefer (Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario RWTH Aachen) per l'eccellente supporto tecnico e la Banca della cornea di Aquisgrana (Dipartimento di Oftalmologia, Ospedale universitario RWTH Aachen) per aver fornito gli occhi del donatore umano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation of primary human RPE cells | |||
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Colibri Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18950 | |
| Curved Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18856 | |
| Disposable Scalpel (No. 11) | Feather, Osaka, Japan | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Extra Fine Pointed Eye Scissor | Geuder, Heidelberg, Germany | G-19405 | |
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Glass Pasteur Pipettes | Brand, Wertheim, Germany | 747715 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Sterile Drape | Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany | ||
| Sterile Gauze Compress | Fink-Walter, Merchweiler, Germany | 321063 | |
| Sterile Gloves | Sempermed, Wien, Austria | ||
| Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) | Corning, Corning, NY | 351007 | |
| Sterile Surgical Gown | Halyard Health, Alpharetta, GA | ||
| Straight Iris Forceps | Geuder, Heidelberg, Germany | G-18855 | |
| Electroporation of primary human RPE cells | |||
| 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) | |||
| 12-Well Cell Culture Plate | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 150628 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030722019 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Inverted Microscope | Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany | Leica DMi8 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Capillary Transfection System (Neon Transfection System) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK5000 | |
| Neon Transfection System 10 µL Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MPK1096 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ | Biochrom, Berlin, Germany | L182-50 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Plasmid Maxi Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 12163 | |
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 | |
| Analyses of transfected primary human RPE cells | |||
| 10% SDS-Polyacrylamide Gel | |||
| 1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| 2x SDS Sample Buffer | |||
| 4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane | Cytiva, Marlborough, MA | 10600015 | |
| Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) | Merck, Darmstadt, Germany | A2942 | |
| Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) | BioProducts, Middletown, MD | AB-PEDF1 | |
| Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) | Qiagen, Hilden, Germany | 34660 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P04-41150 | |
| Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) | |||
| Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) | PAN-Biotech, Aidenbach, Germany | P40-37500 | |
| Hemocytometer (Neubauer Chamber) | Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany | 0640110 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) | Agilent Dako, Santa Clara, CA | P0260 | |
| Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) | Abcam, Cambridge, United Kingdom | ab6721 | |
| Human PEDF ELISA Kit | BioProducts, Middletown, MD | PED613 | |
| LAS-3000 Imaging System | Fujifilm, Minato, Japan | ||
| LightCycler 1.2 Instrument | Roche Life Science, Penzberg, Germany | ||
| LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 12239264001 | |
| LightCycler Capillaries (20 μl) | Roche Life Science, Penzberg, Germany | 4929292001 | |
| Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ||
| Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658015 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1658004 | |
| Ni-NTA Superflow | Qiagen, Hilden, Germany | 30410 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 26616 | |
| Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) | Merck, Darmstadt, Germany | P0781 | |
| Pipette Tips (10 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (1000 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| Pipette Tips (200 µL) | Starlab, Hamburg, Germany | ||
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1645050 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 51304 | |
| Reverse Transcription System | Promega, Madison, WI | A3500 | |
| RNase-Free DNase Set | Qiagen, Hilden, Germany | 79254 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Rocking Shaker | Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom | SSM3 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (0.1-10 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (100-1000 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Single Channel Pipette (10-200 µL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | ||
| Trans-Blot Turbo Transfer System | Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany | 1704150 | |
| Trypan Blue Solution | Merck, Darmstadt, Germany | T8154 | |
| Trypsin-EDTA (0,05 %) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 25300054 |
References
- James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
- Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
- Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
- Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
- Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
- Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
- Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
- Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
- Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
- Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
- Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
- Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
- Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
- Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
- Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
- Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
- Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
- Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
- Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
- Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
- Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
- Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
- Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
- Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
- Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
- Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
- Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
- Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
- van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
- Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
- Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
- Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
- Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
- Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
- Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
- Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
- May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
- Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
- Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
- Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
- Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
- Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
- Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
- Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
- Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
- Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
- Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
- Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
- Chang, L., et al.
- Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
- Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
- Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).
