Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/61987
Automatic Translation
1, 2,3, 4,5, 4, 6, 7, 1, 2,3
1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Summary

פיתחנו פרוטוקול לטרנספקציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים על ידי אלקטרופורציה עם הגן המקודד גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). העברה מוצלחת הודגמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).

Abstract

החברה המזדקנת יותר ויותר שלנו מובילה לשכיחות גוברת של מחלות נוירודגנרטיביות. עד כה, המנגנונים הפתולוגיים אינם מובנים כראוי, ובכך מעכבים את כינונתם של טיפולים מוגדרים. טיפולים גנטיים מוספים מבוססי תאים לביטוי מוגבר של גורם מגן נחשבים כאופציה מבטיחה לטיפול תרופתי במחלות נוירודגנרטיביות, כגון ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD). פיתחנו שיטה לביטוי יציב של הגורם הנגזר מאפיתל פיגמנטי (PEDF), המאופיין כחלבון נוירו-פרוטקטיבי ואנטי-אנגיוגני במערכת העצבים, לתוך הגנום של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). תאי PE ראשוניים בודדו מעיני תורמים אנושיים ונשמרו בתרבית. לאחר שהגיעו למפגש, 1 x 104 תאים הושעו ב-11 μL של מאגר resuspension ובשילוב עם 2 μL של תמיסה מטוהרת המכילה 30 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזן היפראקטיבי (SB100X) ו-470 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזון PEDF. השינוי הגנטי בוצע עם מערכת אלקטרופורציה נימית באמצעות הפרמטרים הבאים: שתי פולסים עם מתח של 1,100 V ורוחב של 20 ms. תאים שעברו טרנספקציה הועברו לצלחות תרבית המכילות תוסף בינוני עם סרום בקר עוברי; אנטיביוטיקה ואנטי-מיקוטיקה נוספו עם חילופי המדיום הראשונים. העברה מוצלחת הודגמה בניסויים שבוצעו באופן עצמאי. תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) הראתה את הביטוי המוגבר של טרנסגן PEDF. הפרשת ה-PEDF הייתה גבוהה באופן משמעותי ונותרה יציבה, כפי שהוערך על ידי אימונובלוטציה, וכומתה על ידי בדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA). העברה בתיווך SB100X אפשרה אינטגרציה יציבה של גן PEDF בגנום של תאי PE והבטיחה הפרשה מתמשכת של PEDF, שהיא קריטית לפיתוח טיפול תוספת גנים מבוסס תאים לטיפול ב- AMD או במחלות ניווניות אחרות ברשתית. יתר על כן, ניתוח פרופיל האינטגרציה של טרנספוזון PEDF לתאי PE אנושיים הצביע על התפלגות גנומית כמעט אקראית.

Introduction

גיל מתקדם מתואר כסיכון העיקרי למחלות נוירודגנרטיביות. ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), מחלה פוליגנית המובילה לאובדן ראייה חמור בחולים מעל גיל 60, שייך לארבעת הגורמים השכיחים ביותר לעיוורון ולפגיעה בראייה1 וצפוי לעלות ל -288 מיליון איש בשנת 20402. תפקוד לקוי של אפיתל פיגמנט הרשתית (RPE), שכבה אחת של תאים ארוזים היטב הממוקם בין choriocapillaris לבין photoreceptors הרשתית, לתרום פתוגנזה של AMD. ה- RPE ממלא משימות מרובות החיוניות לתפקוד רשתית תקין3 ומפריש מגוון גורמי גדילה וגורמים חיוניים לשמירה על השלמות המבנית של הרשתית והכוריוקפילריס, ובכך תומך בהישרדות הפוטורצפטור ומספק בסיס למחזור הדם ולאספקת חומרים מזינים.

בעיניים בריאות, גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) אחראי לאיזון ההשפעות של גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) ומגן על תאי עצב מפני אפופטוזיס, מונע שגשוג תאי אנדותל ומייצב את האנדותל הנימי. יחס VEGF-to-PEDF קשור לניאו-וסקולריזציה של העין, אשר נצפתה במודלים של בעלי חיים 4,5 וכן בדגימות של חולים עם ניאו-וסקולריזציה כורואידלית (CNV) עקב AMD ורטינופתיה סוכרתית שגשוג 6,7,8,9,10 . ריכוז ה-VEGF המשופר הוא היעד לטיפול הסטנדרטי הנוכחי. התרופות נגד VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept ולאחרונה, brolucizumab לשפר את חדות הראייה בכשליש מחולי CNV או ליתר דיוק לייצב את הראייה ב 90% מהמקרים11,12,13. עם זאת, הזריקות התוך-גופיות התכופות, לעתים קרובות חודשיות, נושאות בסיכון לתופעות לוואי14, פוגעות בציות המטופלים ומהוות נטל כלכלי משמעותי על מערכות הבריאות15. יתר על כן, אחוז מסוים מהחולים (2%-20%) אינם מגיבים או רק מגיבים בצורה גרועה לטיפול נגד VEGF16,17,18,19. מקבילות שליליות אלה מחייבות פיתוח של טיפולים אלטרנטיביים, כגון שתלים תוך עיניים, גישות טיפוליות בתאים ו/או בגנים.

הריפוי הגנטי התפתח כטיפול מבטיח במחלות תורשתיות ולא תורשתיות ומתכוון לשחזר רצפי גנים לא מתפקדים או לדכא תקלות. עבור מחלות פוליגניות, שבהן זיהוי והחלפה של הגורמים הסיבתיים כמעט ואינו אפשרי, אסטרטגיות שואפות לאספקה רציפה של גורם מגן. במקרה של AMD, פותחו טיפולים מוספים שונים, כגון הביטוי היציב של אנדוסטטין ואנגיוסטטין 20, אנטגוניסט VEGF מסיס דמוי טירוזין קינאז-1 (sFLT-1)21,22, אשכול החלבון הרגולטורי המשלים של התמיינות 59 (CD59)23 או PEDF 24,25 . העין, ובמיוחד הרשתית, היא מטרה מצוינת לתרופה מבוססת גנים בשל המבנה הסגור, הנגישות הטובה, הגודל הקטן והפריבילגיה החיסונית, ובכך מאפשרת אספקה מקומית של מינונים טיפוליים נמוכים והופכת את ההשתלות לפחות רגישות לדחייה. יתר על כן, העין מאפשרת ניטור לא פולשני, וניתן לבחון את הרשתית בטכניקות הדמיה שונות.

וקטורים נגיפיים הם, בגלל יעילות ההתמרה הגבוהה שלהם, הכלי העיקרי להעברת גנים טיפוליים לתאי מטרה. עם זאת, בהתאם לווקטור הנגיפי המשמש, תוארו תגובות שליליות שונות, כגון תגובות חיסוניות ודלקתיות26, השפעות מוטגניות ואונקוגניות27,28, או הפצה ברקמות אחרות 29. המגבלות המעשיות כוללות גודל אריזה מוגבל30 וכן קשיים ועלויות הכרוכים בייצור מגרשים ברמה קלינית31,32. חסרונות אלה קידמו את המשך הפיתוח של וקטורים לא ויראליים, מבוססי פלסמיד, המועברים באמצעות ליפו-/פוליפלקסים, אולטרסאונד או אלקטרופורציה. עם זאת, אינטגרציה גנומית של הטרנסגן לתוך הגנום המארח בדרך כלל אינה מקודמת עם וקטורים פלסמידים, וכתוצאה מכך ביטוי חולף.

טרנספוזונים הם מקטעי דנ"א טבעיים המשנים את מיקומם בתוך הגנום, מאפיין שאומץ לריפוי גנטי. בשל מנגנון אינטגרציה פעיל, מערכות וקטוריות מבוססות טרנספוזון מאפשרות ביטוי רציף וקבוע של הטרנסגן המוכנס. הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB), ששוחזר מטרנספוזון עתיק מסוג Tc1/mariner שנמצא בדגים33 ושופר עוד יותר על ידי אבולוציה מולקולרית וכתוצאה מכך הגרסה ההיפראקטיבית SB100X34, אפשרה טרנספוזיציה יעילה בתאים ראשוניים שונים ושימשה לתיקון פנוטיפי במודלים שונים של מחלות35. נכון לעכשיו, 13 ניסויים קליניים החלו באמצעות מערכת טרנספוזון SB . מערכת הטרנספוזון SB100X מורכבת משני מרכיבים: הטרנספוזון, המרכיב את הגן המעניין המוקף בחזרות הפוכות סופניות (TIRs), והטרנספוזה, המגייסת את הטרנספוזון. לאחר העברת דנ"א פלסמיד לתאים, הטרנספוזאז קושר את ה-TIRs ומזרז את הכריתה והאינטגרציה של הטרנספוזון בגנום של התא.

פיתחנו תוסף שאינו מבוסס על תאים נגיפיים לטיפול ב- AMD ניאו-וסקולרי. הגישה כוללת החדרה מבוססת אלקטרופורציה של הגן PEDF לתאי אפיתל פיגמנטים ראשוניים (PE) באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X 36,37,38. המידע הגנטי של הטרנספוזאז וה-PEDF מסופק על פלסמידים נפרדים, ובכך מאפשר התאמה של יחס הטרנספוזון האידיאלי SB100X-to-PEDF. האלקטרופורציה מתבצעת באמצעות מערכת טרנספקציה נימית מבוססת פיפטה המאופיינת בגודל מרווח מקסימלי בין האלקטרודות תוך מזעור שטח הפנים שלהן. הודגם כי המכשיר משיג שיעורי העברה מצוינים במגוון רחב של תאי יונקים 39,40,41. שטח הפנים של האלקטרודה הקטנה מספק שדה חשמלי אחיד ומפחית את תופעות הלוואי השונות של אלקטרוליזה42.

הפונקציונליות האנטי-אנגיוגנית של PEDF המופרשת על ידי תאי אפיתל פיגמנטיים שעברו טרנספקציה הודגמה בניסויים שונים במבחנה שניתחו את ההנבטה, הנדידה והאפופטוזיס של תאי אנדותל וורידי הטבור האנושיים43. בנוסף, השתלת תאים שעברו טרנספקציה של PEDF במודל ארנב של ניאו-וסקולריזציה של הקרנית44 וכן מודל חולדות שלCNV 43,45,46 הראו ירידה של ניאו-וסקולריזציה.

כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להחדרה יציבה של הגן PEDF לתאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת טרנספוזון SB100X באמצעות מערכת טרנספקציה נימרית. התאים שעברו טרנספקציה נשמרו בתרבית במשך 21 יום ולאחר מכן נותחו במונחים של ביטוי גנים של PEDF על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ובמונחים של הפרשת חלבון PEDF על ידי אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA, איור 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עיני התורם האנושי התקבלו מבנק אאכן קורניאה של המחלקה לרפואת עיניים (בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) לאחר קבלת הסכמה מדעת בהתאם לפרוטוקולי הצהרת הלסינקי. נהלים לאיסוף דגימות אנושיות ולשימוש בהן אושרו על ידי ועדת האתיקה המוסדית.

1. בידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים

  1. פרשו בגדי מגן סטריליים וכפפות. מניחים וילון סטרילי מתחת לזרימה למינרית.
  2. מניחים מכשירי הכנה סטריליים וציוד סטרילי נחוץ אחר מתחת לזרימה הלמינרית.
  3. להקליט את קבלת גלובוסים העין, את תחילת ההכנה, כמו גם חריגות אפשריות. רשום את גיל התורם, מינו, סיבת המוות והתקופה שבין זמן המוות להסרת העיניים.
  4. מניחים את כדור העין בדחיסת גזה סטרילית ומחזיקים אותו ביד אחת.
  5. הפרידו את המקטע הקדמי מהמקטע האחורי על ידי חתך היקפי של כ-3.5 מ"מ אחורי ללימבוס באמצעות אזמל ומספריים מחודדים עדינים במיוחד.
  6. לאחר הטיית החלק האחורי כלפי מטה, הסר בזהירות את הזגוגית ואת הרשתית באמצעות מלקחיים קוליברי.
  7. סדרו מחדש בדיסקרטיות את קומפלקס ה-RPE/choroidea המכווץ באמצעות מלקחיים ישרים של הקשתית ולאחר מכן החזיקו אותו במקומו עם מלקחיים מעוקלים.
  8. מלאו את העיניים האחורית ב-1 מ"ל של תערובת החומרים המזינים F-12 של Dulbecco (DMEM/F12) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 80 פניצילין U/mL ו-80 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (עט/סטרפ), ו-2.5 מיקרוגרם/מ"ל אמפוטריצין B (אמפוב).
    הערה: בניגוד לבידוד של תאי RPE ראשוניים מעיני חזיר או בקר36,37, אין צורך למלא את כוס העין האחורית ולדגירה עם טריפסין.
  9. קצירת תאי ה-RPE על ידי הברשה עדינה של אפיתל פיגמנט הרשתית מעצב הראייה לכיוון הלימבוס באמצעות פיפטת פסטר זכוכית מעוגלת מלוטשת באש, תוך קיבוע קומפלקס RPE/choroidea בלימבוס באמצעות מלקחיים קוליבריים. מעבירים את מתלה התא לצלחת פטרי.
  10. חזור על השלבים 1.8 ו- 1.9 ואסוף את כל התאים בצלחת פטרי. השהה את מתלה התא בזהירות על ידי צנרת למעלה ולמטה באמצעות פיפטה ערוץ יחיד (100-1,000 μL).
  11. זרעו את תרחיף תאי ה-RPE של כל גלובוס עיניים לשלוש בארות של צלחת תרבית תאים בת 24 בארות ומלאו אותן עד 1 מ"ל ב-DMEM/F12 בתוספת FBS, עט/סטרפ ואמפוב.
  12. שמור על תרביות תאי RPE בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו-5% CO2 עד להגעה למפגש. שנה את מדיום תרבית התאים פעמיים בשבוע.

2. אלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים

  1. הכנת תערובת פלסמיד טרנספוזון/PEDF SB100X טרנספוזון
    1. לטהר את ה- SB100X transposase ו- PEDF טרנספוזון פלסמיד DNA באמצעות ערכות טיהור פלסמיד מקובלות, אשר מזוהים כמתאימים לשימוש ביישומים כגון טרנספקציה, על פי פרוטוקול היצרן.
    2. לכמת את תכולת הדנ"א הפלסמיד באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח ולהתאים אותם לריכוז של 250 ננוגרם/מיקרון עם 10 mM Tris-HCl (pH 8.5).
    3. יש לערבב חלק אחד של 250 ננוגרם/μL SB100X טרנספוזאז פלסמיד DNA (לדוגמה, 2.5 μL) עם 16 חלקים של 250 ng/μL PEDF טרנספוזון פלסמיד DNA (למשל, 40 μL). תערובת פלסמיד שיורית ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש להימנע ממחזורי הקפאה והפשרה חוזרים ונשנים של תערובת הפלסמיד.
    4. מקם 2 μL של תערובת פלסמיד טרנספוזאז/PEDF טרנספוזון/PEDF, המכילה 29.4 ננוגרם של פלסמיד טרנספוז SB100X ו-470.6 ננוגרם של פלסמיד טרנספוזון PEDF, בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל עם נעילה בטוחה. יש לשמור על הקרח עד לערבוב עם התאים.
  2. הקמת מערכת הטרנספקציה הנימית
    הערה: אלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים בוצעה באמצעות מערכת טרנספקציה נימית באמצעות ערכת 10 μL על פי פרוטוקול היצרן. המערכת כוללת את מכשיר הטרנספקציה, את פיפטה הטרנספקציה ואת תחנת הפיפטה. הערכה מכילה 10 קצוות טרנספקציה של μL, צינורות חיץ, חיץ אלקטרוליטי E (חיץ E) וחיץ מחדש R (חיץ R).
    1. חבר את תחנת הפיפטה להתקן הטרנספקציה.
    2. מלא צינור חיץ עם 3 מ"ל של חיץ E והכנס אותו לתחנת פיפטה עד צליל קליק נשמע.
      הערה: ודא שהאלקטרודה הצדדית של צינור החיץ מחוברת לבוכנה הכדורית הצדדית של תחנת הפיפטה.
    3. עבור אלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים, הגדר את תנאי הפולס הבאים בהתקן הטרנספקציה: 1,100 V (מתח פולס), 20 מילישניות (רוחב פולס), שתי פולסים (מספר פולס).
  3. הכנת תאי ה-RPE האנושיים הראשוניים המעובדים
    1. תעד צורה ומורפולוגיה של תרביות תאי RPE ראשוניות באמצעות מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. קח מיקרוגרפים בהגדלה נמוכה כדי להדגים את הצמיחה של תאי RPE למונו-שכבה משולבת ומשולבת, כמו גם מיקרוגרפים בהגדלה גבוהה יותר כדי להצביע על המורפולוגיה המרוצפת האופיינית של תאי ה- RPE.
    2. שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו את התאים פעמיים עם 1 מ"ל מלח פוספט (PBS, pH 7.4).
    3. טריפסיני תאי RPE אנושיים ראשוניים עם 0.5 מ"ל 0.05% טריפסין-EDTA ב 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו 5% CO2 במשך 7-15 דקות (מקסימום). בדוק את ניתוק התא באופן מיקרוסקופי.
    4. הפסק טריפסיניזציה עם 1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת FBS. קח 20 μL aliquot לספירת תאים באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה מתלה תא RPE ב 106 x גרם במשך 10 דקות.
    5. מערבבים את האליקוט של 20 μL עם תמיסה כחולה של 20 μL. פיפטה 10 μL בכל מחצית של ההמוציטומטר ולספור את התאים תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
    6. לאחר צנטריפוגה, יש להשעות את גלולת תא ה-RPE ב-1 מ"ל של PBS.
    7. קח 10,000-100,000 תאי RPE לכל תגובת טרנספקציה וצנטריפוגה אותם ב 106 x גרם במשך 10 דקות.
      הערה: לצד תגובות הטרנספקציה עם יישום שדה חשמלי והוספת דנ"א פלסמיד, כל גישה כוללת גם שתי תרבויות בקרה שונות: (1) ללא יישום שדה חשמלי וללא דנ"א פלסמיד; (2) עם יישום שדה חשמלי, אך ללא דנ"א פלסמיד.
    8. יש לתלות את גלולת התא ב-11 μL של מאגר R ולשלב אותה עם 2 μL של תערובת פלסמיד טרנספוזה/PEDF של SB100X טרנספוזון (ראה שלב 2.1.4).
      הערה: לאחר חידוש במאגר R, יש לעבד את התאים תוך 15 דקות כדי למנוע ירידה בכדאיות התא וביעילות ההעברה.
    9. הכנס את ראש פיפטה transfection לתוך קצה transfection 10 μL transfection עד מהדק לחלוטין להרים את גזע הרכבה של הבוכנה. משכו את תמיסת התא/פלסמיד לתוך קצה הטרנספקציה.
      הערה: הימנעו מיצירת בועות אוויר ושאיפתן לקצה הטרנספקציה.
    10. ספק 1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת FBS, אך ללא עט/סטרפ וללא AmphoB, למספר הבארות הנדרש של צלחת תרבית תאים של 24 בארות.
  4. תהליך אלקטרופורציה
    1. הכנס את פיפטה הטרנספקציה לתוך צינור החיץ הממוקם בתחנת הפיפטה (ראה שלב 2.2.2) עד שיישמע צליל לחיצה.
      הערה: ודא שראש המתכת של פיפטה הטרנספקציה מחובר לבוכנה הכדורית בתוך תחנת הפיפטה ולצינור החיץ.
    2. לחץ על התחל במסך המגע של התקן הטרנספקציה. לפני היישום של הדופק החשמלי, המכשיר בודק באופן אוטומטי אם צינור החיץ ואת פיפטה transfection מוכנסים כראוי. לאחר מסירת הפולסים החשמליים, Complete מוצג על מסך המגע.
    3. הסר בזהירות את פיפטה הטרנספקציה מתחנת הפיפטה ושחרר מיד את התאים האלקטרופוארטיים מקצה הטרנספקציה של 10 μL על ידי הזרמת תמיסת התא/פלסמיד לתוך הבארות המוכנות של צלחת תרבית התאים (ראה שלב 2.3.10).
    4. שמור על תרביות תאי RPE שעברו טרנספקציה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו-5% CO2. הוסף עט/סטרפ ואמפוב עם ההחלפה הבינונית הראשונה 3 ימים לאחר האלקטרופורציה.

3. ניתוחים של תאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה

  1. הכנת דוגמאות
    1. לאחר זמן גידול של 3 שבועות, בסופו של דבר דגירה של תרביות תאי RPE בנפח מוגדר של 1.0 מ"ל DMEM/F12 בתוספת FBS, עט/סטרפ ואמפוב לזמן מוגדר של 24 שעות.
    2. קח את תרבית התאים supernatants ולאחסן אותם ב -20 °C עד עיבוד נוסף כמעט בזמן או ב -80 °C עבור דגימות לא יציבות תרמית ואחסון לטווח ארוך.
    3. טריפסיניזציה של תרביות תאי RPE שעברו טרנספקציה עם 0.5 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה של 95% אוויר ו-5% CO2 למשך 10 דקות.
    4. הפסק טריפסיניזציה עם 1 מ"ל של DMEM/F12 בתוספת FBS. קח aliquots קטנים לספירת תאים באמצעות hemocytometer (ראה שלב 2.3.5). צנטריפוגה מתלי תא RPE ב 106 x גרם במשך 10 דקות.
    5. אחסן את כדורי תא RPE בטמפרטורה של -80°C עד לעיבוד נוסף.
  2. הערכת הפרשת PEDF על ידי כתם מערבי
    הערה: לצורך הערכה איכותית, סופרנאטנטים של תרביות תאים (ראה שלב 3.1.2) מנותחים באמצעות אלקטרופורזה של נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל (SDS-PAGE) והכתמה מערבית לאחר מכן. בהתאם ל PEDF טרנספוזון פלסמיד DNA בשימוש, supernatants צריך להיות מעובד אחרת.
    1. טיהור חלבוני היתוך PEDF המתויגים שלו מתרבי-על של תרביות תאים
      1. יש ליטול 30 μL של חומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית (Ni-NTA) לכל דגימה באמצעות קצה משופע לחתוך וכדור את שרף Ni-NTA על ידי צנטריפוגה (2,660 x גרם במשך 30 שניות).
      2. יש להשעות בזהירות את שרף Ni-NTA עם 200 μL של מאגר דגירה 1x (50 mM NaH 2 PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0) וכדור אותו על ידי צנטריפוגה (2,660 x g עבור 30 שניות).
      3. חזור על השלב הקודם.
      4. יש לחדש בזהירות את שרף Ni-NTA עם מאגר דגירה 40 μL 4x (200 mM NaH 2 PO4,1.2M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0) לכל דגימה.
      5. יש לערבב 900 μL של תרבית-על של תרבית תאים עם 260 μL של מאגר דגירה 4x ו-55 μL של תרביית Ni-NTA שטופלה מראש (ראה שלב 3.2.1.4).
      6. דגרו את התערובת על שייקר מתנדנד בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.
      7. גלולה שרף Ni-NTA על ידי צנטריפוגה (2660 x גרם עבור 60 שניות).
      8. יש להשעות בזהירות את שרף Ni-NTA עם 175 μL של מאגר דגירה 1x ושרף גלולות על ידי צנטריפוגה (2,660 x g עבור 60 שניות).
      9. חזור על השלב הקודם.
      10. יש להשעות בזהירות את שרף Ni-NTA עם 30 μL של חיץ אלוטיון (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) ולדגור את התערובת על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
      11. גלולה שרף Ni-NTA על ידי צנטריפוגה (2,660 x גרם עבור 30 שניות).
      12. קח בזהירות את הסופרנטנט וערבב אותו עם 2x מאגר דגימות SDS47.
      13. מחממים את התערובת בטמפרטורה של 95°C למשך 5 דקות ומפרידים את החלבונים המטוהרים של Ni-NTA על ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד בטמפרטורה של 10%.
      14. בצע הכתמה מערבית באמצעות נוגדנים נגד פנטה-הו (מונוקלונל עכבר, 1:500) ונוגדנים מצומדים נגד עכברים (נוגדנים נגד עכבר ארנב, 1:1,000) כפי שתואר קודם לכן36,37.
    2. אנליזה ישירה של חלבוני PEDF שאינם מתויגים
      1. קח 15 μL של תרבית תאים supernatant ולערבב אותו עם 2x SDS דגימה מאגר47.
      2. מחממים את התערובת ל-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומפרידים את החלבונים על ג'ל SDS-פוליאקרילאמיד 10%.
      3. בצע הכתמה מערבית באמצעות נוגדני PEDF אנטי-אנושיים (רב-שבטיים של ארנב, 1:4,000) ונוגדנים מצומדים נגד ארנבים של HRP (רב-שבטי עזים, 1:2,000) כפי שתואר קודם לכן38.
    3. כימות הפרשת PEDF על ידי ELISA
      1. ניתוח תרביות-על של תרביות תאים (ראה שלב 3.1.2) באמצעות ערכת PEDF ELISA אנושית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      2. יש לקשר את כמות ה-PEDF המופרשת לזמן ולמספר התא שנקבע עבור כל תגובת טרנספקציה (ראו שלב 3.1.4).
    4. ניתוח ביטוי גנים של PEDF בתאי RPE שעברו טרנספקציה
      1. יש לבודד את סך הרנ"א מכדורי תאי ה-RPE (ראה שלב 3.1.5) באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      2. כימות תכולת RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
      3. לבצע שעתוק הפוך על 0.1 מיקרוגרם RNA באמצעות מערכת שעתוק הפוך על פי פרוטוקול היצרן.
      4. בצע qPCR בזמן אמת כפי שתואר קודם לכן38.
    5. ניתוח של אתרי החדרת טרנסגנים בתאי RPE שעברו טרנספקציה
      1. לבודד דנ"א גנומי מכדורי תאי RPE (ראה שלב 3.1.5) באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      2. כימות תכולת הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח.
      3. צור ספריות אתר הכנסה באמצעות ערכת PCR ספציפית ל- hemi בסיוע חישוב כפי שתואר קודםלכן 38.
      4. בצע ניתוח חישובי כפי שתואר קודםלכן 38.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

טיפוח ואלקטרופורציה של תאי RPE אנושיים ראשוניים
הראינו כי זריעה של מספר מספיק של תאי RPE ראשוניים ממוצא מן החי מאפשרת טיפוח וצמיחה לחד-שכבתי משולב של תאים בעלי פיגמנטציה בצורת משושה36,37,48. יכולתם ליצור צמתים הדוקים, להפגין פעילות פאגוציטית ולבטא גנים ספציפיים של סמנים במבחנה48 משקפת משימות משמעותיות של אפיתל פיגמנט הרשתית in vivo. תאי RPE ראשוניים מעובדים שבודדו מעיני התורם האנושי הראו גם את המורפולוגיה המרוצפת האופיינית, ללא קשר לגיל התורם (65.3 ± 9.94 a, min: 49 a, max: 83 a, n = 12), זמן הבידוד שלאחר המוות (37.3 ± 17.0 שעות, מינימום: 16 שעות, מקסימום: 68 h, n = 12), וזמן הטיפוח (27.6 ± 14.1 d, מינימום: 13 d, מקסימום: 61 d, n = 12) (איור 2, לוח שמאלי). היישום של פולסים חשמליים לטווח קצר על תאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספקציה הנימית לא השפיע לרעה על המורפולוגיה של האפיתל (איור 2, פאנל ימני). בדיקה של פרמטרים חשמליים שונים העלתה כי שני פולסים עם מתח פולס של 1,200 וולט ורוחב פולס של 20 מילישניות הניבו יעילות העברה טובה ויציבה ואת המספר הגבוה ביותר של תאי RPE בני קיימא (נתונים שלא פורסמו).

החדרה בתיווך SB100X של הגן PEDF לתאי RPE אנושיים ראשוניים מעובדים
בדקנו יחסי דנ"א פלסמידים של טרנספוזון SB100X-to-PEDF הנעים בין טרנספוזון של 250 ng (0.08 pmol) SB100X טרנספוזאז בתוספת 250 ng (0.052 pmol) טרנספוזון PEDF לטרנספוזון של 12.2 ng (0.0039 pmol) SB100X טרנספוזאז בתוספת 487.8 ng (0.1 pmol) טרנספוזון PEDF. גישה זו זיהתה את שני הצירופים 29.4 ng (0.0094 pmol) SB100X טרנספוזאז בתוספת 470.6 ng (0.098 pmol) טרנספוזון PEDF ו-23.8 ng (0.0076 pmol) בתוספת 476.2 ng (0.099 pmol) ככאלה שהשיגו את יעילות הטרנספוזיציה הטובה ביותר37. בתאי RPE אנושיים ראשוניים מעובדים, העברת טרנסגן PEDF באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X אפשרה ביטוי גנים מוגבר ברציפות של PEDF והפרשת חלבון PEDF. עבור PEDF רקומביננטי מתויג שלו, ניתוח כתם מערבי של מדיה של תרביות תאים מתאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה הדגים הפרשת PEDF ברמות קבועות ללא השתקה טרנסגנית במשך יותר מ-500 ימים (איור 3A). עבור PEDF שאינו מתויג, הודגם כי ההפרשה בתאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה הייתה מוגברת באופן משמעותי בהשוואה לתאים שאינם מותמרים38. ניתוח מייצג של כתמי תרבית תאים מטרנספקציות שבוצעו באופן סדרתי הצביע בבירור על שיעור הפרשת PEDF הגבוה יותר באופן אוניברסלי ב-21 יום לאחר ההעברה (איור 3B), ובתרבית נרדפת, הוכחה הפרשת PEDF מוגברת לטווח ארוך במשך 165 ימים לפחות (איור 3C). כימות מבוסס ELISA הדגים עלייה של פי 20 בסך הפרשת ה-PEDF בתאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה, בהשוואה לתאי בקרה שאינם מועברים בהתאמה (איור 3D). תוספת זו אושרה גם ברמת ביטוי הגנים, שם הביטוי הכולל של PEDF הועלה יותר מפי 30 (איור 3E).

Figure 1
איור 1: זרימת עבודה להחדרה מבוססת אלקטרופורציה של הגן PEDF לתאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X. התוכנית מתארת את המהלך הכרונולוגי של (A) הבידוד של תאי RPE אנושיים ראשוניים והטיפוח שלהם לאחר מכן למונו-שכבה קונפלואנטית, (B) השלבים היחידים של תהליך האלקטרופורציה, כולל טיהור הטרנספוזאז SB100X והדנ"א הפלסמיד של טרנספוזון PEDF, הכנת הטרנספוזאז SB100X / PEDF תערובת פלסמיד טרנספוזון, הקמת מערכת הטרנספקציה הנימית, הכנת תאי ה- RPE האנושיים הראשוניים המעובדים, האלקטרופורציה, הזריעה והטיפוח של תאי ה- RPE המועברים, וכן (C) הניתוחים של תאי ה- RPE האנושיים הראשוניים המועברים, הכוללים את הכנת תרביות התאים ודגימות התאים המועברות, הערכה וכימות של הפרשת PEDF, וניתוח ביטוי גנים של PEDF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מיקרוגרפים של ניגודיות פאזה של תאי RPE שבודדו מעיני תורמים שונים. תרביות של תאי RPE אנושיים ראשוניים, שונות בגיל התורם, בזמן הבידוד שלאחר המוות ובזמן הגידול לפני היישום שלהן לאלקטרופורציה (פאנל שמאלי), כמו גם תרביות של תאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה, החשופים לפרמטרים החשמליים 1,100 V (מתח פולס), 20 מילישניות (רוחב פולס) ו-2 פולסים (מספר פולסים) באמצעות מערכת הטרנספקציה הנימית (פאנל ימני) ), הציג חד-שכבתי משולב של תאים פיגמנטיים בתבנית דמוית אבן מרוצפת (פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הפרשת PEDF וביטוי גנים של PEDF לאחר טרנספקציה בתיווך SB100X של תאי RPE אנושיים ראשוניים. (A-C) ניתוחים מבוססי אימונובלוט של יציבות הפרשת PEDF בתאי RPE אנושיים ראשוניים מעובדים שעברו טרנספקציה עם תערובת של 29.4 ננוגרם (0.0094 pmol) SB100X טרנספוזאז פלסמיד בתוספת 470.6 ננוגרם (0.098 pmol) פלסמיד טרנספוזון PEDF באמצעות מערכת הטרנספקציה הנימית. (A) תאי RPE מתורם בן 26 (נקבה, זמן בידוד לאחר המוות: 26 שעות, זמן גידול לפני אלקטרופורציה: 14 יום) הועברו ותוחזקו בתרבית במשך יותר מ-500 ימים. ה-PEDF הרקומביננטי המתויג שלו (~48 kDa) טוהר ממדיה של תרביות תאים בנקודות זמן שונות והוערך על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים נגד פנטה-הו. (B) עבור PEDF רקומביננטי שאינו מתויג, תאי RPE מתורם בן 53 (נקבה, זמן בידוד לאחר המוות: 28 שעות, זמן גידול לפני ההעברה: 19 יום) עברו אלקטרופוזה ללא דנ"א פלסמיד (תרביות בקרה #1 ו #2) או עם תוספת של דנ"א פלסמיד (תרביות תאים טרנספקטיביות של PEDF #3 עד #7) ונשמרו בתרבית במשך 21 יום. סופרנאטנטים של תרביות תאים לא טוהרו, אלא נותחו ישירות על ידי אימונובלוטינג באמצעות נוגדנים נגד PEDF. ניתוח כתמים מערבי של ליזטים תאיים הראה את רמת ה-PEDF התוך-תאי בבקרות (תרביות #1 ו-#2) ובתאים שעברו טרנספקציה (תרביות #3 ו-#4). העמסה של כמויות חלבון דומות צוינה על ידי צפיפות שווה של רצועות חלבון GAPDH (~ 36 kDa). (C) לצורך ניתוח הפרשת PEDF ארוכת טווח, תאי RPE מתורם בן 63 (זכר, זמן בידוד לאחר המוות: 26 שעות, זמן גידול לפני טרנספקציה: 15 יום) עברו אלקטרופוזה ללא דנ"א פלסמיד (תרביות בקרה #1 ו #2) או עם דנ"א פלסמיד (תרבית תאים טרנספקטיבית #3) ונשמרו בתרבית במשך 165 ימים לפחות. מדיה של תרביות תאים לא טוהרה, אלא נותחה ישירות על ידי אימונובלוטינג באמצעות נוגדנים נגד PEDF. (D) כימות מבוסס ELISA של סך הפרשת PEDF בתאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה (שתי דגימות) ובתאי בקרה שאינם מותמרים (ארבע דגימות). הפרשת התאים הטרנספקטיים הושוותה להפרשת התאים שאינם מותמרים (*p = 0.0264, מבחן t לא מזווג עם התיקון של וולש). (E) ביטוי גנים אנדוגני PEDF אנדוגני וסך הכל (אנדוגני פלוס רקומביננטי) בתאי RPE אנושיים ראשוניים שעברו טרנספקציה היו קשורים לביטוי בתאי בקרה שאינם מותמרים, שהביטוי שלהם הוגדר ל-1 (קו מקווקו). הנתונים מוצגים כמגרש קופסה ושפם (שפם: דקה עד מקסימום). ביטוי גנים כולל של PEDF הושווה לביטוי גנים אנדוגניים של PEDF (לא מבחן t משמעותי, לא מזווג עם התיקון של וולש). התוצאות עבור PEDF רקומביננטי לא מתויג (B-E) מייצגות שתי יחידות של כל מערך הנתונים של תאי RPE ראשוניים מעד 27 תורמים שעברו טרנספקציה עם יחס טרנספוזון SB100X-to-PEDF של 29.4 ng (0.0094 pmol) בתוספת 470.6 ng (0.098 pmol), אשר תואר על ידי Thumann et al. 2017 38. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרויקט שלנו, אנו שואפים לייצור לא ויראלי של תאי RPE אנושיים ראשוניים מהונדסים גנטית, אשר מבטאים יתר על המידה ומפרישים ללא הרף גורם יעיל על מנת להשתמש בתאים המועתקים כטיפול ארוך טווח להקמה ותחזוקה של סביבה מגוננת. ביססנו את ההקדמה של הגן המקודד PEDF, חלבון רב-תפקודי המתבטא בכל מקום עם פונקציות אנטי-אנגיוגניות ונוירו-פרוטקטיביות. ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן כדי להעביר ביציבות ובשכפול תאי RPE אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון SB100X . העברת דנ"א והכנסתו לתאי ה-RPE מתבצעת באמצעות מערכת העברה נימית מבוססת פיפטה, המשתמשת בקצוות ספציפיים כתא אלקטרופורציה במקום cuvettes.

ההעשרה של תרביות RPE ראשוניות המורכבות מתאים ממוינים היטב מבחינה מורפולוגית שישמשו לטרנספקציות הבאות מושפעת ממספר גורמים הקשורים לתורם האנושי (גיל ומצב בריאותי כללי) כמו גם קבלת העיניים (זמן לאחר המוות של בידוד תאים). תאי RPE ראשוניים שבודדו ונזרעו זה עתה זקוקים לשבועיים לפחות כדי לפתח חד-שכבתי של תאים בצורת משושה. ככלל, תרביות תאים שהיו זקוקות לזמן רב יותר כדי להגיע למפגש לפני הטרנספקציה הראו גם האטה בדבקות ובהתפשטות לאחר הטרנספקציה. היצמדות והתפשטות התאים נפגעות גם על ידי הפקדת פיגמנט חופשי מתאי RPE שניזוקו במהלך בידוד התאים או בתהליך הטרנספקציה.

מערכת הטרנספוזון SB היא כלי גנטי נפוץ המאפשר העברה יעילה ובטוחה של רצפי נוקלאוטידים רלוונטיים מבחינה טיפולית לסוגים שונים של תאים כדי ליישם אותם לאחר מכן בטיפולים תאיים מבוססי גנים. במיוחד, הגרסה המשופרת שלה SB100X משלבת את היתרונות של וקטורים ויראליים ודנ"א פלסמיד לא ויראלי. אופן הפעולה המשולב מבטיח אינטגרציה גנומית יציבה של קלטת הביטוי לתוך הגנום של התא המארח ומאפשר ביטוי מתמשך של הגן או רצף העניין. בניגוד לווקטורים רטרו-ויראליים, המשתלבים באופן מועדף ביחידות שעתוק פעילות עם סיכון גבוה למוטגנזה פוטנציאלית ואונקוגנזה27,28, פרופיל האינטגרציה מבוסס SB הוא אקראי. זה הודגם במספר רב של מחקרים שהשתמשו בתאי יונקים תרבית וראשוניים שונים, כולל תאים אנושיים 49,50,51,52, כמו גם עבור חולדות ראשוניות ותאי RPE אנושיים 38,46. יתר על כן, היישום של מערכת טרנספוזון SB כדנ"א פלסמיד מספק אימונוגניות מופחתת ומקל על תהליך הייצור.

מסירת המידע הגנטי של טרנספוז SB100X וטרנסגן PEDF על פלסמידים נפרדים היא היבט חשוב, שכן היא מאפשרת התאמה מדויקת של יחס הטרנספוזון האופטימלי SB100X-to-PEDF. כפי שתואר קודם לכן, מערכת הטרנספוזון SB רגישה לעודף של ביטוי טרנספוזאז, מה שמביא לעיכוב הפעילות הטרנספוזיציונית53. ראינו את ההשפעה הזו גם עבור תאי ARPE-19, קו תאים שהתפתח באופן ספונטני ומטוהר על ידי טריפסיניזציה סלקטיבית של תרבית RPE אנושית ראשונית54, ותאי RPE ראשוניים. כאן, טרנספקציה עם יחסי טרנספוזון SB100X-to-PEDF עד 55.6 ng (0.018 pmol) SB100X טרנספוזאז בתוספת 444.4 ng (0.093 pmol) טרנספוזון PEDF הביאה לירידה ברורה בשיעורי הפרשת PEDF 37. יש לקבוע את היחס האידיאלי בין טרנספוזאז לטרנספוזון עבור כל פלסמיד טרנספוזון חדש שנבנה.

וקטורים שאינם מבוססי פלסמיד נגיפיים ניתנים להעברה באמצעות ליפו-פוליפלקסים, ננו-חלקיקים, לייזר, אולטרסאונד או אלקטרופורציה. כבר הראינו שהעברה מבוססת ליפופקציה של תאי PE ראשוניים לא הייתה יעילה ולכן עברנו להעברת גנים מבוססת אלקטרופורציה36. אלקטרופורציה מוגדרת כיישום של שדה חשמלי קצר טווח לתאים, מה שמביא לעלייה בחדירות הממברנה ולהיווצרות נקבוביות מימיות, שדרכן דנ"א פלסמיד יכול להיכנס לתא. באופן כללי, תערובת של תאים, דנ"א פלסמיד וחיץ מוליך מתמלאת לתוך תא אלקטרופורציה ספציפי בין שתי אלקטרודות, המחוברות למכשיר האלקטרופורציה ומייצרות את הפולסים החשמליים. במערך זה המכונה אלקטרופורציה בתפזורת, תא אלקטרופורציה קונבנציונלי של קובט מאופיין בשתי אלקטרודות מקבילות מסוג צלחת, שמרחקן משתנה (0.1-0.4 מ"מ), בהתאם לסוג התא ולמספר התאים המשמשים לתגובת אלקטרופורציה. למרות יעילות טובה של טרנספקציה, תופעות לוואי שונות עלולות להשפיע לרעה על הישרדותם של התאים שעברו טרנספקציה, למשל, שינויי pH, התפתחות חום, יצירת בועות וזרימה טורבולנטית. מערכת הטרנספקציה הנימית לפחות מחלישה את תופעות הלוואי המבוססות על קובט על ידי החזקת אלקטרודות עם שטח פנים ממוזער וגודל מרווח מקסימלי ביניהן42 , כמו גם על ידי שימוש בחיזוקים ספציפיים ואלקטרוליטיים; עם זאת, יצירותיהם אינן נחשפות.

למרות השיפורים במערך האלקטרופורציה בתפזורת, שהובילו להישרדות תאים מוגברת, נזק בלתי הפיך לאחוז מסוים של תאים הוא בלתי נמנע. יתר על כן, שליטה מדויקת של כמות פלסמיד משולב לתוך התאים אינו אפשרי. הפיתוח העדכני יותר של מערכות אלקטרופורציה ממוזערות איפשר שיפורים נוספים על ידי הפחתה נוספת של המגבלות הקשורות לאלקטרופורציה בתפזורת. התקנים חדשים אלה מבוססים על מיקרואלקטרודות, מיקרופלואידיות או ננו-מבנים. הם מציעים פרספקטיבות יישומיות חדשות בתחומי הריפוי הגנטי, הרפואה הרגנרטיבית והחקירה התוך-תאית באתרה (שנסקרו על ידי Chang et al. ו-Shi et al.) 55,56.

הוכחנו כי אלקטרופורציה, אשר בוצעה בתחילה באמצעות מערכת מבוססת קובט ולאחר מכן הוקמה באמצעות מערכת נימים מבוססת פיפטה, היא שיטה מתאימה ויעילה כדי transfect הן את קו תאי אפיתל פיגמנט ARPE-19 כמו גם תאי PE ראשוניים 36,37,38,57,58 . בהתאם לסוג התא שבו נעשה שימוש, חשוב להגדיר פרוטוקולי אלקטרופורציה מתאימים המיישמים פרמטרים המאפשרים הן יעילות העברה טובה והן הישרדות תאים. שדות חשמליים לא מספיקים מונעים נזק לתאים, אך גורמים ליעילות העברה נמוכה. עם העלייה בחוזק השדה החשמלי, מושגת יעילות משופרת של טרנספקציה. עם זאת, פרמטרים חשמליים גבוהים גם מובילים לאחוזים גבוהים יותר של תאים מתים בגלל נזק בלתי הפיך לתאים. עבור קו התאים ARPE-19, באמצעות מערכת הטרנספקציה הנימית, הוכחו פרמטרים אלקטרופורציה של 1,350 וולט, 20 אלפיות השנייה ו-2 פולסים כבעלי יעילות העברה ראשונית של 100%37. היישום של פרמטרים אלה עבור טרנספקציה של תאי RPE ראשוניים הביא גם ליעילות טובה, אך גם למספר נמוך יותר של תאים מעובדים לאחר טרנספקציה בהשוואה לפרמטרים אלקטרופורציה של 1,100 וולט, 20 אלפיות השנייה ו-2 פולסים (הנתונים לא מוצגים). לכן, התקבלה ההחלטה לבחור בפרמטרים המתונים יותר של אלקטרופורציה כדי למנוע נזק לתאים ולקבל פחות תאים שעברו טרנספקציה.

המטרה הכוללת של גישה זו טמונה ביישום הקליני של תאים שעברו טרנספקציה של PEDF לטיפול בחולים הסובלים מ- AMD ניאו-וסקולרי. הטיפול כולל החדרה יציבה של טרנסגן PEDF לתאי אפיתל פיגמנטיים אוטולוגיים ex vivo המבוססים על מערכת הטרנספוזון SB100X , ולאחר מכן השתלת התאים הטרנספקטיים לחלל התת-קרקעי של המטופל. לכן, חשוב לוודא כי התאים PEDF-transfected אינם transdifferentiate ולא לרכוש צורה פיברובלסטית והתנהגות גדילה. חשוב גם להוכיח כי התאים המועתקים מאפשרים הפרשה מתמשכת ועקבית של PEDF. יתר על כן, חשוב לדעת את הכמות המדויקת של PEDF המופרשת על ידי מספר מסוים של תאים למשך פרק זמן מסוים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

זולטן איביץ' וז'וז'נה איזבאק הם ממציאים על מספר פטנטים על טכנולוגיית טרנספוזון SB

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי למחקר, פיתוח טכנולוגי והדגמה, הסכם מענקים מס' 305134. Zsuzsanna Izsvák מומן על ידי מועצת המחקר האירופית, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). המחברים רוצים להודות לאנה דוביאס ואנטג'ה שייפר (המחלקה לרפואת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) על התמיכה הטכנית המצוינת, ולבנק הקרנית של אאכן (המחלקה לרפואת עיניים, בית החולים האוניברסיטאי RWTH Aachen) על מתן עיני התורם האנושי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isolation of primary human RPE cells
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Colibri Forceps Geuder, Heidelberg, Germany G-18950
Curved Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18856
Disposable Scalpel (No. 11) Feather, Osaka, Japan
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Extra Fine Pointed Eye Scissor  Geuder, Heidelberg, Germany G-19405
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Glass Pasteur Pipettes Brand, Wertheim, Germany 747715
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Sterile Drape Lohmann & Rauscher, Rengsdorf, Germany
Sterile Gauze Compress  Fink-Walter, Merchweiler, Germany 321063
Sterile Gloves Sempermed, Wien, Austria
Sterile Petri Dish (Falcon 60 mm x 15 mm) Corning, Corning, NY 351007
Sterile Surgical Gown Halyard Health, Alpharetta, GA
Straight Iris Forceps  Geuder, Heidelberg, Germany G-18855
Electroporation of primary human RPE cells
10 mM Tris-HCl (pH 8.5)
12-Well Cell Culture Plate Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 150628
24-Well Cell Culture Plate Eppendorf, Hamburg, Germany 0030722019
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Inverted Microscope Leica Mikrosysteme, Wetzlar, Germany Leica DMi8
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Capillary Transfection System (Neon Transfection System) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK5000
Neon Transfection System 10 µL Kit Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA MPK1096
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
PBS Dulbecco w/o Ca2+ w/o Mg2+ Biochrom, Berlin, Germany L182-50
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Plasmid Maxi Kit Qiagen, Hilden, Germany 12163
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054
Analyses of transfected primary human RPE cells
10% SDS-Polyacrylamide Gel
1x Incubation Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8.0)
2x SDS Sample Buffer
4x Incubation Buffer (200 mM NaH2PO4, 1.2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8.0)
Amersham Protran Supported 0.2 µm Nitrocellulose Blotting Membrane Cytiva, Marlborough, MA 10600015
Amphotericin B [250 µg/mL] (AmphoB) Merck, Darmstadt, Germany A2942
Anti-PEDF Antibodies (Rabbit Polyclonal) BioProducts, Middletown, MD AB-PEDF1
Anti-Penta-His Antibodies (Mouse Monoclonal) Qiagen, Hilden, Germany 34660
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P04-41150
Elution Buffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8.0) 
Fetal Bovine Serum [0.2 µm Sterile Filtered] (FBS) PAN-Biotech, Aidenbach, Germany P40-37500
Hemocytometer (Neubauer Chamber) Paul Marienfeld, Lauda-Königshofen, Germany 0640110
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Mouse Antibodies (Rabbit Polyclonal) Agilent Dako, Santa Clara, CA P0260
Horseradish Peroxidase-Conjugated Anti-Rabbit Antibodies (Goat Polyclonal) Abcam, Cambridge, United Kingdom ab6721
Human PEDF ELISA Kit  BioProducts, Middletown, MD PED613
LAS-3000 Imaging System Fujifilm, Minato, Japan
LightCycler 1.2 Instrument Roche Life Science, Penzberg, Germany
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I Roche Life Science, Penzberg, Germany 12239264001
LightCycler Capillaries (20 μl) Roche Life Science, Penzberg, Germany 4929292001
Microvolume Spectrophotometer (NanoDrop Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Module Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658015
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1658004
Ni-NTA Superflow Qiagen, Hilden, Germany 30410
PageRuler Prestained Protein Ladder Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 26616
Penicillin [10,000 units/mL] and Streptomycin [10 mg/mL] (Pen/Strep) Merck, Darmstadt, Germany P0781
Pipette Tips (10 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (1000 µL) Starlab, Hamburg, Germany
Pipette Tips (200 µL) Starlab, Hamburg, Germany
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1645050
QIAamp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Germany 51304
Reverse Transcription System  Promega, Madison, WI A3500
RNase-Free DNase Set Qiagen, Hilden, Germany 79254
RNeasy Mini Kit  Qiagen, Hilden, Germany 74104
Rocking Shaker Cole-Parmer, Staffordshire, United Kingdom SSM3
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (2.0 mL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (0.1-10 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (100-1000 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Single Channel Pipette (10-200 µL) Eppendorf, Hamburg, Germany
Trans-Blot Turbo Transfer System Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Germany 1704150
Trypan Blue Solution Merck, Darmstadt, Germany T8154
Trypsin-EDTA (0,05 %) Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 25300054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. James, S. L., et al. national incidence, prevalence, and years lived with disability for 354 diseases and injuries for 195 countries and territories, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. Lancet. 392 (10159), 1789-1858 (2018).
  2. Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), 106-116 (2014).
  3. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  4. Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
  5. Gao, G., et al. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Letters. 489 (2-3), 270-276 (2001).
  6. Bhutto, I. A., et al. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in aged human choroid and eyes with age-related macular degeneration. Experimental Eye Research. 82 (1), 99-110 (2006).
  7. Holekamp, N. M., Bouck, N., Volpert, O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 134 (2), 220-227 (2002).
  8. Kolomeyer, A. M., Sugino, I. K., Zarbin, M. A. Characterization of conditioned media collected from aged versus young human eye cups. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5963-5972 (2011).
  9. Li, X., et al. The significance of the increased expression of phosphorylated MeCP2 in the membranes from patients with proliferative diabetic retinopathy. Scientific Reports. 6, 32850 (2016).
  10. Mohan, N., Monickaraj, F., Balasubramanyam, M., Rema, M., Mohan, V. Imbalanced levels of angiogenic and angiostatic factors in vitreous, plasma and postmortem retinal tissue of patients with proliferative diabetic retinopathy. Journal of Diabetes and its Complications. 26 (5), 435-441 (2012).
  11. Empeslidis, T., et al. How successful is switching from Bevacizumab or Ranibizumab to Aflibercept in Age-Related Macular Degeneration? A systematic overview. Advances in Therapy. 36 (7), 1532-1548 (2019).
  12. Solomon, S. D., Lindsley, K., Vedula, S. S., Krzystolik, M. G., Hawkins, B. S. Anti-vascular endothelial growth factor for neovascular age-related macular degeneration. Cochrane Database of Systematic Reviews. 3, (2019).
  13. Dugel, P. U., et al. phase 3, multicenter, randomized, double-masked trials of brolucizumab for neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 127 (1), 72-84 (2020).
  14. Falavarjani, K. G., Nguyen, Q. D. Adverse events and complications associated with intravitreal injection of anti-VEGF agents: a review of literature. Eye. 27 (7), 787-794 (2013).
  15. Jaffe, D. H., Chan, W., Bezlyak, V., Skelly, A. The economic and humanistic burden of patients in receipt of current available therapies for nAMD. Journal of Comparative Effectiveness Research. 7 (11), 1125-1132 (2018).
  16. Eghoj, M. S., Sorensen, T. L. Tachyphylaxis during treatment of exudative age-related macular degeneration with ranibizumab. British Journal of Ophthalmology. 96 (1), 21-23 (2012).
  17. Forooghian, F., Cukras, C., Meyerle, C. B., Chew, E. Y., Wong, W. T. Tachyphylaxis after intravitreal bevacizumab for exudative age-related macular degeneration. Retina - The Journal of Retinal and Vitreous Diseases. 29 (6), 723-731 (2009).
  18. Otsuji, T., et al. Initial non-responders to ranibizumab in the treatment of age-related macular degeneration (AMD). Clinical Ophthalmology. 7, 1487-1490 (2013).
  19. Zuber-Laskawiec, K., Kubicka-Trzaska, A., Karska-Basta, I., Pociej-Marciak, W., Romanowska-Dixon, B. Non-responsiveness and tachyphylaxis to anti-vascular endothelial growth factor treatment in naive patients with exudative age-related macular degeneration. Journal of Physiology and Pharmacology. 70 (5), (2019).
  20. Campochiaro, P. A., et al. Lentiviral vector gene transfer of endostatin/angiostatin for macular degeneration (GEM) study. Human Gene Therapy. 28 (1), 99-111 (2017).
  21. Constable, I. J., et al. Phase 2a randomized clinical trial: safety and post hoc analysis of subretinal rAAV.sFLT-1 for wet age-related macular degeneration. EBioMedicine. 14, 168-175 (2016).
  22. Rakoczy, E. P., et al. Three-year follow-up of phase 1 and 2a rAAV.sFLT-1 subretinal gene therapy trials for exudative age-related macular degeneration. American Journal of Ophthalmology. 204, 113-123 (2019).
  23. Kumar-Singh, R. The role of complement membrane attack complex in dry and wet AMD - from hypothesis to clinical trials. Experimental Eye Research. 184, 266-277 (2019).
  24. Campochiaro, P. A., et al. Adenoviral vector-delivered pigment epithelium-derived factor for neovascular age-related macular degeneration: results of a phase I clinical trial. Human Gene Therapy. 17 (2), 167-176 (2006).
  25. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Human Gene Therapy. 22 (5), 523-529 (2011).
  26. Ahi, Y. S., Bangari, D. S., Mittal, S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies. Current Gene Therapy. 11 (4), 307-320 (2011).
  27. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Efficacy of gene therapy for X-linked severe combined immunodeficiency. New England Journal of Medicine. 363 (4), 355-364 (2010).
  28. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. Journal of Clinical Investigation. 118 (9), 3143-3150 (2008).
  29. Stieger, K., et al. Subretinal delivery of recombinant AAV serotype 8 vector in dogs results in gene transfer to neurons in the brain. Molecular Therapy. 16 (5), 916-923 (2008).
  30. Tornabene, P., Trapani, I. Can adeno-associated viral vectors deliver effectively large genes. Human Gene Therapy. 31 (1-2), 47-56 (2020).
  31. Ayuso, E. Manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors: new technologies are welcome. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 3, 15049 (2016).
  32. van der Loo, J. C., Wright, J. F. Progress and challenges in viral vector manufacturing. Human Molecular Genetics. 25, 42-52 (2016).
  33. Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells. Cell. 91 (4), 501-510 (1997).
  34. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nature Genetics. 41 (6), 753-761 (2009).
  35. Izsvak, Z., Hackett, P. B., Cooper, L. J., Ivics, Z. Translating Sleeping Beauty transposition into cellular therapies: victories and challenges. Bioessays. 32 (9), 756-767 (2010).
  36. Thumann, G., et al. High efficiency non-viral transfection of retinal and iris pigment epithelial cells with pigment epithelium-derived factor. Gene Therapy. 17 (2), 181-189 (2010).
  37. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  38. Thumann, G., et al. Engineering of PEDF-expressing primary pigment epithelial cells by the SB transposon system delivered by pFAR4 plasmids. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 6, 302-314 (2017).
  39. Abdul Halim, N. S., Fakiruddin, K. S., Ali, S. A., Yahaya, B. H. A comparative study of non-viral gene delivery techniques to human adipose-derived mesenchymal stem cell. International Journal of Molecular Sciences. 15 (9), 15044-15060 (2014).
  40. Ahlemeyer, B., Vogt, J. F., Michel, V., Hahn-Kohlberger, P., Baumgart-Vogt, E. Microporation is an efficient method for siRNA-induced knockdown of PEX5 in HepG2 cells: evaluation of the transfection efficiency, the PEX5 mRNA and protein levels and induction of peroxisomal deficiency. Histochemistry and Cell Biology. 142 (5), 577-591 (2014).
  41. May, R. D., et al. Efficient nonviral transfection of primary intervertebral disc cells by electroporation for tissue engineering application. Tissue Engineering Part C - Methods. 23 (1), 30-37 (2017).
  42. Kim, J. A., et al. A novel electroporation method using a capillary and wire-type electrode. Biosensors & Bioelectronics. 23 (9), 1353-1360 (2008).
  43. Johnen, S., et al. Antiangiogenic and neurogenic activities of Sleeping Beauty-mediated PEDF-transfected RPE cells in vitro and in vivo. Biomed Research International. 2015, 863845 (2015).
  44. Kuerten, D., et al. Transplantation of PEDF-transfected pigment epithelial cells inhibits corneal neovascularization in a rabbit model. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (7), 1061-1069 (2015).
  45. Garcia-Garcia, L., et al. Long-term PEDF release in rat iris and retinal epithelial cells after Sleeping Beauty transposon-mediated gene delivery. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 9, 1-11 (2017).
  46. Hernandez, M., et al. Preclinical evaluation of a cell-based gene therapy using the Sleeping Beauty transposon system in choroidal neovascularization. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 403-417 (2019).
  47. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  48. Johnen, S., et al. Presence of xenogenic mouse RNA in RPE and IPE cells cultured on mitotically inhibited 3T3 fibroblasts. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2817-2824 (2011).
  49. Gogol-Doring, A., et al. Genome-wide profiling reveals remarkable parallels between insertion site selection properties of the MLV retrovirus and the piggyBac transposon in primary human CD4(+) T cells. Molecular Therapy. 24 (3), 592-606 (2016).
  50. Holstein, M., et al. Efficient non-viral gene delivery into human hematopoietic stem cells by minicircle Sleeping Beauty transposon vectors. Molecular Therapy. 26 (4), 1137-1153 (2018).
  51. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Molecular Therapy. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  52. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Molecular and Cellular Biology. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  53. Grabundzija, I., et al. Comparative analysis of transposable element vector systems in human cells. Molecular Therapy. 18 (6), 1200-1209 (2010).
  54. Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties. Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).
  55. Chang, L., et al. Micro-/nanoscale electroporation. Lab on a Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).
  56. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), (2018).
  57. Johnen, S., et al. Endogenic regulation of proliferation and zinc transporters by pigment epithelial cells nonvirally transfected with PEDF. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (8), 5400-5407 (2011).
  58. Pastor, M., et al. The antibiotic-free pFAR4 vector paired with the Sleeping Beauty transposon system mediates efficient transgene delivery in human cells. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 11, 57-67 (2018).

Tags

רפואה גיליון 168 ניוון מקולרי הקשור לגיל AMD מערכת אלקטרופורציה נימרית טרנספקציה לא ויראלית גורם שמקורו באפיתל פיגמנט PEDF תאי אפיתל פיגמנט ראשוניים מערכת טרנספוזון של היפהפייה הנרדמת SB
שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnen, S., Harmening, N., Marie,… More

Johnen, S., Harmening, N., Marie, C., Scherman, D., Izsvák, Z., Ivics, Z., Walter, P., Thumann, G. Electroporation-Based Genetic Modification of Primary Human Pigment Epithelial Cells Using the Sleeping Beauty Transposon System. J. Vis. Exp. (168), e61987, doi:10.3791/61987 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter