Summary
Kombineret ozon og bakteriel endotoxin eksponerede mus viser udbredt celledød, herunder neutrofiler. Vi observerede cellulære tilpasninger såsom forstyrrelse af cytoskeletal lamellipodia, øget cellulær ekspression af komplekse V ATP-syntetiserende underenhed β og angiostatin i broncho-alveolar-lavage, undertrykkelse af lunge immunrespons og forsinket neutrofil rekruttering.
Abstract
Lungerne står konstant over for direkte og indirekte fornærmelser i form af sterile (partikler eller reaktive toksiner) og infektiøse (bakterielle, virale eller svampe) inflammatoriske tilstande. En overvældende vært respons kan resultere i kompromitteret åndedræt og akut lungeskade, som er karakteriseret ved lunge neutrofil rekruttering som følge af pato-logisk vært immun, koagulativ og væv remodeling respons. Følsomme mikroskopiske metoder til at visualisere og kvantificere murin lunge cellulære tilpasninger, som reaktion på lav dosis (0,05 ppm) ozon, en potent miljøforurenende stof i kombination med bakteriel lipopolysaccharid, en TLR4 agonist, er afgørende for at forstå værten inflammatoriske og reparation mekanismer. Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse af forskellige lunge-og systemiske kropsrum, nemlig broncho-alveolar lavage væske, lunge vaskulær perfusate, venstre lunge cryosections, og brystbenet knoglemarv perfusate. Vi viser skader på alveolar makrofager, neutrofiler, lungeparenchymalt væv samt knoglemarvsceller i korrelation med et forsinket (op til 36-72 h) immunrespons, der er præget af diskrete kemokingradienter i de analyserede rum. Derudover præsenterer vi lunge ekstracellulær matrix og cellulære cytoskeletale interaktioner (actin, tubulin), mitokondrie og reaktive iltarter, antikoagulativ plasminogen, dens anti-angiogene peptidfragment angiostatin, mitokondrie ATP-synthasekomplekset V-underenheder, α og β. Disse surrogat markører, når suppleret med tilstrækkelig in vitro celle-baserede assays og in vivo dyr billeddannelse teknikker såsom intravital mikroskopi, kan give vigtige oplysninger til at forstå lungerespons på nye immunmodulatoriske midler.
Introduction
Akut lungeskade (ALI) er en afgørende patologisk reaktion fra lungerne på infektiøse eller andre skadelige stimuli, som er præget af samtidig aktivering af koagulativt, fibrinolytisk og medfødt immunforsvar1. Neutrofiler hurtigt forstand mikrobielle samt intracellulære skader mønstre gennem Toll-lignende receptor (TLR) familie2,3,4. Neutrofiler frigiver præfabrikerede cytokiner og cytotoksisk granulatindhold, som derefter kan forårsage skader på væv i sikkerhedsstillelse. Den efterfølgende alveolar skade er skæmmet med sekundær celledød, der fører til frigivelse af molekyler som adenosin triphosphat (ATP)5, og dermed indstilling i en ond cirkel af immun-dysregulering.
Et uløst problem i forståelsen af ALI vedrører spørgsmålet om, hvordan skaden er indledt inden for alveolarmembranen. Elektrontransportkomplekset V, F1F0 ATP-synthase, er et mitokondrieprotein, der vides at udtrykkes allestedsnærværende, på celle (herunder endotel, leukocyt, epitel) plasmamembran under inflammation. Cellen cytoskeleton, som består af actin og tubulin, huser mange celleform og funktion modulerende samt mitokondrie proteiner, henholdsvis. Vi har for nylig vist, at blokade af ATP-synthase af et endogent molekyle, angiostatin, tavsheder neutrofil rekruttering, aktivering og lipopolysaccharid (LPS) induceret lungebetændelse6. Således kan både biokemiske (ATP-synthase) og immunmekanismer (TLR4) regulere alveolarbarrieren under lungebetændelse.
Udsættelse for ozon (O3), et miljøforurenende stof, svækker lungefunktionen, øger modtageligheden for lungeinfektioner, og korte lave niveauer af O3-eksponeringer øger risikoen for dødelighed hos personer med underliggende kardiorespiratoriske tilstande7,8,9,10,11,12,13,14. Således giver eksponering for fysiologisk relevantekoncentrationer af O 3 en meningsfuld model af ALI til undersøgelse af grundlæggende mekanismer forinflammation 7,8. Vores laboratorium har for nylig etableret en murine model af lav-dosis O3 induceret ALI15. Efter at have udført en dosis og tidsrespons på lave O3-koncentrationer observerede vi, at eksponering for 0,05 ppm O3 i 2 timer fremkalder akut lungeskade, der er præget af lunge ATP-synthasekomplekset V-underenhed β (ATPβ) og angiostatinudtryk, svarende til LPS-modellen. Intravital lunge billeddannelse afslørede uorganisering af alveolar actin mikrofilamenter angiver lungeskader, og ablation af alveolar septal reaktive iltarter (ROS) niveauer (angiver abrogation af baseline celle signalering) og mitokondriemembran potentiale (angiver akut celledød) efter 2 timers eksponering for 0,05 ppm O315, som korreleret med en heterogen lunge 18FDG retention16, neutrophil rekruttering og cytokin frigivelse, især IL-16 og SDF-1α. Hjemmebudskabet fra vores seneste undersøgelser er, at O3 producerer eksponentielt høj toksicitet, når de udsættes for koncentrationer under de tilladte grænser på 0,063 ppm over 8 timer (pr. dag) for menneskelig eksponering. Det er vigtigt, at der ikke er nogen klar forståelse af, om disse subkliniske O3-eksponeringer kan modulere TLR4-medierede mekanismer som ved bakteriel endotoxin17. Således har vi studeret en dual-hit O3 og LPS eksponering model og observerede immunforsvaret og ikke-immune cellulære tilpasninger.
Vi beskriver en omfattende fluorescerende mikroskopisk analyse af forskellige lunge- og systemiske karrosserirum, nemlig broncho-alveolar lavagevæsken (dvs. BAL), som prøver alveolar rum, lunge vaskulær perfusate (dvs. LVP), der prøver lungevakulturen og alveolar septal interstitium i tilfælde af en kompromitteret endotel barriere, venstre lunge cryosections, at se på hjemmehørende parenchymal og vedhængende leukocytter tilbage i lavaged lungevæv , perifert blod, som repræsenterer de cirkulerende leukocytter og bryst- og lårbenets knoglemarv, der prøver de proksimale og distale steder af henholdsvis hæmatopoietisk cellemobilisering under betændelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Undersøgelsen design blev godkendt af University of Saskatchewan's Animal Research Ethics Board og overholdt den canadiske Rådet for Animal Care retningslinjer for human dyrefoder. Seks-otte uger gamle mandlige C57BL/6J mus blev indkøbt. BEMÆRK: Aflive dyr, der udvikler alvorlig sløvhed, åndedrætsbesvær eller andre tegn på alvorlig nød før planlagt slutpunkt.
BEMÆRK: Forbered følgende: 27-18 G nålestumpet (afhænger af musens luftrørdiameter), passende størrelse PE-slange, så den passer til den stumpe nål (lav en PE-kanyle til hver mus), kanyle, 2 skarpe saks, 2 stumpe pincet (lille), 1 skarp pincet (lille), 3 1 mL sprøjter, mærket mikrofuge rør (for BAL, blod, vaskulære og knoglemarv perfusate indsamling) og mærket hætteglas (for væv fiksering), prøve poser / cryovials til vævsindsamling, slagterens bomuldstråd roll (skåret i tilstrækkelig størrelse ligaturer). Alle kemikalier, der anvendes til forsøgene, er angivet i materialeoversigten.
1. Ozon- og LPS-eksponeringer for induktion af murin-lungeskader
- Eksponering for ozon
- Forbered en brugerdefineret O3 induktionsboks. Tilsæt musefoder, vandflaske, berigelseslegetøj og rent sengetøj for at efterligne musenes boligmiljø.
BEMÆRK: Disse trin sikrer, at musene har fri adgang til mad og vand, når de anbringes i den brugerdefinerede induktionsboks, og hjælper med at lindre unødig stress. - Skift O3 kalibrator/generator "ON" (placeret mod indløbsporten) for at stabilisere UV-lampen før hånden (ca. 15 minutter før eksponeringer) og forbinde med in-line O3-skærm.
BEMÆRK: O3-skærmen skal i gennemsnit aflæse 0,05 ppm, som udtaget fra stikkontakten ved konstant kammerlufttemperatur (72 ±3 °F) og relativ luftfugtighed (50±15%). - Ved O3-eksponeringer skal mus forsigtigt placeres i den brugerdefinerede induktionsboks, og musene udsættes kontinuerligt for 0,05 ppm O3 i 2 timer.
- Forbered en brugerdefineret O3 induktionsboks. Tilsæt musefoder, vandflaske, berigelseslegetøj og rent sengetøj for at efterligne musenes boligmiljø.
- Anæstesi og intranasal LPS administration
- Der fremstilles 10 mg/mL lagre til ketamin og xylazin separat.
- Forbered en cocktail ved at blande 20 dele ketamin og 1 del af xylazin. Hvis musen vejer X g, injicere (X/200) mL af ketamin / xylazin cocktail i peritoneal hulrum. For en mus tilberedes 1 mL cocktail bestående af 1000 μL af 10 mg/mL ketaminbestand og 50 μL af xylazinbestanden. Bland godt ved pipettering op og ned i et mikrofuge rør.
BEMÆRK: Ketamin- og xylazinlagrene kan tilberedes en uge i forvejen. - Bedøve musene under let intraperitoneal (IP) ketamin (50 mg/kg)/xylazin (1 mg/kg) blanding (f.eks for en 25 g mus, injicere 0,125 mL af cocktail).
- Der fremstilles en LPS-opløsning på 1 mg/mL i saltvand, og opløsningen fyldes 50 μL i en pipette.
- Hold musen oprejst med ryggen/rygsiden på håndfladen, og hold ørerne med samme hånd. Placer nu 50 μL af LPS-opløsningen18 forsigtigt uden næsebor (dvs. 25 μL på hvert næsebor eller 50 μL i et næsebor; betyder ikke noget, så længe proceduren er hurtig) og lad musene indånde LPS-opløsningen.
- Indgyde kontrol mus med 50 μL steril saltvand.
Forsigtig: Må ikke overstige mere end 100 μL for instillation, som kan være dødelig. For mindre volumen (dvs. <50 μL), og der er risiko for kun nasal deposition. - Efter LPS administration, forsigtigt fastsætte musene, enten på deres mave eller ryggen på højen af strøelse med hovedet vinklet lidt nedad.
BEMÆRK: Denne orientering forlænger fastholdelsen af opløsningen i næsehulen19. - Ved 0, 2, 4, 24, 36 og 72 timer efter eksponeringen bedøves musene, dvs.
- Overhold musen, indtil den mister bevidstheden og den rigtige refleks (dvs. ikke vende tilbage, når de lægges i liggende position). Kontroller nu musen for dybde af anæstesi ved at overvåge vejrtrækningen (rytmiske brystudflugter) og puls, som skulle falde mærkbart efter 1-2 minutter.
- Dernæst skal du kontrollere for pedalreflekser, dvs. klemme et af bagbenscifrene og observere for tilbagetrækning af lemmerne som en refleks. Hvis musen reagerer, fyldes op med yderligere 0,1 mL injektioner eller mere efter behov.
BEMÆRK: For at opnå dyb anæstesi skal du huske på, at visse stammer eller fede mus normalt har en større mængde distribution og dermed let kan over doseres, hvis tilstrækkelig tid, hvis det ikke er tilladt for fuld anæstesi (som kan være omkring 10 minutter eller mere). Derfor kan nogle stammer være resistente over for anæstesi og kræver dermed flere top-ups. Denne viden erhverves efter mange praktiske observationer og erfaringer med mus af forskellig stamme og alder. Da der også blev udført nogle få pilotforsøg umiddelbart efter O3- og LPS-eksponeringer (dvs. på 2-timers-tidspunktet), inkluderede vi også nogle meget tidlige BAL-celleanalyser fra disse eksperimenter for at fremhæve de umiddelbare virkninger af den kombinerede O3-og LPS-eksponering.
2. Prøveindsamling
- Placer musen på kirurgisk bakke. Sæt nu forsigtigt smørende øjensalt på begge øjne for at undgå væsketab og desinficere musen med 70% ethanolspray.
- Lav små snit gennem de øvre og nedre hudmembraner med en saks for at afsløre luftrøret og brystkassen.
- Lav et snit lige under brystbenet og udsæt hjertet.
- Hjerte punktering
- Placer en 25G nål fastgjort til hepariniseret sprøjte i højre hjertekammer og trække blod ved hjerte punktering.
BEMÆRK: Blod trækker normalt med minimal stemplet trække, hvis tiden fra at udsætte hjertet til hjerte punktering er under et minut. Efter opsamling omkring 0,4-0,5 mL, kan man være nødt til at holde pause i et par sekunder, før man samler det resterende blod. Dette gøres for at lade hjertet pumpe eventuelle resterende volumen i højre ventrikel kammer. Ved udgangen af blodsamlingen, hjerte stopper for at pumpe. - Saml blodet og opbevares i mikrofugerør til videre behandling.
- Placer en 25G nål fastgjort til hepariniseret sprøjte i højre hjertekammer og trække blod ved hjerte punktering.
- Trakeostomi
- Brug forsigtigt pincet/stumpe pincet til at fjerne luftrøret fra overliggende væv. Brug behandskede hænder mere end de kirurgiske instrumenter for at undgå blødning. Hvis der siver meget blod, er der risiko for at forurene BAL-prøverne. Brug om nødvendigt vatpinde, men ikke foretrukket. Kimwipes er bedre alternativer.
- Skær gennem brystkassen for at afsløre lungerne. Igen, være forsigtig med ikke at skære brystbenet og intercostal arterierne eller den opstigende aorta; foretage mindre snit, mens du går gennem brystkassen)
- Pass en bomuld ligatur under luftrøret klip og lad som sådan for tiden.
- Klip luftrøret på et passende sted i distal 1/3rd del, der peger mod lungerne, for at give adgang til en 28 G tracheal kanyle.
- Sæt en 28 G PE kanyle (en minimal længde på 3-5 mm og distal ende trimmet for nem indføring) i luftrøret. Hold øje med slutningen af luftrøret før bifurcation og derefter trække omkring en mm tilbage for at undgå prøveudtagning kun enkelt lap.
- Fast, binde bomuld ligatur til at holde kanylen på plads. Må ikke kollapse kanylen.
- Broncho-alveolar lavage (BAL)
- Fyld 0,5 mL PBS i en 1 mL sprøjte.
- Nu injiceres der gradvist 0,5 mL PBS i kanylen ved hjælp af 1 mL sprøjte.
- Efter injektion af PBS suges sprøjten ud, så længe den ikke modstår sugningen.
BEMÆRK: Hvis der er modstand, mens BAL-væsken suges ud, indikerer det, at alveoler eller bronkialt væv kollapser. I dette tilfælde skal du trække kanylen tilbage med en minimal for at løsne kanylen danne vævets vægge. - Opsamles den indsugningsvæske i et mærket mikrofugerør og anbringes på is.
- Udfør yderligere to lavages på samme måde, der samler i samme hætteglas (dvs. i alt 0,5 X 3 = 1,5 mL lavage).
- Mål mængden af opsamlet BAL-væske. Lavage opsving bør være tæt på 90%.
- Lunge vaskulær perfusate (LVP)
- Skær den faldende thoracic aorta på et sted mellem bryst og abdominal halvdele, for at undgå enhver back-up af perfusate i lungerne, mens perfusing gennem højre ventrikel.
- Blot hulrummet nær cut aorta ende, fri for blod.
- Dernæst gennemgå lungerne med 0,5 mL rum-temp heparinized saltvand injiceres gennem højre hjertekammer.
- Opsamle vaskulær perfusate fra hulrummet i den afskårne ende af den faldende thoracic aorta, i en mikrofuge rør, placeret på is og måle dens volumen.
- Ligate den rigtige bronchus proksimal til sin forgrening fra luftrør (med bomuldstråd).
- In situ venstre lunge fiksering
- Tilslut en 1 mL sprøjte til tracheal kanyle, som er lang nok til at indsætte gennem det tidligere tracheal snit.
- Træk luft tilbage i sprøjten op til 0,6 mL mærket.
- Fyld derefter den resterende sprøjte (op til slutningen) med 2% paraformaldehyd ved stuetemperatur. Sørg for, at stemplet er klar til at springe ud uden at suge luft tilbage fra kanylen.
- Sæt sprøjten på et scotch-bånd på en opretstående beholder, målt op til 20 cm højde.
- Træk forsigtigt stemplet ud for at lade fikseringsflowet mod luftrøret. Hvis der er et par luftbobler i kanylen, skal du forsigtigt placere stemplet oven på sprøjten, og væsken begynder at flyde efter et par sekunder.
- Lad venstre lunge pustes op til sin samlede kapacitet in situ, i 5 minutter, fra en 20 cm højde, der danner en 20 cm vandsøjle.
- Under denne procedure skal du sørge for at beskytte de rigtige lungeflipper mod at komme i kontakt med paraformaldehyd, da dette vil påvirke downstream-assays.
- Placer foldet laboratorievæv til at absorbere enhver paraformaldehyd, der kan komme i kontakt med højre lunge lapper.
ADVARSEL: Paraformaldehyd er meget giftigt. Derfor må du ikke inhalere eller placere kontakt til udsatte dele af kroppen. Vær yderst forsigtig under håndteringen. - I løbet af paraformaldehyd instillationen skal du desinficere maven.
- Skær de højre lungeflipper af luftrøret, og sørg for at fjerne enhver tråd og sæt straks loberne i et mærket kryokin og smid det i flydende nitrogen til downstream molekylær / biokemisk cytokinanalyse / RT-PCR / vestlig blot analyse af lunge homogenat.
- Trim forsigtigt venstre lunge for bindevæv eller pleuralmembraner, og dyp den i 2% paraformaldehyd i 24 timer ved 4 °C.
- Integrer den faste lunge i paraffin i henhold til standard indlejringsprotokollen.
Forsigtig:Lungeprøverne må ikke overopvarmes. - Skær abdominal del og de-hud det fra bækken (hofte) knogle.
- Adskil venstre og højre lårben knogler fra bækken del, i en saltvand fyldt petriskål holdes på is.
- Sternal og lårben knoglemarv aspirat indsamling
- Rengør væv og muskler fra knoglerne ved hjælp af laboratorievæv.
- Saml ventral brystkasse og brystben i en saltvand fyldt Petri parabol holdes på is.
- Skær de distale og proksimale spidser af bryst- og lårbensbenene.
- Perfuse knoglerne 4 gange med 0,5 mL saltvand, ved hjælp af veludstyrede nåle (24 til 28 G) på 1 mL sprøjter, og indsamle fraktioner fra hver knogle i mærkede rør udstyret med filtre og placeret på is.
BEMÆRK: Nålemåleren varierer mellem dyrenes størrelse. Efter skylning skal lårbenet vise sig gennemsigtigt. - Når prøverne er blevet indsamlet, pose musen i en plastikpose og sat i et dyr slagtekroppe fryser til korrekt bortskaffelse, som pr retningslinjer for den institutionelle dyrefacilitet.
3. Prøvebehandling
- Antal (TLC) og forskelle (DLC)
- Centrifuge perifere blod-, BAL-, lungevaskulære perfusate- og knoglemarvsprøver (bryst- og lårben) i 10 minutter ved 500 g.
- Supernatanterne opsamles, lynfryses og opbevares ved -80 °C, indtil de analyseres nærmere.
- Cellerne rekonstitueres i mindst 200 μL PBS.
- Udfør TLC ved at tælle BAL, blod, lunge vaskulær perfusate og knoglemarvsceller på et hæmocytometer.
- Pletten yderligere 9 μL aliquot af BAL med en 1 μL blanding af calcein grøn og rød ethidium homodimer-1 til at kvantificere levende (grønne) celler på grund af intracellulær esterase aktivitet og eventuelle beskadigede BAL celler (i rødt) på grund af tab af plasmamembran integritet.
- Tilsæt 2% eddikesyre til lyse RBCs, i et 1:10 forhold for blod TLC og 1:2 ratio for lunge vaskulærtperfusate TLC.
ADVARSEL: Juster cellekoncentrationerne ved fortynding i PBS, hvis koncentrationen er mere end 1x106 celler pr. mL (meget vigtig for knoglemarvsprøverne). - Centrifuge cellerne til at forberede cytospins på dias og pletten som forklaret nedenfor for DDC'er.
BEMÆRK: Typisk kan man forberede to cytospins på et dias. Og efter 10-15 minutters lufttørring skal du fortsætte med farvningstrin. - Split den indsamlede BAL fra tre pilotmus pr. gruppe i to cytospins hver og pletten for actin/tubulin og mitokondrier med aktiv oxidativ fosforylering (reduceret mitotracker). Udnyt BAL fra yderligere tre mus til at opdele i to cytospins hver, for NK1.1/Gr1/CX3CR1 og ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin farvede dias. Split BAL fra yderligere tre mus i to cytospins hver til pletten for ATPα/Ly6G og CX3CR1/Siglec-F.
- Bronchoalveolar lavage (BAL) og Lunge vaskulær perfusat (LVP) total protein kvantificering
- For at kvantificere O3- og LPS-inducerede forbrændinger af vaskulær barriere eller det relative oncotictryk i de to lungerum (dvs. alveolar-septalen (interstitiel) og lungevakulær perfusate (vaskulær) rum) måles det samlede proteinindhold i de opsamlede væsker.
- Analysere de optøede supernatantfraktioner for deres samlede proteinkoncentration ved hjælp af en standard vaskemiddelresistent kolorimetrisk analyse.
- Bronchoalveolar lavage (BAL) og lunge vaskulær perfusate (LVP) kemokin analyse
- Derefter analysere kemokiner i BAL og lunge vaskulær perfusate (LVP) supernatants ved hjælp af en 33-plex magnetisk perle-baseret immunoassay. Dette vil informere om retningen af luftveje / interstitium vs vaskulære kemokin gradienter etableret efter kombineret eksponering.
- Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (reguleret ved aktivering, normal T-celle udtrykt og udskilles (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (stromal celle-afledt faktor 1), TARC (thymus og aktivering reguleret kemokin (TARC)), TECK (Thymus-Udtrykt Kemokine (CCL25)) og TNFα (tumor nekrose faktor alpha).
4. Cytospin farvning og lunge histologi
- Cytospin biokemisk farvning
- Omkrans cytospinerne med en hydrofobisk pen for at indeholde kemikalierne til inkubation under proceduren.
- Rehydrer cytospinerne i PBS i 5 minutter.
- Fastgør cytospinprøverne i 2% paraformaldehyd i 10 minutter, vask tre gange med PBS i 5 minutter hver.
- Permeabilize med iskold 70% acetone i 7 minutter og igen vaske tre gange med PBS i 5 minutter hver.
- Plet for actin og tubulin eller reduceret Mitotracker (inkuberes med en blanding på 2 μg/50 μL Alexa 488 konjugeret falloidin vist med grønt, og 2 μg/μL Alexa 555 konjugeret mus anti-α tubulin eller reduceret Mitotracker vist i rødt, henholdsvis) i 15 minutter.
BEMÆRK: Brug musenS IgG1 isotypekontrolantistof i en separat cytospin til at validere tubulin-farvningsprotokollen. Udfør de samme trin som forklaret fra 4.1.1 til 4.1.8, men for isotypekontrolelementer. - Fjern pletterne ved forsigtigt at vippe blandingen fra rutsjebanen. Inkuber dias med DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) i 5-10 min til plet kerner.
- Vask cytospins 3 gange med PBS i 5 min hver, coverslip med anti-fade montering medier og opbevare natten over i mørke ved stuetemperatur før billeddannelse.
- Tilegne billeder under et bredt felt opretstående mikroskop udstyret med et videnskabeligt kamera. Sørg for, at der er angivet ensartede tidsforsendelser for kameraet for de forskellige lysstofrør, når billeddiasene blinker.
- Cytospin immun-fluorescerende farvning:
- Omkrans cytospinerne med en hydrofobisk pen for at indeholde kemikalierne til inkubation under proceduren. Rehydrer cytospinerne i PBS i 5 minutter.
- Cytospinprøverne fastgøres ved at inkubere paraformaldehyd i 2 % i 10 minutter, vaske tre gange med PBS i 5 minutter hver.
- Permeabilize med 0,1% kold triton X-100 i 2 minutter, vask tre gange med PBS i 5 min hver.
- Dernæst blokerer Fc i 15 minutter ved at inkubere cytospinen med 1:50 fortynding af Fc-blokantistofbestanden (for at sikre, at det primære museantistof ikke krydsreagerer ikke-specifikt med musen Fc-antistoffer).
- Tip diasene for at fjerne Fc-blokken og skift til 1% BSA for og inkuber cytospinen med en blanding af 3 primære antistoffer af interesse (se tabel 1 for de forskellige kombinationer) i 30 minutter.
BEMÆRK: Sørg for at køre isotypekontrolantistoffer (inkuberes med en blandingsmus IgG1 og rotte IgG2b kappa primære antistoffer ved at udføre trin 4.2.1 til 4.2.9 og erstatte antistofferne med isotypekontroller) parallelt med tilsvarende sekundære antistoffer som beskrevet i vores nylige undersøgelse20. - Vask 3 gange med PBS i 5 min hver. Cytospins inkuberes med en blanding af passende designede sekundære antistoffer (se nærmere i tabel 1).
- Fjern pletterne ved forsigtigt at vippe blandingen fra diaset, inkuber med DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) i 5-10 minutter for at plette kerner. Vask 3 gange med PBS i 5 min hver.
- Coverslip med anti-fade montering medier og gemme natten over i mørke ved stuetemperatur før billedbehandling.
- Tilegne billeder under et bredt felt opretstående mikroskop udstyret med et videnskabeligt kamera. Sørg for, at der er angivet ensartede tidsfornelser for kameraet for alle fluorrørkanaler, når billeddiagnostiket glider.
- Hematoxylin og eosin (H&E) histologi
- Udfør modificeret H &E farvning3 på lunge kryo-sektioner for alle grupper.
- Billedanalyse
- Behandle og analysere billeddatafiler (.tiff) i fiji-billedj-open software (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
- Kontroller de nødvendige parametre (Område, Omkreds, Integreret tæthed, Figurbeskrivelser, Ferets diameter, Cirkularitet, Visningsetiket), der skal registreres under fanen Analyser og Angiv målinger.
- Ved hjælp af ROI Managerskal du manuelt skitsere omkring 50-200 celler i det flettede billedpanel ved hjælp af værktøjet "frihåndsvalg". Gem interesseområderne (ROI) med kommandoen Ctrl+T, og kopier de gemte ROM'er for hver celle over til alle fluorophorekanalerne.
- Tryk derefter på Ctrl+M for at måle de forudindstillede parametre for alle lysstofrør (f.eks. 405 nm (DAPI eller ATPβ i blåt), 488 nm (actin eller NK1.1 eller Ki-67 i grøn), 568 nm (tubulin eller Gr1 eller CD61 i rødt) og 633 nm (CX3CR1 eller angiostatin i magenta)).
- Gem filen Results som .csv under et passende navn, der repræsenterer analysen. Kopier resultaterne fra .csv fil over til et regneark og divider fluorescensintensiteten (FI) (som er kolonnen Rå integreret tæthed fra resultatfilen) for det farvede molekyle med DAPI eller CD61 FI, som pr. farvningsdesign. Disse nøgletal kaldes "NORMALISEREDE DAPI- eller CD61-nøgletal".
- Derefter afbildes disse normaliserede forhold, cirkularitet, celleomkreds og Feret-diameter for at evaluere enhver ændring i cellestørrelsen efter den kombinerede O3- og LPS-eksponering.
- Brug passende statistisk software til at kontrollere de indsamlede datas normalitet og til at teste null-hypotesen (se afsnittet om statistisk analyse nedenfor).
- statistisk analyse
- Udtrykke resultater som en gennemsnitlig ± SEM. Der blev anvendt mindst tre mus pr. gruppe.
- For kemokin dataanalyse, justere envejs ANOVA p-værdier for falsk opdagelse sats i henhold til Benjamini og Hoshberg korrektion.
- Analyser billedparametre, cellularitet, Feret-diameter, perimeter, DAPI eller CD61 normaliserede fluorescensintensitetsforhold ved Mann-Whitney U-test (til sammenligning af to grupper) eller Kruskal Wallis-test (til sammenligning af flere grupper), da disse data normalt ikke blev distribueret.
- I resten af billedeksperimenterne skal du analysere resultaterne ved hjælp af en envejsanalyse af varians efterfulgt af Sidaks mange sammenligninger. p-værdier <0,05 blev anset for betydelige.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kombineret O3- og LPS-eksponering fører til systemisk inflammation og knoglemarvsmobilisering ved 72 timer: Celletællinger i forskellige rum afslørede betydelige ændringer i perifert blod, og lårbenets knoglemarvs samlede celletal ved kombineret O3- og LPS-eksponering. Selv om kombinerede O3- og LPS-eksponeringer ikke fremkaldte nogen ændringer i det samlede antal BAL-celler (figur 1A) eller LVP-(figur 1B)celletal, præsenterede polymoromorkleare celler som den fremherskende celletype ved 24 (Figur 1F, Supplerende figur 1), 36 og 72 h efter eksponering. Bemærk, at der ikke er nogen siglec-f- og CX3CR1-farvning i polymorfoklede celler ved 24 timer i BAL cytospinbilledet(Figur 1F). Triple DAPI/CD11b/Gr1 farvning af BAL cytospins viste tilstedeværelsen af store CD11b- og Gr1-positive mononukleare celler, som er makrofager ved 0 timer, som ændres til mindre polymorfoklede celler, der viser punktlig Gr1staining, men blottet for CD11b farvning ved 4 timer (som vist i starten i supplerende 1F). Størstedelen af BAL-cellerne er polymorfosuclear og positive for både CD11b og Gr1, ved 24 timers posteksponering(supplerende figur 1).
Musene viste systemisk leukocytose ved 24 timer (3,3 gange vs. 0 h, p<0,05, figur 1C) efterfulgt af leukopeni ved 72 timer, som var præget af 13 gange lavere tal i perifert blod sammenlignet med 24 timer (p<0,01) og en 8,6 gange lavere sammenlignet med 4 timer (p<0,05) efter kombineret O3- og LPS-eksponering(figur 1C). Brystbenet knoglemarvsceller var også uændrede sammenlignet med 0 timer eller efter kombineret O3- og LPS-eksponering (Figur 1D). Antallet af lårbensbensmarv viste en sen 28,8 gange stigning på 72 timer sammenlignet med 0 timer (p<0,01, figur 1E) samt andre tidspoint (p<0,01, figur 1E). Visualisering af LVP og bryst- og lårbens knoglemarvsceller viste også ændringer i celletyperne til overvejende polymoromoklede celler(supplerende figur 1). De sternal knoglemarvsceller viste tegn på skade som det fremgår af ekstracellulært nukleart materiale. Lårbenet knoglemarv viste et højere antal CD11b og Gr1 positive celler (Supplerende Figur 1), som falder sammen med celletal.
Bals samlede proteinindhold var højest ved 36 timer efter kombineret O3- og LPS-eksponering: Kvantificering af de samlede proteiner i LVP- og BAL-rumene blev udført for at korrelere ozoninduceret lungeødem, dvs. Bal samlede protein var 4,5 gange højere ved 36 timer (p<0,05) sammenlignet med 4 timer (Figur 2A). LVP-proteinet var imidlertid uændret efter eksponering (figur 2B).
Kombineret O3 og LPS eksponering fremkalder stærke kemokin gradienter i lunge vaskulære rum og ikke BAL: Chemokine multiplex assays blev udført på både BAL og LVP supernatants. Bemærk, at de relative forskelle mellem disse to segmenter repræsenterer præferenceopbevaring i et bestemt rum. Eosinophil kemoattratant eotaxin-2 var 4,3 gange højere ved 4 timer i LVP-rummet sammenlignet med 0 timer (p<0,05, figur 3A). I BAL-rummet var eotaxin-2 3,2 gange lavere ved 4 timer sammenlignet med 0 timer (p<0,01, figur 3B). Bal eotaxin-2-niveauerne fortsatte med at falde konsekvent indtil 72 timer med 12,6 gange reduktion sammenlignet med 0 timer (p<0,01, figur 3B). Lymfocyt kemoattraktiv IL-2 var 10,1 gange højere ved 4 timer i LVP-rummet sammenlignet med 0 timer (p<0,05, Figur 3C). I BAL-rummet var IL-2 5,0 gange lavere ved 36 timer sammenlignet med 0 timer (p<0,05, Figur 3D). Bal eotaxin-2-niveauerne fortsatte med at falde konsekvent 5,9 gange reduktion ved 72 timer sammenlignet med 0 timer (p<0,05, Figur 3D).
Interessant nok blev mange kemokiner ændret ved 4 timer, i LVP og ikke BAL. De fleste af disse kemokiner viste beskeden, men betydelig, stigning i LVP-niveauet på 4 timer sammenlignet med senere tidspunkter. Selv om eotaxin-1-niveauerne ikke var høje efter eksponeringerne sammenlignet med 0 timer, men niveauerne var betydeligt høje ved 4 timer sammenlignet med 24 (2,7 gange, p<0,05) og 72 timer (5,0 gange, p<0,01, figur 4A) efter kombineret eksponering. Niveauerne af LVP TNFα var 3,4 gange højere ved 4 timer sammenlignet med 36 timer (p<0,05, figur 4B). Tilsvarende var LVP IFNγ 2,9 gange højere ved 4 timer sammenlignet med 72 timer (p<0,05, figur 4C). CX3CL1-niveauerne var også høje ved 4 timer sammenlignet med 24 (1,7 gange, p<0,05), 36 (1,6 gange, p<0,05) og 72 timer (2,2 gange, p<0,01) efter kombineret eksponering (Figur 4D). CCL27-niveauerne viste højere niveauer ved 4 timer samt sammenlignet med 24 (2,7 gange, p<0,05), 36 (3,9 gange, p<0,01) og 72 timer (2,9 gange, p<0,05) efter kombineret eksponering (Figur 4E).
Nogle kemokiner havde en stærk tilstedeværelse i LVP på 4 timer efter kombineret eksponering, og ikke ændret i BAL før og efter eksponering, hvilket indikerer en stærk kemokinrespons fra lungekapillærerne. Med 4 timer, IL-16 LVP niveauer var 3,4 gange sammenlignet med 0 timer (p<0,01), 3,2 gange sammenlignet med 24 timer (p<0,01), 3,2 gange sammenlignet med 24 timer (p<0,01), 3,2 gange 4,5 gange sammenlignet med 36 timer (p<0,01) og 4,6 gange sammenlignet med 72 timer (p<0,01) efter kombineret eksponering(figur 4F). Med 4 timer, den neutrofile kemokine, CXCL5 LVP-niveauer var 2,0 gange sammenlignet med 0 timer (p<0,01), 4,7 gange sammenlignet med 24 timer (p<0,01), 2 2 gange sammenlignet med 36 timer (p<0,01) og 2,7 gange sammenlignet med 72 timer (p<0,01) efter kombineret eksponering(figur 4G). Med 4 timer, CXCL10 LVP niveauer var 2,3 gange sammenlignet med 0 timer (p<0,01), 2,1 gange sammenlignet med 24 timer (p<0,05), 2 5 gange sammenlignet med 36 timer (p<0,01) og 2,7 gange sammenlignet med 72 timer (p<0,01) efter kombineret eksponering(figur 4H). Ved 36 timer var neutrofil kemokin, SDF1α LVP-niveauerne 4,2 gange sammenlignet med 0 timer (p<0,01), 2,9 gange sammenlignet med 24 timer (p<0,05), 6,8 gange sammenlignet med 72 timer (p<0,01) efter kombineret eksponering (figur 4I). Ved 4 timer var MIP3β LVP-niveauerne 2,3 gange sammenlignet med 0 timer (p<0,05) og 2,3 gange sammenlignet med 72 timer (p<0,05) efter kombineret eksponering(figur 4J).
Kombineret O3- og LPS-eksponering fremkalder nekrose, forstyrrer cellulær cytoskeletal, plasmamembran og mitokondrieintegritet: Da de opdelte leukocyttaler og proteinindhold ikke korrelerede med LVP-kemokingradienterne, blev det vigtigere at visualisere cellerne fra disse rum. Ex vivo actin/tubulin farvning af baseline (0 h) BAL-celler viste tilstedeværelse af kortikal actin, stressfibre samt lamellipodi (vist med grønt, figur 5 venstre overpanel) og mikrotubulenetværk (vist med rødt, figur 5 venstre overpanel), der faldt sammen med reduceret mitotracker farvning, der indikerer tilstedeværelse af aktive mitokondrier (vist med rødt, figur 5 venstre nederste panel). Mere end 95% af BAL-cellerne var mononukleare ved baseline. Ved 4 timer viste BAL-celler ekstracellulært nukleart materiale, punktlig cytoplasmisk actin farvning blottet for lamellipodi og reduceret kortikal actin farvning (vist med grønt, Figur 5 højre overpanel), pustet mikrotubule netværk (vist med rødt, Figur 5 højre øverste panel), der ikke svarede til den reducerede mitotracker farvning (vist med rødt, Figur 5 venstre højre panel). DAPI normaliseret actin fluorescerende intensitet analyse viste en 3,7 gange fald i forholdet angiver reduktion i actin farvning på 4 timer efter eksponering (p<0,01, Figur 6A). På samme måde reducerede DAPI's normaliserede fluorescerende intensitet også med 1,5 gange efter eksponering (p<0,01, Figur 6B), hvilket indikerer en reduktion i tubulin farvning. Tabet af lamellipodia var tydeligt med en stigning i cirkulariteten af BAL cellulære cytoskeleton straks, dvs<. Figur 6C) og 4 h (p<0,05, figur 6C) efter eksponering sammenlignet med 0 timer og et fald i cytoskeletal cirkularitet ved 24 (p<0,05) og 36 h (p<0,01) efter eksponering sammenlignet med 0 h (figur 6C).
Op til 24 timer var BAL-cellerne fra den kombinerede eksponering dobbelt positive for calcein (i grøn, figur 7), der indikerer tilstedeværelse af aktiv esteraseaktivitet, og ethidium homodimer (i rødt, figur 7), hvilket indikerer, at selv om nogle celler var døde (røde), blev flertallet delvist kompromitteret celler. Ved 36 timer var BAL-cellerne stort set levedygtige (grønne), hvilket indikerer udskiftning af de kompromitterede celler med leukocytter rekrutteret fra andre systemiske rum (Figur 7).
Specifik ATPα og Ly6G farvning af BAL-cellerne afslørede diskret intracellulær lokalisering (Film 1 og 2) af både proteiner i alveolar makrofager samt neutrofiler efter eksponering (Figur 7). Den kombinerede eksponering førte til en reduktion af DET NORMALISEREDE DAPI-lysstofindhold i ATPα (figur 7, 8A) og en stigning i det intracellulære Ly6G-proteinindhold (Figur 7, Figur 8B, Film 1 og 2). Reduktion i ATPα farvning, ved 24 timer efter eksponering, korreleret med lavere tubulin og til en vis grad reduceret mitotracker farvning. Vi observerede også anukleare ATPα positive cellelegemer efter eksponering, som kunne være blodplader. Vi bekræftede dog ikke vores resultater. Ved 2 timer observerede vi mindre mononukleare BAL-celler (p<0,01 Figur 8C, p<0,01 Figur 8D) sammenlignet med 0 timer, men ved 4 timer var de mononukleare celler større (p<0,01 Figur 8C, p<0,01 Figur 8D) sammenlignet med 0 timer. Ved 24 (p<0.01 Figur 8C, p<0.01 Figur 8D) og 36 timer (p<0.01 Figur 8C, p<0.01 Figur 8D) blev BAL-cellerne gradvist mindre på grund af et skift i retning af polymoromorkleare celler sammenlignet med 0 h.
Immunophenotyping af BAL-celler afslørede forbigående udtryk for NK1.1, ATP β og Ki-67 og vedvarende udtryk for Gr1, CX3CR1 og angiostatin positive BAL-celler efter kombineret O3- og LPS-eksponering: Immunofluorescent farvning af det første sæt BAL-cytospiner blev normaliseret til DAPI-farvning. Der var en stigning i de cellulære NK1.1 positive celler ved 24 timer (p<0,05 vs 0 h, Figur 9, 10A). Ved 36 timer havde BAL-cellerne lavere cellulær NK1.1 fluorescerende intensitet (p<0,01 vs. 0 og 24 timer, figur 9, 10A). Den cellulære Gr1-lysstofrørsintensitet var højere ved 24 timer (p<0,01 vs. 0 h, figur 9, 10B) samt 36 timer (p<0,01 vs. 0 h, figur 9, 10B). Tilsvarende var den cellulære CX3CR1-lysstofrørsintensitet højere ved 24 timer (p<0,01 vs. 0 h, figur 9, 10C) samt 36 timer (p<0,01 vs. 0 h, figur 9, 10C).
Når den er normaliseret til cellulær CD61, som også er allestedsnærværende i udtrykket, afslørede en stigning i den cellulære ATPβ fluorescerende intensitet ved 24 timer (p<0,01 vs 0 h, Figur 9, 10D) og et fald i den cellulære ATPβ fluorescerende intensitet ved 36 h (p<0,01 vs 0 og 24 h, Figur 9, 10D). Især viste ATPβ overvejende nuklear lokalisering på 24 timer sammenlignet med perifer lokalisering ved 36 timer(figur 9). Den cellulære fluorescerende intensitet af BAL Ki-67, en indikator for cellulær spredning, var højere ved 24 timer (p<0,01 vs 36 h, Figur 9, 10E) sammenlignet med 0 og 36 h. Niveauerne lå under basisniveauet ved 36 timer (p<0,01, figur 9, 10E), sandsynligvis på grund af højere polymorfo-nukleare CD61 vs Ki-67 udtryk ved 36 h ( Figur9). Endelig var den cellulære fluorescerende intensitet af BAL angiostatin konsekvent høj ved både 24 og 36 timer (p<0,01 vs. 0 h, figur 9, 10F), hvilket indikerer en specifik stigning i dette metalloproteinase kløvede plasminogenfragment under lungeinflammatorisk respons.
Kombineret eksponering giver udbredt lungeskade: Lunge histologi viste, at den kombinerede eksponeringer producere langvarig skade på lungerne som set i H &E farvede cryosections (Figur 11). Selv om der forventedes bronchiolar- og alveolar-septalskader, var det overraskende at observere endotelskader på større fartøjer ved 36 timer efter eksponering(figur 11). Der var klæbende intravaskulære leukocytter, pletter af leukocytaggregater (herunder neutrofiler) i de beskadigede alveolar septal- og peri-bronchiolar-regioner(figur 11).
Figur 1: Antal opdelte leukocyttaler: A) Broncho-alveolar lavage (BAL) samlede leukocyttal ved 0 (dvs. basislinje), 4, 24, 36 og 72 timer efter kombineret 0,05 ppb ozon (O3)og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. B) Lungevakulær perfusat (LVP) samlet leukocytkoncentration ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 timer efter kombineret 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. C) Perifer blod (PB) total leukocytkoncentration ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 timer efter kombineret 0,05 ppb ozon (O3)og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. D) Sternal knoglemarv (BM) total leukocytkoncentration ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 timer efter kombineret 0,05 ppb ozon (O3)og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. E) Lårbenets knoglemarv (BM) total leukocytkoncentration ved 0 (dvs. baseline), 4, 24, 36 og 72 timer efter kombineret 0,05 ppb ozon (O3)og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. For graferne A-E er 0 timer repræsenteret i blåt, 4 timer i rødt, 24 timer i grønt, 36 timer i lilla og 72 timer i orange datapunkter; * p<0,05 og ** p<0,01. F) Repræsentativ BAL cytospin glide fra 24 timer eksponering, der viser mononukleare og polymoromorferare celler, når farves til kerner med DAPI (i blåt), CX3CR1 (i grøn) og Siglec-F (i rødt). Bemærk, at fletningen af CX3CR1 og Siglec-F viser sig som orange-gul. Størstedelen af mononukleare celler er positive for Siglec-F, som er karakteristisk for alveolar makrofager. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Samlet proteinkvantificering: A) Bronchoalveolar lavage (BAL) samlet proteinindhold og B) Lungevakulær perfusat (LVP) samlet proteinkoncentration blev anslået vedPierce 660 nm proteinanalyse (Thermoscientific, IL, USA). For graferne A-B er 0 h repræsenteret i blåt, 4 timer i rødt, 24 timer i grønt, 36 timer i lilla og 72 timer i orange datapunkter; * s<0,05. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Lunge-Eotaxin-2- og IL-2-kemokingradienter: Ud af de 33 kemokiner to kemokiner, der blev væsentligt ændret i lungevaskulær perfusate (LVP) og bronchoalveolar lavage (BAL) og væske efter kombineret 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus A) LVP eotaxin-2, B) BAL eotaxin-2, C) LVP IL-2 og D) BAL IL-2. Data blev analyseret af envejs-anova og p-værdi for falsk opdagelse sats af flere variabler blev justeret som pr Benjamini og Hoshberg korrektion. For graferne A-D er 0 timer repræsenteret i blåt, 4 timer i rødt, 24 timer i grønt, 36 timer i lilla og 72 timer i orange datapunkter. Parvise sammenligninger blev analyseret efter Bonferronis korrektion. * repræsenterer p<0,05, ** repræsenterer p<0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Lungevakulære perfusate kemokinkoncentrationer: Koncentrationerne af yderligere ti kemoketter blev ændret, men kun i lungevaskulær perfusate (LVP) rum. A) Eotaxin-1, B) TNFα, C) IFNγ, D) CX3CL1, E) CCL27, F) IL-16, G) CXCL5, H) CXCL10, I) SDF1α og J) MIP3β. For graferne A-J er 0 h repræsenteret i blåt, 4 timer i rødt, 24 timer i grønt, 36 timer i lilla og 72 timer i orange datapunkter. Parvise sammenligninger blev analyseret efter Bonferronis korrektion. * repræsenterer p<0,05, ** repræsenterer p<0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Bronchoalveolar lavage (BAL) cytospin actin/tubulin og reduceret mitotracker farvning: Repræsentative billeder afactin/tubulin farvede BAL cytospins fra A) 0 h og B) 4 timer efter kombineret 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. Bemærk, at DAPI er vist med blåt, actin i grøn og tubulin i rødt. Repræsentative billeder af brændt mitotracker farvede BAL cytospins fra A) 0 h og B) 4 timer efter kombineret 0,05 ppb ozon (O3) og 50 μg intranasal LPS eksponering for mus. Bemærk, at DAPI vises med blåt og reduceret mitotracker med rødt. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Bronchoalveolar lavage (BAL) cytoskeletal protein og cirkularitetsanalyse: BAL cytospins farves til actin og tubulin blev analyseret for DAPI normaliserede parametre, dvs. B) Tubulin til DAPI-fluorescerende intensitetsforhold (FI) ved 0 og 4 timer og C) BAL-cellecellulæritet ved 0 (n=75 celler), 2 (n=105 celler), 4 (n=66 celler), 24 (n=31 celler), 36 (n=154 celler) h. Da der også blev udført nogle få pilotforsøg umiddelbart efter O3- og LPS-eksponeringer,dvs. For graferne A-C er 0 timer repræsenteret i blåt, 2 timer i rødt, 4 timer i grønt, 24 timer i lilla og 36 timer i orange datapunkter. * repræsenterer p<0,05, ** repræsenterer p<0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Bronchoalveolar lavage (BAL) intracellulær og plasmamembranstatus: BAL-celler blev plettet for vitale pletter, calcein (i grøn) og ethidium homodimers/EthHD (i rødt) som vist i repræsentative øvre billedpaneler ved A) 0, B) 24 og C) 36 timer efter O3- og LPS-eksponeringer. Skalastang = 200 μm. BAL cytospins blev immunostained for DAPI (i blåt), ATPα (i grøn) og Ly6G (i rødt). Repræsentative billeder vises i de nederste billedpaneler ved A) 0 og B) 24 timer efter O3- og LPS-eksponeringer. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Bronchoalveolar lavage (BAL) mitokondrieprotein ATPα, lysosomalt protein Ly6G og analyse af cellestørrelse: Immunostained BAL-celler blev normaliseret for DAPI til beregning A) ATPα til DAPI-fluorescerende intensitet (FI) og B) Ly6G til DAPI FI-forholdet ved 0 og 24 timer efter O3- og LPS-eksponeringer. Immunostained BAL celler blev også analyseret for deres A) længste dvs fritte diameter og B) perimeter, ved 0, 2, 4, 24 og 36 timer efter O3 og LPS engagementer. For graferne A-D er 0 timer (n=119 celler) repræsenteret i blåt, 2 timer (n=105 celler) i rødt, 4 timer (n=66 celler) i grønt, 24 timer (n=309 celler) i lilla og 36 timer (n=154 celler) i orange datapunkter. * repræsenterer p<0,05, ** repræsenterer p<0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Bronchoalveolar lavage (BAL) intracellulær fænotyping: BAL-celler blev immunostained for DAPI (i blåt), NK1.1 (i grøn), Gr1 (i rødt) og CX3CR1 (i magenta) som vist i repræsentative øvre billedpaneler ved A) 0, B) 24 og C) 36 timer efter O3- og LPS-eksponeringer. Skalastang = 50 μm. BAL cytospins blev immunostained for ATPβ (i blåt), Ki-67 (i grøn), CD61 (i rødt) og angiostatin (i magenta). Repræsentative billeder vises i de nederste billedpaneler ved A) 0, B) 24 og C) 36 timer efter O3- og LPS-eksponeringer. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Bronchoalveolar lavage (BAL) mitokondrieprotein ATPβ, lysosomalt protein Gr1, intracellulær CX3CR1- og angiostatinanalyse: Immunostained BAL-celler blev normaliseret for DAPI til beregning A) NK1.1 til DAPI-fluorescerende intensitetsforhold (FI), B) Gr1 til DAPI-FI-forhold og C) CX3CR1 til DAPI FI-forhold ved 0, 24 og 36 timer efter O3- og LPS-eksponeringer. Immunostained BAL-celler blev normaliseret for CD61 til beregning A) ATPβ til DAPI-fluorescerende intensitet (FI) forhold B) Ki-67 til DAPI FI-forhold og B) Angiostatin (ANG) til DAPI FI-forholdet ved 0, 24 og 36 timer efter O3- og LPS-eksponeringer. For graferne A-F er 0 timer (n=21 celler) repræsenteret i blåt, 24 timer (n=796 celler) i rødt og 36 timer (n=2692 celler) i grønne datapunkter. * repræsenterer p<0,05, ** repræsenterer p<0,01. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Lunge hæmatoxylin og eosin (H&E) histologi. Ozon (O3) og LPS induceret lunge cryosection H &E histologi ved 0, 24 og 36 timer efter kombineret O3 og LPS eksponeringer. Regioner med alveolær epitelskader er præget af solide sorte pile og endotelskader af sorte pilespidser. Gule stjerner (*) repræsenterer pletter af leukocytter i alveolar septal regioner. A = alveolarplads, B = bronkus, V = vaskulatur, skalastang = 100 μm for venstre billedpaneler og 50 μm for billedpaneler i højre side. Klik her for at se en større version af dette tal.
| S.No. | Primært antistof | Invitrogen Sekundært antistof |
| 1 | Mus anti-NK1.1 IgG2a kappa (klon PK136), Invitrogen Katalog nr. 16-5941-82 | Alexa 488 konjugerede ged anti-mus IgG (H + L), Catalog No. A11002 |
| 2 | Rotte anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (klon RB6-8C5), Invitrogen Katalog nr. 53-5931-82 | Alexa 568 konjugerede ged anti-rotte IgG (H + L), Catalog No. A11077 |
| 3 | Kanin anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880), Invitrogen Katalog nr. 14-6093-81 | Alexa 633 konjugerede ged anti-kanin IgG (H + L), Catalog No. A21070 |
| 4 | Mus anti-ATP5A1 IgG2b (klon 7H10BD4F9), Invitrogen Katalog nr. 459240 | Alexa 488 konjugerede ged anti-mus IgG (H + L), Catalog No. A11002 |
| 5 | Rotte anti-Ly6G IgG2a kappa (klon 1A8), Invitrogen Katalog Nr. 16-9668-82 | Alexa 568 konjugerede ged anti-rotte IgG (H + L), Catalog No. A11077 |
| 6 | Mus anti-ATP5β IgG2b (klon 3D5AB1), Thermofisher Catalog No. A-21351 | Alexa 350 konjugerede ged anti-mus IgG (H + L), Catalog No. A11045 |
| 7 | Rotte anti-Ki-67 (klon SolA15) IgG2a kappa, Invitrogen Katalog nr. 14-5698-82 | Alexa 568 konjugerede ged anti-rotte IgG (H + L), Catalog No. A11077 |
| 8 | Armensk hamster anti-CD61 (klon 2C9. G2) IgG1 kappa, BD-katalognr. 553343 | Alexa 568 konjugerede ged anti-hamster IgG (H +L), Katalognr. A21112 |
| 9 | Kanin anti-angiostatin (mus aa 98-116) IgG, Abcam Catalog No. ab2904 | Alexa 633 konjugerede ged anti-kanin IgG (H + L), Catalog No. A21070 |
Tabel 1 — De: Primære og sekundære antistofkombinationer, der anvendes til farvning af cytospiner fremstillet af prøverne.
| Udlæsning | Bal | LVP | Pb | SBM | FBM |
| Tlc | * | * | + ved 24 timer; - ved 36, 72 timer | + ved 72 timer | |
| Neutrofiler | + ved 24, 36, 72 timer | + ved 24 timer | * | + ved 4, 24, 36, 72 timer | + ved 4, 24, 36, 72 timer |
| protein | + ved 36 timer | * | n.d. | n.d. | n.d. |
| Chemokine profil | - For eotaxin-2, IL-2 ved 4, 24, 36, 72 h | + for Eotaxin-1/2, IL-2, TNFα, IFNγ, CX3CL1, CCL27, IL-16, CXCL5, CXCL10, MIP3β ved 4 timer; + for SDF1α ved 36 timer | n.d. | n.d. | n.d. |
| Cellestørrelse | + ved 4 timer; - ved 24, 36 timer | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPα | - ved 24 timer | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| NK1.1/Ki-67 | + ved 24 timer | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
| ATPβ/Gr1/CX3CR1/ANG | + ved 24, 36 timer | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
Tabel 2 — De tolv Et omfattende resumé af undersøgelsens vigtigste resultater i forskellige segmenter. * betegner ingen ændring, + betegner en stigning og - betegner et fald i de målte parametre. BAL betegner broncho-alveolar lavagevæske, LVP betegner lungevaskulær perfusate, PB betegner perifert blod, SBM betegner brystbenet knoglemarv og FBM betegner lårben knoglemarvsrum.
Supplerende figur 1: Immunosang fra Gr1 og CD11b: Repræsentative billeder fra DAPI (i blåt), Gr1 (i grøn) og CD11b (i rødt) fluorescerende immunostained cytospin dias af lunge vaskulær perfusate (LVP), sternal knoglemarv (BM) og lårben knoglemarv (BM) rum på 0, 4 og 24 timer efter kombineret O3 og LPS eksponeringer. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende film 1 Tredimensionelt afsmeltet volumen af BAL-makrofager fra 0 h tidspunkt (dvs. basislinje), der viser kernen (vist med blåt) og immunostained for ATPα (vist med grønt) og Ly6G (vist med rødt). Klik her for at downloade denne film.
Supplerende film 2: Tredimensionelt afsmeltet volumen af BAL-makrofager fra 24 timer tidspunkt efter kombineret O3- og LPS-eksponering, der viser kernen (vist med blåt) og immunostained for ATPα (vist med grønt) og Ly6G (vist med rødt). Bemærk tilstedeværelsen af anukleare ATPα positive organer samt en fragmenteret celle. Klik her for at downloade denne film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De metoder, der præsenteres i den aktuelle undersøgelse fremhæve nytten af flere rum analyse til at studere flere cellulære begivenheder under lungebetændelse. Vi har sammenfattet resultaterne i tabel 2. Vi og mange laboratorier har grundigt studeret murine reaktion intranasal LPS instillation, som er præget af hurtig rekruttering af lunge neutrofiler, som topper mellem 6-24 timer efter hvilken opløsning spark i. Og for nylig har vi vist, at subklinisk O3 (ved 0,05 ppm i 2 timer) alene kan fremkalde betydelig lungeskade i C57BL/6NJ sub-strain15, som er præget af opdeling af neutrofiler i lungevakulære rum, mens beskadigede makrofager og snavs blev observeret i BAL, hvilket indikerer det inflammatoriske potentiale i O3. I denne model observerede vi fraværet af neutrofiler i alveolarrummet som følge af O3-inducerede alveolar epitelskader og deraf følgende fagagocytose ved alveolar makrofagerne. Ikke alene observerede vi ekstracellulært DNA og snavs i O3-modellen, BAL-makrofagerne var dysmorfe, som korrelerer med høje IL-16-niveauer, en alarmin, der normalt frigives af døende neutrofiler. Derfor er det vigtigt at forstå, om disse subkliniske O3-niveauer kan påvirke immunresponset i ellers robust C57BL/6J-understamme, som bemærket med supra-fysiologiskE O3-niveauer 21. Vi bemærkede, at kombineret O3 og intranasal bakteriel endotoxin induceret neutrofil rekruttering i lunge-såvel som systemiske rum, præget af tilstedeværelsen af beskadigede neutrofiler i BAL, lunge vaskulær perfusate, brystbenet og lårben knoglemarv rum starter ved 4 timer, som forblev høj på 24, 36 og 72 timer. Den cellulære skade var repræsenteret som tab af kortikale actin og lamellipodia og stigning i cellestørrelse i BAL leukocytter; neutrofiler, analyseret i BAL-rummet, udviste signifikant reduceret positiv reaktivitet til mikrotubule, ATP-synthasekompleks V-underenhed α (ATPα) og aktiv mitokondrieplet. Lungerne tilpasser sig denne kombinerede eksponering ved at opregulere udtrykket af cellulær ATP-synthasekompleks V-underenhed β (ATPβ) samt af ATPβ ligand, angiostatin (tabel 2).
Et vigtigt aspekt af at studere inflammation er at forstå cellulær nekrose sammen med kemokin gradienter. Det var interessant at bemærke, at de samlede leukocyttal ikke var forskellige undtagen i perifert blod og lårbenet knoglemarvsrum. Disse observationer førte os til at undersøge de cellulære cytoskeletale mønstre, størrelse og immunophenotyping. Vi observerede et tab af lamellipodi og aktiv mitokondrier i BAL-celler, der indikerer cellulær skade. Kortikal actin organisation er et vigtigt element i inter-cellulære signalering og den deraf følgende barriere egenskaber. Cytoskeletal uorganisering er således en god markør for celleskader, når nekrose ikke er så indlysende at vurdere. Selv ved 36 timer havde BAL-cellerne kompromitteret plasmamembranen som angivet ved ethidium homodimer farvning. Umiddelbart efter den kombinerede eksponering, neutrofiler i BAL viste Gr1 positivitet, men en hovedsagelig negativ farvning for CD11b, som lokaliserer mod forkant og hjælpemidler i alveolar septal crawling22. Således fører de kombinerede eksponeringer til akkumulering af atypiske neutrofiler uden CD11b-proteinet. LPS fremkalder ikke nedregulering af CD11b. Således er denne funktion sandsynligvis et resultat af O3 induceret skade på neutrofiler.
BAL-cellerne havde en unik proteinsignatur med højere NK1.1,Ki-67 og ATPβ farvning ved 24 timer sammenlignet med 0 h (tabel 2). BAL-cellerne havde højere ekspression af Gr1, CX3CR1 samt angiostatin, ved 24 samt 36 timer sammenlignet med 0 h (Tabel 2). Disse resultater blev underbygget af tilstedeværelsen af gradvist mere Gr1 positive neutrofiler på BAL, ved 24 og 36 timer, efter eksponering (tabel 2). Tilstedeværelsen af positive celler af typen NK1.1, CX3CR1 og Gr1, ved 24 timer, indikerer rekruttering af både mononukleare og polymoromokleare celler i BAL. Blandt de mononukleare celler dominerede de CX3CR1 positive celler ved 36 timer, hvilket indikerer tilstedeværelse af enten interstitielle makrofager, blodplader eller monocytafledte makrofager. Inddragelsen af både Ki-67 og angiostatin som markører informeret os om den proliferative vs anti-angiogenic miljø, henholdsvis i BAL. Således fører de kombinerede O3- og LPS-eksponeringer til spredning af sandsynligvis makrofager efterfulgt af et antiangiogent miljø på grund af neutrofil infiltration. Den forbigående stigning i ATPβ farvning kan tyde på en vigtig tilpasning til en øget overlevelse af BAL leukocytterne ved 24 timer. Det skal bemærkes, at ATPβ kan binde sig til angiostatin og hæmme langvarig overlevelse6,23, hvilket faktisk afspejles i det lavere Ki-67-indeks ved 36 timers posteksponering.
Selvom BAL-proteinet var højest ved 36 timer og ikke andre tidspunkter, viste lungevakulær perfusate ikke nogen ændringer i proteinkoncentrationen før eller efter eksponering. Det er muligt, at det vaskulære rum ikke blev påvirket, men dette er sandsynligvis forvirret på grund af oxidation af elektronrige aminosyrer som methionin, histidin og cystein af O3 inducerede frie radikaler og deraf følgende overfladeaktive proteiner (SP-A, SP-B) nedbrydning samt vaskulær lækage24,25,26. Kvantificering af BAL IgM, BAL overfladeaktive proteiner, BAL albumin eller farvestof ekstravasation (ved hjælp af Evans blå eller fluorescein iso-thiocyanat (FITC) dextran) er alternative metoder til at vurdere epitel-og endotel integritet.
Interessant, lunge vaskulær perfusate niveauer af eotaxin-2 og IL-2 blev akut rejst på 4 timer tid-punkt. BAL eotaxin-2- og IL-2-niveauerne blev reduceret betydeligt efter eksponering, hvilket indikerer enten nedbrydning i alveolarrummet eller fastklemning i lungevakulaturen. Flere kemoketter analyseret i lungevakulær perfusate afslørede højere niveauer af eosinofil kemokin (eotaxin-1), TNFα, IFNγ, lymfeknude afledt mononuklear celle kemokiner (CX3CL1, CXCL10, CCL27, MIP3β), epitel afledt neutrofil kemokin (CXCL5), og alarmin (IL-16) frigivet efter sekundær nekrose af neutrofiler27, men kun ved 4 timer efter eksponering. Ved 36 timer, knoglemarven afledt pan-leukocyte kemokine, SDF1α28, var højere i lungerne vaskulær perfusate. Knoglemarven afledtE SDF1α koncentrationer korrelerer med cytologi fund, hvorved CD11b og Gr1 positive celler er rigelige på 24 og 36 timer efter eksponering. Kemokin- og cytologiske profiler afspejler således en betydelig leukocytmobilisering fra knoglemarvsrummene (tabel 2).
Vores dyremodel og forskningsresultater er afgørende for at huske på den virkelige verden situationer, hvor levende væsener i bymiljøer sandsynligvis er udsat for sådanne subkliniske O3 og smitsomme stoffer8. Vores murine model fungerer som en let tilgængelig prototype, der kan reproduceres i niveau-2 indeslutning labs til at studere lunge-og ekstra-lungemekanismer af invasive celledød og infektioner, som det er tilfældet med COVID-19 infektioner29. Fremtidige undersøgelser bør rettes mod at visualisere reparationen eller opfølgningen i den sene fase samt kronisk eksponering for at undersøge de langsigtede cellulære tilpasninger. For omfattende undersøgelser af lungebetændelse, der involverer levende organ15 og dyr16,30,31 billeddannelsesteknikker, kan det nuværende slutpunktsundersøgelsesdesign give afgørende indsigt i værtsresponset på kombineret lavdosis O3 (celledød) og LPS (immunstimulation) og dermed dechifrere mekanismerne for akut lungeskade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter eller afsløringer at gøre.
Acknowledgments
Den gennemførte forskning er finansieret af præsidentens NSERC tilskud samt start-up midler fra Sylvia Fedoruk canadiske Center for Nuclear Innovation. Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation er finansieret af Innovation Saskatchewan. Fluorescens imaging blev udført på WCVM Imaging Centre, som er finansieret af NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) og Manpreet Kaur (MSc Student) blev finansieret af start-up midler fra Sylvia Fedoruk canadiske Center for Nuklear Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 33-plex Bioplex chemokine panel | Biorad | 12002231 | |
| 63X oil (NA 1.4-0.6) Microscope objectives | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 conjugated goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 conjugated phalloidin | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 conjugated mouse anti-α tubulin clone DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-hamster IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Armenian hamster anti-CD61 (clone 2C9.G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Invitrogen | D1306 | aliquot in 2 µl stocks and store at -20°C |
| Inverted fluorescent wide field microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamine (Narketan) | Vetoquinol | 100 mg/ml | Dilute 10 times to make a 10 mg/ml stock |
| Live (calcein)/Dead (Ethidium homodimer-1) cytotoxicity kit | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Mouse anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| Mouse anti-NK1.1 IgG2a kappa (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Rabbit anti-angiostatin (mouse aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Rabbit anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Rat anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Rat anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Rat anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Reduced mitotracker orange | Invitrogen | M7511 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Dilute 2 times to make a 10 mg/ml stock |
References
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K.
- Aulakh, G. K., Suri, S. S., Singh, B. Angiostatin inhibits acute lung injury in a mouse model. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (1), 58-68 (2014).
- Schneberger, D., Aulakh, G., Channabasappa, S., Singh, B. Toll-like receptor 9 partially regulates lung inflammation induced following exposure to chicken barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 11 (1), 1-10 (2016).
- Shah, D., Romero, F., Stafstrom, W., Duong, M., Summer, R. Extracellular ATP mediates the late phase of neutrophil recruitment to the lung in murine models of acute lung injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 152-161 (2014).
- Aulakh, G. K., Balachandran, Y., Liu, L., Singh, B. Angiostatin inhibits activation and migration of neutrophils. Cell Tissue Research. , (2013).
- Cakmak, S., et al. Associations between long-term PM2.5 and ozone exposure and mortality in the Canadian Census Health and Environment Cohort (CANCHEC), by spatial synoptic classification zone. Environment International. 111, 200-211 (2018).
- Dauchet, L., et al. Short-term exposure to air pollution: Associations with lung function and inflammatory markers in non-smoking, healthy adults. Environment International. 121, Pt 1 610-619 (2018).
- Delfino, R. J., Murphy-Moulton, A. M., Burnett, R. T., Brook, J. R., Becklake, M. R. Effects of air pollution on emergency room visits for respiratory illnesses in Montreal, Quebec. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 155 (2), 568-576 (1997).
- Peterson, M. L., Harder, S., Rummo, N., House, D. Effect of ozone on leukocyte function in exposed human subjects. Environmental Research. 15 (3), 485-493 (1978).
- Rush, B., et al. Association between chronic exposure to air pollution and mortality in the acute respiratory distress syndrome. Environmental Pollution. 224, 352-356 (2017).
- Rush, B., Wiskar, K., Fruhstorfer, C., Celi, L. A., Walley, K. R. The Impact of Chronic Ozone and Particulate Air Pollution on Mortality in Patients With Sepsis Across the United States. Journal of Intensive Care Medicine. , (2018).
- Stieb, D. M., Burnett, R. T., Beveridge, R. C., Brook, J. R. Association between ozone and asthma emergency department visits in Saint John, New Brunswick, Canada. Environmental Health Perspectives. 104 (12), 1354-1360 (1996).
- Thomson, E. M., Pilon, S., Guenette, J., Williams, A., Holloway, A. C. Ozone modifies the metabolic and endocrine response to glucose: Reproduction of effects with the stress hormone corticosterone. Toxicology and Applied Pharmacology. 342, 31-38 (2018).
- Aulakh, G. K., Brocos Duda, J. A., Guerrero Soler, C. M., Snead, E., Singh, J. Characterization of low-dose ozone-induced murine acute lung injury. Physiological Reports. 8 (11), 14463 (2020).
- Aulakh, G. K., et al. Quantification of regional murine ozone-induced lung inflammation using [18F]F-FDG microPET/CT imaging. Scientific Reports. 10 (1), 15699 (2020).
- Charavaryamath, C., Keet, T., Aulakh, G. K., Townsend, H. G., Singh, B. Lung responses to secondary endotoxin challenge in rats exposed to pig barn air. Journal of Occupational Medicine and Toxicology. 3, London, England. 24 (2008).
- Szarka, R. J., Wang, N., Gordon, L., Nation, P. N., Smith, R. H. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. Journal of Immunological Methods. 202 (1), 49-57 (1997).
- Southam, D. S., Dolovich, M., O'Byrne, P. M., Inman, M. D. Distribution of intranasal instillations in mice: effects of volume, time, body position, and anesthesia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 282 (4), 833-839 (2002).
- Aulakh, G. K. Lack of CD34 produces defects in platelets, microparticles, and lung inflammation. Cell Tissue Research. , (2020).
- Gilmour, M. I., Hmieleski, R. R., Stafford, E. A., Jakab, G. J. Suppression and recovery of the alveolar macrophage phagocytic system during continuous exposure to 0.5 ppm ozone. Experimental Lung Research. 17 (3), 547-558 (1991).
- Yipp, B. G., et al. The Lung is a Host Defense Niche for Immediate Neutrophil-Mediated Vascular Protection. Science Immunology. 2 (10), (2017).
- Lee, T. Y., et al. Angiostatin regulates the expression of antiangiogenic and proapoptotic pathways via targeted inhibition of mitochondrial proteins. Blood. 114 (9), 1987-1998 (2009).
- Hawkins, C. L., Davies, M. J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. Journal of Biological Chemistry. 294 (51), 19683-19708 (2019).
- Hemming, J. M., et al. Environmental Pollutant Ozone Causes Damage to Lung Surfactant Protein B (SP-B). Biochemistry. 54 (33), 5185-5197 (2015).
- Oosting, R. S., et al. Exposure of surfactant protein A to ozone in vitro and in vivo impairs its interactions with alveolar cells. American Journal of Physiology. 262 (1), Pt 1 63-68 (1992).
- Roth, S., et al. Secondary necrotic neutrophils release interleukin-16C and macrophage migration inhibitory factor from stores in the cytosol. Cell Death & Discovery. 1, 15056 (2015).
- Kawaguchi, N., Zhang, T. T., Nakanishi, T. Involvement of CXCR4 in Normal and Abnormal Development. Cells. 8 (2), (2019).
- Gupta, A., et al.
- Aulakh, G. K., Kuebler, W. M., Singh, B., Chapman, D. 2017 IEEE Nuclear Science Symposium and Medical Imaging Conference (NSS/MIC). , 1-2 (2017).
- Aulakh, G. K., et al. Multiple image x-radiography for functional lung imaging. Physics in Medicine & Biology. 63 (1), 015009 (2018).
