Summary
压力反射是自主神经系统响应血压变化的心率调节机制。我们描述了一种植入遥测发射器的手术技术，用于连续和同时测量小鼠的心电图和血压。这可以确定自发性压力反射敏感性，这是心血管疾病的重要预后标志物。
Abstract
血压（BP）和心率（HR）都由自主神经系统（ANS）控制，并且由于反射机制而紧密交织在一起。压力反射是一种关键的稳态机制，可抵消动脉血压的急性短期变化，并将血压维持在相对狭窄的生理范围内。血压由位于主动脉弓和颈动脉窦的压力感受器感知。当血压改变时，信号被传递到中枢神经系统，然后传递到自主神经系统的副交感神经和交感神经分支以调节心率。血压升高导致心率反射下降，血压下降导致心率反射性增加。
压力反射敏感性（BRS）是动脉血压变化与相应心率变化之间的定量关系。 心血管疾病通常与压力反射功能受损有关。在各种研究中，已有减少BRS的报道，例如心力衰竭、心肌梗死或冠状动脉疾病。
BRS的测定需要来自BP和HR的信息，这些信息可以使用遥测设备同时记录。首先描述外科手术，首先将压力传感器插入左颈动脉并将其尖端定位在主动脉弓中以监测动脉压，然后皮下放置发射器和心电图电极。我们还描述了术后重症监护和镇痛药管理。经过两周的术后恢复后，在有意识和无拘无束的小鼠中进行长期心电图和血压记录。最后，我们包括高质量记录的示例以及使用序列方法分析自发压力感受器的敏感性。
Introduction
动脉压力感受器反射是人类的主要反馈控制系统，它提供短期 - 也可能是长期1，2 - 动脉血压 （ABP） 控制。这种反射缓冲了对生理或环境触发因素的反应而发生的血压扰动。它提供心率、每搏输出量和总外周动脉阻力的及时反射变化。反射起源于主动脉弓和颈动脉窦的感觉神经末梢。这些神经末梢构成了动脉压力感受器。主动脉弓神经末梢的躯体位于结节神经节中，而颈动脉窦的神经末梢位于岩神经节中。反射是由血压升高触发的，血压升高拉伸并激活压力感受器神经末梢（图1A）。激活导致动作电位凌空抽射通过传入主动脉抑制器和颈动脉窦神经集中传递到心血管脑干核，例如孤束核和迷走神经背核。传入神经活动的变化反过来调节自主神经传出活动。压力感受神经活动增加会降低交感神经并增加副交感神经活动。因此，压力感受器激活的后果是心率，心输出量和血管阻力降低，它们共同抵消和缓冲血压升高3。相比之下，压力感受神经活动减少会增加交感神经并降低副交感神经活动，从而增加心率、心输出量和血管阻力，从而抵消血压的降低。
对人类和动物的大量研究表明，在运动4、睡眠5、热应激6或怀孕7等生理条件下，压力感受器反射可以调节。此外，有证据表明，在高血压、心力衰竭、心肌梗死和卒中等心血管疾病中，压力反射会长期受损。事实上，压力反射功能障碍也被用作几种心血管疾病的预后标志物8，9，10。此外，压力反射功能障碍也存在于ANS疾病中。鉴于压力感受器反射对健康和疾病状态的重要性，体内估计这种反射是自主神经和心血管研究的重要组成部分，具有某些严重的临床意义。
遗传小鼠系是心血管研究中必不可少的工具。这种小鼠系的体内研究为心血管生理学和病理生理学提供了有价值的见解，并且在许多情况下可作为心血管疾病的临床前模型系统。在这里，我们提供了一种在有意识的，无限制的，自由移动的小鼠中进行遥测体内ECG和BP记录的协议，并描述了如何使用序列方法从这些记录中确定压力反射敏感性（图1B）。应用的方法称为序列法，因为在 HR 的反射适应下，在 SBP 自发增加或减少期间，筛选收缩压 （SBP） 和 RR 间期的逐搏系列，以显示 3 次或更多次的短序列。该方法是测定压力反射敏感性的金标准，因为仅研究自发反射机制。该技术优于涉及侵入性程序（例如注射血管活性药物以诱导血压变化）的旧技术。
图 1：使用序列法进行压力反射和压力反射敏感性评估的示意图 。 （A）血压急剧升高期间的压力反射过程。位于主动脉弓和颈动脉窦的压力感受器可感觉到 ABP 的短期升高.该信息被传递到中枢神经系统，并诱导交感神经活动的减少，同时副交感神经活动的增加。位于窦房结区域的神经末梢释放乙酰胆碱诱导窦房结起搏器细胞中第二信使cAMP降低，从而降低心率。血压的短期下降会产生相反的效果。（B） 连续三个节拍的上行序列（左上图）和下序列（右上图）期间的BP曲线示意图。上升序列与RR间期的平行增加（左下图）相关，这相当于HR的降低。下降序列与RR间期的平行降低（右下图）相关，这相当于HR的增加。 请点击此处查看此图的大图。
Protocol
按照当地机构指南和国家动物实验法律进行所有动物研究。对于这个实验，这些研究得到了Regierung von Oberbayern的批准，并符合德国关于动物实验的法律。WT动物（C57BL / 6J背景）和病态窦房结综合征小鼠模型的动物显示BRS敏感性增加（Hcn4tm3（Y527F;R669E;T670A）Biel）11 （混合C57BL/6N和129/SvJ背景）用于本研究。
1. 设备设置
- 从无菌包装中取出遥测发射器，并将心电图导联线缩短至适合鼠标尺寸的长度。对于体重~30g的12周龄雄性黑六小鼠（C57BL / 6J），使用剪刀将正铅（红色）缩短至~45mm长度，将负铅（无色）缩短至~40mm长度。
注意：这些值作为方向给出，必须根据需要进行调整（图2）。 - 使用手术刀取出大约 6 mm 的心电图导联硅胶管，露出电线。用过多的管子覆盖电线的尖端，留下~2毫米的ECG线部分以记录电信号。用不可吸收的5-0丝线材料固定硅胶管（图2A）。
- 将变送器序列号记入操作协议（补充文件 1）。
- 将递质在温热的无菌 0.9 % NaCl 溶液中水合。
- 称量鼠标并记录其重量。
- 手术前高压灭菌所有手术器械。在手术期间以及使用热玻璃珠灭菌器通过干热操作不同动物之间对它们进行消毒。
注意：手术器械在使用前必须冷却至室温，以防止皮肤灼伤。 - 对工作台进行消毒以确保无菌条件。
2. 手术植入遥测发射器，用于心电图和血压测量相结合
- 解剖左颈总动脉。
- 通过腹膜内注射麻醉混合物（100mg / kg氯胺酮;15mg / kg甲苯噻嗪;1mg / kg乙酰丙嗪）麻醉小鼠。进行脚趾捏伤测试，以确保在开始手术前小鼠完全麻醉。
- 使用修剪器将手术区域从下巴下方剃向胸肌横肌。
- 将鼠标仰卧放在设置为37°C的温控手术板上。 用手术胶带固定四肢，并用直肠温度计持续监测体温（图2C）。如果体温降至37°C以下，则在手术过程中用无菌棉纱布覆盖动物的身体。
- 在麻醉期间涂抹眼膏以保护动物的眼睛。
- 在先前剃光的手术区域涂抹脱毛膏。3-4分钟后使用化妆棉和温水去除头发和脱毛膏。确保皮肤清洁，没有任何残留的毛发和脱毛膏，以免在手术过程中污染伤口。
- 用几轮交替的聚维酮碘或洗必泰磨砂膏消毒皮肤，然后喝酒。
- 将动物置于解剖显微镜下，并在手术区域周围放置无菌窗帘。
- 从下巴下方开始，在颈部皮肤上做一个1-1.5厘米的中线切口。努力使切口尽可能直。（图 2D）。
注意：在以下步骤中，必须通过定期施用无菌，温暖（37°C）0.9%NaCl来保持手术区域的湿润。 - 用钝性解剖剪刀将皮肤与下面的结缔组织分开，在切口两侧创建一个皮下空间。注意不要用镊子用力捏皮肤，因为这会导致坏死并导致手术后伤口愈合受损。
- 使用棉尖涂抹器将腮腺和下颌下腺分开，以暴露覆盖气管的肌肉组织。
- 用弯曲的夹层钳缩回左侧唾液腺，以识别位于气管侧面的左颈动脉（图2E）。
- 使用弯曲的镊子从邻近组织中仔细解剖颈动脉。非常小心，不要伤害沿血管运行的迷走神经。继续钝性解剖，将左颈动脉暴露至约10mm长，并将其与血管筋膜和迷走神经完全分离（图2F）。
- 在颈动脉的隔离部分下方通过不可吸收的5-0丝线，同时用弯曲的镊子稍微抬起血管，以减少缝合线和颈动脉之间的摩擦，因为这很容易损坏血管壁。
- 将缝合线放在颅骨上，就在颈动脉分叉的近端，打一个结并将其绑起来以永久结扎血管（图2G）。用手术胶带将颅骨闭塞缝合线的两端固定在手术台上。
- 在颈动脉下方通过第二条闭塞缝线，并将其放置在尾部距颅缝线~5毫米的距离处（图2H）。在动脉插管期间需要暂时阻塞血流。因此，打一个松散的结，并用手术胶带固定两个缝合端。
- 在颅骨和尾部闭塞缝合线之间放置第三条缝合线（安全缝合线），并打一个松散的结（图2I）。需要这种缝合线来保持导管就位，同时插管动脉。将缝合线的一端粘在手术台上。
- 左颈总动脉插管。
注意：血压导管的传感器区域距离远端4毫米，由一根装有不可压缩液体和生物相容性凝胶的管子组成（图2B）。由于该区域非常敏感，请确保它没有气泡，并且在手术过程中任何时候都不要触摸它。- 将 24 G 针头的尖端弯曲成 ~100° 角，以用作导管介绍器。
- 轻轻拉动尾部闭塞缝合线并用张力固定，以暂时停止血液流动并稍微抬起动脉。
- 用弯曲的针小心地穿透颅闭塞缝合线近端的动脉（图2J）。用血管插管钳夹住导管，将其引入小穿刺中，让它慢慢滑入血管。同时轻轻拉回弯曲的针（图2K）。
- 当导管到达尾部闭塞缝合线时，稍微收紧安全缝合线以保持导管就位（图2L）。
- 松开尾部闭塞缝合线，以便导管可以进一步移动，直到其尖端位于主动脉弓中。
注意：请务必确定导管的正确插入长度，因为这取决于鼠标的大小。对于在12周龄时具有C57BL / 6J背景和~30g体重的雄性小鼠，我们建议插入导管直到集成的切口到达颅闭塞缝合线。在动物安乐死后，可以验证特定小鼠线导管的正确插入深度和位置。 - 正确定位后，用所有三条缝合线固定导管，并尽可能缩短末端。不要把结拉得太紧，因为这可能会损坏脆弱的血压导管。
图2：植入组合心电图和血压递送器 - 左颈动脉插管 。 （A）遥测发射器由压力导管、两个生物电势电极和装置主体组成。（B）压力导管示意图。传感器区域由不可压缩流体和生物相容性凝胶组成。必须将导管插入颈动脉，直到切口达到颅闭塞缝合线的水平，以确保在血管中的位置正确。（C）准备用于手术递质植入的麻醉C57BL / 6J小鼠。（D-L）图像序列显示左颈动脉插管的外科手术。（四）宫颈皮肤切口。（E）暴露的气管以识别位于气管侧面的左颈动脉。（F）钝性夹层，将动脉与邻近组织和迷走神经隔离开来。（G）用颅闭塞缝合永久结扎左颈动脉。（H）对尾部闭塞缝合线施加张力以暂时停止血流。（I）固定缝合线以在插管期间保持导管就位。（J）带有弯曲尖端的套管，用于将导管插入血管。（K）将压力导管插入颈动脉。（L）导管尖端位于主动脉弓中，导管用中间缝合线固定。D - L 的比例尺显示 4 毫米。 转载自16. 请点击此处查看此图的大图。
- 将遥测设备主体放置在鼠标左侧的皮下口袋中（图3）。
- 从颈部形成一个皮下隧道，指向动物的左胁，并使用小而钝的解剖剪刀形成一个小袋（图3B）。
- 用装有温热无菌 0.9% NaCl 溶液的 1 mL 注射器冲洗隧道，并将 ~300 μL 溶液引入袋中（图 3C）。
- 用钝钳小心地提起皮肤，并将发射器设备主体引入袋中（图 3D）。在此步骤中，要非常小心，不要将血压导管从颈动脉中拉出。
- 在埃因托芬II配置中放置心电图导联。
- 用钝性解剖剪刀在右侧胸肌形成一条细隧道，并使用钝钳将负（无色）导线放入隧道中。使用6-0可吸收缝合材料将引线的末端缝合线固定在胸肌上（图3E）。
- 在正（红色）导线上形成一个环，将其尖端定位在左尾肋区域，并使用6-0可吸收缝合材料用缝合线固定其位置。
注意：重要的是，两根导线在整个长度上都平放在身体上，以避免组织刺激（图3F）。 - 使用5-0不可吸收的缝合材料用单结闭合皮肤（图3H）。此外，在每个结上涂抹少量组织粘合剂，以防止动物咬伤缝合线并防止裂开。
- 将聚维酮碘水凝胶10%涂抹在伤口上，以防止在恢复阶段伤口感染。
- 为了先发制人的止痛，在小鼠仍处于麻醉状态时，皮下注射5mg / kg卡洛芬中的0.9%NaCl。
- 将加热平台设置为39±1°C，并将鼠标放在单独的外壳笼中。手术后将笼子的一半放在平台上12小时，并将鼠标转移到温暖的区域。当动物从麻醉中醒来时，它可以选择留在温暖的区域或移动到笼子较冷的部分。
图3：植入组合的ECG和血压递质 - 皮下放置ECG电极和设备主体 。 （A）插入血压导管后的小鼠。导管位置由闭塞缝合线固定。（B）用钝剪刀在动物的左胁形成皮下袋。（C） 用~300μL温热的无菌盐水冲洗袋。（D）将器械主体置于皮下袋中。（E）负极的末端（无色）用可吸收的缝合材料固定在右胸肌上。（F）将正极（红色）固定在左侧肋间肌上。（G）在胸肌上放置永久性缝合线以确保心电图电极的位置。（H）皮肤闭合后的小鼠。心电图电极尖端的皮下位置用红色圆圈表示。为了演示目的，使用死去的动物来拍摄这些图像。使用活体动物时请遵循无菌做法。转载自16. 请点击此处查看此图的大图。
- 术后护理
- 为了缓解术后疼痛，每12小时皮下注射5mg / kg卡洛芬中的0.9%NaCl，持续3-5天，直到伤口愈合。
- 腹腔注射 10 μL/g 温热的铃声-乳酸溶液，以保护动物免于脱水。
- 让鼠标恢复 2-3 周，然后再进行第一次遥测测量。在恢复期间仔细监测一般健康状况、伤口愈合、体重以及食物和水的摄入量。
- 在实验结束时，通过吸入二氧化碳（CO2）对小鼠实施安乐死。
注意：不建议将颈椎脱位或斩首作为安乐死方法，因为这可能会损坏心电图和血压发射器装置的部分。
- 数据采集。
- 采取措施避免数据记录过程中的声学和电子噪音。此外，在数据记录期间限制人员的访问，并在实验前完成所有饲养程序。
- 将动物的笼子放在遥测接收器板上，并通过将磁铁靠近动物来打开遥测发射器。
- 使用数据采集软件在72小时（12小时暗/光周期）内获取连续的ECG，血压和活动记录（图4）。
- 分析心率，血压和活动的昼夜节律。
- 使用数据采集软件12 检查HR，BP和活动的常规昼夜节律是否存在（图5）。
- 数据分析，包括使用带有心电图和血压分析软件的序列方法确定压力感受器的敏感性。
- 将血压和心率数据从数据采集软件导出到心电图和血压分析软件中（补充文件 2）。使用以下命令序列： 打开心电图和血压分析软件 > 文件> 来自转换器的原始数据 > 转换非 IOX 原始数据。在新窗口中，单击 “文件”>加载数据任务 ART4 数据。同样，将打开一个新窗口，选择要 导出的数据文件>新窗口打开，从“受试者”列表中选择动物，然后从“波形列表”中选择心电图和血压，然后按 OK。通过单击转换 数据>创建 IOX 二进制站点文件来选择应从中转换数据的动物。
- 使用以下命令序列在心电图和血压分析软件中打开 IOX 二进制站点文件： 文件>加载 IOX 数据>选择血压和心电图迹线> 按 绿色复选标记。
注意：以下数据处理参数针对从野生型小鼠获得的数据进行了优化，原则上应适合临床前领域使用的所有小鼠模型。然而，当使用特定的实验模型时，可能需要调整这些参数，例如，具有极高或极低HR和/或BP值的小鼠，或不同的啮齿动物物种。在任何情况下，都需要仔细审查数据处理参数，以确保它们适合所研究的特定模型。 - 有关心电图、血压和BRS分析的设置，请参见补充文件3，4。对于小鼠的BRS分析，调整BRS参数以仅检测三个（或更多）搏动的序列，这些序列在SBP和RR之间表现出一次搏动之间的延迟，并将SBP和RR变化的阈值设置为0.5mmHg和2ms。确保RR/SBP图中回归线斜率的相关系数大于0.75，并仅分析表现出稳定窦性心律的部分。使用以下命令序列相应地设置心电图、血压和 BRS 分析的参数： 在新窗口打开>调整>分析设置
- 心电图设置（在“心电图模式和信号过滤”窗口中单击鼠标右键（补充文件3））。设置参数，如下所示。模式： 心电图， 仅遥控， 滤波模式： 自动， 根据设定心率， 预期心率： bpm > 300， 基线去除滤波器宽度 （毫秒）： 100.00， 噪声去除滤波器宽度： 1.00 毫秒， 陷波滤波器： 50.0 Hz， 尖峰去除滤波器： 关闭， 压差检测模式： 关闭， 最大 RR 长度 （ms）： 900.00， 调整后的 R 峰值的 RR： 关闭， RR_only 设置模式： Xsmall： 鼠标， R 峰宽 （毫秒）： 10.00， PR 宽度 （毫秒）： 20.00， RT 宽度 （毫秒）： 50.00， 最大拍频间伪影 （%）： 50.00， R 与其他振幅比： 3.00， R 峰号： 正， 和 计算额外参数： 关闭
- 对于血压设置（血压，压力设置），右键单击“血压分析仪”窗口（补充文件4）。设置参数，如下所示。降噪滤波器宽度（毫秒）： 10.00， 微分滤波器宽度（毫秒）： 6.00， 陷波滤波器： 50.0 Hz， 尖峰去除滤波器： 关闭， 验证阈值（校准单位）： 12.00， 剔除阈值（校准单位）： 8.00， 开始上冲程时的导数 （校准U/s）： 10.00， 抑制限制： 关闭， 参考心电图延迟： 用户自定义窗口， 心电图最小延迟 峰值 （毫秒）： 10.00， 心电图最大延迟 峰值 （毫秒）： 250.00， 从标记Conduct_time_1： 未计算， Conduct_time_2 从标记： 未计算， BR （呼吸频率）： 关闭， BRS （压力反射灵敏度）： 打开， 最小连续心跳次数： 3， 延迟心跳次数： 1， 压力值： SBP， 标记以计算脉冲间隔： R， 最小压力变化 （caIU）： 0.50， 最小间隔变化 （毫秒）： 2.00， 最小相关： 0.75
- 筛选低活性的3小时序列的活性信号。在此时间窗口中执行BRS分析，因为动物的高活性会干扰BP和RR相关性。
- 在此3小时时间窗口内执行BP和RR分析，同时将3小时分析细分为10分钟步骤。
- 使用以下命令序列执行 BRS 分析：打开 BRS 分析 窗口>查看 BRS 分析>。这将打开 BRS 分析面板。手动检查 BRS 分析面板中显示的每个序列，并排除异位搏动、窦性停搏、心律失常事件或嘈杂数据。确保使此类序列的每个节拍无效，以成功将其从分析中排除。
- 将 BRS 分析的结果导出到电子表格文件（结果文件）中。使用以下命令序列修改导出到电子表格文件的参数（补充文件 5-7）：
- 调整 txt > txt > 部分中的> 参数（补充文件 5）。选择“节拍”部分和任何其他包含感兴趣信息的部分，但无效的节拍部分除外。
- 调整 txt （补充文件 6）> > 步骤中的>参数。选择要导出的步长值。
- 调整列表/到文件中的>参数 > 节拍 -> txt （补充文件 7）。
- 确保文件的节拍部分至少包含每个节拍的以下数据。ECG_RR、ECG_HR、BP_SBP、BP_BRS_deltaP、BP_BRS_# （=序列的连续拍频间隔）、BP_BRS_slope、BP_BRS_correl、BP_BRS_shiftl（=后续节拍的 RR）
- 然后单击“ 文件”>“保存结果文件”。
- 使用Excel的过滤功能对导出的数据进行排序（补充文件8）。分别计算上行序列和下序的序列数、平均BRS斜率、标准差和BRS斜率标准误差。还要计算每 1000 次节拍的序列总数。
注意：补充文件（补充文件8）中提供了用于自动排序和分析上行和下序列的电子表格模板（模板BRS），便于分析。通过调整滤波器功能，您可以按不同的节拍数字（例如，三拍或四拍序列）对序列进行排序。有关更多详细信息，请参阅补充文件 9-13。- 打开结果文件和模板 BRS Excel 文件（补充文件 8）。从结果文件中复制以下列的数据：（压力）_BRS_deltaP、（压力）_BRS_# 和（压力）_BRS_slope（补充文件 9）。将数据粘贴到 TemplateBRS 文件（补充文件 10）中“上序列”和“下序列”电子表格的相应列中。此外，从结果文件（补充文件 11）复制列（压力）_BRS_SBP的数据，并将其粘贴到 TemplateBRS 文件（补充文件 12）中的“所有序列”电子表格中。
注意：（压力）_BRS_# 列中的数字仅在序列的最后一拍下列出，并描述序列长度。上行和下序列可以通过（压力）_deltaP值的符号来区分。三拍序列的第二和第三拍的负值表示下降序列。正值分别表示上行序列。 - 使用默认筛选器设置筛选复制的数据。单击（压力）_BRS_# 列的过滤器图标，然后按“确定”（补充文件 13）。将此步骤应用于“上行序列”和“下序列”电子表格。
注意：电子表格会过滤三拍序列。如果请求其他序列长度，则必须在下拉菜单中更改此列的设置。序列数、平均 BRS 斜率、标准偏差和 BRS 斜率标准误差的计算显示在“上序列”和“下序列”电子表格的绿色框中。每 1000 次拍子的序列总数的计算显示在“所有序列”电子表格的绿色框中。
- 打开结果文件和模板 BRS Excel 文件（补充文件 8）。从结果文件中复制以下列的数据：（压力）_BRS_deltaP、（压力）_BRS_# 和（压力）_BRS_slope（补充文件 9）。将数据粘贴到 TemplateBRS 文件（补充文件 10）中“上序列”和“下序列”电子表格的相应列中。此外，从结果文件（补充文件 11）复制列（压力）_BRS_SBP的数据，并将其粘贴到 TemplateBRS 文件（补充文件 12）中的“所有序列”电子表格中。
Representative Results
心电图和血压原始数据的结果为阳性
使用该协议可以获得高质量的心电图和血压数据（图4和补充文件14），不仅可以进行精确的BRS分析，还可以分析广泛的心电图或血压衍生参数，例如心电图间隔（图4B，上图），血压参数（图4B，下图），心率和血压变异性， 心律失常检测等12，13，14，15。
图 4：遥测心电图和血压记录。 （A） 具有代表性的高质量心电图迹线（上图）和相应的高质量原始血压记录（下图）。（B）心电图迹线的放大倍数（上图）。需检查 P 波、QRS 波群、T 波和 RR 间期。相应血压数据的放大倍数（下图）。需进行舒张压 （DBP） 和收缩压 （SBP）。请点击此处查看此图的大图。
昼夜节律阳性结果
从手术中充分恢复的健康小鼠在活动（黑暗）阶段显示出活动，HR和BP的生理增加（图5）。许多不同的因素会扰乱这种规律的昼夜节律。这些包括心理压力，声音或电噪声和疼痛。例如，手术后立即出现急性疼痛状况会导致心率增加，同时活动减少。因此，昼夜节律是动物健康和福祉的重要指标，应在BRS分析前进行常规检查。
图 5：分析长期遥测测量以确定昼夜节律变化。 在12小时光照和黑暗周期中，9只雄性野生型C57BL / 6J小鼠的心率（A），活动（B），收缩压（C）和舒张压（D）的昼夜节律平均。灰色区域描绘动物的活动（黑暗）阶段，白色区域描绘动物的休息（浅色）阶段。在动物的活动（黑暗）阶段，所有参数在生理上都升高。数据表示为平均值 +/- SEM。 请点击此处查看此图的大图。
BRS 分析的阳性结果
按照协议第2.8节所述执行分析后，软件将分别检测上行和下行序列。使用的方法称为序列法，因为在 SBP 自发上升或下降的三个或更多次的短序列中，在逐搏的基础上检查 SBP 和 RR 间期的变化（图 6）。三次心跳后 SBP 持续升高会导致副交感神经活动的反射性增加，从而减慢 HR，这相当于更长的 RR 间期。反射心率适应的潜伏期为一拍。这样的序列如图6A所示，定义为上行序列。相反，SBP在三次心跳内持续下降，HR平行上升（RR间期减少）被定义为下降序列（图6B）。为了评估RR和SBP之间的相关性，将两个参数相互绘制，并计算每个序列的线性回归线的斜率（ms/mmHg）（图6A，B，下图）。按上行和下行序列排序后，可以分别计算上行和下行序列的每1000次跳动的平均序列数（图6C）和自发BRS的平均增益（图6D，E）。自发BRS的增益反映在根据RR/SBP关系计算的线性回归线的斜率上。与正常 BRS 值的偏差可能有多种原因。这些包括ANS输入的变化或窦房结对自主神经系统输入的反应性的变化。在图6中，在病态窦房结综合征（SSS）小鼠模型中BRS增加，窦房结对迷走神经输入的反应性被夸大，如图11所示。
图 6：使用序列法估计 BRS。 （A）野生型C57BL / 6J小鼠在连续三次心跳的上升序列（上图）期间的代表性血压痕迹与RR间隔的平行增加（中图）相关，相当于HR的降低。RR区间与SBP相对立（下图）。上图和中图（WT，黑色圆圈）中描绘的上升序列的回归线（红线）的斜率为4.10 ms/mmHg。病态窦房结综合征小鼠模型的代表性RR / SBP关系产生6.49ms / mmHg的斜率增加，表明BRS（SSS，灰色圆圈）升高。（B） 野生型小鼠的代表性下序列，SBP 下降（上图）和随后 RR 间隔减少（中图），导致 BRS 斜率为 4.51 ms/mmHg（下图;WT，黑色圆圈）。病态窦房结综合征小鼠模型（SSS，灰色圆圈）的代表性RR / SBP关系，斜率为7.10 ms / mmHg。红色箭头的方向指示序列的方向（向上或向下序列）。（C）WT和SSS小鼠每1000次跳动的序列总量。（D）WT和SSS小鼠上序列的RR / SBP关系的平均斜率。（E）WT和SSS小鼠下序列的RR / SBP关系的平均斜率。根据病态窦房结综合征小鼠模型的6只雄性WT动物和8只雄性动物的结果进行（C-E）中的统计。箱线图显示中线、perc 25/75 和最小/最大值;开放符号表示平均值。 请点击此处查看此图的大图。
原始数据质量的负面结果
特别是在较高活动信号质量的阶段可能会降低（图7 和 补充文件15，16）。这可能是由于动物的运动而导致的暂时移位或血压导管或心电图导联的位置不正确，或两者兼而有之。此外，骨骼肌活动可能会从心电图导联检测到并引起噪音（图7B，上图）。使用上述软件设置，无法检测到这些低质量的节拍，因此被排除在分析之外。然而，必须对分析的原始数据进行人工检查。
图 7：低质量原始信号的示例。 （A）心电图信号（上图）检测质量良好，但血压信号（下图）质量低。（B）心电图（上图）和血压（下图）信号的质量不足。请点击此处查看此图的大图。
BRS 分析的阴性结果
协议第2.8.3节中列出的BRS分析设置通常对于快速正确地检测上行和下行序列至关重要。回归线的最小相关系数设置为 0.75。将最小相关系数的值设置得太低会导致序列检测错误，这些序列不反映压力反射活动，而是由心律失常搏动引起（图 8）。对于BRS分析，仅必须分析具有稳定窦性心律的发作。异位搏动或其他心律失常事件，例如窦性停搏，可通过心电图和血压分析软件的 HRV 选项找到，必须失效。
图 8：不反映压力反射活动的序列。 （A）患有轻度窦性心律失常的小鼠的心电图痕迹。（B） 血压记录显示SBP自发增加。（C）相应的RR区间表示血压升高时HR的降低。 （D）SBP图和相应的RR区间。回归线的低相关系数表明HR降低不是由压力反射活动引起的，而是由窦性心律失常引起的。（E） 描述窦性停搏的原始心电图轨迹。（F） 相应的原始血压信号。窦性停搏导致舒张压下降。随后心跳的收缩压几乎不受影响。请点击此处查看此图的大图。
补充文件1：手术方案。 用于记录外科手术和术后护理的模板。 请点击此处下载此文件。
补充文件2：将Dataquest A.R.T数据转换为IOX数据，以便在ecgAUTO软件中进行分析。 在受试者列表中选择动物（左）和波形列表中的压力和心电图（右）。按确定转换数据。 请点击此处下载此文件。
补充文件3：用于BRS分析的心电图设置。 设置列出的参数，按确定并应用配置。 请点击此处下载此文件。
补充文件 4：BRS 分析的 BP 设置。 设置列出的参数，按确定并应用配置。将配置另存为配置文件，以便能够轻松加载设置。 请点击此处下载此文件。
补充文件 5：“部分”列表/到文件窗口中的参数。 在部分> txt标题（已选择）下选择要导出的部分，然后按应用！请点击此处下载此文件。
补充文件 6：列表/到文件窗口中“步骤”的参数。 在步骤> txt 标头（已选中）下选择要导出的步骤数据，然后按应用！请点击此处下载此文件。
补充文件 7：“节拍”列表/到文件窗口中的参数。选择要在 txt 标题>节拍下导出的值（已选中），然后按应用！对于 BRS 分析，勾选参数是必需的。请注意数字指示的选择顺序。请点击此处下载此文件。
补充文件 8：模板 BRS 电子表格文件。 用于自动排序和分析上下序列的电子表格模板。 请点击此处下载此文件。
补充文件 9：从结果文件 I 复制相关数据。 从结果文件中复制列（压力）_BRS_deltaP、（压力）_BRS_# 和（压力）_BRS_slope列。 请点击此处下载此文件。
补充文件 10：用于数据排序和分析的电子表格模板文件 （TemplateBRS） I. 将复制的数据粘贴到 TemplateBRS 电子表格文件中“上序列”和“下序列”电子表格的相应列中。 请点击此处下载此文件。
补充文件 11：从结果文件 II 复制相关数据。 从结果文件中复制列（压力）_BRS_SBP。 请点击此处下载此文件。
补充文件12：用于数据排序和分析的电子表格模板文件（模板BRS） II. 将复制的 SBP 数据粘贴到 TemplateBRS 电子表格文件中的“所有序列”电子表格中，以计算序列总数。 请点击此处下载此文件。
补充文件13：过滤和分析序列。 在 TemplateBRS 电子表格文件的“上行序列”电子表格中，打开（压力）_BRS_# 列过滤器的下拉菜单，然后按 确定 而不更改任何参数。这将自动对数据进行排序，并以 3 拍更新序列的计算。对“向下序列”电子表格重复此操作。 请点击此处下载此文件。
补充文件14：使用ECG和BP分析软件检测到的高质量记录的屏幕截图。 上迹线 （ECG） 显示每个 R 峰的检测，下迹线 （BP） 显示每个舒张压 （DP） 和收缩压 （SP） 峰的检测。成功检测到的峰值下的区域以红色标记。 请点击此处下载此文件。
补充文件 15：低质量血压记录的屏幕截图，其中仅部分检测到血压参数。 上迹线（ECG）显示每个R峰的检测，但下迹线（BP）显示检测到的血压峰之间的间隙。检测到的舒张压 （DP） 和收缩压 （SP） 峰值用红色区域标记。 请点击此处下载此文件。
补充文件16：无法检测到心电图和血压参数的低质量心电图和血压记录的屏幕截图。 上部迹线（ECG）显示无法检测到ECG参数的区域（紫色背景）。由于信号质量低，血压检测（下迹线）也失败。 请点击此处下载此文件。
Discussion
该方法相对于替代方法的意义
在目前的工作中，我们提出了一个详细的协议来量化自发BRS，使用序列方法。这种方法利用通过心电图和血压遥测测量的自发血压和反射心率变化。这种方法的优点是，通过走进进行测量的房间，甚至通过注射药物所需的物理相互作用，可以在有意识的、自由移动的、不受约束的动物身上记录这两个参数，而不会打扰动物。这一点非常重要，因为已经清楚地表明，这种干扰会严重干扰心率和血压记录。例如，注射药物需要固定小鼠，这会导致最大应激反应，使HR增加到650-700 bpm。为了规避这些应激反应，先前已在麻醉小鼠中测定了BRS。然而，兽药中使用的标准麻醉剂（如氯胺酮/甲苯噻嗪或异氟烷）会诱发心动过缓并影响自主神经反射反应，从而限制了这些方法的有效性和结果的解释。为了部分克服这些限制，使用了植入式给药装置，即渗透泵，其可以将药物释放到腹膜腔中。然而，使用渗透泵，不可能应用限制此类装置应用的确定剂量的药物推注。或者，使用复杂的输液导管17 可以植入小鼠体内以给药。然而，这些导管难以处理，并且需要与植入遥测设备所需的手术技能相当的手术技能，而与自发性BRS的测量相比，产生的科学结果较少。除了与使用注射药物测量BRS相关的技术问题外，还存在与药物作用本身相关的一些限制。确定 BRS 的传统方法包括推注血管活性药物。然而，推注血管收缩剂（例如去氧肾上腺素）或血管扩张剂（例如硝普钠）被认为是反射性心率适应血压变化的过度和非生理刺激18.压力感受器反射的自发活动也可以使用光谱方法量化。其中一种方法通过计算特定频带中心率变化与血压变化之间的比率来评估频域中的BRS18,19.其他光谱方法包括确定BP和HR的传递函数或BP和HR之间相干性的量化20,21.这些方法还需要遥测采集自发血压和心率参数，虽然它们适用于确定自发BRS，但它们需要密集的计算工具并且难以应用。此外，所有频谱方法都存在非平稳信号妨碍频谱方法应用的限制。特别是，通过要求患者停止呼吸，可以在人类患者中减少由呼吸节律诱导的光谱峰值，而这在小鼠中显然是不可能的。因此，小鼠的信噪比通常相当低。鉴于上述方法的局限性，我们倾向于确定小鼠BRS的序列方法。这种方法的一个相当大的优点是它是一种非侵入性技术，可在现实生活中提供自发BRS的数据。22.另一个重要的一点是，使用序列方法分析的序列的持续时间非常短，涉及3-5次。迷走神经对HR的反射调节非常快，并且在这些序列的时间范围内。因此，序列法非常适合评估迷走神经对BRS的贡献。相比之下，交感神经系统的调节要慢得多。事实上，在这些短序列中，交感神经系统的活动可以假设几乎是恒定的。因此，该方法被定制为选择性地检测迷走神经活动驱动的HR的反射变化。
BRS数据的解释
对于BRS功能障碍或BRS数据本身的解释，重要的是要考虑压力感受器反射所涉及的各个功能水平。在神经元水平上，反射的传入、中枢或传出成分可能会受到影响23。在心血管水平上，窦房结对ANS输入的反应可能降低或过度11，24。每个级别的变化都可能导致BRS的变化。为了剖析神经元和/或心脏机制是否负责观察到的BRS，心脏或神经元特异性基因缺失的变化，可以使用敲低或基因编辑方法。
协议中的关键步骤
该方案中最复杂和最关键的步骤是左颈动脉的准备和插管（步骤2.3）。尾部闭塞缝合线的张力必须足够高，以便在插管前完全停止血流。否则，即使是插管过程中少量的血液泄漏也会严重限制能见度，甚至导致小鼠流血致死。插管应在第一次尝试时成功。但是，在第一次尝试失败后，仍然可以仔细重试插管。
从颈部到左胁的中线切口和皮下隧道（步骤2.3）必须足够大，以便轻松引入发射器而不会用力，但也必须尽可能小以保持发射器就位。否则，需要用缝合材料或组织粘合剂将其锁定到位。由于小鼠的皮肤非常娇嫩，如果发射器的隧道太小，就会发生皮肤坏死。
如果心电图电极太长而无法放入皮下隧道（步骤2.4），则需要通过将电极缩短到适当的长度来形成新的尖端。电极必须在引线的整个长度上平放在主体上。过长的电极会干扰动物，它们会试图打开伤口以去除递质，导致组织刺激和伤口裂开的风险。当然，太短的引线不能延长，在这种情况下，电极可能无法以符合Einthoven II配置的方式定位。因此，我们建议确定相同性别、体重和遗传背景的死小鼠心电图导联的最佳长度。
如果小鼠没有正常的昼夜节律，则应在递质植入后给予更长的恢复时间，并且这不是所研究的小鼠系的表型（步骤2.7）。昼夜节律紊乱的另一个原因可能是测量期间动物设施或进入房间的人员的声学隔离不足。
心电图、血压和BRS数据分析很简单（步骤2.8）。最关键的一步是从数据分析中排除异位搏动、窦性停搏、心律失常发作或信号低质量的部分。
Disclosures
没有
Acknowledgments
这项工作得到了德国研究基金会[FE 1929/1-1和WA 2597/3-1]的支持。我们感谢Sandra Dirschl提供的出色技术援助和Julia Rilling的兽医建议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 1229 | anesthesia |
| B.Braun Injekt-F 1 mL syringe | Wolfram Droh GmbH, Germany | 9166017V | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer AG, Germany | ||
| Blunt dissecting scissors | Fine Science Tools GmbH, Germany | 14078-10 | |
| Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 115 | preemptive and post-operative pain relief |
| Cutasept F skin desinfectant | BODE Chemie GmbH, Germany | 9803650 | |
| Cotton Tipped Applicator sterile | Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany | 09-119-9100 | |
| Forceps - Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11253-25 | |
| Forceps - straight | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11008-13 | |
| Gauze swabs with cut edges, 7.5x7.5 cm, cotton | Paul Hartmann AG. Germany | 401723 | |
| HD?X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters | Data Sciences International, United States | ||
| Homothermic blanket system with flexible probe | Harvard Apparatus, United States | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18000-45 | |
| Ketamine 10% | Ecuphar GmbH, Germany | 799-760 | anesthesia |
| Magnet | Data Sciences International, United States | transmitter turn on/off | |
| Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter | Fine Science Tools GmbH, Germany | 12502-12 | |
| Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710005525 | 24 G needle |
| Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710004020 | 27 G needle |
| Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided) | Resorba Medical, Germany | PA10273 | lead fixation |
| Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided) | Resorba Medical, Germany | 4023 | skin closure |
| OPMI 1FR pro, Dissecting microscope | Zeiss, Germany | ||
| Pilca depilatory mousse | Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany | 6943151 | |
| PVP-Iodine hydrogel 10% | Ratiopharm, Germany | ||
| Ringer's lactate solution | B. Braun Melsungen AG, Germany | 401-951 | |
| Sensitive plasters, Leukosilk | BSN medical GmbH, Germany | 102100 | surgical tape |
| Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Surgibond tissue adhesive | SMI, Belgium | ZG2 | |
| Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided) | Resorba Medical, Germany | G2105 | lead preparation, ligation sutures |
| Trimmer, Wella Contura type 3HSG1 | Procter & Gamble | ||
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18403-11 | |
| Xylazine (Xylariem) 2% | Ecuphar GmbH, Germany | 797469 | anesthesia |
| Data acquisition and analysis | Source | ||
| DSI Data Exchange Matrix | Data Sciences International, United States | ||
| DSI Dataquest ART 4.33 | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
| DSI Ponemah | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
| DSI PhysioTel HDX-11 for mice | Data Sciences International, United States | ||
| DSI PhysioTel receivers RPC1 | Data Sciences International, United States | ||
| ecgAUTO v3.3.5.11 | EMKA Technologies | ECG and BP analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, United States |
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