Summary
Baroreflexen är en hjärtfrekvensregleringsmekanism av det autonoma nervsystemet som svar på blodtrycksförändringar. Vi beskriver en kirurgisk teknik för att implantera telemetrisändare för kontinuerlig och samtidig mätning av elektrokardiogram och blodtryck hos möss. Detta kan bestämma spontan baroreflexkänslighet, en viktig prognostisk markör för hjärt-kärlsjukdom.
Abstract
Blodtryck (BP) och hjärtfrekvens (HR) styrs båda av det autonoma nervsystemet (ANS) och är nära sammanflätade på grund av reflexmekanismer. Baroreflexen är en viktig homeostatisk mekanism för att motverka akuta, kortvariga förändringar i arteriellt BP och för att upprätthålla BP i ett relativt smalt fysiologiskt intervall. BP känns av baroreceptorer belägna i aortabågen och carotid sinus. När BP förändras överförs signaler till centrala nervsystemet och kommuniceras sedan till de parasympatiska och sympatiska grenarna i det autonoma nervsystemet för att justera HR. En ökning av BP orsakar en reflexminskning av HR, en minskning av BP orsakar en reflexökning av HR.
Baroreflexkänslighet (BRS) är det kvantitativa förhållandet mellan förändringar i arteriell BP och motsvarande förändringar i HR. Kardiovaskulära sjukdomar är ofta förknippade med nedsatt baroreflexfunktion. I olika studier har minskat BRS rapporterats vid t.ex. hjärtsvikt, hjärtinfarkt eller kranskärlssjukdom.
Bestämning av BRS kräver information från både BP och HR, som kan registreras samtidigt med telemetriska enheter. Det kirurgiska ingreppet beskrivs med början med införandet av trycksensorn i den vänstra halspulsådern och positionering av dess spets i aortabågen för att övervaka artärtrycket följt av den subkutana placeringen av sändaren och EKG-elektroderna. Vi beskriver också postoperativ intensivvård och smärtstillande behandling. Efter en tvåveckorsperiod av återhämtning efter operationen utförs långsiktiga EKG- och BP-inspelningar på medvetna och ohämmade möss. Slutligen inkluderar vi exempel på högkvalitativa inspelningar och analys av spontan baroreceptorkänslighet med hjälp av sekvensmetoden.
Introduction
Den arteriella baroreceptorreflexen är det viktigaste återkopplingskontrollsystemet hos människor som ger en kortvarig - och möjligen också långsiktig 1,2 - kontroll av arteriellt blodtryck (ABP). Denna reflex buffrar störningar i BP som uppstår som svar på fysiologiska eller miljömässiga triggers. Det ger snabba reflexförändringar i hjärtfrekvens, slagvolym och totalt perifert arteriellt motstånd. Reflexen har sitt ursprung i sensoriska nervändar i aortabågen och halspulsådern. Dessa nervterminaler utgör de arteriella baroreceptorerna. Somata av nervterminaler i aortabågen är belägna i nodose ganglion medan de av nervterminaler i carotid sinus är belägna i petrosal ganglion. Reflexen utlöses av en ökning av blodtrycket, vilket sträcker sig och aktiverar baroreceptornervterminalerna (figur 1A). Aktivering resulterar i aktionspotentialvolleys som överförs centralt via afferenta aortadepressivor och carotid sinusnerver till kardiovaskulära hjärnstamkärnor såsom kärnan tractus solitarii och dorsala kärnan i vagusnerven. Förändringar i afferent nervaktivitet modulerar i sin tur den autonoma efferenta aktiviteten. Ökad aktivitet av baroreceptornerver minskar sympatisk och ökar parasympatisk nervaktivitet. Således är konsekvenserna av aktivering av baroreceptorer en minskning av hjärtfrekvens, hjärtminutvolym och vaskulär resistans som tillsammans motverkar och buffrar ökningen av blodtrycket3. Däremot ökar minskad aktivitet av baroreceptornerver sympatisk och minskar parasympatisk nervaktivitet, vilket ökar hjärtfrekvensen, hjärtminutvolymen och vaskulär resistans och därmed motverkar minskningen av blodtrycket.
Många studier på människor och djur har visat att baroreceptorreflexen kan justeras under fysiologiska förhållanden som träning4, sömn5, värmestress6 eller graviditet7. Dessutom finns det bevis för att baroreflexen är kroniskt nedsatt vid hjärt-kärlsjukdomar, såsom högt blodtryck, hjärtsvikt, hjärtinfarkt och stroke. Faktum är att baroreflexdysfunktion också används som en prognostisk markör vid flera hjärt-kärlsjukdomar 8,9,10. Vidare är dysfunktion av baroreflexen också närvarande vid störningar i ANS. Med tanke på baroreceptorreflexens betydelse för hälsa och sjukdomstillstånd är in vivo-uppskattning av denna reflex en viktig komponent i autonom och kardiovaskulär forskning med vissa allvarliga kliniska konsekvenser.
Genetiska muslinjer är viktiga verktyg inom kardiovaskulär forskning. In vivo-studier av sådana muslinjer ger värdefulla insikter i kardiovaskulär fysiologi och patofysiologi och fungerar i många fall som prekliniska modellsystem för kardiovaskulära sjukdomar. Här tillhandahåller vi ett protokoll för telemetrisk in vivo EKG- och BP-inspelning i medvetna, ohämmade, fritt rörliga möss och beskriver hur baroreflexkänslighet kan bestämmas från dessa inspelningar med hjälp av sekvensmetoden (Figur 1B). Den tillämpade metoden kallas sekvensmetoden, eftersom beat-to-beat-serien av systoliska BP (SBP) och RR-intervall screenas för korta sekvenser av tre eller flera slag under spontan ökning eller minskning av SBP med reflexanpassning av HR. Denna metod är guldstandarden för baroreflexkänslighetsbestämning eftersom endast spontana reflexmekanismer undersöks. Tekniken är överlägsen äldre tekniker som involverade invasiva procedurer såsom injektion av vasoaktiva läkemedel för att inducera BP-förändringar.
Figur 1: Schematisk representation av baroreflex- och baroreflexkänslighetsbedömningen med hjälp av sekvensmetoden . (A) Baroreflexens förlopp under en akut blodtryckshöjning. En kortvarig ökning av ABP känns av baroreceptorer som ligger i aortabågen och carotid sinus. Denna information överförs till centrala nervsystemet och inducerar en minskning av sympatisk nervaktivitet parallellt med en ökning av parasympatisk aktivitet. Frisättning av acetylkolin från nervändar belägna i sinoatriella nodregionen inducerar en minskning av den andra budbäraren cAMP i sinoatriella nodpacemakerceller och därmed en minskning av hjärtfrekvensen. En kortvarig minskning av blodtrycket har motsatt effekt. (B) Schematiska BP-spår under en uppåtsekvens (övre vänstra panelen) och nedåtsekvens (övre högra panelen) av tre på varandra följande slag. En uppåtsekvens är associerad med en parallell ökning av RR-intervall (nedre vänstra panelen) vilket motsvarar en minskning av HR. En nedåtsekvens är associerad med en parallell minskning av RR-intervall (nedre högra panelen) vilket motsvarar en ökning av HR. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protocol
Utföra alla djurstudier i enlighet med lokala institutionella riktlinjer och nationella lagar om djurförsök. För detta experiment godkändes studierna av Regierung von Oberbayern och var i enlighet med tyska lagar om djurförsök. WT-djur (C57BL/6J-bakgrund) och djur med mus med sjuka sinussyndrom som uppvisar ökad BRS-känslighet (Hcn4tm3(Y527F; R669E; T670A)Biel)11 (blandad C57BL/6N och 129/SvJ bakgrund) användes för denna studie.
1. Inställning av utrustning
- Ta bort en telemetrisk sändare från dess sterila förpackning och förkorta EKG-ledningarna till den längd som är lämplig för musens storlek. För en 12 veckor gammal svart sexmus hane (C57BL / 6J), som väger ~ 30 g, förkorta den positiva ledningen (röd) till en längd av ~ 45 mm och den negativa ledningen (färglös) till en längd av ~ 40 mm med sax.
OBS: Dessa värden anges som orientering och måste anpassas vid behov (figur 2). - Ta bort cirka 6 mm av EKG-kabelns silikonslang med en skalpell för att exponera tråden. Täck trådspetsarna med överdriven slang och lämna en ~ 2 mm del av EKG-tråden avtäckt för att registrera elektriska signaler. Säkra silikonslangen med icke-absorberbart 5-0 silkesuturmaterial (figur 2A).
- Skriv ner sändarens serienummer i operationsprotokollet (kompletterande fil 1).
- Hydrera sändaren i varm, steril 0,9 % NaCl-lösning.
- Väg musen och registrera dess vikt.
- Autoklav alla kirurgiska instrument före operationen. Sterilisera dem under operationen och mellan att driva olika djur med torr värme med en varm glaspärlsterilisator.
OBS: Kirurgiska instrument måste svalna till rumstemperatur före användning för att förhindra hudbrännskador. - Desinficera arbetsbänken för att säkerställa aseptiska förhållanden.
2. Kirurgisk implantation av telemetriska transmittorer för kombinerade EKG- och blodtrycksmätningar
- Dissektion av den vänstra gemensamma halspulsådern.
- Bedöva en mus genom intraperitoneal injektion av anestesiblandning (100 mg/kg ketamin; 15 mg/kg xylazin; 1 mg/kg acepromazin). Utför ett tånyptest för att säkerställa att musen är helt bedövad innan operationen påbörjas.
- Använd en trimmer för att raka det kirurgiska området från under hakan mot de tvärgående bröstmusklerna.
- Placera musen i ryggläge på en temperaturkontrollerad operationsplatta inställd på 37 °C. Säkra lemmarna med kirurgisk tejp och övervaka kontinuerligt kroppstemperaturen med en rektal termometer (figur 2C). Om kroppstemperaturen sjunker under 37 °C, täck djurets kropp med steril bomullsgas under operationen.
- Applicera ögonsalva för att skydda djurets ögon under anestesi.
- Applicera hårborttagningskräm på det tidigare rakade kirurgiska området. Ta bort hår och hårborttagningskräm med en bomullspad och varmt vatten efter 3-4 min. Se till att huden är ren och fri från kvarvarande hår och hårborttagningskräm, så att såret inte kommer att förorenas under operationen.
- Desinficera huden med flera alternerande omgångar av povidon-jod eller klorhexidinskrubb följt av alkohol.
- Placera djuret under ett dissekerande mikroskop och placera ett sterilt draperi runt operationsområdet.
- Gör ett 1-1,5 cm mittlinjesnitt genom huden på halsen, börja omedelbart under hakan. Ansträng dig för att göra snittet så rakt som möjligt. (Figur 2D).
Anmärkning: Under följande steg måste operationsområdet hållas fuktigt genom regelbunden applicering av steril, varm (37 °C) 0,9 % NaCl. - Skapa ett subkutant utrymme på båda sidor av snittet genom att separera huden från underliggande bindväv med trubbig dissektionssax. Var försiktig så att du inte klämmer i huden för starkt med pincetten, eftersom detta kan orsaka nekros och leda till försämrad sårläkning efter operationen.
- Separera parotid- och submandibulära körtlar med bomullsspetsapplikatorer för att exponera muskulaturen som ligger över luftstrupen.
- Dra tillbaka vänster spottkörtel med krökta dissektionspincett för att identifiera den vänstra halspulsådern som ligger lateralt till luftstrupen (figur 2E).
- Dissekera försiktigt halspulsådern från intilliggande vävnad med hjälp av böjda pincett. Var mycket försiktig så att du inte skadar vagusnerven som löper längs kärlet. Fortsätt trubbig dissektion för att exponera den vänstra halspulsådern till cirka 10 mm i längd och separera den helt från vaskulär fascia och vagusnerven (figur 2F).
- För en icke-absorberbar, 5-0 silkesutur under den isolerade delen av halspulsådern medan du lyfter blodkärlet något med böjda pincett för att minska friktionen mellan suturen och halspulsådern, eftersom detta lätt kan skada kärlväggen.
- Placera suturen kranialt, precis proximalt till bifurkationen av halspulsådern, bilda en knut och binda den för att permanent ligera kärlet (figur 2G). Fäst båda ändarna av kranial ocklusionssutur på operationsbordet med kirurgisk tejp.
- För en andra ocklusionssutur under halspulsådern och placera den kaudalt på ~5 mm avstånd till kranialsuturen (figur 2H). Det behövs för tillfällig ocklusion av blodflödet under kanylering av artären. Bind därför en lös knut och fixa båda suturändarna med kirurgisk tejp.
- Placera en tredje sutur (säker sutur) mellan kranial- och caudal ocklusionssutur och gör en lös knut (figur 2I). Denna sutur behövs för att hålla katetern på plats medan kanylering av artären. Tejpa ena änden av suturen på operationsbordet.
- Kanylering av den vänstra gemensamma halspulsådern.
OBS: Blodtryckskateterns sensorområde är beläget 4 mm från den distala änden och består av ett rör innehållande en icke-komprimerbar vätska och en biokompatibel gel (figur 2B). Eftersom detta område är mycket känsligt, se till att det är fritt från luftbubblor och rör inte vid det när som helst under proceduren.- Böj spetsen på en 24 G nål till en vinkel på ~ 100 ° för att använda den som en kateterintroducerare.
- Dra försiktigt i den kaudala ocklusionssuturen och fixera den med spänning för att tillfälligt stoppa blodflödet och lyfta artären något.
- Penetrera försiktigt artären proximalt till kranial ocklusionssutur med den böjda nålen (figur 2J). Ta tag i katetern med kärlkanylpincett, för in den i den lilla punkteringen och låt den sakta glida in i kärlet. Dra försiktigt tillbaka den böjda nålen samtidigt (bild 2K).
- När katetern når den kaudala ocklusionssuturen dra åt den säkra suturen något för att hålla katetern på plats (figur 2L).
- Lossa den kaudala ocklusionssuturen så att katetern kan flyttas ytterligare tills dess spets är placerad i aortabågen.
OBS: Var noga med att bestämma kateterns korrekta införingslängd, eftersom det beror på musens storlek. För hanmöss med C57BL / 6J-bakgrund vid 12 veckors ålder och ~ 30 g kroppsvikt rekommenderar vi att katetern sätts in tills det integrerade hacket når kranial ocklusionssutur. Korrekt införingsdjup och placering av katetern för den specifika muslinjen kan verifieras efter avlivning av djuret. - När den är korrekt placerad, säkra katetern med alla tre suturerna och skär ändarna så korta som möjligt. Dra inte i knutarna för hårt eftersom det kan skada den ömtåliga blodtryckskatetern.
Figur 2: Implantation av en kombinerad EKG- och blodtryckssändare - kanylering av vänster halspulsåder . (A) Telemetrisändaren består av en tryckkateter, två biopotentiella elektroder och enhetens kropp. (B) Schematisk representation av tryckkatetern. Sensorområdet består av en icke-komprimerbar vätska och en biokompatibel gel. Katetern måste sättas in i halspulsådern tills skåran är i nivå med kranial ocklusionssutur för att säkerställa korrekt position i blodkärlet. (C) Sövd C57BL / 6J-mus förberedd för implantation av kirurgisk sändare. (D-L) Bildsekvens som visar kirurgiskt ingrepp för kanylering av vänster halspulsåder. (D) Snitt i livmoderhalshud. (E) Exponerad luftstrupe för att identifiera den vänstra halspulsådern som ligger lateralt till luftstrupen. (F) Trubbigt dissektion för att isolera artären från intilliggande vävnad och vagusnerven. (G) Permanent ligering av vänster halspulsåder med sutur vid kranial ocklusion. (H) Spänning som appliceras på caudal ocklusionssutur för att tillfälligt stoppa blodflödet. (I) Säker sutur för att hålla katetern på plats under cannulation. (J) Kanyl med böjd spets för införande av katetern i blodkärlet. (K) Tryckkateter sätts in i halspulsådern. (L) Kateterspetsen placeras i aortabågen och katetern säkras med mittsuturen. Skalstång i D - L visar 4 mm. Omtryckt från16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Placering av telemetrienhetens kropp i en subkutan ficka på musens vänstra sida (figur 3).
- Forma en subkutan tunnel från halsen riktad mot djurets vänstra flank och bilda en liten påse med en liten, trubbig dissekeringssax (figur 3B).
- Bevattna tunneln med en 1 ml spruta fylld med varm, steril 0,9% NaCl-lösning och för in ~300 μL av lösningen i påsen (figur 3C).
- Lyft försiktigt huden med trubbig pincett och för in sändarenhetens kropp i påsen (bild 3D). Under detta steg, var mycket försiktig så att du inte drar blodtryckskatetern ur halspulsådern.
- Placering av EKG-ledningar i Einthoven II-konfiguration.
- Forma en tunn tunnel till höger bröstmuskel med trubbig dissekeringssax och placera den negativa (färglösa) ledningen i tunneln med trubbiga pincett. Fäst den slutliga änden av ledningen med ett stygn till bröstmuskeln med 6-0 absorberbart suturmaterial (figur 3E).
- Forma en ögla i den positiva (röda) ledningen, placera spetsen i den vänstra kaudala revbensregionen och säkra dess position med en sutur med 6-0 absorberbart suturmaterial.
OBS: Det är viktigt att båda ledningarna ligger platt mot kroppen i hela sin längd för att undvika vävnadsirritation (figur 3F). - Stäng huden med enkla knutar med 5-0 icke-absorberbart suturmaterial (figur 3H). Applicera dessutom en liten mängd vävnadslim på varje knut för att hindra djuret från att bita suturen och förhindra dehiscens.
- Applicera povidon-jodhydrogel 10% på såret för att förhindra sårinfektion under återhämtningsfasen.
- För förebyggande smärtlindring, injicera 5 mg/kg karprofen i 0,9 % NaCl subkutant medan musen fortfarande är anestesi.
- Ställ in en värmeplattform på 39 ± 1 °C och placera musen i en separat bur. Placera hälften av buret på plattformen i 12 timmar efter operationen och överför musen i det varma området. När djuret vaknar från anestesi har det möjlighet att stanna i det varma området eller flytta till den kallare delen av buret.
Figur 3: Implantation av en kombinerad EKG- och blodtryckssändare - subkutan placering av EKG-elektroderna och enhetens kropp. (A) Mus efter insättning av blodtryckskatetern. Kateterpositionen säkras av ocklusionssuturerna. (B) Bildar en subkutan ficka på djurets vänstra sida med trubbig sax. (C) Påsen bevattnas med ~ 300 μL varm steril saltlösning. (D) Enhetens kropp placeras i den subkutana fickan. (E) Den negativa elektrodens terminalände (färglös) är fixerad till höger bröstmuskel med absorberbart suturmaterial. (F) Fixering av den positiva elektroden (röd) till vänster interkostala muskler. (G) Placering av en permanent sutur på bröstmuskeln för att säkra EKG-elektrodernas position. (H) Musen efter hudförslutning. EKG-elektrodspetsarnas subkutana positioner indikeras med röda cirklar. I demonstrationssyfte användes ett dött djur för att ta dessa bilder. Följ sterila rutiner när du använder ett levande djur. Omtryckt från16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Postoperativ vård
- För postoperativ smärtlindring, injicera 5 mg / kg karprofen i 0,9% NaCl subkutant var 12: e timme i 3-5 dagar tills såret har läkt.
- Injicera 10 μl/g varm ringerlaktatlösning intraperitonealt för att skydda djuret mot uttorkning.
- Låt musen återhämta sig i 2-3 veckor innan du kör de första telemetriska mätningarna. Övervaka noggrant allmänna hälsotillstånd, sårläkning, kroppsvikt och mat- och vattenintag under återhämtningsperioden.
- I slutet av experimentet, avliva musen genom inandning av koldioxid (CO2).
OBS: Cervikal dislokation eller halshuggning rekommenderas inte som eutanasimetod eftersom detta kan skada delar av EKG- och BP-sändaranordningen.
- Datainsamling.
- Vidta åtgärder för att undvika akustiskt och elektroniskt brus under datainspelning. Dessutom begränsa tillgången till personal under dataregistrering och slutföra alla djurhållningsprocedurer före experimentet.
- Placera djurets bur på telemetrimottagarplattan och slå på den telemetriska sändaren genom att föra en magnet nära djuret.
- Få kontinuerliga EKG-, blodtrycks- och aktivitetsregistreringar under 72 timmar (12 timmars mörker/ljuscykel) med datainsamlingsprogramvara (figur 4).
- Analys av dygnsrytmen av hjärtfrekvens, blodtryck och aktivitet.
- Kontrollera förekomsten av en regelbunden dygnsrytm av HR, BP och aktivitet med hjälp av datainsamlingsprogramvara12 (figur 5).
- Dataanalys inklusive bestämning av baroreceptorkänslighet med hjälp av sekvensmetoden med EKG- och BP-analysprogramvara.
- Exportera BP- och HR-data från datainsamlingsprogramvara till EKG- och BP-analysprogramvara (kompletterande fil 2). Använd följande sekvens av kommandon: Öppna EKG- och BP-analysprogramvara > Fil > Rådata från omvandlare > Konvertera icke-IOX rådata. I det nya fönstret klickar du på Arkiv > Läs in Dataquest ART4-data. Återigen öppnas ett nytt fönster, välj datafil för export > Nytt fönster öppnas, välj djur från listan "ämnen" och välj EKG och BP från "vågformslista" och tryck på OK. Välj djur från vilka data ska konverteras genom att klicka på Konvertera data > Skapa binär IOX-platsfil.
- Öppna IOX binär platsfil i EKG- och BP-analysprogramvara med hjälp av följande kommandosekvens: Fil > Läs in IOX-data > Välj BP- och EKG-spårning > tryck på den gröna bocken.
OBS: Följande databehandlingsparametrar är optimerade för data som förvärvats från vildtypsmöss och bör i princip passa alla musmodeller som används inom prekliniskt fält. Anpassning av dessa parametrar kan dock vara nödvändig när man arbetar med specifika experimentella modeller, t.ex. möss med extremt höga eller låga HR- och/eller BP-värden, eller olika gnagararter. I vilket fall som helst måste databehandlingsparametrar granskas noggrant för att säkerställa att de passar den specifika modellen som studeras. - För inställningar för EKG-, BP- och BRS-analys se Supplemental File 3,4. För BRS-analys på möss justerar du BRS-parametrarna för att detektera endast sekvenser med tre (eller fler) slag som uppvisar en fördröjning mellan SBP och RR på ett slag och ställer in tröskelvärdet för SBP- och RR-ändring till 0,5 mmHg och 2 ms. Se till att korrelationskoefficienten för regressionslinjens lutning från RR/SBP-diagram är större än 0,75 och analysera endast sektioner som uppvisar stabil sinusrytm. Ställ in parametrar för EKG-, BP- och BRS-analys i enlighet med detta med hjälp av följande kommandosekvens: Justera > analysinställningar > nytt fönster öppnas
- EKG-inställningar (högerklicka i fönstret "EKG-läge och signalfiltrering" (tilläggsfil 3)). Ställ in parametrarna enligt beskrivningen här. Läge: EKG, endast RR, Filterläge: auto, enligt inställd HR, Förväntad hjärtfrekvens: bpm > 300, Baslinjeborttagningsfilterbredd (ms): 100.00, Bredden på brusborttagningsfiltret: 1.00 ms, Hackfilter: 50.0 Hz, Spikborttagningsfilter: av, Drop-out-detekteringsläge: av, Max RR-längder (ms): 900.00, RR från justerade R-toppar: av, RR_only inställningsläge: Xsmall: mus, R-toppbredd (ms): 10,00, PR-bredd (ms): 20,00, RT-bredd (ms): 50,00, Max interbeatartefakt (%): 50,00, R till annat amplitudförhållande: 3,00, R-topptecken: positivt och Compute extra-parameter: av
- För blodtrycksinställningarna (BP, tryckinställningar) högerklickar du på fönstret "BP-analysator" (kompletterande fil 4). Ställ in parametrarna enligt beskrivningen här. Bredd på brusborttagningsfilter (ms): 10.00, Derivatfilterbredd (ms): 6.00, Hackfilter: 50.0 Hz, Filter för borttagning av spetsar: av, Valideringströskel (kal. enhet): 12.00, Avvisningströskel (kal. enhet): 8.00, Derivata vid början uppslag (cal U/s): 10.00, Avvisningsgränser: av, Fördröjning från referens-EKG: användardefinierat fönster, Min fördröjning från EKG Rpeak (ms): 10.00, Max fördröjning från EKG Rpeak (ms): 250.00, Conduct_time_1 från märke: ej beräknat, Conduct_time_2 från märke: ej beräknat, BR (andningsfrekvens): av, BRS (baroreflexkänslighet): på, Minsta slag i följd: 3, Slagnummer: 1, Tryckvärde: SBP, Markera för att beräkna pulsintervall: R, Minsta tryckvariation (caIU): 0,50, Minsta intervallvariation (ms): 2,00, Minsta korrelation: 0,75
- Skärma aktivitetssignalen för en 3-timmarssekvens med låg aktivitet. Utför BRS-analysen i detta tidsfönster eftersom hög aktivitet hos djuren stör BP- och RR-korrelationen.
- Utför en BP- och RR-analys under detta 3-timmarsfönster medan du delar upp 3-timmarsanalysen i 10 minuters steg.
- Utför BRS-analys med hjälp av följande kommandosekvens: Öppna BRS-analysfönstret > Visa > BRS-analys. Detta öppnar BRS-analyspanelen. Inspektera manuellt varje sekvens som visas i BRS-analyspanelen och uteslut ektopisk takt, sinuspauser, arytmiska händelser eller bullriga data. Se till att ogiltigförklara varje enskilt slag av sådana sekvenser för att framgångsrikt utesluta dem från analysen.
- Exportera resultaten av BRS-analysen till en kalkylarksfil (resultatfil). Ändra parametrarna som exporteras till kalkylbladsfilen med hjälp av följande kommandosekvens (tilläggsfiler 5–7):
- Justera > Parametrar i lista/till fil > avsnitt > txt (tilläggsfil 5). Välj avsnittet "beats" och alla andra avsnitt som innehåller information av intresse förutom avsnittet ogiltigförklarade beats.
- Justera > Parametrar i lista/till-fil > steg > txt (tilläggsfil 6). Välj stegvärden som ska exporteras.
- Ställ in > Parametrar i lista / till fil > slår -> txt (tilläggsfil 7).
- Kontrollera att beats-avsnittet i filen innehåller minst följande data för varje taktslag. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (= på varandra följande taktintervall i sekvensen), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=RR för efterföljande slag)
- Klicka sedan på Arkiv > Spara resultatfil.
- Sortera exporterade data för upp- och nedsekvenser med hjälp av filterfunktionen i Excel (kompletterande fil 8). Beräkna antalet sekvenser, genomsnittlig BRS-lutning, standardavvikelse och standardfel för BRS-lutning för upp- och nedsekvenser separat. Beräkna också den totala mängden sekvenser per 1000 slag.
OBS: En kalkylarksmall (TemplateBRS) för automatiserad sortering och analys av upp- och nedsekvenser finns i tillägget (kompletterande fil 8) och underlättar analysen. Genom att justera filterfunktionen kan du sortera sekvenser efter olika taktnummer (t.ex. tre- eller fyrtaktssekvenser). För ytterligare detaljer se Tilläggsfiler 9-13.- Öppna resultatfilen och TemplateBRS Excel-filen (kompletterande fil 8). Kopiera data från följande kolumner från resultatfilen: (Tryck)_BRS_deltaP, (Tryck)_BRS_# och (Tryck)_BRS_slope (Kompletterande fil 9). Klistra in data i respektive kolumner i kalkylbladen "Uppsekvenser" och "Nedsekvenser" i TemplateBRS-filen (kompletterande fil 10). Kopiera dessutom data i kolumnen (Tryck)_BRS_SBP från resultatfilen (kompletterande fil 11) och klistra in den i kalkylbladet "Alla sekvenser" i TemplateBRS-filen (kompletterande fil 12).
OBS: Numret i kolumnen (Pressure)_BRS_# visas endast i den sista takten i en sekvens och visar sekvenslängden. Upp- och nedsekvenser kan särskiljas med tecknet på (Tryck)_deltaP värdet. Negativa värden för det andra och tredje taktslaget i en tretaktssekvens indikerar en nedåtsekvens. Positiva värden anger en uppåtgående sekvens. - Filtrera kopierade data med standardfilterinställningarna. Klicka på filterikonen för kolumnen (Pressure)_BRS_# och tryck på "ok" (Supplemental File 13). Använd det här steget på kalkylbladen "Uppsekvenser" och "Nedsekvenser".
Kalkylbladet filtrerar efter tretaktssekvenser. Om andra sekvenslängder begärs måste inställningen för denna kolumn ändras i rullgardinsmenyn. Beräkningar för antal sekvenser, genomsnittlig BRS-lutning, standardavvikelse och standardfel för BRS-lutning visas i de gröna rutorna i kalkylbladen "Uppsekvenser" och "Nedsekvenser". Beräkningar för det totala antalet sekvenser per 1000 slag visas i den gröna rutan i kalkylbladet "Alla sekvenser".
- Öppna resultatfilen och TemplateBRS Excel-filen (kompletterande fil 8). Kopiera data från följande kolumner från resultatfilen: (Tryck)_BRS_deltaP, (Tryck)_BRS_# och (Tryck)_BRS_slope (Kompletterande fil 9). Klistra in data i respektive kolumner i kalkylbladen "Uppsekvenser" och "Nedsekvenser" i TemplateBRS-filen (kompletterande fil 10). Kopiera dessutom data i kolumnen (Tryck)_BRS_SBP från resultatfilen (kompletterande fil 11) och klistra in den i kalkylbladet "Alla sekvenser" i TemplateBRS-filen (kompletterande fil 12).
Representative Results
Positiva resultat för EKG- och BP-rådata
Med hjälp av detta protokoll kan högkvalitativa EKG- och BP-data erhållas (figur 4 och kompletterande fil 14), vilket inte bara möjliggör exakt BRS-analys utan också för analys av ett brett spektrum av EKG- eller BP-härledda parametrar, t.ex. EKG-intervall (figur 4B, övre panelen), blodtrycksparametrar (figur 4B, nedre panelen), hjärtfrekvens och blodtrycksvariation, Arytmidetektion etc12,13,14,15.
Figur 4: Telemetriska EKG- och BP-inspelningar. (A) Representativa EKG-spår av hög kvalitet (övre panelen) och motsvarande högkvalitativa råa BP-inspelningar (nedre panelen). (B) Förstoring av EKG-spår (övre panelen). P-våg, QRS-komplex, T-våg och RR-intervall anges. Förstoring av motsvarande BP-data (nedre panelen). Diastoliskt BP (DBP) och systoliskt BP (SBP) indikeras. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Positiva resultat för dygnsrytmen
En frisk mus som har återhämtat sig tillräckligt från operationen visar en fysiologisk ökning av aktivitet, HR och BP under aktivitetsfasen (mörk) (figur 5). Många olika faktorer kan störa denna regelbundna dygnsrytm. Dessa inkluderar psykisk stress, akustiskt eller elektriskt brus och smärta. Till exempel skulle ett akut smärttillstånd omedelbart efter operationen resultera i en ökning av hjärtfrekvensen med en samtidig minskning av aktiviteten. Därför är dygnsrytmen en viktig indikator för djurs hälsa och välbefinnande och bör rutinmässigt kontrolleras före BRS-analys.
Figur 5: Analys av långsiktiga telemetrimätningar för att bestämma dygnsrytmvariationer. Dygnsrytm av hjärtfrekvens (A), aktivitet (B), systoliskt blodtryck (C) och diastoliskt blodtryck (D) i genomsnitt från 9 manliga vildtyp C57BL / 6J möss under 12 h ljusa och mörka cykler. Grå områden visar aktiviteten (mörk) fas och vita områden visar djurens vilofas (ljus). Alla parametrar är fysiologiskt förhöjda under djurets aktivitet (mörka) fas. Data representeras som medelvärde +/- SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Positiva resultat för BRS-analys
Efter att ha utfört analysen enligt beskrivningen i protokollavsnitt 2.8 kommer programvaran att upptäcka upp- respektive nedsekvenser. Metoden som används kallas sekvensmetod eftersom förändringar i SBP- och RR-intervall undersöks på slag-för-slag-basis under korta sekvenser av tre eller fler slag med en spontan ökning eller nedgång i SBP (figur 6). En kontinuerlig höjning av SBP över tre hjärtslag orsakar en reflexökning av parasympatisk aktivitet och saktar följaktligen ner HR, vilket motsvarar längre RR-intervall. Latensen för reflex HR-anpassning är ett slag. En sådan sekvens visas i figur 6A och definieras som en uppåtsekvens. Däremot definieras en kontinuerlig minskning av SBP över tre slag med parallell ökning av HR (minskning av RR-intervall) som en nedåtsekvens (figur 6B). För att utvärdera korrelationen mellan RR och SBP plottas båda parametrarna mot varandra och lutningen (ms/mmHg) för den linjära regressionslinjen beräknas för varje sekvens (figur 6A,B, nedre paneler). Efter sortering efter upp- och nedsekvenser kan det genomsnittliga antalet sekvenser per 1000 slag (figur 6C) och genomsnittlig förstärkning av spontan BRS beräknas för upp- respektive nedsekvenser (figur 6D,E). Förstärkningen av spontan BRS återspeglas av lutningen på den linjära regressionslinjen beräknad från RR/SBP-relationen. Avvikelsen från normala BRS-värden kan ha olika orsaker. Dessa inkluderar förändringar i ANS-ingång eller förändringar i responsen hos den sinoatriella noden till ingång från autonoma nervsystemet. I figur 6 visas ökad BRS i en musmodell för sick sinus syndrome (SSS) med överdriven respons hos den sinoatriella noden till vagal inmatning11.
Figur 6: Uppskattning av BRS med sekvensmetoden. (A) Representativt BP-spår av en vildtyp C57BL/6J-mus under en uppsekvens av tre på varandra följande slag (övre panelen) associerad med en parallell ökning av RR-intervallet (mittpanelen) vilket motsvarar en minskning av HR. RR-intervallen plottades mot SBP (nedre panelen). Regressionslinjens lutning (röd linje) för uppsekvensen som avbildas i den övre och mellersta panelen (WT, svarta cirklar) var 4,10 ms/mmHg. Ett representativt RR/SBP-förhållande för musmodellen med sick sinus syndrom gav en ökad lutning på 6,49 ms/mmHg vilket indikerar förhöjd BRS (SSS, grå cirklar). (B) Representativ nedåtsekvens för en vildtypsmus med en minskning av SBP (övre panelen) och en efterföljande minskning av RR-intervallet (mittpanelen) vilket resulterar i en BRS-lutning på 4,51 ms/mmHg (nedre panelen; WT, svarta cirklar). Ett representativt RR/SBP-förhållande för musmodellen med sjukt sinussyndrom (SSS, grå cirklar) med en lutning på 7,10 ms/mmHg. Orienteringen av de röda pilspetsarna indikerar sekvensernas riktning (upp eller ner sekvens). (C) Total mängd sekvenser per 1000 slag för WT- och SSS-möss. (D) Genomsnittlig lutning för RR/SBP-förhållandet för uppåtsekvenser för WT- och SSS-möss. (E) Genomsnittlig lutning för RR/SBP-förhållandet för nedåtsekvenser för WT- och SSS-möss. Statistik i (C-E) utfördes från resultat från sex manliga WT-djur och åtta handjur av musmodellen med sick sinus-syndrom. Boxplots visar medianlinjen, perc 25/75 och min/max-värde; Öppna symboler representerar medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Negativt resultat för rådatakvalitet
Särskilt under faser med högre aktivitet kan signalkvaliteten minska (figur 7 och kompletterande filer 15,16). Detta kan orsakas av tillfällig förskjutning eller felaktig position av antingen BP-katetern eller EKG-ledningarna eller båda på grund av djurets rörelse. Dessutom kan skelettmuskelaktivitet detekteras från EKG-ledningarna och inducera buller (figur 7B, övre panelen). Med de programvaruinställningar som beskrivs ovan detekteras inte dessa slag av låg kvalitet och utesluts därför från analys. Manuell inspektion av analyserade rådata är dock obligatorisk.
Figur 7: Exempel på råsignaler av låg kvalitet. (A) EKG-signal (övre panel) detekteras med god kvalitet, men BP-signalkvaliteten (nedre panelen) är låg. (B) Kvaliteterna för EKG (övre panel) och BP (nedre panel) signal är inte tillräckliga. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Negativa resultat för BRS-analys
BRS-analysinställningarna som anges i protokollavsnitt 2.8.3 är i allmänhet väsentliga för snabb och korrekt detektering av upp- och nedsekvenser. Den minsta korrelationskoefficienten för regressionslinjen är satt till 0,75. Om du ställer in för låga värden för den minsta korrelationskoefficienten resulterar det i falska detektioner av sekvenser som inte återspeglar baroreflexaktivitet utan snarare är resultatet av arytmiska slag (figur 8). För BRS-analys måste endast episoder med stabil sinusrytm analyseras. Ektopisk beats eller andra arytmiska händelser, t.ex. sinuspauser, kan hittas med HRV-alternativet EKG och BP-analysprogramvara och måste ogiltigförklaras.
Figur 8: Sekvenser som inte återspeglar baroreflexaktivitet . (A) EKG-spår av en mus med mild sinusdysrytmi. (B) BP-inspelning som visar en spontan ökning av SBP. (C) Motsvarande RR-intervall indikerar en minskning av HR vid ökningen av BP. (D) Plot of SBP och motsvarande RR-intervall. Regressionslinjens låga korrelationskoefficient indikerar att HR-reduktion inte orsakades av baroreflexens aktivitet utan snarare av sinusdysrytmi. (E) Rå EKG-spår som visar en sinuspaus. (F) Motsvarande rå BP-signal. Sinuspausen orsakar en minskning av diastoliskt blodtryck. Systoliskt blodtryck i efterföljande slag är nästan opåverkat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Operationsprotokoll. Mall för dokumentation av det kirurgiska ingreppet och postoperativ vård. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Konvertera Dataquest A.R.T-data till IOX-data för analys i ecgAUTO-programvaran. Välj djur i ämneslistan (vänster) och Tryck och EKG i vågformslistan (höger). Tryck på OK för att konvertera data. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 3: EKG-inställningar för BRS-analys. Ställ in parametrar enligt listan, tryck på ok och använd konfigurationen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 4: BP-inställningar för BRS-analys. Ställ in parametrar enligt listan, tryck på ok och använd konfigurationen. Spara konfigurationen som en konfigurationsfil för att enkelt kunna ladda inställningarna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 5: Parametrar i list/till-filfönster för "sektioner". Välj avsnitt som ska exporteras under rubriken avsnitt > txt (vald) och tryck på Använd!. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 6: Parametrar i list/till fil-fönster för "steg". Välj stegdata som ska exporteras under stegen > txt-rubriken (vald) och tryck på Verkställ!. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 7: Parametrar i list/till filfönster för "beats". Välj värden som ska exporteras under beats > txt-rubriken (vald) och tryck på Verkställ!. För BRS-analys är de kryssade parametrarna nödvändiga. Notera valordningen som anges av siffrorna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 8: TemplateBRS-kalkylbladsfil. Kalkylarksmall för automatiserad sortering och analys av upp- och nedsekvenser. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 9: Kopiera relevanta data från resultatfil I. Kopiera kolumnerna (Pressure)_BRS_deltaP, (Pressure)_BRS_# och (Pressure)_BRS_slope från resultatfilen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 10: Kalkylbladsmallfil (TemplateBRS) för datasortering och analys I. Klistra in kopierade data i respektive kolumner i kalkylbladet "Uppsekvenser" och "Nedsekvenser" i TemplateBRS-kalkylbladsfilen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 11: Kopiera relevanta data från resultatfil II. Kopiera kolumnen (Tryck)_BRS_SBP från resultatfilen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 12: En kalkylarksmallfil (TemplateBRS) för datasortering och analys II. Klistra in kopierade SBP-data i kalkylbladet "Alla sekvenser" i TemplateBRS-kalkylbladsfilen för att beräkna det totala antalet sekvenser. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 13: Filtrering och analys av sekvenserna. I kalkylbladet "Uppsekvenser" i kalkylbladet TemplateBRS öppnar du rullgardinsmenyn för kolumnfiltret (Pressure)_BRS_# och trycker på OK utan att ändra några parametrar. Detta sorterar automatiskt data och uppdaterar beräkningarna för sekvenser med 3 slag. Upprepa detta för kalkylbladet "Nedåtsekvenser". Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 14: Skärmdump av en högkvalitativ inspelning upptäckt med EKG- och BP-analysprogramvara. Det övre spåret (EKG) visar detektion av varje R-topp och det nedre spåret (BP) visar detektion av varje diastoliskt tryck (DP) och systoliskt tryck (SP) topp. Områden under framgångsrikt upptäckta toppar markeras med rött. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 15: Skärmbild av en BP-inspelning av låg kvalitet där BP-parametrar endast delvis identifieras. Det övre spåret (EKG) visar detektion av varje R-topp men det nedre spåret (BP) visar luckor mellan upptäckta BP-toppar. Detekterade toppar av diastoliskt tryck (DP) och systoliskt tryck (SP) markeras med röda områden. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 16: Skärmbild av en EKG- och BP-inspelning av låg kvalitet där EKG- och BP-parametrar inte kunde detekteras. Det övre spåret (EKG) visar ett område (lila bakgrund) där EKG-parametrar inte kunde detekteras. BP-detektering (lägre spår) misslyckades också på grund av låg signalkvalitet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Metodens betydelse i förhållande till alternativa metoder
I detta arbete presenterar vi ett detaljerat protokoll för att kvantifiera spontan BRS med hjälp av sekvensmetoden. Detta tillvägagångssätt använder spontana BP- och reflex-HR-förändringar som mäts med EKG- och BP-telemetri. Fördelen med denna metod är att båda parametrarna kan registreras i medvetna, fritt rörliga, ohämmade djur utan att störa djur genom att gå in i rummet där mätningarna utförs eller till och med genom fysisk interaktion som krävs för injektion av droger. Denna punkt är mycket viktig eftersom det tydligt har visats att sådana störningar allvarligt stör HR- och BP-inspelningar. Till exempel kräver injektion av läkemedel fixering av mössen, vilket orsakar ett maximalt stressrespons som ökar HR upp till 650-700 bpm. För att kringgå dessa stressreaktioner har BRS tidigare bestämts hos sövda möss. Standardanestetika som används inom veterinärmedicin såsom ketamin/xylazin eller isofluran inducerar dock bradykardi och påverkar autonoma reflexsvar, vilket begränsar giltigheten av dessa metoder och tolkningen av resultaten. För att delvis övervinna dessa begränsningar användes implanterbara läkemedelsleveransanordningar, dvs osmotiska pumpar, som kan frigöra läkemedel i bukhålan. Med osmotiska pumpar är det emellertid inte möjligt att applicera en bolus av en definierad dos av läkemedel som begränsar tillämpningen av sådana anordningar. Alternativt komplexa infusionskatetrar17 kan implanteras i möss för att administrera läkemedel. Dessa katetrar är dock svåra att hantera och kräver kirurgiska färdigheter jämförbara med dem som krävs för implantation av telemetriska enheter, samtidigt som de ger mindre vetenskapligt resultat jämfört med mätningar av spontan BRS. Förutom de tekniska problemen i samband med mätning av BRS med injektion av läkemedel, finns det vissa begränsningar relaterade till läkemedelsverkan i sig. Traditionella metoder för att bestämma BRS inkluderar bolusinjektioner av vasoaktiva läkemedel. Bolusinjektion av vasokonstriktorer (t.ex. fenylefrin) eller vasodilatatorer (t.ex. natriumnitroprussid) har dock ansetts vara en överdriven och icke-fysiologisk stimulans för reflexmässig HR-anpassning till förändringar i BP18. Spontan aktivitet hos baroreceptorreflexen kan också kvantifieras med spektralmetoder. En av dessa metoder bedömer BRS i frekvensdomänen genom beräkning av förhållandet mellan förändringar i HR och förändringar i blodtryck i ett specifikt frekvensband18,19. Andra spektrala metoder innefattar bestämning av överföringsfunktionen hos BP och HR eller kvantifiering av koherensen mellan BP och HR20,21. Dessa metoder kräver också telemetrisk insamling av spontana BP- och HR-parametrar och även om de är lämpliga för bestämning av spontan BRS, kräver de intensiva beräkningsverktyg och är utmanande att tillämpa. Dessutom lider alla spektralmetoder av begränsningen att icke-stationära signaler utesluter tillämpning av spektralmetoder. I synnerhet kan spektraltoppar inducerade av andningsrytmer minskas hos mänskliga patienter genom att be patienten att sluta andas, medan detta uppenbarligen inte är möjligt hos möss. Därför är signal-brusförhållandet ofta ganska lågt hos möss. Med tanke på begränsningarna av de metoder som diskuterats ovan föredrar vi sekvensmetoden för att bestämma BRS hos möss. En stor fördel med denna metod är det faktum att det är en icke-invasiv teknik som ger data om spontan BRS under verkliga förhållanden22. En ytterligare viktig punkt är att varaktigheten av sekvenser som analyseras med sekvensmetoden är ganska kort, med 3-5 slag. Reflexreglering av HR av vagusnerven är mycket snabb och väl inom tidsramen för dessa sekvenser. Därför är sekvensmetoden väl lämpad för att utvärdera vagusnervens bidrag till BRS. Däremot är reglering av det sympatiska nervsystemet mycket långsammare. Faktum är att under dessa korta sekvenser kan aktiviteten i det sympatiska nervsystemet antas vara nästan konstant. Därför är metoden anpassad för att selektivt detektera reflexförändringar hos HR som drivs av vagusnervaktivitet.
Tolkning av BRS-data
För tolkningen av BRS-dysfunktion eller BRS-data i sig är det viktigt att överväga de individuella funktionella nivåerna som är involverade i baroreceptorreflexen. På neuronal nivå kan afferenta, centrala eller efferenta komponenter i reflexen påverkas23. På kardiovaskulär nivå kan minskad eller överdriven respons hos den sinoatriella noden till ANS-ingång vara närvarande11,24. En förändring på varje nivå kan leda till förändringar i BRS. För att dissekera huruvida neuronala och/eller hjärtmekanismer är ansvariga för observerade förändringar i BRS, kan hjärt- eller neuronspecifik gendeletion, knock down eller genredigeringsmetoder användas.
Kritiska steg i protokollet
Det mest sofistikerade och kritiska steget i detta protokoll är beredningen och kanyleringen av vänster halspulsåder (steg 2.3). Spänningen i den kaudala ocklusionssuturen måste vara tillräckligt hög för att helt stoppa blodflödet före kannulation. Annars kan även ett litet läckage av blod under kanylering allvarligt begränsa synligheten eller till och med få musen att blöda ihjäl. Kanylering bör lyckas vid första försöket. Men vid misslyckande av det första försöket är det fortfarande möjligt att försiktigt försöka igen cannulation.
Mittlinjens snitt och subkutan tunnel från halsen till vänster flank (steg 2.3) måste vara tillräckligt stora för att enkelt föra in sändaren utan kraft men måste också vara så liten som möjligt för att hålla sändaren på plats. Annars måste man låsa den på plats med suturmaterial eller vävnadslim. Eftersom möss har en mycket känslig hud kan nekros i huden uppstå om tunneln för sändaren är för liten.
Om EKG-elektroderna är för långa för att passa in i den subkutana tunneln (steg 2.4) är det nödvändigt att bilda en ny spets genom att förkorta elektroden till rätt längd. Elektroden måste ligga platt mot kroppen över hela ledningens längd. För långa elektroder kommer att störa djuren och de kommer att försöka öppna såret för att ta bort sändaren, vilket resulterar i risk för vävnadsirritation och sårdehiscens. Ledningar som är för korta kan naturligtvis inte förlängas och det kan vara så att elektroderna i detta fall inte kan placeras på ett sådant sätt att de motsvarar Einthoven II-konfigurationen. Vi rekommenderar därför att bestämma den optimala längden på EKG-ledningarna på en död mus av samma kön, vikt och genetisk bakgrund.
Möss bör ges en längre återhämtningstid efter implantation av transmittorer om de inte har en normal dygnsrytm och detta inte är fenotypen för den muslinje som studeras (steg 2.7). En annan orsak till störd dygnsrytm kan vara otillräcklig akustisk isolering av djuranläggningen eller personal som kommer in i rummet under mätningen.
EKG-, BP- och BRS-dataanalys är rakt fram (steg 2.8). Det mest kritiska steget är att utesluta ektopisk beats, sinuspauser, arytmiska episoder eller sektioner med signaler av låg kvalitet från dataanalys.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den tyska forskningsstiftelsen [FE 1929/1-1 och WA 2597/3-1]. Vi tackar Sandra Dirschl för utmärkt teknisk hjälp och Julia Rilling för veterinärrådgivning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 1229 | anesthesia |
| B.Braun Injekt-F 1 mL syringe | Wolfram Droh GmbH, Germany | 9166017V | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer AG, Germany | ||
| Blunt dissecting scissors | Fine Science Tools GmbH, Germany | 14078-10 | |
| Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 115 | preemptive and post-operative pain relief |
| Cutasept F skin desinfectant | BODE Chemie GmbH, Germany | 9803650 | |
| Cotton Tipped Applicator sterile | Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany | 09-119-9100 | |
| Forceps - Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11253-25 | |
| Forceps - straight | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11008-13 | |
| Gauze swabs with cut edges, 7.5x7.5 cm, cotton | Paul Hartmann AG. Germany | 401723 | |
| HD?X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters | Data Sciences International, United States | ||
| Homothermic blanket system with flexible probe | Harvard Apparatus, United States | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18000-45 | |
| Ketamine 10% | Ecuphar GmbH, Germany | 799-760 | anesthesia |
| Magnet | Data Sciences International, United States | transmitter turn on/off | |
| Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter | Fine Science Tools GmbH, Germany | 12502-12 | |
| Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710005525 | 24 G needle |
| Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710004020 | 27 G needle |
| Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided) | Resorba Medical, Germany | PA10273 | lead fixation |
| Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided) | Resorba Medical, Germany | 4023 | skin closure |
| OPMI 1FR pro, Dissecting microscope | Zeiss, Germany | ||
| Pilca depilatory mousse | Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany | 6943151 | |
| PVP-Iodine hydrogel 10% | Ratiopharm, Germany | ||
| Ringer's lactate solution | B. Braun Melsungen AG, Germany | 401-951 | |
| Sensitive plasters, Leukosilk | BSN medical GmbH, Germany | 102100 | surgical tape |
| Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Surgibond tissue adhesive | SMI, Belgium | ZG2 | |
| Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided) | Resorba Medical, Germany | G2105 | lead preparation, ligation sutures |
| Trimmer, Wella Contura type 3HSG1 | Procter & Gamble | ||
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18403-11 | |
| Xylazine (Xylariem) 2% | Ecuphar GmbH, Germany | 797469 | anesthesia |
| Data acquisition and analysis | Source | ||
| DSI Data Exchange Matrix | Data Sciences International, United States | ||
| DSI Dataquest ART 4.33 | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
| DSI Ponemah | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
| DSI PhysioTel HDX-11 for mice | Data Sciences International, United States | ||
| DSI PhysioTel receivers RPC1 | Data Sciences International, United States | ||
| ecgAUTO v3.3.5.11 | EMKA Technologies | ECG and BP analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, United States |
References
- Landgren, S. On the excitation mechanism of the carotid baroceptors. Acta Physiologica Scandinavica. 26 (1), 1-34 (1952).
- Heyman, C., Neil, E.
- Lu, Y., et al. The ion channel ASIC2 is required for baroreceptor and autonomic control of the circulation. Neuron. 64 (6), 885-897 (2009).
- Fadel, P. J., Raven, P. B. Human investigations into the arterial and cardiopulmonary baroreflexes during exercise. Experimental Physiology. 97 (1), 39-50 (2012).
- Nagura, S., Sakagami, T., Kakiichi, A., Yoshimoto, M., Miki, K. Acute shifts in baroreflex control of renal sympathetic nerve activity induced by REM sleep and grooming in rats. The Journal of Physiology. 558, Pt 3 975-983 (2004).
- Crandall, C. G., Cui, J., Wilson, T. E. Effects of heat stress on baroreflex function in humans. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (3), 321-328 (2003).
- Crandall, M. E., Heesch, C. M. Baroreflex control of sympathetic outflow in pregnant rats: effects of captopril. The American Journal of Physiology. 258 (6), Pt 2 1417-1423 (1990).
- Mortara, A., et al. Arterial baroreflex modulation of heart rate in chronic heart failure: clinical and hemodynamic correlates and prognostic implications. Circulation. 96 (10), 3450-3458 (1997).
- La Rovere, M. T., Bigger, J. T., Marcus, F. I., Mortara, A., Schwartz, P. J. Baroreflex sensitivity and heart-rate variability in prediction of total cardiac mortality after myocardial infarction. ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) Investigators. Lancet. 351 (9101), 478-484 (1998).
- Robinson, T. G., Dawson, S. L., Eames, P. J., Panerai, R. B., Potter, J. F. Cardiac baroreceptor sensitivity predicts long-term outcome after acute ischemic stroke. Stroke. 34 (3), 705-712 (2003).
- Fenske, S., et al. cAMP-dependent regulation of HCN4 controls the tonic entrainment process in sinoatrial node pacemaker cells. Nature Communications. 11 (1), 5555 (2020).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Thireau, J., Zhang, B. L., Poisson, D., Babuty, D. Heart rate variability in mice: a theoretical and practical guide. Experimental Physiology. 93 (1), 83-94 (2008).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory Mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260 (2011).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Brox, V. Optical and electrophysiological approaches to examine the role of cAMP-dependent regulation of the sinoatrial pacemaker channel HCN4. Dissertation, LMU Munich. , Available from: https://edoc.ub.uni-muenchen.de/24431/1/Brox_Verena.pdf (2019).
- Just, A., Faulhaber, J., Ehmke, H. Autonomic cardiovascular control in conscious mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (6), 2214-2221 (2000).
- Parati, G., Di Rienzo, M., Mancia, G. How to measure baroreflex sensitivity: from the cardiovascular laboratory to daily life. Journal of Hypertension. 18 (1), 7-19 (2000).
- Robbe, H. W., et al. Assessment of baroreceptor reflex sensitivity by means of spectral analysis. Hypertension. 10 (5), 538-543 (1987).
- Pinna, G. D., Maestri, R., Raczak, G., La Rovere, M. T. Measuring baroreflex sensitivity from the gain function between arterial pressure and heart period. Clinical Science. 103 (1), 81-88 (2002).
- Pinna, G. D., Maestri, R. New criteria for estimating baroreflex sensitivity using the transfer function method. Medical and Biological Engineering and Computing. 40 (1), 79-84 (2002).
- Laude, D., Baudrie, V., Elghozi, J. L. Applicability of recent methods used to estimate spontaneous baroreflex sensitivity to resting mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 294 (1), 142-150 (2008).
- Ma, X., Abboud, F. M., Chapleau, M. W. Analysis of afferent, central, and efferent components of the baroreceptor reflex in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 283 (5), 1033-1040 (2002).
- Fleming, S., et al. Impaired Baroreflex Function in Mice Overexpressing Alpha-Synuclein. Frontiers in Neurology. 4 (103), (2013).
