Summary
Nous décrivons un protocole rapide et robuste pour enrichir les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) de la rate de souris et les étendre in vitro à des nombres appropriés pour des études in vitro et in vivo.
Abstract
Les cellules T tueuses naturelles invariantes (iNKT) sont des lymphocytes T de type inné exprimant un récepteur de lymphocytes T semi-invariants (TCR) conservé spécifique aux antigènes lipidiques auto-microbiens ou microbiens présentés par la molécule non polymorphe CD1d liée au CMH de classe I. Des études précliniques et cliniques soutiennent un rôle pour les cellules iNKT dans le cancer, l’auto-immunité et les maladies infectieuses. Les cellules iNKT sont très conservées dans toutes les espèces et leur étude a été facilitée par des modèles murins, y compris des souris déficientes en CD1d ou déficientes en iNKT, et la possibilité de les détecter sans équivoque chez les souris et les hommes atteints de tétramères CD1d ou de mAbs spécifiques du TCR semi-invariant. Cependant, les cellules iNKT sont rares et elles doivent être étendues pour atteindre des nombres gérables pour toute étude. Parce que la génération de lignée cellulaire iNKT primaire de souris in vitro s’est avérée difficile, nous avons mis en place un protocole robuste pour purifier et développer les cellules iNKT spléniques des souris transgéniques iVα14-Jα18 (iVα14Tg), dans lesquelles les cellules iNKT sont 30 fois plus fréquentes. Nous montrons ici que les cellules iNKT spléniques primaires iVα14Tg peuvent être enrichies par un processus de séparation immunomagnétique, produisant environ 95 à 98% de cellules iNKT pures. Les cellules iNKT purifiées sont stimulées par des billes anti-CD3/CD28 plus IL-2 et IL-7, ce qui entraîne une expansion de 30 fois par jour +14 de la culture avec une pureté de 85-99%. Les cellules iNKT élargies peuvent être facilement manipulées génétiquement, fournissant un outil inestimable pour disséquer les mécanismes d’activation et de fonctionnement in vitro et, plus important encore, également lors du transfert adoptif in vivo.
Introduction
Les lymphocytes T tueurs naturels invariants (cellules iNKT) sont des lymphocytes T innés qui expriment un récepteur semi-invariant des lymphocytes T αβ (TCR), formé chez la souris par une chaîne Vα14-Jα18 invariante associée à un ensemble limité de chaînes Vβ diverses1, ce qui est spécifique aux antigènes lipidiques présentés par la molécule CD1d2liée au CMH de classe I. Les cellules iNKT subissent un programme de sélection des agonistes entraînant l’acquisition d’un phénotype effecteur activé/inné déjà dans le thymus, qui se produit à travers plusieurs étapes de maturation3,4, produisant un sous-ensemble CD4+ et un CD4- . Grâce à ce programme, les cellules iNKT acquièrent des phénotypes effecteurs T auxiliaires (TH)distincts, à savoir TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) et TH17 (iNKT17), identifiables par l’expression des facteurs de transcription T-bet, GATA3, PLZF et RORγt, respectivement5. Les cellules iNKT reconnaissent une gamme de lipides microbiens mais sont également auto-réactives contre les lipides endogènes qui sont régulés à la hausse dans le contexte de situations pathologiques de stress cellulaire et de lésions tissulaires, telles que le cancer et l’auto-immunité2. Lors de l’activation, les cellules iNKT modulent les fonctions d’autres cellules effectrices immunitaires innées et adaptatives par contact direct et production de cytokines2.
Les recherches sur les cellules iNKT ont été facilitées par des modèles murins, y compris des souris déficientes en CD1d ou en Jα18, et par la production de tétramères CD1d chargés d’antigènes ainsi que par la génération d’anticorps monoclonaux (mAbs) spécifiques au TCR semi-invariant humain. Cependant, la génération de la lignée cellulaire iNKT de souris primaire s’est avérée difficile. Pour mieux caractériser les fonctions antitumorales des cellules iNKT et les utiliser pour la thérapie cellulaire adoptive, nous avons mis en place un protocole pour purifier et étendre les cellules iNKT spléniques de souris transgéniques iVα14-Jα18 (iVα14Tg)6, dans lequel les cellules iNKT sont 30 fois plus fréquentes que chez les souris de type sauvage.
Les cellules iNKT expansées peuvent être exploitées pour des essais in vitro et in vivo lors du transfert chez la souris. Dans ce contexte, par exemple, nous avons montré leurs puissants effets anti-tumoraux7. De plus, les cellules iNKT étendues in vitro se prêtent à une modification fonctionnelle via le transfert ou l’édition de gènes avant leur injection in vivo8,ce qui permet une analyse fonctionnelle perspicace des voies moléculaires et ouvre la voie à des thérapies cellulaires avancées.
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Protocol
Les procédures décrites ici ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) (n° 1048) de l’Institut scientifique de San Raffaele.
REMARQUE: Toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions stériles. Tous les réactifs utilisés sont répertoriés dans le tableau des matériaux.
1. Traitement de la rate
- Euthanasier les souris iVα14-Jα18 par inhalation de CO2 selon la politique institutionnelle.
REMARQUE: Les souris iVα14-Jα18 doivent être âgées de 8 semaines ou plus. Pour éviter le rejet des cellules du transfert in vivo des cellules, considérez que les cellules isolées de souris femelles peuvent être transférées de manière adoptive à la fois chez des receveurs mâles et femelles, tandis que les cellules isolées de souris mâles ne peuvent être transférées que chez des receveurs mâles. Pour les expériences in vitro, aucun préjugé sexiste ne doit être pris en compte. Plus de souris peuvent être regroupées afin d’obtenir plus de cellules. - Disséquez la rate de la souris et écrasez-la à travers une passoire cellulaire de 70 nm pour obtenir une suspension unicellulaire dans 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 2% de sérum bovin fœtal (FBS).
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Retirer le surnageant par inversion et traiter avec un tampon de lyse érythrocytaire. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 1 mL de tampon de lysage stérile ACK (ammonium-chlorure-potassium), incuber pendant 3 min à température ambiante et bloquer avec 5 mL de PBS avec 2% de FBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
REMARQUE: ACK est disponible dans le commerce; il se compose d’une solution de 0,15 MNH4Cl, 10 mM deKHCO3et 0,1 mMna2EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique) dissous dans duH2Obidistillé, pH 7,2-7,4. S’il est fait maison, stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 μm. - Retirez le surnageant par inversion. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 3 mL de PBS avec 2% de FBS et éliminer les résidus de graisse par pipetage. Si nécessaire, mettez en commun les cellules provenant de différentes souris.
- Comptez les cellules et conservez 50 μL pour l’analyse FACS.
2. Enrichissement des lymphocytes T
REMARQUE: Pour les étapes d’enrichissement, travaillez rapidement, gardez les cellules froides et utilisez des solutions pré-refroidies à 4 ° C pendant la nuit, puis conservées sur de la glace
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
- Remettre en suspension toutes les cellules dans la quantité appropriée de PBS avec 2% FBS (500 μL pour 107 cellules) et un bloqueur Fc (2,5 μL x 107 cellules); incuber pendant 15 min à température ambiante (RT).
- Laver avec 1-2 mL de tampon de séparation MACS (MB) par 107 cellules totales et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
REMARQUE: Le tampon MACS est disponible dans le commerce. Il se compose de PBS pH 7,2, 0,5% d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM EDTA. S’il est fait maison, stériliser par filtration avec un filtre de 0,22 μm. - Retirer le surnageant par inversion et colorer les cellules avecCD19-FITC et H2(IA b)-FITC (utiliser 5 μL x 107 cellules dans 100 μL de MB). Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.
- Laver les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 107 cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
- Pipette complètement le surnageant et remise en suspension de la pastille de cellule dans 90 μL de MB pour 107 cellules au total. Ajouter 10 μL de microbilles anti-FITC pour 107 cellules au total. Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.
- Lavez les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 107 cellules et centrifugez à 300 x g pendant 10 min.
- Pipette complètement le surnageant et remise en suspension jusqu’à 1,25 x 108 cellules dans 500 μL de MB.
- Placez une colonne LD dans le champ magnétique du séparateur MACS pour procéder à l’épuisement. Pour éviter le colmatage, appliquez un filtre de pré-séparation sur la colonne LD et rincez avec 2 mL de MB.
- Lorsque le réservoir de colonne est vide, appliquez la suspension cellulaire sur le filtre. Collectez les cellules non étiquetées qui traversent la colonne.
- Laver 3 fois avec 1 mL de Mb, uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide. Recueillir l’effluent total, qui sera enrichi en lymphocytes T, et compter les cellules. Gardez toujours 50 μL pour l’analyse FACS.
3. Enrichissement des cellules iNKT
- Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et retirer le surnageant par inversion.
- Colorez les cellules avec CD1d-tétramère-PE (souris PBS57-CD1d-tétramère), selon le titrage des anticorps dans 50 μL de MB pour 106 cellules. Bien mélanger et incuber pendant 30 min dans l’obscurité sur de la glace.
REMARQUE: La procédure peut également être effectuée avec des tétramères mCD1d marqués APC et des billes anti-APC; ajuster les fluorochromes utilisés dans la coloration suivante en conséquence. Dans le protocole actuel, nous avons utilisé des tétramères PBS-57-CD1d de souris fournis par les NIH. L’αgalactosylcéramide (αGal-Cer) est l’antigène prototypique reconnu par les cellules iNKT ; PBS-57 est un analogue de l’αGal-Cer avec une solubilité améliorée9; l’installation de tétramères des NIH fournit un ligand PBS-57 complexé à des tétramères CD1d. Cependant, d’autres dimères/tétramères/dextramères CD1d sont disponibles dans le commerce et peuvent être chargés d’un antigène lipidique comme αGal-Cer. Nous envisageons la possibilité d’ajuster le protocole pour leur utilisation. - Lavez les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 107 cellules et centrifugez à 300 x g pendant 10 min.
- Pipette complètement le surnageant et remise en suspension de la pastille de cellule dans 80 μL de MB pour 107 cellules au total. Ajouter 20 μL de microbilles anti-PE pour 107 cellules au total. Bien mélanger et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à 4-8 °C.
- Laver les cellules en ajoutant 1−2 mL de MB pour 107 cellules et centrifuger à 300 x g pendant 10 min.
- Pipette complètement le surnageant et remise en suspension jusqu’à 108 cellules dans 500 μL de MB. Sinon, si les cellules dépassent 108, ajustez le volume en conséquence.
- Selon le nombre de cellules, placez une colonne LS (jusqu’à 108)ou MS (jusqu’à10 7)dans le champ magnétique du séparateur MACS. Rincer la colonne avec MB (3 mL pour LS, 500 μL pour MS).
- Appliquez la suspension de cellule sur la colonne.
- Collectez les cellules non marquées qui passent à travers. Lavez la colonne 3 fois en ajoutant la quantité appropriée de Mo (3 x 3 mL pour la colonne LS, 3 x 500 μL pour la colonne MS) uniquement lorsque le réservoir de colonne est vide. L’effluent total est la fraction négative.
- Retirez la colonne du champ magnétique et placez-la sur un nouveau tube collecteur.
- Pipette MB sur la colonne (5 mL pour la colonne LS ou 1 mL pour la colonne MS); poussez le piston fourni dans la colonne et débusquez la fraction positive (enrichie en cellules iNKT).
- Pour augmenter encore la récupération de la cellule iNKT, centrifugez la fraction négative à 300 x g pendant 10 minutes et répétez les étapes 3.6-3.7 avec une nouvelle colonne LS ou MS. Regroupez les fractions positives et déterminez le nombre de cellules. Conservez 50 μL de fractions positives et négatives pour l’analyse FACS.
- Vérifiez les étapes de purification par analyse FACS. Les échantillons comprennent: la rate ex vivo, la fraction enrichie en lymphocytes T, la fraction positive iNKT et la fraction négative iNKT. Colorez les cellules avec : CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC et DAPI.
REMARQUE: La récupération attendue d’une souris iVα14-Jα18 est de 2x106 cellules iNKT .
4. Activation et expansion des cellules iNKT
- Activez les cellules iNKT purifiées avec des billes magnétiques anti-CD3/CD28 de l’activateur T de souris dans un rapport de 1:1.
- Centrifuger la fraction positive de la cellule iNKT à 300 x g pendant 5 min.
- Pendant ce temps, transférez le volume approprié de billes magnétiques anti-CD3 / CD28 dans un tube et ajoutez un volume égal de PBS, vortex pendant 5 secondes. Placez le tube sur un aimant pendant 1 minute et jetez le surnageant.
- Retirez le tube de l’aimant et remettez en suspension les billes magnétiques lavées dans le volume approprié de RPMI complet (milieu RPMI 1640, FCS inactivé à la chaleur à 10%, pyruvate de sodium 1 mM, 1% d’acides aminés non essentiels, 10 U / ml de pénicylline et de streptomycine, 50 μM β-mercaptoéthanol) pour avoir 5 x 105 cellules iNKT dans 1 mL. Utilisez cette suspension pour remettre en suspension la fraction positive iNKT centrifuge.
- Plaque 1 mL de la suspension cellulaire (5 x 105 cellules iNKT) et perles magnétiques anti-CD3/CD28 dans une plaque de 48 puits avec 20 U/mL IL-2 et incuber à 37 °C.
- Après 5 jours, ajouter 10 ng/mL IL-7.
- Divisez les cellules 1:2 lorsqu’elles atteignent 80-90% de confluence, ajoutez toujours 20U/mL IL-2 et 10 ng/mL IL-7. Dans ces conditions, les cellules iNKT peuvent être étendues jusqu’à 15 jours.
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Representative Results
Le protocole décrit dans ce manuscrit permet d’enrichir les cellules iNKT de la rate de souris transgéniques iVa14-Ja18 grâce à un processus de séparation immunomagnétique résumé à la figure 1A. Les lymphocytes T de la rate totale sont d’abord sélectionnés négativement en épuisant les cellules B et les monocytes, suivis par le tri immunomagnétique positif des cellules iNKT avec des tétramères CD1d chargés d’antigène lipidique PBS-57, qui permettent de colorer spécifiquement uniquement les cellules iNKT. Ce protocole produit environ 2 x 106 de cellules iNKT pures à 95-98% de la rate d’une seule souris iVa14-Ja18 Tg. Aucune ou très peu de cellules iNKT ne peuvent être détectées dans la fraction négative(Figure 1B).
Après enrichissement, les cellules iVa14 iNKT peuvent être étendues avec des billes anti-CD3/CD28 plus IL-2 et IL-7(Figure 2A),ce qui entraîne une expansion de 30 fois en moyenne par jour +14 de la culture comme le montre la Figure 2B.
La figure 3A montre la pureté de la cellule iNKT ainsi que l’expansion in vitro et l’expression de la molécule CD4. Nous avons observé une diminution du pourcentage de cellules TCRβ+ CD1d-tétramère+ double positif : la forte activation avec les billes anti-CD3/CD28 induit la régulation négative de l’expression TCR de la cellule iNKT à la surface de la cellule, et une double population négative apparaît. La majorité des cellules iNKT expansées étaient CD4-. La figure 3B montre une caractérisation de l’expression des facteurs de transcription spécifiques à la lignée PLZF et RORγt sur les cellules iNKT enrichies au jour 0 et 14 jours après l’expansion. Cette coloration permet d’identifier les phénotypes NKT1 (PLZFlow RORγt-), NKT2 (PLZFhigh RORγt-), et NKT17 (PLZFint RORγt+). Étant principalement NKT1 et NKT2, les cellules iNKT enrichies montrent un phénotype effecteur de type TH0. Ce phénotype est conservé après 14 jours d’expansion, comme le confirme la sécrétion d’IFN-γ et d’IL-4 après stimulation PMA/ionomycine illustrée à la figure 3C.
Figure 1: Enrichissement des cellules iNKT. A) Représentation schématique du protocole de séparation immunomagnétique. B)Analyse par cytométrie en flux de chaque étape d’enrichissement. Le pourcentage de fréquences des lymphocytes T est indiqué dans les graphiques supérieurs, sur des lymphocytes viables. Alors que le pourcentage de fréquences cellulaires iNKT le long de chaque étape est indiqué dans les graphiques inférieurs, dépendant des lymphocytes CD19- TCRβ+ viables. La coloration sur des lymphocytes CD19- TCRβ+ viables avec un tétramère CD1d déchargé permet de tirer correctement la porte cellulaire iNKT. Une expérience représentative est montrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Expansion in vitro des cellules iNKT. A) Nombre de cellules iNKT le long de l’expansion cellulaire iNKT. Trois expériences représentatives et indépendantes sont présentées. B)Augmentation du nombre de cellules iNKT aux jours 7 et 14 après la purification et l’activation. Les moyens ± SD sont affichés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Caractérisation étendue des cellules iNKT. A) Analyse par cytométrie en flux du pourcentage de cellules iNKT et de l’expression des CD4 tout au long de la période d’expansion. Les parcelles supérieures sont fermées sur des lymphocytes viables. Les tracés inférieurs sont fermés sur des cellules iNKT (tétramère CD1d viable+ TCRβ+ lymphocytes). B) Caractérisation phénotypique des cellules iNKT enrichies (jour 0) et expansées (jour 14). Les tracés sont fermés sur des cellules iNKT (tétramère CD1d viable+ TCRβ+ lymphocytes). Les cellules ont été colorées par voie intranucléaire pour les facteurs de transcription avec le Foxp3 Transcription Factor Staining Buffer Set. Les sous-ensembles NKT1 (PLZFlow RORγt-), NKT2 (PLZFhigh RORγt-) et NKT17 (PLZFint RORγt+) ont été identifiés, les fréquences de chaque sous-ensemble sont indiquées en pourcentage. C) Production de cytokines par les cellules iNKT expansées au jour 14. Les tracés sont fermés sur des cellules iNKT (tétramère CD1d viable+ TCRβ+ lymphocytes). Les cellules ont été stimulées pendant 4 heures avec PMA 25 ng/mL/Ionomycine 1 μg/mL, en présence pendant les 2 dernières heures de Brefeldin A 10 μg/mL. Les cellules ont ensuite été fixées avec du PFA 2%, perméabilisées avec Permwash, puis colorées intracellulairement pour la production de cytokines. La stratégie de contrôle a été définie sur le panneau de gauche de la commande non activée. Une expérience représentative est montrée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Nous montrons ici un protocole reproductible et réalisable pour obtenir des millions de cellules iNKT prêtes à l’emploi. En raison de la rareté de ces cellules in vivo, une méthode pour les étendre était fortement nécessaire. Le protocole que nous proposons ne nécessite ni une instrumentation particulière ni un nombre élevé de souris. Nous avons exploité des souris transgéniques iVα14-Jα18 à dessein pour réduire le nombre de souris nécessaires à la procédure.
Un autre protocole réussi pour l’expansion des cellules iNKT à partir de souris transgéniques iVα14-Jα18 est disponible dans la littérature10. Ce protocole implique la génération, 6 jours avant la purification des cellules iNKT, de cellules dendritiques fraîches dérivées de la moelle osseuse, puis chargées de α-galactosylcéramide et irradiées, plus IL-2 et IL-7. Nous considérons la réduction du nombre de souris impliquées dans la procédure comme un grand avantage du protocole. Il est également tempsé, car la mise en place de la culture cellulaire dure une seule journée au lieu d’une semaine. Une limitation possible de la reproductibilité du protocole actuel pourrait être la disponibilité de souris transgéniques iVα14-Jα18, qui sont cependant disponibles dans le commerce. En l’absence de ces souris, nous envisageons la possibilité d’utiliser un grand nombre de souris WT, mais le protocole doit être mis en place en conséquence en raison de la rareté des cellules iNKT chez les souris WT.
Au cours de la culture cellulaire, nous vérifions généralement la pureté et le phénotype des cellules iNKT expansées. La diminution du pourcentage de TCRβ+ CD1d-tétramère+ cellules doubles positives(Figure 3A)peut s’expliquer par une régulation naturelle à la baisse du TCR invariant de la cellule NKT de la surface de la cellule après activation. De plus, la majorité des cellules iNKT expansées n’exprimaient pas cd4(figure 3A): cela peut représenter un avantage dans le cadre d’une thérapie cellulaire adoptive, puisque les cellules CD4-iNKT se sont avérées les plus efficaces pour contrôler la progression tumorale11. De plus, le phénotype effecteur de type TH0 observé(Figure 3C)est entièrement cohérent avec celui observé dans les cellules iNKT humaines après expansion et restimulation in vitro8,12,13,14,15. Les cellules expansées sont hautement réactives in vivo et in vitro, donc utiles dans les contextes d’immunothérapies adoptives à base de cellules iNKT. Le transfert adoptif de cellules iNKT non manipulées ou expansées prévient ou améliore la maladie aiguë du greffon contre l’hôte (GVH) laissant inchangé l’effet Greffon contre leucémie16,17,18,19. Les cellules iNKT humaines transférées de manière adoptive se sont développées in vitro avec αGal-Cer pour soulager l’aGVHD xénogénique et cet effet est médié par les cellules CD4- mais pas CD4+ 20. De plus, étant donné que les cellules iNKT ne provoquent pas d’aGVHD, elles constituent les cellules idéales pour l’immunothérapie CAR sans besoin de délétion de leur TCR et se sont avérées avoir une activité antitumorale prolongée in vivo8,15. Les cellules iNKT sont actuellement exploitées dans le cadre d’essais cliniques en cours et terminés21,22,23,24.
En conclusion, le protocole décrit est rapide, simple et permet une augmentation de 30 fois du nombre de cellules iNKT récupérées dans la rate d’une souris(Figure 3B). Ces cellules peuvent être facilement exploitées pour des tests de reconnaissance in vitro, des systèmes de co-culture ou une thérapie cellulaire adoptive dans des études précliniques. Les cellules iNKT jouent en effet un rôle essentiel dans la surveillance immunitaire tumorale, les maladies infectieuses et l’auto-immunité. Dans ces contextes, les cellules iNKT peuvent représenter un outil puissant, étant une alternative attrayante aux cellules T conventionnelles dépourvues de la restriction MHC. La génération rapide de grandes quantités de ces cellules et la possibilité de les manipuler davantage in vitro peuvent conduire au développement de stratégies thérapeutiques sans précédent.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions Paolo Dellabona et Giulia Casorati pour leur soutien scientifique et leur lecture critique du manuscrit. Nous remercions également le NIH Tetramer Core Facility pour le tétramère CD1d de souris. L’étude a été financée par la Bourse De la Fondazione Cariplo 2018-0366 (à M.F.) et la bourse de l’Association italienne pour la recherche sur le cancer (AIRC) 2019-22604 (à G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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