Summary
Vi beskriver en rask og robust protokoll for å berike invariante naturlige killer T (iNKT) celler fra mus milt og utvide dem in vitro til passende tall for in vitro og in vivo studier.
Abstract
Invariant Natural Killer T (iNKT) celler er medfødt-lignende T Lymphocytes uttrykker en konservert semi-invariant T celle reseptor (TCR) spesifikk for selv eller mikrobielle lipid antigener presentert av ikke-polymorfisk MHC klasse I-relatert molekyl CD1d. Prekliniske og kliniske studier støtter en rolle for iNKT celler i kreft, autoimmunitet og smittsomme sykdommer. iNKT-celler er svært bevart gjennom arter, og deres undersøkelse har blitt tilrettelagt av musemodeller, inkludert CD1d-mangelfulle eller iNKT-mangelfulle mus, og muligheten til å utvetydig oppdage dem hos mus og menn med CD1d tetramers eller mAbs som er spesifikke for den semi-konstante TCR. Imidlertid er iNKT-celler sjeldne, og de må utvides for å nå håndterbare tall for enhver studie. Fordi genereringen av primærmus iNKT cellelinje in vitro har vist seg vanskelig, har vi satt opp en robust protokoll for å rense og utvide miltniske iNKT-celler fra iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg), der iNKT-celler er 30 ganger hyppigere. Vi viser her at primære milt iVα14Tg iNKT-celler kan berikes gjennom en immunomagnetisk separasjonsprosess, noe som gir ca 95-98% rene iNKT-celler. De rensede iNKT-cellene stimuleres av anti-CD3 / CD28 perler pluss IL-2 og IL-7, noe som resulterer i 30 ganger utvidelse om dagen +14 av kulturen med 85-99% renhet. De utvidede iNKT-cellene kan enkelt genetisk manipuleres, og gir et uvurderlig verktøy for å dissekere mekanismer for aktivering og funksjon in vitro og, enda viktigere, også ved adoptivoverføring in vivo.
Introduction
Invariant Natural killer T celler (iNKT celler) er medfødt-lignende T-lymfocytter som uttrykker en semi-invariant αβ T celle reseptor (TCR), dannet i mus av en invariant Vα14-Jα18 kjede sammen med et begrenset sett med forskjellige Vβ kjeder1, som er spesifikk for lipid antigener presentert av MHC klasse I-relatert molekyl CD1d2. iNKT-celler gjennomgår et agonistisk utvalgsprogram som resulterer i oppkjøpet av en aktivert / medfødt effektorfenotype allerede i tymus, som oppstår gjennom flere modningsstadier3,4, og produserer en CD4+ og en CD4- delsett. Gjennom dette programmet får iNKT-celler distinkte T-hjelper (TH) effektorfenotyper, nemlig TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) og TH17 (iNKT17), identifiserbar ved uttrykk for transkripsjonsfaktorene T-bet, GATA3, PLZF og RORγt, henholdsvis5. iNKT-celler gjenkjenner en rekke mikrobielle lipider, men er også selvreaktive mot endogene lipider som er oppregulert i sammenheng med patologiske situasjoner med cellestress og vevsskade, for eksempel kreft og autoimmunitet2. Ved aktivering modulerer iNKT-celler funksjonene til andre medfødte og adaptive immuneffektorceller via direkte kontakt og cytokinproduksjon2.
Undersøkelsene av iNKT-celler har blitt tilrettelagt av musemodeller, inkludert CD1d-mangelfulle eller Jα18-mangelfulle mus, og ved produksjon av antigenbelastede CD1d tetramerer pluss generering av monoklonale antistoffer (mAbs) som er spesifikke for den menneskelige semi-invariantE TCR. Imidlertid har genereringen av primærmus iNKT cellelinje vist seg vanskelig. For bedre å karakterisere antitumorfunksjonene til iNKT-celler og for å bruke dem til adoptivcelleterapi, setter vi opp en protokoll for å rense og utvide miltika iNKT-celler av iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg)6, der iNKT-celler er 30 ganger hyppigere enn hos villtype mus.
Utvidede iNKT-celler kan utnyttes for in vitro-analyser, og in vivo ved overføring tilbake til mus. I denne innstillingen har vi for eksempel vist deres potente anti-tumor effekter7. Videre er in vitro utvidede iNKT-celler egnet til funksjonell modifikasjon via genoverføring eller redigering før injeksjonen in vivo8, noe som gir innsiktsfull funksjonell analyse av molekylære veier, samt baner vei for avanserte celleterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer beskrevet her ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (nr. 1048) ved San Raffaele Scientific Institute.
MERK: Alle prosedyrene må utføres under sterile forhold. Alle reagensene som brukes er oppført i Materiallisten.
1. Miltbehandling
- Euthanize iVα14-Jα18 mus ved innånding av CO2 i henhold til institusjonell politikk.
MERK: iVα14-Jα18-mus må være 8 uker gamle eller eldre. For å unngå avvisning av cellene fra in vivo-overføringen av cellene, bør du vurdere at celler isolert fra kvinnelige mus kan overføres adoptivt både hos mannlige og kvinnelige mottakere, mens celler isolert fra mannlige mus bare kan overføres hos mannlige mottakere. For in vitro-eksperimenter må ingen kjønnsforskjeller vurderes. Flere mus kan samles for å få flere celler. - Disseker musen milt og knuse den gjennom en 70 nm celle sil for å få en encellet suspensjon i 10 ml fosfat bufret saltvann (PBS) med 2% foster bovint serum (FBS).
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten ved inversjon og prosess med erytrocytt lysisbuffer. Resuspend cellepellet med 1 ml steril ACK (Ammonium-Chloride-Kalium) Lysing Buffer, inkubere i 3 min ved romtemperatur, og blokker med 5 ml PBS med 2% FBS. Sentrifuge ved 300 x g i 5 min.
MERK: ACK er kommersielt tilgjengelig; Den består av en løsning på 0,15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3og 0,1 mM Na2EDTA (etylendiamintetraacetic acid) oppløst i bidistillert H2O, pH 7,2-7,4. Hvis hjemmelaget, steriliser ved filtrering med et 0,22 μm filter. - Fjern supernatanten ved inversjon. Resuspend cellepellet i 3 ml PBS med 2% FBS og fjern fettrester ved pipettering. Om nødvendig, slå sammen cellene som kommer fra forskjellige mus.
- Tell cellene og behold 50 μL for FACS-analyse.
2. T-celleberikelse
MERK: For berikelsestrinnene, arbeid raskt, hold cellene kalde og bruk løsninger forhåndskjølt ved 4 °C over natten og deretter holdt på is
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min.
- Resuspend alle cellene i riktig mengde PBS med 2% FBS (500 μL for 107 celler) og Fc blokkering (2,5 μL x 107 celler); inkubere i 15 min ved romtemperatur (RT).
- Vask med 1-2 ml MACS separasjonsbuffer (MB) per 107 totale celler og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter.
MERK: MACS-bufferen er kommersielt tilgjengelig. Den består av PBS pH 7,2, 0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA. Hvis hjemmelaget, steriliser ved filtrering med et 0,22 μm filter. - Fjern supernatanten ved inversjon og flekk cellene med CD19-FITC og H2(IA b)-FITC (bruk 5 μL x 107 celler i 100 μL MB). Bland godt og inkuber i 15 min i mørket ved 4-8 °C.
- Vask celler ved å tilsette 1-2 ml MB per 107 celler og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter.
- Pipette av supernatanten helt og resuspender cellepellet i 90 μL MB per 107 totale celler. Tilsett 10 μL Anti-FITC MicroBeads per 107 totale celler. Bland godt og inkuber i 15 min i mørket ved 4-8 °C.
- Vask cellene ved å tilsette 1-2 ml MB per 107 celler og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter.
- Pipette av supernatanten helt og resuspend opp til 1,25 x 108 celle i 500 μL MB.
- Plasser en LD-kolonne i magnetfeltet til MACS-separatoren for å gå videre til uttømmingen. For å unngå tilstopping, bruk et forseparasjonsfilter på LD-kolonnen og skyll med 2 ml MB.
- Når kolonnereservoaret er tomt, bruker du celleopphenget på filteret. Samle cellene uten etikett som passerer gjennom kolonnen.
- Vask 3 ganger med 1 ml MB, bare når kolonnereservoaret er tomt. Samle det totale avløpet, som vil bli beriket i T-celler, og telle cellene. Hold alltid 50 μL for FACS-analyse.
3. iNKT celleberikelse
- Sentrifuge ved 300 x g i 5 min og fjern supernatanten ved inversjon.
- Flekk cellene med CD1d-tetramer-PE (mus PBS57-CD1d-tetramer), i henhold til antistofftitrering i 50 μL MB per 106 celler. Bland godt og inkuber i 30 min i mørket på is.
MERK: Prosedyren kan også utføres med APC-merkede mCD1d tetramers og anti-APC perler; justere fluorokromene som brukes i følgende farging tilsvarende. I den nåværende protokollen brukte vi mus PBS-57-CD1d-tetramers levert av NIH. αgalactosylceramid (αGal-Cer) er det prototypiske antigenet som gjenkjennes av iNKT-celler; PBS-57 er en analog av αGal-Cer med forbedret løselighet9; NIH Tetramer Facility leverer PBS-57 ligand kompleks til CD1d tetramers. Imidlertid er andre CD1d dimers / tetramers / dextramers kommersielt tilgjengelige og kan lastes med et lipidisk antigen som αGal-Cer. Vi ser for oss muligheten til å justere protokollen for deres bruk. - Vask cellene ved å tilsette 1-2 ml MB per 107 celler og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter.
- Pipette av supernatanten helt og resuspender cellepellet i 80 μL MB per 107 totale celler. Tilsett 20 μL Anti-PE MicroBeads per 107 totale celler. Bland godt og inkuber i 15 min i mørket ved 4-8 °C.
- Vask celler ved å tilsette 1-2 ml MB per 107 celler og sentrifuger ved 300 x g i 10 minutter.
- Pipette av supernatanten helt og resuspender opptil 108 celler i 500 μL MB. Ellers hvis cellene overskrider 108, justerer du volumet tilsvarende.
- I henhold til celleantallet plasserer du en LS-kolonne (opptil 108) eller MS-kolonne (opptil 107) i magnetfeltet til MACS-separatoren. Skyll kolonnen med MB (3 ml for LS, 500 μL for MS).
- Bruk celleopphenget på kolonnen.
- Samle celler uten etikett som passerer gjennom. Vask kolonnen 3 ganger ved å legge til riktig mengde MB (3 x 3 ml for LS-kolonne, 3 x 500 μL for MS-kolonne) bare når kolonnebeholderen er tom. Det totale avløpet er den negative brøken.
- Fjern kolonnen fra magnetfeltet og legg den på et nytt oppsamlingsrør.
- Pipette MB på kolonnen (5 ml for LS-kolonne eller 1 ml for MS-kolonne); skyv det medfølgende stempelet inn i kolonnen og skyll den positive fraksjonen (beriket i iNKT-celler).
- For ytterligere å øke iNKT-cellegjenoppretting, sentrifugerer du den negative brøkdelen ved 300 x g i 10 minutter og gjentar trinn 3,6-3,7 med en ny LS- eller MS-kolonne. Grupper de positive brøkene, og bestem celleantall. Hold 50 μL av både positive og negative brøker for FACS-analyse.
- Kontroller purifiseringstrinnene etter aktivaanalyse. Eksempler inkluderer: milt ex-vivo, T-celleberiket brøkdel, iNKT positiv brøkdel og iNKT negativ brøkdel. Flekk cellene med: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC og DAPI.
MERK: Forventet gjenoppretting fra en iVα14-Jα18-mus er 2x106 iNKT-celler .
4. iNKT celleaktivering og utvidelse
- Aktiver rensede iNKT-celler med mus T-aktivator anti-CD3 / CD28 magnetiske perler i et 1: 1-forhold.
- Sentrifuger iNKT-cellen positiv brøkdel ved 300 x g i 5 min.
- I mellomtiden overføre riktig volum av anti-CD3 / CD28 magnetiske perler til et rør og legge til et likt volum av PBS, virvel i 5 sekunder. Plasser røret på en magnet i 1 minutt og kast supernatanten.
- Fjern røret fra magneten og resuspend de vaskede magnetiske perlene i riktig volum av fullstendig RPMI (RPMI 1640 medium, 10% varmeinaktivert FCS, 1 mM natriumpyrominitt, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 10 U/ ml penicyllin og streptomycin, 50 μM β-Mercaptoethanol) for å ha 5 x 105 iNKT-celler i 1 ml. Bruk denne suspensjonen til å resuspendere sentrifugert iNKT positiv brøkdel.
- Plate 1 ml av cellefjæringen (5 x 105 iNKT-celler) og anti-CD3/CD28 magnetiske perler i en 48 brønnplate med 20 U/ml IL-2 og inkuberer ved 37 °C.
- Etter 5 dager, tilsett 10 ng/ml IL-7.
- Del cellene 1:2 når de når 80-90% samløp, legg alltid til 20U / ml IL-2 og 10 ng / ml IL-7. Under disse forholdene kan iNKT-celler utvides i opptil 15 dager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet i dette manuskriptet gjør det mulig å berike iNKT-celler fra milten av iVa14-Ja18 transgene mus gjennom en immunomagnetisk separasjonsprosess oppsummert i figur 1A. Totalt milt T-celler velges først negativt ved å tømme B-celler og monocytter, etterfulgt av iNKT-cellens positive immunomagnetiske sortering med PBS-57 lipidantigenbelastede CD1d-tetramerer, som gjør det mulig å spesifikt flekke bare iNKT-celler. Denne protokollen gir omtrent 2 x 106 av 95-98% rene iNKT-celler fra milten til en enkelt iVa14-Ja18 Tg-mus. Ingen eller virkelig få iNKT-celler kan oppdages i den negative brøkdelen (Figur 1B).
Etter berikelse kan iVa14 iNKT-celler utvides med anti-CD3/CD28 perler pluss IL-2 og IL-7 (figur 2A), noe som resulterer i 30 ganger ekspansjon i gjennomsnitt etter dag +14 av kulturen som vist i figur 2B.
Figur 3A viser iNKT-cellerenheten sammen med ekspansjonsintroen og uttrykket for CD4-molekylet. Vi observerte en reduksjon i prosentandelen av TCRβ+ CD1d-tetramer+ doble positive celler: den sterke aktiveringen med anti-CD3 / CD28 perler induserer downregulation av iNKT celle TCR uttrykk på celleoverflaten, og en dobbel negativ populasjon vises. De fleste utvidede iNKT-celler var CD4-. Figur 3B viser en karakterisering av uttrykket av avledningsspesifikke transkripsjonsfaktorer PLZF og RORγt på berikede iNKT-celler på dag 0 og 14 dager etter utvidelsen. Denne fargingen gjør det mulig å identifisere NKT1 (PLZFlav RORγt-), NKT2 (PLZFhøy RORγt-), og NKT17 (PLZFint RORγt+) fenotyper. Å være for det meste NKT1 og NKT2, viser de berikede iNKT-cellene en TH0-lignende effektorfenotype. Denne fenotypen bevares etter 14 dagers ekspansjon som bekreftet ved sekresjon av både IFN-γ og IL-4 etter PMA/Ionomycinstimulering vist i figur 3C.
Figur 1: iNKT-celleberikelse. A) Skjematisk representasjon av den immunomgnetiske separasjonsprotokollen. B) Strømningscytometrianalyse av hvert berikelsestrinn. Prosentandel av T-cellefrekvenser vises i de øvre tomtene, inngjerdet på levedyktige lymfocytter. Mens prosentandelen av iNKT-cellefrekvenser langs hvert trinn vises i de nedre tomtene, inngjerdet på levedyktige CD19- TCRβ+ lymfocytter. Farging på levedyktig CD19- TCRβ+ lymfocytter med losset CD1d tetramer tillater å tegne iNKT-celleporten riktig. Et representativt eksperiment vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: iNKT-celle in vitro-utvidelse. A) iNKT-celleantall langs iNKT-celleutvidelse. Tre representative og uavhengige eksperimenter vises. B) Brett økningen i iNKT-cellenummer på dag 7 og 14 etter rensing og aktivering. Midler ± SD vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Utvidet iNKT-cellekarakterisering. A) Strømningscytometrianalyse av iNKT-celleprosent og CD4-uttrykk i utvidelsesperioden. Øvre tomter er inngjerdet på levedyktige lymfocytter. Lavere tomter er inngjerdet på iNKT-celler (levedyktig CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocytter). B) Fenotypisk karakterisering av beriket (dag 0) og utvidet (dag 14) iNKT celler. Tomter er inngjerdet på iNKT-celler (levedyktig CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocytter). Celler ble intranukleært farget for transkripsjonsfaktorer med Foxp3 Transkripsjonsfaktor staining Buffer Set. NKT1 (PLZFlow RORγt-), NKT2 (PLZFhigh RORγt-) og NKT17 (PLZFint RORγt+) undergrupper ble identifisert, frekvensene til hvert delsett vises i prosent. C) Cytokinproduksjon ved utvidede iNKT-celler på dag 14. Tomter er inngjerdet på iNKT-celler (levedyktig CD1d-tetramer+ TCRβ+ lymfocytter). Celler ble stimulert i 4 timer med PMA 25 ng/ml/ionomycin 1 μg/ml, i nærvær de siste 2 timene av Brefeldin A 10 μg/ml. Celler ble deretter festet med PFA 2%, permeabilisert med Permwash og deretter intracellulært farget for cytokinproduksjon. Gating strategi ble satt på den ikke-aktiverte kontrollen, venstre panel. Et representativt eksperiment vises. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi en reproduserbar og gjennomførbar protokoll for å skaffe millioner av iNKT-celler som er klare til bruk. På grunn av paucity av disse cellene in vivo, var det svært nødvendig med en metode for å utvide dem. Protokollen vi foreslår krever verken en bestemt instrumentering eller et høyt antall mus. Vi utnyttet iVα14-Jα18 transgene mus med vilje for å redusere antall mus som trengs for prosedyren.
En annen vellykket protokoll for iNKT celleutvidelse fra iVα14-Jα18 transgene mus er tilgjengelig i litteraturen10. Denne protokollen involverer generering, 6 dager før iNKT cellerensing, av friske benmarg-avledede dendrittiske celler, deretter lastet med α-galaktosylceramid og bestrålet, pluss IL-2 og IL-7. Vi anser reduksjonen av antall mus som er involvert i prosedyren en stor fordel med protokollen. Det er også tidsbesparende, siden oppsettet av cellekulturen varer en enkelt dag i stedet for en uke. En mulig begrensning av reproduserbarheten til den nåværende protokollen kan være tilgjengeligheten av iVα14-Jα18 transgene mus, som imidlertid er kommersielt tilgjengelige. I fravær av disse musene ser vi for oss muligheten for å bruke et stort antall WT-mus, men protokollen må settes opp tilsvarende på grunn av paucity av iNKT-celler i WT-mus.
Under cellekulturen sjekker vi vanligvis renheten og fenotypen til utvidede iNKT-celler. Nedgangen i prosentandelen av TCRβ+ CD1d-tetramer+ doble positive celler (figur 3A) kan forklares med en naturlig nedregulering av den invariante NKT-celle-TCR fra celleoverflaten etter aktivering. Videre uttrykte flertallet av utvidede iNKT-celler ikke CD4 (Figur 3A): Dette kan representere en fordel i sammenheng med en adoptivcelleterapi, siden CD4- iNKT-celler ble funnet å være de mest effektive i å kontrollere tumorprogresjon11. Videre er den observerte TH0-lignende effektorfenotypen (figur 3C) helt sammenhengende med det som observeres i humane iNKT-celler etter in vitro-utvidelse og restimulering8,12,13,14,15. De utvidede cellene er svært reaktive in vivo og in vitro, og er dermed nyttige i sammenhenger med iNKT-cellebaserte adoptivimmunoterapier. Adoptivoverføring av umanipulerte eller utvidede iNKT-celler forhindrer eller ameliorates akutt Graft-Versus-Host Sykdom (aGVHD) forlater uendret Graft-Versus-Leukemi effekt16,17,18,19. Adoptivt overførte humane iNKT-celler utvidet in vitro med αGal-Cer lindre xenogeneic aGVHD og denne effekten er mediert av CD4- men ikke CD4+ celler20. Videre, gitt at iNKT-celler ikke forårsaker aGVHD, utgjør de de ideelle cellene for CAR-immunterapi uten behov for sletting av TCR og viste seg å ha langvarig antitumoraktivitet in vivo8,15. iNKT-celler utnyttes for tiden i pågående og konkluderte kliniske studier21,22,23,24.
Til slutt er den beskrevne protokollen rask, grei og tillater en 30x økning i antall iNKT-celler gjenopprettet fra en mus milt (Figur 3B). Disse cellene kan lett utnyttes for in vitro-anerkjennelsesanalyser, samkultursystemer eller adoptivcelleterapi i prekliniske studier. iNKT-celler spiller faktisk en kritisk rolle i tumorimmun overvåking, smittsomme sykdommer og autoimmunitet. I disse sammenhengene kan iNKT-celler representere et kraftig verktøy, som er et tiltalende alternativ til konvensjonelle T-celler uten MHC-begrensningen. Den raske generasjonen av store mengder av disse cellene og muligheten til å manipulere dem ytterligere in vitro kan føre til utvikling av enestående terapeutiske strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Paolo Dellabona og Giulia Casorati for vitenskapelig støtte og kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker også NIH Tetramer Core Facility for mus CD1d tetramer. Studien ble finansiert av Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (til M.F.) og Italian Association for Cancer Research (AIRC) fellowship 2019-22604 (til G.D.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
| anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
| anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
| CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
| CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
| Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
| FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
| H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
| hrIL-2 | Chiron Corp | ||
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
| MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
| PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
| PFA | Sigma | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
| RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
| sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
| TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
| αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L.
- Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions. Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).
- Pellicci, D. G., et al. A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage. Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).
- Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. A thymic precursor to the NK T cell lineage. Science. 296 (5567), 553-555 (2002).
- Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells. Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).
- Griewank, K., et al. Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development. Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).
- Cortesi, F., et al. Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression. Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).
- Heczey, A., et al. Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy. Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).
- Liu, Y., et al. A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells. Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).
- Crowe, N. Y., et al. Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).
- de Lalla, C., et al. Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis. Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).
- Tian, G., et al. CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo. Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).
- Gaya, M., et al. Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells. Cell. 172 (3), 517-533 (2018).
- Rotolo, A., et al. Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting. Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).
- Schneidawind, D., et al. Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality. Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).
- Schneidawind, D., et al. CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells. Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).
- Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation. Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).
- Leveson-Gower, D. B., et al. Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism. Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).
- Coman, T., et al. Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease. Oncoimmunology. 7 (11), 1470735 (2018).
- Xu, X., et al. NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma. Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).
- Heczey, A., et al. Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis. Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).
- Exley, M. A., et al. Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial. Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).
- Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy. Frontiers in Immunology. 9, 384 (2018).
