Summary
Qui presentiamo un nuovo protocollo per studiare e mappare la deposizione mirata dei portatori di farmaci alle cellule endoteliali in modelli di arteria umana fabbricati, di dimensioni reali e tridimensionali sotto flusso fisiologico. Il metodo presentato può servire come una nuova piattaforma per colpire i portatori di farmaci all'interno del sistema vascolare.
Abstract
L'utilizzo di modelli tridimensionali (3D) di arterie umane, progettati con le dimensioni e l'anatomia corrette, consente la corretta modellazione di vari processi importanti nel sistema cardiovascolare. Recentemente, sebbene diversi studi biologici siano stati eseguiti utilizzando tali modelli 3D di arterie umane, non sono stati applicati allo studio del targeting vascolare. Questo articolo presenta un nuovo metodo per fabbricare modelli arteriosi umani di dimensioni reali e ricostruiti utilizzando una tecnica di stampa 3D, allinearli alle cellule endoteliali umane (EC) e studiare il targeting delle particelle sotto flusso fisiologico. Questi modelli hanno il vantaggio di replicare le dimensioni fisiologiche e le condizioni dei vasi sanguigni nel corpo umano utilizzando componenti a basso costo. Questa tecnica può servire come una nuova piattaforma per lo studio e la comprensione del targeting farmacologico nel sistema cardiovascolare e può migliorare la progettazione di nuove nanomedicine iniettabili. Inoltre, l'approccio presentato può fornire strumenti significativi per lo studio della somministrazione mirata di diversi agenti per le malattie cardiovascolari in condizioni fisiologiche e di flusso specifiche del paziente.
Introduction
Diversi approcci sono stati recentemente applicati utilizzando modelli 3D di arterie umane1,2,3,4,5. Questi modelli replicano l'anatomia fisiologica e l'ambiente delle diverse arterie del corpo umano in vitro. Tuttavia, sono stati utilizzati principalmente negli studi di biologia cellulare. Gli attuali studi sul targeting vascolare delle particelle all'endotelio comprendono simulazioni computazionali silico 6,7,8, modelli microfluidici in vitro 9,10,11e modelli animali in vivo 12. Nonostante le intuizioni che hanno fornito, questi modelli sperimentali non sono riusciti a simulare accuratamente il processo di targeting che si verifica nelle arterie umane, in cui il flusso sanguigno e l'emodinamica costituiscono fattori dominanti. Ad esempio, lo studio del targeting delle particelle verso le regioni aterosclerotiche nella biforcazione dell'arteria carotide, note per il loro complesso modello di flusso di ricircolo e il gradiente di sollecitazione di taglio della parete, può influire sul viaggio intrapreso dalle particelle prima che raggiungano l'endotelio13,14,15,16. Pertanto, questi studi devono essere eseguiti in condizioni che replicano l'ambiente fisiologico, cioèdimensioni, dimensione, anatomia e profilo di flusso.
Recentemente, questo gruppo di ricerca ha fabbricato modelli arteriosi umani ricostruiti in 3D per studiare la deposizione e il targeting delle particelle alla vascucolatura17. I modelli erano basati su repliche geometriche 3D di vasi sanguigni umani, che venivano poi coltivati con HC umani che successivamente fiancheggiavano le loro pareti interne. Inoltre, se sottoposti a un sistema di perfusione che produce flusso fisiologico, i modelli hanno replicato accuratamente le condizioni fisiologiche. Il sistema di perfusione è stato progettato per perfondere fluidi a una portata costante, utilizzando una pompa peristaltica sia in configurazioni a circuito chiuso che a circuito aperto(Figura 1). Il sistema può essere utilizzato come circuito chiuso per mappare la deposizione di particelle e mirare alle cellule sementi all'interno del modello carotide. Inoltre, può essere utilizzato come circuito aperto per lavare le particelle non aderenti alla fine degli esperimenti e per pulire e mantenere il sistema. Questo documento presenta protocolli per la fabbricazione di modelli 3D della biforcazione carotide umana, la progettazione del sistema di perfusione e la mappatura della deposizione di particelle mirate all'interno dei modelli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTA: Questo protocollo descrive la fabbricazione di un modello 3D dell'arteria carotide e può essere applicato per generare qualsiasi altra arteria di interesse semplicemente modificando i parametri geometrici.
1. Progettazione e fabbricazione di una biforcazione 3D del modello di arteria carotide umana
- Scegli le immagini dei pazienti o geometrie precedentemente studiate della biforcazione dell'arteria carotide umana e crea un modello di progettazione computerizzate dello stampo che deve essere stampato.
NOTA: La biforcazione dell'arteria carotide ha un ingresso e due prese. È importante progettare un telaio di stampo 3D attorno all'arteria e supporti di stampa temporanei tra il telaio e lo stampo dell'arteria (Figura 2A-C). - Stampare le geometrie utilizzando una stampante 3D. Tagliare i supporti di stampa temporanei e utilizzare carta vetrata per lucidare e levigare gli stampi, specialmente nelle aree in cui sono stati tagliati i supporti. Risciacquare il modello levigato con alcool isopropile per rimuovere la polvere di plastica e lasciare asciugare completamente in una cappa chimica per 2-3 ore.
NOTA: Qui, gli stampi stampati sono stati realizzati in resina trasparente v4 (Figura 2D, E). - Per sciogliere facilmente la plastica, spruzzare gli stampi con lacca trasparente all'interno di una cappa chimica e lasciare asciugare all'aria per 1 h. Ripeti questo 3x.
NOTA: Qui è stato utilizzato 2X Ultra Cover Clear Spray, ma qualsiasi altro tipo dovrebbe essere adatto purché non sia lacca di legno. Confermare che non è rimasta plastica esposta perché la plastica può reagire con il silicone e impedirne la corretta solidificazione. La qualità della superficie spruzzata determinerà la qualità della superficie del modello finale in silicone. - Tagliare scivoli/strisce rettangolari trasparenti di plastica liscia delle stesse dimensioni del telaio dello stampo e incollarli utilizzando la lacca al telaio su tutti i lati e da un lato del telaio, in modo che venga sigillato nella parte inferiore e aperto nella parte superiore. Applicare la lacca utilizzando una spazzola all'interno di un cappuccio chimico e lasciare asciugare completamente i vetrini per almeno 24 ore(Figura 2F).
- Per preparare la miscela di gomma siliconica, aggiungere silicone liquido con il suo agente polimerizzante (rapporto di massa 1:10) in una piastra di plastica e mescolare accuratamente per garantire la miscelazione completa. Per il modello carotide, aggiungere 54 g di silicone e 6 g del suo agente polimerizzante.
- Raffreddare la miscela per 15 minuti a 4 °C, quindi degasarla in un essiccatore sottovuoto fino a quando tutte le bolle d'aria non sono state eliminate. Posizionare lo stampo nell'essiccatore (con il lato aperto rivolto verso l'alto), versare lentamente la miscela di silicone nello stampo e rimuovere nuovamente le bolle d'aria fino a quando la miscela non è chiara.
- Lasciare riposare lo stampo con il silicone durante la notte a temperatura ambiente (se possibile, lasciarlo nell'essiccatore senza vuoto). Se la miscela non si è completamente asciugata, incubarla a 60 °C per altre ore.
- Una volta che la miscela è completamente asciutta, rimuovere i vetri trasparenti e immergere il modello in acetone assoluto per 48 ore in una cappa chimica fino a quando la plastica non è completamente sciolta. Rimuovere eventuali avanzi di plastica con un bastone di legno. Per evaporare l'acetone intrappolato all'interno del modello, incubarlo a 60 °C per almeno 4 giorni prima della semina cellulare.
2. Coltura cellulare e semina nei modelli
- Preparare tre connettori per il modello carotide: uno per l'ingresso e due per le prese (vedi Tabella dei materiali). Sterilizzare il modello e i connettori mediante irradiazione ultravioletta in una cappa biologica per 20 minuti.
- Rivestire i modelli con 4 mL di fibronectina da 100 μg/mL (in 1x salina tamponata da fosfati, (PBS)) per 2 ore a 37 °C o durante la notte a 4 °C. Iniettare la soluzione di fibronectina nel modello attraverso l'ingresso utilizzando una siringa di plastica da 5 o 10 ml. Rimuovere la fibronectina attraverso l'uscita e lavare il modello con mezzo EC.
- Sospendere 2,5 × 106 cellule/mL di cellule endoteliali vena ombelicali umane (HUVEC, passaggio < 6) e riempire il modello con 4 ml della sospensione cellulare utilizzando una siringa di plastica da 5 o 10 ml(figura 3A). Posizionare il modello su un rotatore all'interno di un incubatore (37 °C) ad una velocità di 1 rpm per 48 h per garantire una semina omogenea. Assicurarsi che il modello sia ben collegato al rotatore (Figura 3B). Cambiare il mezzo dopo 24 ore all'interno di una cappa biologica e tornare al rotatore all'interno dell'incubatore per altri 24 h.
NOTA: Dopo 24 ore, le cellule vengono sementi e possono essere immagini utilizzando un microscopio. - Rimuovere il modello dal rotatore e lavare con 1x PBS utilizzando una siringa di plastica da 10 ml. Per fissare le cellule, incubare le cellule con 4 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) al modello per 15 minuti all'interno di una cappa chimica, quindi risciacquare 3 volte con PBS. Aggiungere 4 mL di PBS e conservare a 4 °C fino all'esperimento (Figura 3C). Mantenere le celle all'interno del modello utilizzando protocolli di colorazione standard(ad esempio, colorazione nucleare con 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI), Figura 3D).
3. Progettazione del sistema di perfusione
- Il sistema di perfusione ha due prese e due tubi di uscita. Unire le due entrate in un unico tubo ID da 4 mm e di nuovo in due tubi ID da 6 mm, che si collegano alla pompa peristaltica. Unire i due tubi ID da 6 mm che escono dalla pompa peristaltica in un unico tubo da 4 mm e collegarli a uno smorzatore di oscillazione per eliminare eventuali oscillazioni dalla pompa. Utilizzare una bottiglia a bocca stretta da 250 ml con un coperchio a tre orifizi come smorzatore.
- Collegare un orifizio all'ingresso dalla pompa, chiudere il secondo con un sughero utilizzato per lo sfiato della pressione in caso di emergenza ed estendere il terzo orifizio (che è l'uscita) sul fondo della bottiglia.
- Collegare lo smorzatore all'ingresso del modello carotide coltivato utilizzando i tubi di uscita. Unire le due prese del modello a un tubo, che sarà l'uscita del sistema (tutti i tubi sono 4 mm ID).
- Dividere i tubi di uscita in due tubi di uscita (uno per il circuito chiuso e l'altro per il contenitore dei rifiuti nel circuito aperto). Attaccare un morsetto di plastica a ciascun tubo.
NOTA: La combinazione di morsetti aperti/chiusi determinerà se il sistema si trova in una configurazione a circuito chiuso o aperto. Come mostrato nella figura 1, se i morsetti a e d sono vicini mentre b e c sono aperti, il sistema è un circuito chiuso; il contrario porta il sistema alla configurazione a circuito aperto. - Preparare tre contenitori: uno in grado di contenere 300 mL di fluido (per circuito chiuso) e altri due da 1 L ciascuno: uno per il lavaggio e l'altro per i rifiuti (per circuito aperto).
4. Configurazione a circuito chiuso: esperimento di perfusione e imaging
- Aggiungere 300 mL di PBS al contenitore a circuito chiuso, che è sufficiente per riempire l'intero sistema, compresi i tubi e il modello. Posizionare un tubo di ingresso e un tubo di uscita (morsetti aperti b e c) all'interno del contenitore.
- Riempire il contenitore di lavaggio da 1 L con acqua distillata (per il lavaggio alla fine dell'esperimento) e lasciare vuoto l'altro contenitore di rifiuti da 1 L. Posizionare l'altro tubo di ingresso e uscita (morsetti ravvicinati a e d) rispettivamente nei contenitori di lavaggio e di scarto.
- Eserti il modello carotide in coltura a celle fisse dalla conservazione a 4 °C e svuota il PBS. Collegare l'ingresso e le uscite della carotide come descritto nei passaggi 3.3-3.4. Non lasciare il modello asciutto per molto tempo. Una volta collegato il modello, attivare la pompa per perfondere il fluido.
- Posizionare il modello carotide al microscopio. Aprire il tubo prima dell'ingresso e dopo l'uscita del modello carotide. Impostare la pompa peristaltica a 10 giri/min e accenderla. Aumenta la velocità in incrementi di 5 giri/min, ogni 4-5 minuti. Assicurarsi che non vi siano perdite.
- A 100 giri/min, che equivale alla portata massima della forma d'onda fisiologica dell'arteria carotide umana (~400 mL/min), aggiungere particelle fluorescenti di polistirolo carbossilato (PS) (2 μm, ad una concentrazione di 1,6 μg/mL) ai 300 mL di PBS nel contenitore a circuito chiuso. Immagine della regione di interesse ogni 10 s per 1,5 ore (ancora singole immagini o video in base alle esigenze).
5. Configurazione a circuito aperto: la fase di lavaggio
- Aprire i morsetti dei tubi di lavaggio e scarico nei contenitori da 1 L (morsetti a e d) e chiudere immediatamente i morsetti dei tubi di ingresso e di uscita nel contenitore da 300 mL (morsetti b e c) per cambiare il sistema da una configurazione a circuito chiuso a una aperta.
- Lascia che la maggior parte dell'acqua fluisa dal contenitore di lavaggio al contenitore dei rifiuti a 100 giri/min. Prima che venga completamente trasferito, premere stop sulla pompa peristaltica e chiudere i morsetti del tubo prima dell'ingresso e dopo l'uscita del modello carotide.
- Utilizzando i filtri appropriati, acquisire immagini del modello nella regione di interesse per mostrare la deposizione e l'adesione delle particelle alle cellule. Scollegare il modello carotide. Aggiungere con attenzione e lentamente 4 ml di PBS con una siringa da 10 ml attraverso l'ingresso del modello.
- Collegare un "modello fittizio", (che è anche un modello carotide 3D in gomma siliconica utilizzato solo per il lavaggio, senza celle coltivate) al posto del modello carotide, e risciacquare il sistema. Aggiungere altri 1 L di acqua e lavare nuovamente il sistema fino a quando tutta l'acqua viene trasferita dal contenitore di lavaggio ai rifiuti. Spegnere la pompa peristaltica.
6. Acquisizione e analisi dei dati
- Acquisire un filmato digitale di deposizione di particelle nella regione di interesse con le immagini scattate durante l'esperimento, utilizzando un codice software personalizzato (vedere la Tabella dei Materiali).
- Per la mappatura della deposizione delle particelle lungo il modello, affiancare più immagini per coprire la regione di interesse esaminata (Figura 4A, B).
NOTA: È possibile scrivere un codice software personalizzato per quantificare il numero di particelle aderenti in un sito di interesse (un file di esempio è stato fornito come informazioni supplementari)17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Questo documento presenta un nuovo protocollo per mappare la deposizione di particelle all'interno di modelli di arteria umana 3D di dimensioni reali, che possono fornire una nuova piattaforma per la ricerca sulla somministrazione di farmaci. Utilizzando una tecnica di stampa 3D, è stato fabbricato un modello dell'arteria di biforcazione carotide umana(Figura 2). Il modello era realizzato in gomma siliconica e sementi con HC umani(figura 3). È importante sottolineare che questo protocollo ha permesso la replicazione delle condizioni fisiologiche, in particolare per quanto riguarda la fluidodinamica. Un sistema di perfusione è stato progettato per infondere particelle alla biforcazione carotide sotto flusso costante alla grandezza della forma d'onda fisiologica caratteristica della carotide. La figura 1 presenta il sistema di perfusione, costituito dalla pompa peristaltica, da uno smorzatore di oscillazione, dal modello di biforcazione coltivato, dai tubi e dai contenitori per fluidi.
Per mappare la deposizione e l'adesione delle particelle perfuse, il modello arterioso è stato immaginato sotto uno stereomicroscopio, sia alla fine dell'esperimento che dopo il lavaggio (fase 5.3). Le immagini sono state catturate usando l'obiettivo 2x e piastrellate insieme per formare un'intera immagine del modello. Quindi, il numero di particelle aderenti è stato calcolato utilizzando un codice software personalizzato. Per esaminare la formazione del modello di ricircolo alla biforcazione, nel modello sono state infuse perline di vetro fluorescenti da 10 μm. La figura 4A mostra il ricircolo, il che suggerisce che le condizioni all'interno del modello imitano le condizioni fisiologiche.
Per mappare la deposizione di particelle all'interno del modello, sono state infuse particelle fluorescenti di PS carbossilate da 2 μm e la loro adesione agli EC è stata imageizzata (Figura 4B, C). Queste particelle hanno aderito in modo diverso in varie regioni lungo l'adesione più modello è stata osservata fuori dall'area di ricircolo, dove la sollecitazione di taglio della parete è alta. Questi risultati sono stati precedentemente discussi per dimostrare che l'adesione delle particelle è una funzione della geometria del modello, delle caratteristiche della superficie delle particelle e della sollecitazione ditaglio 17. Queste mappe di deposizione sono relativamente semplici e possono essere rapidamente ottenute per lo screening dell'affinità dei portatori di farmaci e il targeting in condizioni fisiologiche in modelli specifici del paziente.
Figura 1: Il sistema di perfusione. Un sistema di perfusione è stato progettato per perfondere fluidi a flusso costante. È composto da (1) una pompa peristaltica, (2) uno smorzatore di oscillazione, (3) il modello arterioso 3D coltivato e tre contenitori di vetro: due con una capacità di 1 L (4 e 6) e un terzo che può contenere 300 mL di fluido (5). Il sistema può funzionare in due configurazioni: (i) un circuito aperto, in cui i morsetti a+d sono aperti e b+c sono chiusi, o (ii) un circuito chiuso, in cui i morsetti a+d sono chiusi e b+c sono aperti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Processo di fabbricazione di un modello di biforcazione di arteria carotide 3D. (A-C) Biforcazione carotide umana, telaio dello stampo intorno all'arteria e supporti di stampa temporanei. (D, E) Le geometrie sono state stampate utilizzando una stampante 3D. (F) I supporti di stampa temporanei sono stati tagliati e il modello è stato levigato e spruzzato con lacca. Quindi, le diapositive rettangolari trasparenti sono state incollate al telaio da tutti i lati. La gomma siliconica è stata fusa quando la colla era asciutta. Abbreviazione: 3D = tridimensionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Semina di EC all'interno di modelli 3D dell'arteria carotide. (A) Modello 3D di dimensioni reali della biforcazione carotide umana in gomma siliconica. Il modello è stato coltivato con HC umani e riempito con mezzo cellulare. (B) Il modello coltivato è stato posizionato su un rotatore a 37 °C per 48 h. (C) Immagini delle EC coltivate all'interno del modello 3D in campo brillante e (D) con DAPI per la colorazione nucleare in blu. Barre di scala = 10 μm. Abbreviazioni: ECs = cellule endoteliali; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo; 3D = tridimensionale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Perfusare e mappare l'adesione delle particelle. (A) Immagine a linea striata di snellimenti e ricircolo (rettangolo tratteggiato) generata dopo perfusione di particelle di vetro fluorescente da 10 μm a un flusso costante di 400 mL/min attraverso il modello. (B) Mappa di deposizione delle particelle fluorescenti di PS carbossilate da 2 μm (in rosso) all'interno del modello coltivato in 3D. Barra di scala = 2 mm. (C) Adesione delle particelle (in rosso) agli EC coltivati (in blu-DAPI) all'interno del modello con un ingrandimento di 10x. Barra di scala = 10 μm. Abbreviazioni: PS = polistirolo; 3D = tridimensionale; ECs = cellule endoteliali; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenilindolo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Informazioni supplementari: Clicca qui per scaricare questo file.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gli attuali approcci per studiare il targeting vascolare delle particelle non sono all'altezza della replicazione delle condizioni fisiologiche presenti nel corpo umano. Qui è presentato un protocollo per fabbricare modelli di arterie umane ricostruiti in 3D per studiare il targeting delle particelle verso gli EC che rivestono l'arteria sotto flusso fisiologico applicato utilizzando un sistema di perfusione personalizzato. Quando si sceglie il materiale per la stampa 3D, è meglio utilizzare una plastica trasparente per evitare il trasferimento del pigmento al modello in silicone, che dovrebbe essere il più trasparente possibile. Inoltre, è importante scegliere un materiale che non si dissolva in acetone, ma diventi invece morbido e fragile e possa successivamente essere facilmente rimosso dal modello.
I modelli 3D presentati sono realizzati in gomma siliconica, un silicone trasparente, mescolato con il suo agente polimerizzante. È importante assicurarsi che la miscela sia sempre a temperatura ambiente o inferiore, altrimenti il collegamento incrociato tra il silicone e l'agente di polimerizzazione inizierà prima del degassamento e della colata sugli stampi. Sebbene il polidimetilsilossano possa essere utilizzato anche per fabbricare tali modelli (rapporto 1:10 con il suo reticello), la gomma siliconica è più resistente. Dopo aver immergendo il modello in acetone per sciogliere la plastica, è fondamentale incubarla a 60 °C per almeno 4 giorni per garantire la piena evaporazione di eventuali residui di acetone. Se l'acetone rimane intrappolato all'interno del modello, le cellule non cresceranno correttamente. Cambiare il mezzo dopo 24 ore e fissare le cellule dopo 48 ore sono i due passaggi che comportano l'iniezione manuale di liquido utilizzando una siringa da 10 ml. È quindi importante perfondere lentamente, altrimenti le cellule potrebbero essere lavate.
Il sistema di perfusione ha due prese e due tubi di uscita. Ogni tubo ha un morsetto per tubi di plastica per il controllo del flusso. La maggior parte del sistema di tubi è composto da tubi dimetro interno (ID) da 4 mm, ad eccezione dei tubi che sono fissati nella pompa, che sono tubi ID da 6 mm. L'ID dei tubi fissati nella pompa determinerà la portata massima che può essere raggiunta nel sistema. Questo sistema di perfusione può anche generare una forma d'onda pulsatile sovrapponendo le oscillazioni sul flusso mediocostante 17 collegando l'uscita dello smorzatore a un assieme oscillatore, che sovrappone la parte oscillatoria di una forma d'onda desiderata sulla portata costante prodotta dalla pompa peristaltica. Questa configurazione consente il funzionamento in flusso oscillatorio o in condizioni di flusso costante quando l'oscillatore è spento.
In questo articolo, il sistema di perfusione è stato personalizzato sulla base di esperimenti con la biforcazione dell'arteria carotide umana 3D. Pertanto, se vengono utilizzati altri modelli arteriosi o altri tubi, le quantità di fluidi e portata possono richiedere regolazioni. In questi casi, il sistema e la portata dovranno essere calibrati, garantendo al contempo nessun distacco cellulare dalle pareti del modello. È molto importante aumentare gradualmente la portata nella pompa peristaltica per garantire che le cellule non siano lavate via con il flusso. Inoltre, è fondamentale garantire che l'intero sistema, compresi i tubi, il modello e il contenitore siano riempiti di fluidi(ad esempio,in questo caso, è stato riempito con un volume totale di 300 mL di fluido). Inoltre, prima e dopo ogni esperimento, il sistema deve essere lavato con acqua distillata in una configurazione a circuito aperto.
Il sangue può anche essere perfuso nei modelli utilizzando il sistema di perfusione17. In questo caso, è necessario prestare particolare attenzione per prevenire eventuali perdite, specialmente se viene utilizzato sangue umano. Inoltre, la fase di lavaggio è fondamentale in quanto la candeggina deve essere perfusa alla fine dell'esperimento per garantire il lavaggio completo dal sangue. Dopo la candeggina, l'acqua deve essere perfusa come menzionato nel protocollo. È importante notare che in questo documento sono state utilizzate particelle di PS carbossilate, che hanno una composizione uniforme e una distribuzione di dimensioni ridotte. Inoltre, queste particelle aderiscono alle cellule principalmente attraverso interazioni elettrostatiche. Tuttavia, possono essere utilizzati altri nanocarri di farmaci, e si dovrebbe esaminare anche un targeting specifico con particelle etichettate con ligando, ad esempio, alla molecoladi adesione anti-intercellulare 1 e alla molecola di adesione delle cellule endoteliali anti-piastrinica 1, che aumenterà l'accumulo di particelle negli EC nel sito di interesse.
Inoltre, in questo protocollo, gli EC sono stati fissati prima di collegare i modelli al sistema di perfusione e all'iniezione delle particelle. L'adesione delle particelle alle cellule fisse rappresenta il primo stadio del processo di legame e quindi devono essere eseguiti esperimenti con cellule vive, dove l'internalizzazione delle particelle può verificarsi durante le fasi successive del processo di adesione. Questo protocollo può essere utilizzato per fabbricare modelli arteriosi 3D per lo studio dei portatori di farmaci in condizioni fisiologiche. L'approccio delineato può aiutare nello studio della somministrazione di agenti in condizioni specifiche del paziente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation (sovvenzione ISF # 902/18). La borsa di studio di Maria Khoury è stata sostenuta dal programma di dottorato femminile della baronessa Ariane de Rothschild.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D printer | FormLabs | PKG-F2-REFURB | |
| Acetone, absolute (AR grade) | |||
| Connectors | Nordson Medical | FTLL013-1 | Female Luer |
| FTLL230-1 | Female Luer | ||
| FTLL360-1 | Female Luer | ||
| LP4-1 | Male Luer Integral Lock | ||
| Damper | Thermo-Fisher Scientific | DS2127-0250 | Nalgene Polycarbonate, Validation Bottle |
| Damper Cover | Thermo-Fisher Scientific | 2162-0531 | Nalgene Filling/Venting Closures |
| Elastosil Elastosil RT 601 A | Wacker | 60003805 | |
| Elastosil RT 601 B | Wacker | 60003817 | The crosslinker |
| Endothelial Cell Media | ScienCell | 1001 | |
| Fibrontectin | Sigma Aldrich | F0895-5mg | |
| HUVEC | Lonza | CC-2519 | |
| Isopropyl alcohol, AR grade 99.5% | Remove plastic dust from the sanded model | ||
| Lacquer | Rust-Oleum | 2X-Ultra cover Gloss Clear | |
| Matlab | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| Microscope | Nikon | SMZ25 | |
| Microscope Camera | Nikon | DS-Qi2 | |
| Peristaltic pump | Watson Marlow | 530U IP31 | With 2 pumpheads: 313D |
| Plastic tube clamp | Quickun | 1-2240-stopvalve-2pcs | |
| Polystyrene Particles | Thermo-Fisher Scientific | F8827 | Diameter = 2 µm |
| Printer resin | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | |
| Rotator | ELMI Ltd. | Intelli-Mixer RM-2 | |
| Solidworks | SolidWorks Corp., Dassault Systèmes | https://www.solidworks.com/ | |
| Tubing | Watson Marlow | 933.0064.016 | Tubing for the pump: 6.4 mm ID |
| All the other tubing: Silicon tubing: 4 mm ID | |||
References
- Chiu, J. J., et al. Analysis of the effect of disturbed flow on monocytic adhesion to endothelial cells. Journal of Biomechanics. 36 (12), 1883-1895 (2003).
- Martorell, J., et al. Extent of flow recirculation governs expression of atherosclerotic and thrombotic biomarkers in arterial bifurcations. Cardiovascular Research. 103 (1), 37-46 (2014).
- Karino, T., Goldsmith, H. L. Flow behaviour of blood cells and rigid spheres in an annular vortex. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 279 (967), 413-445 (1977).
- Goldsmith, H. L., Karino, T. Platelets in a region of disturbed flow. Transactions - American Society for Artificial Internal Organs. 23, 632-638 (1977).
- Farcas, M. A., Rouleau, L., Fraser, R., Leask, R. L. The development of 3-D, in vitro, endothelial culture models for the study of coronary artery disease. Biomedical Engineering Online. 8, 30 (2009).
- Peng, B., et al. Modeling nanoparticle targeting to a vascular surface in shear flow through diffusive particle dynamics. Nanoscale Research Letters. 10 (1), 942 (2015).
- Shah, S., Liu, Y., Hu, W., Gao, J. Modeling particle shape-dependent dynamics in nanomedicine. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 11 (2), 919-928 (2011).
- Hossain, S. S., Hughes, T. J., Decuzzi, P. Vascular deposition patterns for nanoparticles in an inflamed patient-specific arterial tree. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 13 (3), 585-597 (2014).
- Charoenphol, P., Huang, R. B., Eniola-Adefeso, O. Potential role of size and hemodynamics in the efficacy of vascular-targeted spherical drug carriers. Biomaterials. 31 (6), 1392-1402 (2010).
- Ta, H. T., Truong, N. P., Whittaker, A. K., Davis, T. P., Peter, K. The effects of particle size, shape, density and flow characteristics on particle margination to vascular walls in cardiovascular diseases. Expert Opinion on Drug Delivery. 15 (1), 33-45 (2018).
- Cooley, M., et al. Influence of particle size and shape on their margination and wall-adhesion: implications in drug delivery vehicle design across nano-to-micro scale. Nanoscale. 10 (32), 15350-15364 (2018).
- Jiang, X. Y., et al. Quantum dot interactions and flow effects in angiogenic zebrafish (Danio rerio) vessels and human endothelial cells. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (3), 999-1010 (2017).
- Zarins, C. K., et al. Carotid bifurcation atherosclerosis. Quantitative correlation of plaque localization with flow velocity profiles and wall shear stress. Circulation Research. 53 (4), 502-514 (1983).
- Chien, S. Effects of disturbed flow on endothelial cells. Annals of Biomedical Engineering. 36 (4), 554-562 (2008).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. JAMA. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- Glagov, S., Zarins, C., Giddens, D. P., Ku, D. N. Hemodynamics and atherosclerosis. Insights and perspectives gained from studies of human arteries. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 112 (10), 1018-1031 (1988).
- Khoury, M., Epshtein, M., Zidan, H., Zukerman, H., Korin, N. Mapping deposition of particles in reconstructed models of human arteries. Journal of Controlled Release. 318, 78-85 (2020).
