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प्रयोगात्मक स्टेटोसिस इन विट्रोका एक मॉडल: लिपिड अधिभार-वातानुकूलित माध्यम में हेपेटोसाइट सेल संस्कृति

Published: May 18, 2021 doi: 10.3791/62543
Automatic Translation
1, 1
1Laboratorio de Hígado, Páncreas y Motilidad, Unidad de Medicina Experimental, Facultad de Medicina-UNAM, Hospital General de México “Dr. Eduardo Liceaga”

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य स्टेटोसिस और आणविक, जैव रासायनिक, सेलुलर परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण होना है जो विट्रो मेंलिपिड के लिए हेपेटोसाइट्स के ओवर एक्सपोजर द्वारा उत्पादित है।

Abstract

मेटाबोलिक डिसफंक्शन से जुड़ी फैटी लिवर डिजीज (MAFLD), जिसे पहले नॉन-अल्कोहलिक फैटी लिवर डिजीज (NAFLD) के नाम से जाना जाता था, मोटापे, डायबिटीज टाइप 2 और डिस्लिपिडेमिया के साथ अपने संबंधों के कारण दुनिया भर में सबसे प्रचलित लिवर डिजीज है । हेपेटिक स्टीटोसिस, लिवर पैरेन्चिमा में लिपिड बूंदों का संचय, स्टीटोहेपेटाइटिस, फाइब्रोसिस और अंत चरण जिगर की बीमारी में देखी गई सूजन से पहले की बीमारी की एक प्रमुख विशेषता है। हेपेटोसाइट्स में लिपिड संचय ज़ेनोबायोटिक्स और अंतर्जात अणुओं के उचित चयापचय के साथ-साथ सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रेरित करने के साथ-साथ रोग के अग्रिम के लिए अग्रणी हो सकता है। यद्यपि स्टीटोसिस का प्रायोगिक अध्ययन वीवो मेंकिया जा सकता है, लेकिन स्टीटोसिस के अध्ययन के लिए इन विट्रो दृष्टिकोण विभिन्न फायदों के साथ पूरक उपकरण हैं। लिपिड अधिभार-वातानुकूलित माध्यम में हेपेटोसिट संस्कृति हेपेटिक स्टीटोसिस के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट प्रजनन योग्य विकल्प है जो लिपिड संचय से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं की पहचान की अनुमति देता है, जैसे ऑक्सीडेटिव और रेटिकुलर तनाव, ऑटोफैगिया, प्रसार, सेल डेथ, वगैरह, साथ ही दवा प्रभावशीलता सहित अन्य परीक्षण, और कई अन्य संभावित अनुप्रयोगों के बीच विष विज्ञान परीक्षण। यहां, इसका उद्देश्य लिपिड अधिभार-वातानुकूलित माध्यम में हेपेटोसाइट सेल संस्कृति की पद्धति का वर्णन करना था। हेपजी2 कोशिकाओं को आरएमपीआई 1640 मध्यम वातानुकूलित सोडियम पलमिटेट और सोडियम ओलेट के साथ सुसंस्कृत किया गया था। महत्वपूर्ण बात, इन दो लिपिड का अनुपात लिपिड बूंद संचय एहसान करने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि सेल प्रसार और एक मध्यम मृत्यु दर को बनाए रखने, के रूप में रोग के दौरान जिगर में होता है । लिपिड समाधान स्टॉक, मिश्रण, माध्यम के अलावा, और हेपेटोसाइट संस्कृति की तैयारी से कार्यप्रणाली दिखाई जाती है। इस दृष्टिकोण के साथ, हेपेटोसाइट्स में लिपिड बूंदों की पहचान करना संभव है जो तेल-लाल ओ धुंधला द्वारा आसानी से नमूदार हैं, साथ ही प्रसार/मृत्यु दर के घटता है ।

Introduction

मेटाबोलिक डिसफंक्शन से जुड़ा फैटी लिवर दुनिया भर में अत्यधिक प्रचलित है1,2. यह अनुमान है कि आबादी का 25% तक प्रभावित है3. इस बीमारी को पहले गैर-अल्कोहलिक फैटी लिवर डिजीज (NAFLD) के रूप में जाना जाता है, ने मोटापे, इंसुलिन प्रतिरोध, मधुमेह प्रकार 2, और डिस्लिपिडेमिया के साथ-साथ रोग3,4के संभावित प्रबंधनों से संबंधित रोगजनकों को सही ढंग से प्रतिबिंबित करने के लिए मेटाबोलिक डिसफंक्शन से जुड़े फैटी लिवर डिजीज (एमएएफएलडी) के लिए अपने नामकरण को अपडेट किया है।

नाम के बावजूद, इस रोग में लिवर में लिपिड के असामान्य रूप से उच्च संचय (हेपेटोसाइट्स5में वसा के >5%) की विशेषता वाले हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम शामिल है और आमतौर पर स्टीटोहेपेटाइटिस के लिए सरल स्टीटोसिस में पाए जाने वाले लिपिड संचय के माध्यम से प्रगति हो सकती है, जिससे फाइब्रोसिस, सिरोसिस का विकास हो सकता है, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा, और यकृत विफलता5,6,7,8. इसकी बढ़ती व्यापकता के कारण, एमएएफएलडी को यकृत प्रत्यारोपण का पहला संकेत और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा 9 का प्रमुख कारणबननेकी उम्मीद है ।

यद्यपि इसे फैटी लिवर रोग का सौम्य या हल्का रूप माना गया है, लेकिन हेपेटिक स्टीटोसिस वास्तव में एमएएफएलडी10में मेटाबॉलिक कुंजी है। विभिन्न मेटाबोलिक रास्ते यकृत में लिपिड संचय से प्रभावित होते हैं, जिनमें लिपिड संश्लेषण, निर्यात और चयापचय10तक सीमित नहीं होता है। इंसुलिन प्रतिरोध, ऑक्सीडेटिव तनाव, रेटिकुलर तनाव, और सेलुलर शिथिलता हेपेटिक लिपोटॉक्सिकिटी11,12से दृढ़ता से जुड़े हुए हैं। दूसरी ओर, फैटी हेपेटोसाइट्स प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का लक्ष्य हैं, जो मेटाबोलाइट्स को लिपिड पेरोक्साइड, प्रोटीन कार्बोसिल और न्यूक्लिक एसिड13के एडक्ट्स के रूप में प्रतिपादित करते हैं। सेलुलर स्तर पर, फैटी हेपेटोसाइट्स को माइटोकॉन्ड्रियल क्षति14,सेलुलर सेनेसेंस15,एपोप्टोसिस16,पायरोप्टोसिस12और ऑटोफैगिया17,अन्य घटनाओं के बीच से गुजरना पड़ सकता है।

हेपेटोसाइट्स मेटाबोलिज्म, विषहरण और अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला के संश्लेषण के लिए अत्यधिक जिम्मेदार हैं। इनमें से कई कार्यों को स्टीटोसिस में देखे गए लिपिड संचय से समझौता किया जा सकता है। इसलिए, प्रजनन योग्य उपकरण होना बहुत महत्वपूर्ण है जो स्टीटोसिस के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देते हैं। इस अर्थ में, इन विट्रो मॉडल आसानी से लागू होते हैं और अत्यधिक प्रजनन योग्य होते हैं। 16,18 ,19के विभिन्न लक्ष्यों के साथ विट्रो में स्टीटोसिस का उपयोग किया गया है । हेपजी2 कोशिकाओं का व्यापक रूप से हेपेटोसिटे सेल लाइन के रूप में उपयोग किया जाता है। यह इस तरह के संस्कृति के लिए आसान किया जा रहा है और अच्छी तरह से विशेषता के रूप में लाभ है । शायद, HepG2 कोशिकाओं का एकमात्र नुकसान तथ्य यह है कि यह एक कैंसरजनक सेल लाइन है, इसलिए परिणामों का विश्लेषण करते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए। यहां, सेल संस्कृति में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले फैटी एसिड के मिश्रण का उपयोग दिखाया गया है: पामिटिक एसिड (पीए) और ओलिक एसिड (ओए) दिखाया गया है। पीए और ओए दोनों ही संस्कृति20में अलग - अलग परिणाम देते हैं । PA (C 16:0) आहार16से प्राप्त सबसे आम संतृप्त फैटी एसिड है । पीए को डी-नोवो लिपोजेनेसिसका बायोमार्कर माना जाता है, जो एनएएफएलडी21के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम है । पीए को अत्यधिक विषैला22दिखाया गया है । इसलिए, यह विट्रो मेंस्टेटोसिस प्रेरित करने की सिफारिश नहीं की जा सकती है . ओए (सी 18:1) एक मोनोअनसैचुरेटेड फैटी एसिड है। पीए के विपरीत, ओए को एंटी-भड़काऊ और एंटी-ऑक्सीडेंट गुणों के अधिकारी का सुझाव दिया गया है, जो पीए12का प्रतिकार करने में सक्षम है । स्वास्थ्य यारोगकी स्थिति की परवाह किए बिना पीए और ओए दोनों ही ट्राइग्लिसराइड्स में मौजूद मुख्य फैटी एसिड हैं। तालिका 1 पीए, ओए और उनके मिश्रण के साथ हेपेटोसाइट संस्कृति के उदाहरण प्रदान करता है, साथ ही परिणामों की रिपोर्ट12,23,24,25, 26,27। हेपेटोसाइट संस्कृति में अन्य फैटी एसिड का भी उपयोग किया गया है, जिसमें स्टेरिक एसिड (सी 18:0)28,29,30,लिनोलिक एसिड (सी 18:1)28,30, 31औरइसके संजूगेट्स (सीएलए)28, 32,पामिटोलिक एसिड (सी 16:1)29शामिल हैं। हालांकि, उनका उपयोग साहित्य में कम से कम बार सूचित किया जाता है, शायद इसलिए कि उनकी हेपेटिक बहुतायत पीए और ओए16की तुलना में कम है।

संयोजन के रूप में, दोनों फैटी एसिड विट्रो मेंस्टेटोसिस जैसा दिखता है, जो कोशिकाओं को बढ़ाने के साथ, बढ़ी हुई कोशिकाओं को प्रदान करता है और नियंत्रण स्थितियों की तुलना में कम व्यवहार्यता है। यह उल्लेखनीय है कि इन फैटी एसिड के संबंधित लवण उपलब्ध हैं और के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है लायक है । हेपेटोसिट सेल संस्कृति में लिपिड अधिभार का आकलन करते समय मुख्य समस्याओं में से एक विषविज्ञानी मॉडल और एक मॉडल के बीच भेदभाव में दिया जाता है जो सबसे अच्छा स्टीटोसिस का प्रतिनिधित्व करता है। पहले मामले में कई मॉडलों का हिसाब लगाया जा सकता है। वास्तव में, अकेले पीए के उपयोग को उनमें से माना जा सकता है, और उच्च मृत्यु दर सबसे स्पष्ट परिणाम12,16,23,24, 25,26,27है। ओए के मामले में भी हाई डोज के इस्तेमाल को टॉक्सिकोलॉजिकल मॉडल माना जा सकता है। यहां दिखाया गया प्रोटोकॉल स्टेटोसिस विकास के साथ उच्च अनुसार है क्योंकि यह अन्य मॉडलों में देखे गए कम मृत्यु दर को दिखाता है और इसे प्रगतिशील लिपिड संचय के साथ कई दिनों के दौरान पालन करने की अनुमति देता है क्योंकि यह NAFLD में होता है। प्रायोगिक स्थितियों के माध्यम से हल्के और गंभीर स्टेटोसिस का आकलन करने की संभावना को एक और लाभ माना जाता है।

फैटी एसिड शर्तों परिणाम संदर्भ
पीए एकाग्रता: 200 माइक्रोन लिपिड संचय यान एट अल, 201925।
समय एक्सपोजर: 24 घंटे हेपेटोसाइट क्षति
ट्रांसामिनेस ऊंचाई
पीए एकाग्रता: 50, 100 और 200 माइक्रोन लिपिड संचय Xing एट अल, 201924.
समय एक्सपोजर: 24 घंटे
पीए एकाग्रता: 250 माइक्रोन, 500 माइक्रोन, 750 माइक्रोन और 1,000 माइक्रोन लिपिड संचय वांग एट अल, २०२०26।
समय एक्सपोजर: 24 घंटे सेल व्यवहार्यता में उत्तरोत्तर कमी
ओए/पीए का मिश्रण एकाग्रता: 1 mM लिपिड संचय जिओ एट अल, २०२०27।
समय एक्सपोजर: 24 घंटे लिपोटॉक्सिकिटी की रिपोर्ट नहीं करता है
दर: 2OA:1PA
ओए/पीए का मिश्रण 200 माइक्रोन और पीए के 400 माइक्रोन के साथ पहली उत्तेजना और फिर ओए के 200 माइक्रोन के साथ दूसरी उत्तेजना लिपिड संचय। Zeng एट अल, 202012.
एकाग्रता: 400 माइक्रोन पीए: 200 माइक्रोन ओए ओए की उत्तेजना से पीए द्वारा प्रेरित लिपोटॉक्सिकिटी के सबूत कम हो गए थे।
दर: 2PA:1OA
समय एक्सपोजर: 24 घंटे
ओए/पीए का मिश्रण एकाग्रता: 400 माइक्रोन पीए: 200 माइक्रोन ओए लिपिड संचय चेन एट अल, 201823।
दर: 2PA:1OA
समय एक्सपोजर: 24 घंटे
ओए/पीए का मिश्रण एकाग्रता:50 और 500 माइक्रोन दो प्रकार के स्टेटोसिस का उत्पादन: हल्के स्टीटोसिस और
गंभीर स्टीटोसिस।		 कैम्पोस और गुज़मान 2021
दर: 2PA:1OA लिपिड अधिभार की पुरानी प्रदर्शनी का अनुकरण करता है
समय एक्सपोजर: 24 घंटे, 2 दिन, 3 दिन और 4 दिन।

तालिका 1. स्टीटोजेनिक स्थितियों में हेपेटोसाइट संस्कृति। तालिका में उपयोग किए जाने वाले फैटी एसिड के प्रकार, बनाए रखी गई स्थितियों और हेपेटोसिट संस्कृति में देखे गए परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। पीए: पामिटिक एसिड। ओए: ओलिक एसिड।

अंत में, यह मॉडल न केवल स्टीटोसिस और फैटी लिवर के अध्ययन के लिए लागू होता है, बल्कि स्टीटोसिस के संदर्भ में हेपेटिक मेटाबोलिक, सिंथेटिक और विषहरण मार्गों पर भी लागू होता है। इसके अलावा, इन विट्रो प्रेरित स्टेटोसिस रोग के संभावित मार्कर के साथ-साथ चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान के लिए सबूत प्रदान कर सकता है।

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Protocol

1. मानक और वातानुकूलित मध्यम तैयारी

  1. मानक RPMI 1640 तैयार करने के लिए, पूरक RPMI 1640 पूरक RPMI 1640 संस्कृति माध्यम भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, पहले गर्मी निष्क्रिय) के 10% (v/v) के साथ और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के 1% (v/v) । 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यम स्टोर करें।
  2. पामिलेट स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, मानक आरपीएमआई 1640 में पलमिटेट का 50 mm समाधान तैयार करें जो पहले 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (लिपिड मुक्त) के साथ पूरक था। इस स्टॉक की 5-10 एमएल की मात्रा पर्याप्त होगी। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके स्टॉक समाधान को स्टरलाइज करें। 1 महीने तक प्रकाश से सुरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. ओलिनेट स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए, मानक आरपीएमआई 1640 में ओलिट का 50 एमएम समाधान तैयार करें, जो पहले 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (लिपिड मुक्त) के साथ पूरक था। 10 एमएल की मात्रा पर्याप्त होगी। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके स्टॉक समाधान को स्टरलाइज करें। 1 महीने तक प्रकाश से सुरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. पहले से तैयार स्टॉक से स्टीटोजेनिक माध्यम तैयार करने के लिए, एक 1-भाग पालमिटेट तैयार करें: दो संभावित स्तरों पर 2-भाग ओलेट स्टीटोजेनिक माध्यम: हल्के और गंभीर स्टीटोसिस।
    1. हल्के स्टीटोसिस: 1-भाग पलमिटेट के 100 एमएल तैयार करें: मानक आरपीएमआई 1640 में 2-भाग ओलेट (50 माइक्रोन) मिश्रण। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके स्टरलाइज करें। 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. गंभीर स्टेटोसिस: 1-भाग पलमिटेट के 100 एमएल तैयार करें: मानक आरपीएमआई 1640 में 2-भाग ओलेट (500 माइक्रोन) मिश्रण। 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके स्टरलाइज करें। 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. स्टॉक समाधान के लिए वैकल्पिक तैयारी।
      1. ऊपर बताए गए फ्री लिपिड एल्बुमिन का उपयोग करके संबंधित फैटी एसिड का उपयोग करके दोनों स्टॉक समाधान तैयार करें।
      2. जब मुफ्त लिपिड एल्बुमिन की कमी हो, तो पामिटेट और ओलेट लवण का उपयोग करें।
        1. पूर्ण इथेनॉल के 2 एमसीएल में या तो पामिइटेट या ओलेट को भंग करें और फिर मानक आरपीएमआई 1640 (5-10 मिलीएल) की अंतिम मात्रा में मिलाएं। मानक RPMI 1640 संस्कृति माध्यम में सरगर्मी से सीधे ओले को भंग करें।
        2. 70 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में इनक्यूबेटिंग करके इथेनॉल के वाष्पीकरण की अनुमति दें; अच्छी तरह से मिलाएं।
      3. हर मामले में, 0.22 माइक्रोन फिल्टर का उपयोग करके दोनों स्टॉक समाधानों को स्टरलाइज करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर पामिट स्टॉक समाधान स्टोर करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर ओलिट स्टॉक समाधान करें। दोनों समाधानों को प्रकाश से बचाएं। ये समाधान 1 महीने के लिए स्थिर हैं।

2. पूर्व संस्कृति

  1. बीज १००,००० HepG2 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली में । मानक आरपीएमआई 1640 का 1 एमएल जोड़ें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-इनक्यूबेट और 24 घंटे के लिए 5% सीओ2, सेल अटैचमेंट की अनुमति देता है।

3. स्टीटोजेनिक संस्कृति

  1. प्री-कल्चर के बाद स्टैंडर्ड आरपीएमआई 1640 मीडियम को डिस्कार्ड करें और उसी हिसाब से स्टीटोजेनिक मीडियम डालें।
  2. सुपरनेट को त्यागें और हर 24 घंटे में ताजा स्टीटोजेनिक माध्यम जोड़ें।

4. व्यवहार्यता और मृत्यु दर का आकलन

  1. बीज १००,००० HepG2 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली में । मानक आरपीएमआई 1640 का 1 एमएल जोड़ें।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर24घंटे के लिए प्री-इनक्यूबेट ।
  3. स्टीटोजेनिक माध्यम के लिए मानक आरपीएमआई 1640 माध्यम बदलें।
  4. 24 घंटे, 2 दिन, 3 दिन और 4 दिन के लिए इनक्यूबेट हर 24 घंटे में स्टीटोजेनिक माध्यम को ताज़ा करता है।
  5. उचित समय के बाद, अधिरंत को त्यागें।
  6. 0.05% ट्राइप्सिन-ईडीटीए के 500 माइक्रोल जोड़कर कुएं से अलग कोशिकाओं को अलग करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट और 5% सीओ2.
  7. एक माइक्रोट्यूब में पुनर्नसंरित कोशिकाओं को ले लीजिए।
  8. 300 x g पर सेंट्रलाइज करें और सुपरनेट को त्यागें।
  9. मानक RPMI 1640 के 200 μL जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से खर्च करें।
  10. एक ताजा माइक्रोट्यूब में 0.4% ट्राइपन ब्लू सॉल्यूशन के 15 माइक्रोल जोड़ें। पिछले सेल निलंबन के 15 माइक्रोन के साथ मिलाएं।
  11. एक हीमोसाइटोमीटर में दाग और गैर दाग कोशिकाओं की गिनती।
  12. तदनुसार व्यवहार्यता और मृत्यु दर की गणना करें।
    व्यवहार्यता =
    Equation 1
    मृत्यु =
    Equation 2

5. तेल के साथ लिपिड धुंधला-लाल ओ

  1. एक 24 अच्छी तरह से थाली में हर कुएं में एक सेल संस्कृति कवरलिप रखो ।
  2. बीज 100,000 HepG2 कोशिकाओं को अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से. मानक आरपीएमआई 1640 का 1 एमएल जोड़ें।
  3. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्री-इनक्यूबेट और24 घंटे के लिए 5% सीओ 2।
  4. स्टीटोजेनिक माध्यम के लिए मानक आरपीएमआई 1640 माध्यम बदलें।
  5. 24 घंटे, 2 दिन, 3 दिन और 4 दिनों के लिए इनक्यूबेट, हर 24 घंटे में स्टीटोजेनिक माध्यम को ताज़ा करता है।
  6. उचित समय के बाद, अधिरंत को त्यागें।
  7. फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) के 1 एमएल के साथ धोएं। सुपरनेट को त्याग दें।
  8. पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 1 एमसीएल के साथ फिक्स करें।
  9. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  10. पैराफॉर्मल्डिहाइड की अधिकता को त्यागें।
  11. कोशिकाओं को 1 एमएल आसुत पानी से कुल्ला करें।
  12. 70% आइसोप्रोपैनॉल का 1 मिलियन जोड़ें और 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  13. आइसोप्रोपैनॉल की अधिकता को त्यागें। इस बिंदु पर पीबीएस धोने की आवश्यकता नहीं है।
  14. तेल-लाल ओ समाधान के 1 एमएल जोड़ें और 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  15. तेल-लाल ओ समाधान की अधिकता को त्याग दें।
  16. आसुत पानी के 1 एमएल के साथ कुल्ला।
  17. हेमेटॉक्सीलिन समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें। 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  18. हेमेटॉक्सीलिन समाधान की अधिकता को त्यागें।
  19. आसुत पानी के 1 एमएल के साथ कुल्ला।
  20. 400x (ऑब्जेक्टिव 40x, ऑकुलर 10x) के आवर्धन पर माइक्रोस्कोप के नीचे देखें।

6. लिपिड सामग्री का मॉर्फोमेट्रिक मूल्यांकन

  1. बेतरतीब ढंग से चयन करें और कुएं के पूरे क्षेत्र से 10 ऑप्टिकल क्षेत्रों की तस्वीरों पर कब्जा। हर कुएं के लिए दोहराएं।
  2. फरेरा और रसबैंड33के अनुसार इमेजजे सॉफ्टवेयर में रंग सीमा उपकरण का उपयोग करके लाल दाग वाले क्षेत्र के प्रतिशत का आकलन करें।
  3. फरेरा और रसबैंड33के अनुसार इमेजजे सॉफ्टवेयर में विश्लेषण कण उपकरण का उपयोग करके ऑप्टिकल क्षेत्र के पूर्ण क्षेत्र के साथ दाग क्षेत्र की तुलना करें।
  4. हर कुएं के औसत प्रतिशत की गणना करें।

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Representative Results

हेपेटोसाइट्स ने स्टीटोजेनिक मध्यम प्रदर्शन विकास में अच्छी तरह से सभी की सतह पर सुसंस्कृत; हालांकि, फैटी हेपेटोसाइट्स नियंत्रण माध्यम में सुसंस्कृत कोशिकाओं की तुलना में कम वृद्धि दर दिखाते हैं। प्रस्तावित अनुपात और OA और PA की एकाग्रता, संस्कृति के दौरान सेल अस्तित्व की गारंटी । 24-अच्छी प्लेटों में 1 x10 5 कोशिकाओं को इष्टतम संगम प्रदान करता है जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है।

संस्कारी कोशिकाओं में व्यवहार्यता नियंत्रण स्थितियों की तुलना में स्टीटोजेनिक समूहों, हल्के और गंभीर में कम थी। वास्तव में, संस्कृति के समय में वृद्धि के रूप में व्यवहार्यता उत्तरोत्तर कम हो गई, गंभीर स्टेटोसिस(चित्रा 2 ए)में 4 दिनों में 60% की सबसे कम तक पहुंच गई। तदनुसार, स्टीटोजेनिक स्थितियों में सुसंस्कृत हेपेटोसाइट्स में मृत्यु दर अधिक थी, और लिपिड(चित्रा 2 बी)के संपर्क में आने के समय यह उत्तरोत्तर बढ़ गई। प्रसार(चित्रा 2C)के परिणामस्वरूप सेल संख्या उत्तरोत्तर बढ़ी। हालांकि, 3 दिन और 4 दिनों में हल्के स्टीटोसिस में प्रसार दर कम थी। इसके विपरीत, गंभीर स्टेटोसिस 24 घंटे से कम प्रसार के साथ जुड़ा हुआ था।

प्रस्तावित प्रोटोकॉल में सुसंस्कृत हेपजी 2 कोशिकाएं स्टीटोसिस, इंट्रासेलुलर लिपिड संचय की सबसे महत्वपूर्ण विशेषता दिखाती हैं। तेल लाल ओ के साथ धुंधला कोशिकाओं को चित्र 3 और चित्रा 4 में दिखायागया है के रूप में स्टीटोजेनिक स्थितियों के तहत सुसंस्कृत कोशिकाओं में लिपिड बूंदों की कम से कम एक दो गुना वृद्धि का पालन करने की अनुमति दी । स्टीटोजेनिक माध्यम(चित्र 3)में संस्कृति के जोखिम के समय के अनुसार इंट्रासेलुलर फैट बढ़ गया। हल्के स्टीटोसिस में, लिपिड सामग्री 2 दिन से बढ़ गई थी, जबकि गंभीर स्टेटोसिस में, वे 24 घंटे से काफी अधिक थे।

Figure 1
चित्रा 1:सेल विकास। हेपजी2 हेपेटोसाइट्स संस्कृति नियंत्रण में(चित्रा 1A-D)और हल्के स्टीटोजेनिक स्थितियां(चित्र 1E-एच)। तस्वीरों में संस्कृति के 1-4 दिनों से विकास दिखाई देता है। स्केल बार = 500 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2:व्यवहार्यता और मृत्युदर। (ख)मृत्यु दर। (ग)सेल नंबर। नियंत्रण और स्टीटोजेनिक स्थितियों में HepG2 hepatocytes संस्कृति को ट्राइपैन ब्लू धुंधला द्वारा व्यवहार्यता और मृत्यु दर के लिए मूल्यांकन किया गया था । मतलब एसडी ±। संस्कृति के प्रति समय ट्रिपलिकेट में दो स्वतंत्र प्रयोग। हलकों: नियंत्रण की स्थिति; वर्ग: हल्के स्टीटोसिस; त्रिकोण: गंभीर स्टीटोसिस। एक तरह से ANOVA शर्तों और एक ही हालत के लिए संस्कृति के समय के बीच तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । पी < 0.05 महत्वपूर्ण माना जाता था: "*"- नियंत्रण बनाम गंभीर स्टेटोसिस; "§"- नियंत्रण बनाम हल्के स्टीटोसिस; "¶"- हल्के बनाम गंभीर स्टेटोसिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:लिपिड संचय। हेपजी2 हेपेटोसाइट्स संस्कृति नियंत्रण और स्टीटोजेनिक स्थितियों में लिपिड सामग्री के लिए तेल लाल ओ धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था जिसके बाद इमेजजे सॉफ्टवेयर (एनआईएच, यूएसए) का उपयोग करके एक मॉर्डोमेट्रिक विश्लेषण किया गया था। लिपिड का प्रतिशत प्रत्येक ऑप्टिकल क्षेत्र के पूर्ण क्षेत्र के रूप में 100% पर विचार करते हुए तेल-लाल ओ (लिपिड) द्वारा दाग क्षेत्र के प्रतिशत को संदर्भित करता है। मतलब एसडी ±। संस्कृति के प्रति समय ट्रिपलिकेट में दो स्वतंत्र प्रयोग। हलकों: नियंत्रण की स्थिति; वर्ग: हल्के स्टीटोसिस; त्रिकोण: गंभीर स्टीटोसिस। एक तरह से ANOVA शर्तों और एक ही हालत के लिए संस्कृति के समय के बीच तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । पी < 0.05 महत्वपूर्ण माना जाता था: "*"- नियंत्रण बनाम गंभीर स्टेटोसिस; "§"- नियंत्रण बनाम हल्के स्टीटोसिस; "¶"- हल्के बनाम गंभीर स्टेटोसिस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विट्रो मेंस्टीटोसिस । हेपजी2 हेपेटोसाइट्स संस्कृति नियंत्रण में(चित्रा 4A-डी),हल्के स्टीटोजेनिक(चित्रा 4E-एच),और गंभीर स्टीटोजेनिक(चित्रा 4I-एल)स्थितियों का आकलन लिपिड सामग्री के लिए तेल लाल ओ धुंधला द्वारा किया गया था। तस्वीरों में 24 घंटे से 4 दिनों तक हेपेटोसिट लिपिड बूंदें दिखाई देती हैं । स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य विट्रो मेंस्टीटोसिस का अध्ययन करने के लिए एक रणनीति प्रदान करना है। सेल कल्चर विभिन्न स्थितियों के संपर्क में आने वाली कोशिकाओं के सेलुलर, आणविक, जैव रासायनिक और विषविज्ञानी पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस दृष्टिकोण के साथ, स्टीटोसिस को न केवल जटिल बीमारी के चरण के रूप में कल्पना की जा सकती है जो एमएएफएलडी है, बल्कि लिपिड के लिए हेपेटोसिट ओवरएक्सपोजर और इस तरह के जोखिम के परिणामस्वरूप संभावित परिणामों के रूप में भी कल्पना की जा सकती है। इसलिए, इसका आवेदन एमएएफएलडी के फिजियोपैथोलॉजी तक सीमित नहीं है, लेकिन इस तथ्य के लिए कि फैटी लिवर वाले रोगियों को अन्य स्थितियों के बीच चिकित्सीय दवाओं, संदूषकों के संपर्क में आता है जो स्टीटोसिस से प्रभावित हो सकते हैं। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल में विष विज्ञान, फार्माकोलॉजी और रोग के उपचार के लिए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान में संभावित अनुप्रयोग हैं।

इस प्रोटोकॉल के विकास पर, सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक स्टीटोजेनिक मिश्रण की तैयारी है: पामिट का 1 हिस्सा: ओलिट के 2 हिस्से, जो दिन 2(चित्रा 3, चित्रा 4)से स्टीटोसिस को प्रेरित करते हैं, जिससे हेपेटोसाइट्स को पैदा होने की अनुमति देता है - व्यवहार्यता दर में मामूली कमी और मृत्यु दर में वृद्धि(चित्रा 2)। हालांकि, कम व्यवहार्यता 30%-40% से अधिक नहीं होनी चाहिए, क्योंकि यह एक विषाक्त प्रभाव का प्रतिनिधित्व कर सकता है बजाय एक जो लंबी अवधि में पालन किया जा सकता है। हेपेटिक स्टीटोसिस लिपिड के लिए दीर्घकालिक ओवरएक्सपोजर का परिणाम है। इस अर्थ में, लिपिड पहले, हेपेटोसाइट्स पर हल्के स्नेह के साथ जमा होते हैं, जैसा कि इस मॉडल में मनाया गया है। एक और विशेषता लिपिड ड्रॉपलेट प्रोफाइल है। हल्के स्टीटोसिस में, लिपिड बूंदों में एक बढ़ा हुआ आकार संस्कृति की प्रगति के दौरान देखा जाता है(चित्रा 4E-एच)। गंभीर स्टीटोसिस में, हल्के स्टेटोसिस(चित्रा 4I-L)की तुलना में बूंद का आकार काफी अधिक होता है, जबकि नियंत्रण लिपिड ड्रॉपलेट आकार(चित्रा 4 ए-डी)में परिवर्तन नहीं दिखाते हैं।

एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर हल्के और गंभीर स्टीटोजेनिक मीडिया दोनों को स्टोर करना बेहतर है। इसके बाद, ताजा स्टीटोजेनिक माध्यम तैयार करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, ओए स्टॉक को एक महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संरक्षित किया जा सकता है, जबकि पीए स्टॉक को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है। सुझाए गए समय के बाद इन स्टॉक समाधानों का उपयोग करना फैटी एसिड के क्षरण के जोखिम का प्रतिनिधित्व कर सकता है। हर उपयोग से पहले समाधानों की उचित एकाग्रता सुनिश्चित करने के लिए, एक गैर-एस्टरिफाइड फैटी एसिड (एनईएफए) परख किट द्वारा फैटी एसिड सांद्रता को मापने की सिफारिश की जाती है।

पीए और ओए, साथ ही उनके संबंधित लवण, लिपिड संचय को प्रेरित करने के लिए अलग से उपयोग किया गया है; हालांकि, मतभेद हर फैटी एसिड16,20 के लिएमनाया जाताहै . एक तरफ, अकेले इस्तेमाल किया palmitate स्टीटोसिस का एक अच्छा प्रेरक है। यह कोशिका मृत्यु, हेपेटिक इंसुलिन प्रतिरोध, माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, रेटिकुलर तनाव16,34,35,36को प्रेरित करता है। हालांकि, पामिटेट अत्यधिक विषैला16,34है और संस्कृति में अकेले इसका उपयोग करने की उम्मीद के परिणामों में पीए और ओए16,20के मिश्रण की तुलना में कम व्यवहार्यता और उच्च मृत्यु दर शामिल है। दूसरी ओर, ओलेट भी स्टेटोसिस को प्रेरित करता है। यह डी नोवो लिपोजेनेसिस, इंसुलिन प्रतिरोध37,38और हाइपरप्रलिवेशन38को प्रेरित करता है। हालांकि, ओलेट के साथ देखे गए परिणाम अक्सर पामिइटेट और मिश्रण16,20के साथ तुलना में हल्के होते हैं। यह इसकी सुरक्षात्मक भूमिका से संबंधित हो सकता है। ओलिवेट जैतून के तेल में प्रमुख घटक है, भूमध्य आहार में एक प्रमुख घटक, MAFLD39के खिलाफ प्रसिद्ध सफल रणनीतियों में से एक।

इस प्रोटोकॉल को अपनी प्रजनन क्षमता और परिणाम प्राप्त करने में लगने वाले कम समय के कारण स्टेटोसिस का अध्ययन करने के लिए एक अच्छा उपकरण माना जा सकता है। यह MAFLD के प्रयोगात्मक मॉडल का उपयोग करने की तुलना में है, इस तथ्य को जोड़ते हुए कि यह कृंतक मॉडल का उपयोग करने के लिए निहित नैतिक मुद्दों का मतलब नहीं है। यह प्रोटोकॉल कई दिनों तक पालन करने की अनुमति देता है, बशर्ते कि स्टीटोजेनिक माध्यम हर 24 घंटे में ताजा हो। यह मॉडल लागत प्रभावी भी है और इसमें अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। इसे अन्य सेल लाइनों में भी समायोजित किया जा सकता है, न केवल हेपेटोसाइट्स, बल्कि मोटापे के दौरान लिपिड ओवरएक्सपोजर से प्रभावित कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला। इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक हेपजी 2 कोशिकाओं का उपयोग है। चूंकि यह एक कैंसरजनक कोशिका रेखा है, इसलिए यह कुछ परिणामों को छुपा या बढ़ा सकता है। हालांकि, इस प्रकार के अध्ययनों में हेपजी2 कोशिकाओं का अनुप्रयोग लिपिड मेटाबोलिज्म में इसकी समानता के कारण स्वस्थ हेपेटोसाइट्स40के लिए व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है। मिश्रण PA:2OA का उपयोग भी विवादास्पद साबित हो सकता है क्योंकि यह पूरी तरह से NAFLD/MAFLD रोगियों के रक्त में मनाया NEFA के प्रोफाइल के समान नहीं है४१। लिनोलेनिक या स्टीरिक एसिड सहित अन्य फैटी एसिड को इस प्रोटोकॉल के आगे संशोधनों और सुधारों में शामिल किया जा सकता है। एक अन्य सीमा यह तथ्य है कि केवल एक सेल प्रकार, हेपेटोसाइट्स का अध्ययन किया जाता है, जिसमें यकृत में मौजूद अन्य हेपेटिक कोशिकाओं के साथ बातचीत की कमी होती है, जिसमें साइनसॉयडल एंडोथेलियल, कुफर, हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाएं आदि शामिल हैं, जो एमएएफएलडी की प्रगति में लगे हुए हैं। इसके अलावा, यह विशेष रूप से स्टीटोहेपेटाइटिस और फाइब्रोसिस के लिए कोई प्रगति के साथ, स्टीटोहेपेटाइटिस को प्रेरित करने के लिए एक मॉडल है।

अंत में, अध्ययन हेपेटोसिटेस्टोसिस का एक इन विट्रो प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो फैटी लिवर के संदर्भ में स्टीटोसिस के अध्ययन के साथ-साथ हेपेटोसिटे कार्य में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ, प्रजनन योग्य और आसान है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को कोंसेजो नैसिनल डी सिएंसिया वाई टेक्नोलोगिया (कोनसिट, सीबी-221137) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। एड्रियाना कैम्पोस प्रोग्रामा डी डॉक्टराडो एन सिएंसियास बायोमेडिस, यूनीवर्सिड नैसिनल ऑटोनोमा डी मैक्सीको में डॉक्टरेट छात्र हैं, और कोनासिट (सीवीयू: 1002502) द्वारा समर्थित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biosafety cabinet ESCO Airstream AC2-452+C2:C26 Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Bottle top filter Corning, US 430513  Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL.
Bovine serum albimun (BSA) Gold Biotechnology, US A-421-10 BSA Fatty Acid Free for cell culture
Culture media RPMI 1640 ThermoFisher-Gibco, US 31800-022 -
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher-Gibco, US A4766801 -
Hemocytometer Marienfeld, DE 640010 -
HepG2 cell line ATCC, US HB-8065 Hepatocellular carcinoma human cells.
Humidified incubator Thermo Electronic Corporation,US Model: 3110 Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%)
Inverted microscope Eclipse NIKON, JPN Model: TE2000-S -
Isopropanol Sigma-Aldrich, US I9030-4L -
Oil Red O Kit Abcam, US ab150678 Kit for histological visualization of neutral fat.
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich, US P6148-500G -
Penicillin/streptomycin ThermoFisher-Gibco, US 15140-122 Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin
pH meter Beckman, US Model: 360 PH/Temp/MV Meter -
Phosphate buffered saline ThermoFisher-Gibco, US 10010-023 -
Serological Pipettes Sarstedt, AUS 86.1253.001  Non-pyrogenic, sterile, 5 mL
Serological Pipettes Sarstedt, AUS  86.1254.001  Non-pyrogenic, sterile, 10 mL
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, US S5761-1KG Preparation of culture media
Sodium oleate Santa Cruz Biotechnology, US sc-215879A -
Sodium palmitate Santa Cruz Biotechnology, US sc-215881 -
Syring filter Corning, US 431219  Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm.
Trypan Blue Sigma-Aldrich, US T6146-25G -
Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM Corning, US 25-052-Cl -
24 well cell culture cluster Corning, US 3524 Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.
96 well cell culture cluster Corning, US 3599 Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack.

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प्रयोगात्मक स्टेटोसिस <em>इन विट्रो</em>का एक मॉडल: लिपिड अधिभार-वातानुकूलित माध्यम में हेपेटोसाइट सेल संस्कृति
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Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. … More

Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A Model of Experimental Steatosis In Vitro: Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioned Medium. J. Vis. Exp. (171), e62543, doi:10.3791/62543 (2021).

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