Summary
Este protocolo pretende ser uma ferramenta para estudar a esteatose e as alterações moleculares, bioquímicas, celulares produzidas pela exposição excessiva de hepatócitos a lipídios in vitro.
Abstract
A doença hepática gordurosa associada à disfunção metabólica (MAFLD), anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), é a doença hepática mais prevalente em todo o mundo devido à sua relação com obesidade, diabetes tipo 2 e dislipidemia. Esteatose hepática, o acúmulo de gotículas lipídicas no parnchyma hepático, é uma característica fundamental da doença que precede a inflamação observada na esteatohepatite, fibrose e doença hepática em estágio terminal. O acúmulo de lipídios em hepatócitos pode interferir com o metabolismo adequado de xenobióticos e moléculas endógenas, bem como induzir processos celulares que levem ao avanço da doença. Embora o estudo experimental da esteatose possa ser realizado in vivo,abordagens in vitro para o estudo da esteatose são ferramentas complementares com diferentes vantagens. A cultura hepatocito em meio lipídico-condicionado é uma excelente opção reprodutível para o estudo da esteatose hepática que permite a identificação de processos celulares relacionados ao acúmulo de lipídios, como estresses oxidativos e reticulares, autofagia, proliferação, morte celular, etc, bem como outros testes, incluindo eficácia de drogas, e testes toxicológicos, entre muitas outras aplicações possíveis. Aqui, teve como objetivo descrever a metodologia da cultura celular hepatocitada em meio lipídios condicionados por sobrecarga. As células hepG2 foram cultivadas em RMPI 1640 médio condicionado com palmitato de sódio e oleato de sódio. É importante ressaltar que a razão desses dois lipídios é crucial para favorecer o acúmulo de gotículas lipídicas, mantendo a proliferação celular e uma taxa de mortalidade moderada, como ocorre no fígado durante a doença. A metodologia, a partir da preparação dos estoques de solução lipídica, mistura, além do meio, e cultura hepatócida é mostrada. Com essa abordagem, é possível identificar gotículas lipídicas nos hepatócitos que são prontamente observáveis pela mancha O vermelha-óleo, bem como curvas de taxas de proliferação/mortalidade.
Introduction
Fígado gorduroso associado à disfunção metabólica é altamente prevalente em todo o mundo1,2; estima-se que até 25% da população seja afetada3. Esta doença anteriormente conhecida como doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), atualizou sua nomenclatura para disfunção metabólica associada à doença hepática gordurosa (MAFLD) para refletir com precisão a patogênese relacionada à obesidade, resistência à insulina, diabetes tipo 2 e dislipidemia, bem como os possíveis manejos da doença3,4.
Independentemente do nome, a doença inclui um amplo espectro de alterações histopatológicas caracterizadas pelo acúmulo anormalmente alto de lipídios no fígado (>5% de gordura nos hepatócitos5) e pode progredir através do acúmulo lipídudo tipicamente encontrado em esteatose simples à esteatohepatite, o que por sua vez pode levar ao desenvolvimento de fibrose, cirrose, carcinoma hepatocelular e insuficiência hepática5,6,7,8. Devido à sua crescente prevalência, espera-se que o MAFLD se torne a primeira indicação de transplante hepático e a principal causa do carcinoma hepatocelular9.
Embora tenha sido considerada como uma forma benigna ou leve de doença hepática gordurosa, a esteatose hepática é de fato a chave metabólica no MAFLD10. Diferentes vias metabólicas são afetadas pelo acúmulo de lipídios no fígado, incluindo, mas não se limitando à síntese lipídica, exportação e metabolismo10. Resistência à insulina, estresse oxidativo, estresse reticular e disfunção celular estão fortemente associados à lipotoxicidade hepática11,12. Por outro lado, hepatócitos gordurosos são alvo de espécies reativas de oxigênio, tornando metabólitos como peróxidos lipídicos, carbonilas proteicas e adutos de ácidos nucleicos13. No nível celular, hepatócitos gordurosos podem sofrer danos mitocondriais14, senescência celular15, apoptose16,pioptose12e autofagia17,entre outros eventos.
Hepatocitas são altamente responsáveis pelo metabolismo, desintoxicação e síntese de uma ampla gama de moléculas. Muitas dessas funções podem ser comprometidas pelo acúmulo lipídudo observado na esteatose. Portanto, é de grande importância ter ferramentas reprodutíveis que permitam uma avaliação precisa da esteatose. Nesse sentido, os modelos in vitro são prontamente aplicáveis e altamente reprodutíveis. Esteatose in vitro tem sido usada com diferentes gols16,18,19. As células HepG2 são amplamente utilizadas como linha celular hepatocitte. Tem vantagens como ser fácil de cultivar e bem caracterizado. Talvez, a única desvantagem das células HepG2 seja o fato de ser uma linha celular cancerígena, por isso isso deve ser considerado ao analisar os desfechos. Aqui, mostra-se a aplicação de uma mistura de ácidos graxos amplamente utilizados na cultura celular: ácido palmítico (PA) e ácido oleico (OA). Tanto o PA quanto o OA oferecem resultados diferentes na cultura20. Pa (C 16:0) é o ácido graxo saturado mais comum obtido da dieta16. A AF é considerada biomarcadora da lipogênese de-novo,um passo crucial no desenvolvimento do NAFLD21. Pa é mostrado como altamente tóxico22; portanto, pode não ser recomendado induzir esteatose in vitro. OA (C 18:1) é um ácido graxo monoinsaturado. Em contraste com a AF, foi sugerido que a OA possui propriedades anti-inflamatórias e antioxidantes, sendo capaz de neutralizar a PA12. Tanto a AF quanto a OA são os principais ácidos graxos presentes nos triglicérides, independentemente da condição de saúde ou doença16. A Tabela 1 fornece exemplos da cultura hepatocitte com PA, OA e sua mistura, bem como os resultados relatados12,23,24,25,26,27. Outros ácidos graxos também têm sido utilizados na cultura hepatocita, incluindo ácido esteárico (C 18:0)28,29,30, ácido linoleico (C 18:1)28,30,31 e seus conjugados (CLA)28,32, ácido palmitoleico (C 16:1)29. No entanto, seu uso é menos frequentemente relatado na literatura, talvez porque sua abundância hepática é menor que a PA e OA16.
Em conjunto, ambos os ácidos graxos se assemelham à esteatose in vitro,proporcionando células proliferadoras, com maior morte celular e menor viabilidade em comparação com as condições de controle. Vale ressaltar que os respectivos sais desses ácidos graxos estão disponíveis e também podem ser usados. Um dos principais problemas na avaliação da sobrecarga lipídica na cultura celular hepatocitte é dado na diferenciação entre modelos toxicológicos e um modelo que melhor representa a esteatose. Muitos modelos podem ser contabilizados no primeiro caso. De fato, o uso apenas de PA pode ser considerado entre eles, e a alta mortalidade é o desfecho mais evidente12,16,23,24,25,26,27. O uso de altas doses mesmo no caso de OA também pode ser considerado como um modelo toxicológico. O protocolo aqui mostrado está em maior conformidade com o desenvolvimento da esteatose, pois mostra baixa mortalidade em comparação com o observado em outros modelos e permite que seja seguido durante vários dias com acúmulo progressivo de lipídios como ocorre na NAFLD. A possibilidade de avaliar esteatose leve e grave por meio de condições experimentais é considerada outra vantagem.
| Ácidos graxos | Condições | Resultados | Referência | ||
| PAPAI | Concentração: 200 μM | Acúmulo de lipídios | Yan et al, 201925. | ||
| Exposição de tempo: 24 h | Dano à hepatocita | ||||
| Elevação de transminases | |||||
| PAPAI | Concentração: 50, 100 e 200 μM | Acúmulo de lipídios | Xing et al, 201924. | ||
| Exposição de tempo: 24 h | |||||
| PAPAI | Concentração: 250 μM , 500 μM, 750 μM e 1.000 μM | Acúmulo de lipídios | Wang et al, 202026. | ||
| Exposição de tempo: 24 h | Redução progressiva da viabilidade celular | ||||
| Mistura de OA/PA | Concentração: 1 mM | Acúmulo de lipídios | Xiao et al, 202027. | ||
| Exposição de tempo: 24 h | Não relata lipotoxicidade | ||||
| Taxa: 2OA:1PA | |||||
| Mistura de OA/PA | Primeiro estimulação com 200 μM e 400 μM de PA e depois segundo estímulo com 200 μM de OA | Acúmulo de lipídios. | Zeng et al, 202012. | ||
| Concentração:400 μM PA: 200 μM OA | A evidência de lipotoxicidade induzida pela AF foi reduzida por estimulação de OA. | ||||
| Taxa: 2PA:1OA | |||||
| Exposição de tempo: 24 h | |||||
| Mistura de OA/PA | Concentração: 400 μM PA: 200 μM OA | Acúmulo de lipídios | Chen et al, 201823. | ||
| Taxa: 2PA:1OA | |||||
| Exposição de tempo: 24 h | |||||
| Mistura de OA/PA | Concentração :50 e 500 μM | Geração de dois tipos de esteatose: esteatose leve e esteatose grave. |
Campos e Guzmán 2021 | ||
| Taxa: 2PA:1OA | Simula exposição crônica de sobrecarga lipídica | ||||
| Exposição de tempo: 24h, 2 dias,3 dias e 4 dias. | |||||
Mesa 1. Cultura hepatocita em condições esteatogênicas. A tabela apresenta o tipo de ácido graxo utilizado, as condições mantidas e os desfechos observados na cultura hepatócica. Pa: Ácido palmítico. Ácido oleico.
Por fim, este modelo é aplicável não apenas ao estudo da esteatose e fígado gorduroso, mas também às vias hepáticas metabólicas, sintéticas e desintoxicação no contexto da esteatose. Além disso, a esteatose in vitro induzida pode fornecer evidências para a identificação de potenciais marcadores da doença, bem como alvos terapêuticos.
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Protocol
1. Preparação média padrão e condicionada
- Para preparar o RPMI padrão 1640, suplemente o meio de cultura RPMI 1640 com 10% (v/v) de soro bovino fetal (FBS, anteriormente inativado) e 1% (v/v) da solução penicilina-estreptomicina. Armazene o meio a 4 °C.Esterilizar usando filtros de 0,22 μm.
- Para preparar a solução de estoque palmitato, prepare uma solução de 50 mM de palmitato no RPMI padrão 1640 previamente suplementado com 1% de albumina de soro bovino (livre de lipídios). Um volume de 5-10 mL deste estoque será suficiente. Esterilize a solução de estoque utilizando filtros de 0,22 μm. Armazene a 4 °C protegido da luz por até 1 mês.
- Para preparar a solução de estoque oleate, prepare uma solução de 50 mM de oleate no RPMI padrão 1640 previamente suplementado com 1% de albumina de soro bovino (livre de lipídio). Um volume de 10 mL será suficiente. Esterilize a solução de estoque utilizando filtros de 0,22 μm. Armazene a -20 °C protegido contra luz por até 1 mês.
- Para preparar o meio esteatogênico dos estoques previamente preparados, prepare um palmitato de 1 parte: meio esteatogênico oleatogênico de 2 partes em dois níveis possíveis: esteatose leve e grave.
- Steatosis leve: Prepare 100 mL de uma palmitate de 1 parte: mistura de oleato de 2 partes (50 μM) no RPMI padrão 1640. Esterilize usando filtros de 0,22 μm. Guarde a 4 °C por até 1 semana.
- Steatosis grave: Prepare 100 mL de uma palmitate de 1 parte: mistura de oleato de 2 partes (500 μM) no RPMI padrão 1640. Esterilize usando filtros de 0,22 μm. Guarde a 4 °C por até 1 semana.
- Preparação alternativa para as soluções de estoque.
- Prepare ambas as soluções de estoque usando os respectivos ácidos graxos usando albumina lipídica gratuita, conforme indicado acima.
- Quando não ter albumina lipídica livre, use palmitato e sais de oleato.
- Dissolva palmitato ou oleate em 2 mL de etanol absoluto e, em seguida, misture no volume final do RPMI padrão 1640 (5-10 mL). Dissolva oleate diretamente mexendo no meio de cultura RPMI padrão 1640.
- Permitir a evaporação do etanol incubando em um banho de água a 70 °C; Homogeneizar.
- Em todos os casos, esterilize ambas as soluções de estoque usando filtros de 0,22 μm. Armazene a solução de estoque palmitate a 4 °C e a solução de estoque oleate a - 20 °C. Proteja ambas as soluções da luz. Essas soluções estão estáveis por 1 mês.
2. Pré-cultura
- Semente 100.000 células HepG2 por poço em uma placa de 24 poços. Adicione 1 mL de RPMI padrão 1640.
- Pré-incubação a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h, permitindo a fixação celular.
3. Cultura esteatogênica
- Após a pré-cultura, descarte o meio RPMI padrão 1640 e adicione o meio esteatogênico em conformidade.
- Descarte o supernasal e adicione meio esteatogênico fresco a cada 24 horas.
4. Avaliação de viabilidade e mortalidade
- Semente 100.000 células HepG2 por poço em uma placa de 24 poços. Adicione 1 mL de RPMI padrão 1640.
- Pré-incubação por 24h a 37 °C e 5% de CO2.
- Alterar o meio RPMI padrão 1640 para o meio esteatogênico.
- Incubar por 24h, 2 dias, 3 dias e 4 dias refrescando o meio esteatogênico a cada 24h.
- Após o tempo apropriado, descarte o supernatante.
- Despemar células do poço adicionando 500 μL de 0,05% Trypsin-EDTA. Incubar por 5 min a 37 °C e 5% de CO2.
- Colete as células resuspended em um microtubo.
- Centrifugar a 300 x g e descartar o supernatante.
- Adicione 200 μL de RPMI padrão 1640 e resuspense as células.
- Adicione 15 μL de solução azul Trypan de 0,4% em um microtubo fresco. Misture com 15 μL da suspensão anterior da célula.
- Conte as células manchadas e não manchadas em um hemócito.
- Calcule as taxas de viabilidade e mortalidade em conformidade.
Viabilidade =
Mortalidade =
5. Mancha lipídica com O-Vermelho-Óleo
- Coloque uma cultura celular em cada poço em uma placa de 24 poços.
- Sementes 100.000 células HepG2 por poço. Adicione 1 mL de RPMI padrão 1640.
- Pré-incubação a 37 °C e 5% de CO2 por 24 h.
- Alterar o meio RPMI padrão 1640 para o meio esteatogênico.
- Incubar por 24h, 2 dias, 3 dias e 4 dias, refrescando o meio esteatogênico a cada 24h.
- Após o tempo apropriado, descarte o supernatante.
- Lave com 1 mL de salina tamponada de fosfato (PBS). Descarte o supernatante.
- Corrija com 1 mL de 4% de paraformaldeído em PBS.
- Incubar por 1h à temperatura ambiente.
- Descarte o excesso de paraformaldeído.
- Enxágüe as células com 1 mL de água destilada.
- Adicione 1 mL de isopropanol de 70% e incubar por 5 min.
- Descarte o excesso de isopropanol. Uma lavagem pbs não é necessária neste momento.
- Adicione 1 mL de solução O vermelho-óleo e incubar por 30 min.
- Descarte o excesso da solução O vermelho-óleo.
- Enxágüe com 1 mL de água destilada.
- Adicione 500 μL de solução de hematoxilina. Incubar por 3 min.
- Descarte o excesso de solução de hematoxilina.
- Enxágüe com 1 mL de água destilada.
- Observe sob o microscópio em uma ampliação de 400x (Objetivo 40x, Ocular 10x).
6. Avaliação morfométrica do conteúdo lipídudo
- Selecione e capture aleatoriamente fotografias de 10 campos ópticos da área completa do poço. Repita para cada poço.
- Avalie a porcentagem de área manchada de vermelho utilizando a ferramenta Limiar de Cor no software ImageJ de acordo com Ferreira e Rasband33.
- Compare a área manchada com a área completa do campo óptico utilizando a ferramenta Analisar Partículas no software ImageJ de acordo com Ferreira e Rasband33.
- Calcule a porcentagem média de cada poço.
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Representative Results
Hepatócitos cultivados no meio esteatogênico apresentam crescimento em toda a superfície do poço; no entanto, hepatócitos gordurosos apresentam menor taxa de crescimento em comparação com células cultivadas no meio de controle. A proporção proposta e concentração de OA e PA, garantem a sobrevivência celular durante a cultura. Semear 1 x 105 células por poço em placas de 24 poços fornece confluência ideal como mostrado na Figura 1.
A viabilidade nas células cultivadas foi menor nos grupos esteatogênicos, Leves e Graves, em comparação com as condições de controle. De fato, a viabilidade diminuiu progressivamente à medida que o tempo da cultura aumentava, atingindo o menor de 60% aos 4 dias em esteatose grave(Figura 2A). Assim, a taxa de mortalidade foi maior nos hepatócitos cultivados nas condições esteatogênicas, e aumentou progressivamente com o tempo de exposição aos lipídios(Figura 2B). O número de células aumentou progressivamente como resultado da proliferação(Figura 2C). No entanto, a taxa de proliferação foi menor em esteatose leve em 3 dias e 4 dias. Em contrapartida, a esteatose grave foi associada à menor proliferação a partir de 24 h.
As células hepG2 cultivadas no protocolo proposto mostram a característica mais importante da esteatose, o acúmulo lipíduo intracelular. As células de coloração com Óleo Vermelho O permitiram observar pelo menos um aumento de duas vezes de gotículas lipídicas em células cultivadas sob condições esteatogênicas, como mostrado na Figura 3 e Figura 4. A gordura intracelular aumentou de acordo com o tempo de exposição da cultura no meio esteatogênico (Figura 3). Em Leve esteatose, o conteúdo lipídudo foi aumentado a partir do dia 2, enquanto em esteatose grave, eles foram significativamente elevados a partir de 24 h.
Figura 1: Crescimento celular. Hepatócitos hepG2 em controle (Figura 1A-D) e condições esteatogênicas leves(Figura 1E-H). Fotografias mostram crescimento de 1 a 4 dias de cultura. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Taxas de viabilidade e mortalidade. (A) Viabilidade. (B) Mortalidade. (C) Número de celular. A cultura hepG2 hepatócitos em controle e as condições esteatogênicas foram avaliadas para as taxas de viabilidade e mortalidade pela coloração azul trypan. Mean ± SD. Dois experimentos independentes em triplicado por tempo de cultura. Círculos: condições de controle; Quadrados: esteatose leve; Triângulos: esteatose grave. A ANOVA unidirecional foi utilizada para comparar entre condições e tempo de cultura para a mesma condição. p < 0,05 foi considerado significativo: "*"- controle vs esteatose grave; "§"- controle vs esteatose leve; "¶"- esteatose leve vs grave. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Acúmulo de lipídios. A cultura hepatócitos hepG2 no controle e as condições esteatogênicas foram avaliadas para o conteúdo lipídudo por manchas oleosas vermelhas O seguidas de uma análise morfométrica usando o software ImageJ (NIH, EUA). A porcentagem de lipídios refere-se à porcentagem de área manchada por O -Vermelho-Óleo (lipídios) considerando 100% como a área completa de cada campo óptico analisado. Mean ± SD. Dois experimentos independentes em triplicado por tempo de cultura. Círculos: condições de controle; Quadrados: esteatose leve; Triângulos: esteatose grave. A ANOVA unidirecional foi utilizada para comparar entre condições e tempo de cultura para a mesma condição. p < 0,05 foi considerado significativo: "*"- controle vs esteatose grave; "§"- controle vs esteatose leve; "¶"- esteatose leve vs grave. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Esteatose in vitro. HepG2 hepatócitos cultura em controle (Figura 4A-D),esteatogênica leve(Figura 4E-H), e severas condições esteatogênicas(Figura 4I-L) foram avaliadas para o conteúdo lipídico pela coloração O vermelha do óleo. As fotografias mostram gotículas lipídicas hepatócicas das 24h às 4 horas. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo destina-se a fornecer uma estratégia para estudar esteatose in vitro. A cultura celular é uma ferramenta poderosa para estudar aspectos celulares, moleculares, bioquímicos e toxicológicos das células expostas a diferentes condições. Com essa abordagem, a esteatose pode ser visualizada não apenas como um estágio da doença complexa que é a MAFLD, mas também como a superexposição hepatocita aos lipídios e os possíveis desfechos resultantes dessa exposição. Portanto, sua aplicação não se restringe à fisiopatologia do MAFLD, mas ao fato de que pacientes com fígado gorduroso estão expostos a drogas terapêuticas, contaminantes, entre outras condições que podem ser afetadas pela esteatose. Assim, esse protocolo possui aplicações potenciais em toxicologia, farmacologia e identificação de alvos terapêuticos para o tratamento da doença.
No desenvolvimento deste protocolo, uma das etapas mais críticas é a preparação da mistura esteatogênica: 1 parte do palmitato: 2 partes de oleato, que induz a esteatose do dia 2 (Figura 3, Figura 4), permitindo que os hepatócitos se proliferem - apesar de uma modesta diminuição na taxa de viabilidade e aumento da taxa de mortalidade(Figura 2). No entanto, a diminuição da viabilidade não deve exceder 30%-40%, uma vez que isso pode representar um efeito tóxico em vez de um que possa ser seguido a longo prazo. Esteatose hepática é o resultado de uma superexposição a longo prazo para lipídios. Nesse sentido, os lipídios se acumulam, a princípio, com afetos leves nos hepatócitos, como observado neste modelo. Outra característica é o perfil de gotícula lipídica. Em esteatose leve, observa-se um aumento do tamanho das gotículas lipídicas durante a progressão da cultura (Figura 4E-H). Em esteatose grave, o tamanho da gotícula é consideravelmente maior em comparação com a esteatose leve(Figura 4I-L),enquanto os controles não apresentam alterações no tamanho da gotícula lipídica(Figura 4A-D).
É preferível armazenar a mídia esteatogênica leve e grave a 4 °C por até uma semana. Posteriormente, recomenda-se preparar meio esteatogênico fresco. No entanto, o estoque de OA pode ser preservado a -20 °C por até um mês, enquanto o estoque de PA pode ser armazenado a 4 °C por até um mês. O uso dessas soluções de estoque após o tempo sugerido pode representar um risco de degradação dos ácidos graxos. Para garantir a adequada concentração das soluções antes de cada uso, recomenda-se medir as concentrações de ácidos graxos por um kit de ensaio de ácidos graxos não esterificados (NEFA).
Pa e OA, bem como seus respectivos sais, têm sido utilizados separadamente para induzir o acúmulo de lipídios; no entanto, são observadas diferenças para cada ácido graxo16,20. Por um lado, palmitato usado sozinho é um bom indutor de esteatose. Induz morte celular, resistência à insulina hepática, disfunção mitocondrial, estresse reticular16,34,35,36. No entanto, a palmitato é altamente tóxica16,34, e os desfechos esperados de usá-lo sozinho na cultura incluem menor viabilidade e maior mortalidade em comparação com a mistura de PA e OA16,20. Por outro lado, o oleate também induz a esteatose. Induz de nova lipogênese, resistência à insulina37,38e hiperproliferação38. No entanto, os desfechos observados com oleato são muitas vezes mais leves em comparação com palmitato e a mistura16,20. Isso pode estar relacionado ao seu papel protetor. O oleato é o principal componente do azeite de oliva, um ingrediente-chave na dieta mediterrânea, uma das estratégias bem sucedidas bem-sucedidas contra o MAFLD39.
Este protocolo pode ser considerado como uma boa ferramenta para estudar esteatose devido à sua reprodutibilidade e ao pouco tempo necessário para obter resultados. Isso é comparado com o uso de modelos experimentais de MAFLD, acrescentando que não implica as questões éticas inerentes ao uso de modelos de roedores. Este protocolo permite ser seguido por vários dias, desde que o meio esteatogênico seja atualizado a cada 24 horas. Este modelo também é econômico e possui uma ampla gama de aplicações. Também pode ser ajustado para outras linhas celulares, não apenas hepatócitos, mas uma ampla gama de células afetadas pela superexposição lipídica durante a obesidade. Uma das limitações deste protocolo é o uso de células HepG2. Uma vez que esta é uma linha celular cancerígena, pode esconder ou aumentar alguns resultados. No entanto, a aplicação de células HepG2 nesses tipos de estudos é amplamente aceita devido à sua semelhança no metabolismo lipídico com hepatócitos saudáveis40. O uso da mistura PA:2OA também pode ser controverso, uma vez que não se assemelha totalmente aos perfis de NEFA observados no sangue dos pacientes NAFLD/MAFLD41. Outros ácidos graxos, incluindo ácidos linolenicos ou esteáricos, podem ser incluídos em outras modificações e melhorias deste protocolo. Outra limitação é o fato de que apenas um tipo de célula, hepatócitos, é estudado, sem a interação com outras células hepáticas presentes no fígado, incluindo endotelial sinusoidal, Kupffer, células estelares hepáticas, etc., que estão engajadas na progressão do MAFLD. Além disso, trata-se de um modelo para induzir a esteatose exclusivamente, sem progressão à esteatohepatite e fibrose.
Em conclusão, o estudo fornece um protocolo in vitro de esteatose hepatocitte fácil de implementar, reprodutível e com uma ampla gama de aplicações no estudo da esteatose, bem como a função hepatócito no contexto do fígado gorduroso.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos é doutoranda no Programa de Doutorado em Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, e foi apoiada pela Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
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