Summary
このプロトコルは、肝細胞の脂質への過剰暴露によって産生される脂肪、生化学的、細胞変化をイン ビトロでステアトーシスおよび分子、生化学的、細胞変化を研究するためのツールとなるものである。
Abstract
代謝機能障害関連脂肪肝疾患(MAFLD)は、以前は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)として知られており、肥満、糖尿病2型、および脂質異常症との関係により、世界中で最も流行している肝疾患です。肝脂肪症は、肝臓の小板減少の蓄積、脂肪肝炎、線維症、および末期肝疾患で観察される炎症に先行する疾患の重要な特徴である。肝細胞の脂質蓄積は、異種生物および内因性分子の適切な代謝を妨げるだけでなく、疾患の進行につながる細胞プロセスを誘導する可能性がある。ステアトーシスの実験的研究は 生体内で行うことができるが、精間症の研究に 対するインビトロ アプローチは、異なる利点を有する補完的なツールである。脂質過負荷状態培地中の肝細胞培養は、酸化および網状ストレス、オートファジア、増殖、細胞死、細胞死などの脂質蓄積に関連する細胞プロセスの同定を可能にする肝脂肪症の研究のための優れた再現可能な選択肢であり、薬物の有効性、および毒物学的検査を含む他の多くの可能な用途の中で可能な他のアプリケーションの中で。ここでは、脂質過負荷状態培地における肝細胞培養の方法論を説明することを目的とした。ヘプG2細胞はパルミチン酸ナトリウム及びオレイン酸ナトリウムを用いてRMPI 1640培地で培養した。重要なことに、これら2つの脂質の比率は、疾患の間に肝臓で起こるように、細胞増殖および適度な死亡率を維持しながら、脂質液滴蓄積を支持するために重要である。方法論としては、脂質溶液ストックの調製から、混合物、培地への添加、および肝細胞培養が示される。このアプローチにより、油赤O染色によって容易に観察できる肝細胞中の脂質滴、ならびに増殖/死亡率の曲線を同定することができる。
Introduction
代謝機能障害に関連する脂肪肝は世界的に非常に普及しています1,2;人口の最大25%が3に影響を受けると推定されています。この疾患は、以前は非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)として知られており、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病2型、脂質異常症に関連する病因を正確に反映するように代謝機能不全に対するその命名法を更新した。3,4.
名前に関係なく、この疾患は肝臓における脂質の異常に高い蓄積(肝細胞5の脂肪の>5%)を特徴とする組織病理学的変化の広いスペクトルを含み、単純な脂肪症に典型的に見られる脂質蓄積を通じて進行する可能性があり、線維症、肝硬変の発症につながる可能性がある。 肝細胞癌、肝不全5、6、7、8.その増加の有病率のために, MAFLDは、肝移植の最初の徴候と肝細胞癌の主要な原因になると予想されます9.
それは、良性または軽度の形態の脂肪肝疾患として考えられてきましたが、肝性脂肪症は、実際にはMAFLD10の代謝キーです。異なる代謝経路は、肝臓における脂質蓄積の影響を受け、脂質合成、輸出、代謝10を含むがこれらに限定されない。インスリン抵抗性、酸化ストレス、網状ストレス、および細胞機能障害は、肝脂肪毒性11,12に強く関連している。一方、脂肪肝細胞は、活性酸素種の標的であり、代謝産物を過酸化脂質としてレンダリングし、タンパク質カルボニル、および核酸の付加物を13にする。細胞レベルでは、脂肪肝細胞はミトコンドリア損傷14、細胞老化15、アポトーシス16、ピロプトーシス12、およびオートファジア17を受ける可能性がある。
肝細胞は、幅広い分子の代謝、解毒、合成に大きな責任を負います。これらの機能の多くは、脂肪症で観察される脂質蓄積によって損なわれる可能性があります。.したがって、ステアトーシスの正確な評価を可能にする再現性のあるツールを持つことは非常に重要です。この意味で、in vitroモデルは容易に適用可能で、非常に再現可能である。体外のステアトーシスは、異なる目標16、18、19で使用されています。HepG2細胞は肝細胞細胞株として広く用いられている。それは、文化が容易で、よく特徴づけられるなどの利点を有する。おそらく、HepG2細胞の唯一の欠点は、発がん性細胞株であるという事実であるため、結果を分析する際に考慮する必要があります。ここで、細胞培養において広く用いられている脂肪酸の混合物の適用:パルミチン酸(PA)およびオレイン酸(OA)が示されている。PA と OA の両方が文化20で異なる結果を提供します。PA(C 16:0)は、ダイエット16から得られる最も一般的な飽和脂肪酸である。PAは、NAFLD21の開発における重要なステップである脱ノボリポジェネシスのバイオマーカーと考えられています。PAは毒性が高い22であることが示されている。したがって、体外でステアトーシスを誘発することは推奨されない場合があります。OA(C 18:1)は、一価不飽和脂肪酸である。PAとは対照的に、OAは、PA12に対抗することができる抗炎症および抗酸化特性を有することが示唆されている。PAとOAの両方が、健康または疾患16の状態に関係なく、トリグリセリドに存在する主脂肪酸である。表1は、PA、OA、およびそれらの混合物を含む肝細胞培養の例と、報告された結果が12、23、24、25、26、27である。他の脂肪酸は、ステアリン酸(C 18:0)28、29、30、リノール酸(C 18:1)28、30、31及びそのコンジュゲート(CLA)28、32、パルミトール酸(C16:1)29を含む肝細胞培養にも使用されている。しかし、その使用は、おそらく彼らの肝の豊富さがPAおよびOA16よりも低いため、文献で最も頻繁に報告される。
併用すると、両方の脂肪酸はインビトロで脂肪化に似ており、細胞の増殖を提供し、対照条件と比較して細胞死が増加し、生存率が低い。これらの脂肪酸のそれぞれの塩が利用可能であり、同様に使用することができることを言及する価値があります。肝細胞培養における脂質過多量を評価する際の主な問題の1つは、毒性モデルと脂肪沈殿を最もよく表すモデルとの分化において与えられる。多くのモデルは、最初のケースで説明することができます。実際には、PAの単独使用はそれらの中で考慮されるかもしれないし、高い死亡率は最も明白な結果である12、16、23、24、25、26、27。OAの場合でも高用量の使用は、毒物学的モデルとしても考えることができます。ここに示すプロトコルは、他のモデルで観察されたものと比較して低い死亡率を示し、NAFLDで発生する進行性脂質蓄積と数日間に従うことを可能にするので、ステアトーシスの発達に従って高い。実験条件を通じて軽度および重度のステアトーシスを評価する可能性は、別の利点と考えられる。
| 脂肪酸 | 条件 | 結果 | 参考 | ||
| お父さん | 濃度:200 μM | 脂質蓄積 | ヤンら、201925. | ||
| 時間露光:24時間 | 肝細胞の損傷 | ||||
| トランスアミンデス標高 | |||||
| お父さん | 濃度:50、100、200μM | 脂質蓄積 | Xingら, 201924. | ||
| 時間露光:24時間 | |||||
| お父さん | 濃度:250 μM、500 μM、750 μM、1,000 μM | 脂質蓄積 | 王ら, 202026. | ||
| 時間露光:24時間 | 細胞生存率の進行性の低下 | ||||
| OA/PAのミックス | 濃度:1mM | 脂質蓄積 | Xiaoらら、202027. | ||
| 時間露光:24時間 | リポ毒性を報告しない | ||||
| レート: 2OA:1PA | |||||
| OA/PAのミックス | PAの200 μMおよび400 μMの最初の刺激、そしてOAの200 μMの第2の刺激 | 脂質蓄積。 | Zengら, 202012. | ||
| 濃度:400 μM PA:200 μM OA | PAによって誘発されたリポ毒性の証拠は、OAの刺激によって減少した。 | ||||
| レート: 2PA:1OA | |||||
| 時間露光:24時間 | |||||
| OA/PAのミックス | 濃度:400 μM PA:200 μM OA | 脂質蓄積 | 陳ら, 201823. | ||
| レート: 2PA:1OA | |||||
| 時間露光:24時間 | |||||
| OA/PAのミックス | 濃度:50 μM | 2種類のステアトーシスの生成:軽度のステアトーシスと 重度のステアトーシス。 |
カンポスとグスマン 2021 | ||
| レート: 2PA:1OA | 脂質過負荷の慢性博覧をシミュレート | ||||
| 時間暴露:24時間、2日、3日、4日。 | |||||
表 1.肝細胞培養は、ステア原性の状態で。 表は、使用される脂肪酸の種類、維持された条件、および肝細胞培養における観察された結果を示す。PA:パルミチ酸。OA:オレイン酸。
最後に、このモデルは、脂肪、脂肪肝の研究だけでなく、脂肪のコンテキストで肝代謝、合成、および解毒経路にも適用されます。また、 インビトロ 誘発性ステアトーシスは、疾患の潜在的なマーカーおよび治療標的を同定するための証拠を提供するかもしれない。
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Protocol
1. 標準および条件付き培地製剤
- 標準的なRPMI 1640を調製するために、牛胎児血清(FBS、以前に熱不活性化)の10%(v/v)とペニシリン・ストレプトマイシン溶液の1%(v/v)を含むRPMI 1640培地を補います。0.22 μmフィルターを使用して、4°Cで培地を滅菌してください。
- パルミチンストック溶液を調製するために、牛血清アルブミン(脂質フリー)の1%を以前に補充した標準RPMI 1640にパルミチンの50mM溶液を調製する。この在庫の5〜10 mLの量で十分です。0.22 μmフィルターを使用して、ストック溶液を滅菌します。光から保護された4°Cで1ヶ月まで保管してください。
- オレイン酸ストック溶液を調製するために、ウシ血清アルブミン(脂質フリー)の1%を以前補充した標準RPMI 1640にオレ酸塩の50 mM溶液を調製する。10 mLの容積で十分です。0.22 μmフィルターを使用して、ストック溶液を滅菌します。光から保護された-20°Cで1ヶ月まで保管してください。
- 以前に調製した株式からステアトゲン性培地を調製するには、1部パルミエートを準備します:2つの可能なレベルで2部部分の油性ステアトゲン培地:軽度および重度のステアトシス。
- 軽度のステアトーシス:1部パルミチン酸100 mLを調製:標準RPMI 1640で2部オーレ酸(50 μM)ミックス。0.22 μmフィルターを使用して滅菌します。4°Cで1週間保存します。
- 重度のステアトシス:1部パルミチン酸100 mLを準備:2部分のオレエート(500 μM)ミックスを標準RPMI 1640に入れます。0.22 μmフィルターを使用して滅菌します。4°Cで1週間保存します。
- ストックソリューションの代替準備。
- 上記のように遊離脂質アルブミンを用いて、それぞれの脂肪酸を用いて両方のストック溶液を調製する。
- フリーの脂質アルブミンが欠けている場合は、パルミチンとオレイン酸塩を使用してください。
- パルミチン酸またはオレイン酸を2 mLの絶対エタノールに溶解し、標準RPMI 1640(5〜10 mL)の最終体積で混合します。標準RPMI 1640培地で撹拌することにより直接オレエートを溶解する。
- 70 °Cの水浴でインキュベートすることによってエタノールの蒸発を可能にする;よく混ぜます。
- いずれの場合も、0.22 μmフィルターを使用して両方のストック溶液を殺菌します。パルミエートストックソリューションを4°Cに保存し、20°Cでオレエー酸ストックソリューションを保管してください。 両方のソリューションを光から保護します。これらのソリューションは、1ヶ月間安定しています。
2. プレカルチャー
- 24ウェルプレートに1ウェルあたり100,000 HepG2細胞をシードします。標準RPMI 1640を1 mL追加します。
- 37°Cで5%CO2を24時間前培養し、細胞の付着を可能にする。
3. ステアトゲン文化
- 前培養後、標準RPMI 1640培地を廃棄し、それに応じてスティーアトゲン培地を添加する。
- 上清を捨て、24時間ごとに新鮮なステア原性培地を加えます。
4. 生存率と死亡率評価
- 24ウェルプレートに1ウェルあたり100,000 HepG2細胞をシードします。標準RPMI 1640を1 mL追加します。
- 37°Cで24時間、CO2を5%で事前インキュベートする。
- ステアト原性培地用の標準RPMI 1640培地を変更する。
- 24時間、2日、3日、4日間、24時間ごとにステア原性培地をリフレッシュするインキュベート。
- 適切な時間が経過したら、上清を捨てます。
- 0.05%トリプシン-EDTAの500 μLを加えて、ウェルから細胞を取り外します。37°Cおよび5%CO2で5分間インキュベートする。
- マイクロチューブ内の再懸濁細胞を収集します。
- 300xgで遠心分離機を使用し、上清を捨てる。
- 200 μLの標準 RPMI 1640 を加え、細胞を再中断します。
- 新鮮なマイクロチューブに0.4%トリパンブルー溶液の15 μLを追加します。前の細胞懸濁液の15 μLと混合します。
- 血球計で染色された非染色細胞を数えます。
- それに応じて生存率と死亡率を計算します。
生存率=
死亡率 =
5. オイルレッドOでの脂質染色
- 24ウェルプレートのすべてのウェルに細胞培養カバースリップを入れます。
- 種子 100,000 HepG2 ウェルあたり細胞.標準RPMI 1640を1 mL追加します。
- 37°Cでプレインキュベートし、24時間のCO2 を5%で行います。
- ステアト原性培地用の標準RPMI 1640培地を変更する。
- 24時間、2日間、3日間、4日間インキュベートし、24時間ごとにステア原性培地をリフレッシュする。
- 適切な時間が経過したら、上清を捨てます。
- リン酸緩衝生理食塩分(PBS)1 mLで洗浄します。上清を捨てます。
- PBSで4%パラホルムアルデヒドの1 mLで固定します。
- 室温で1時間インキュベートする。
- 過剰のパラホルムアルデヒドを捨てる。
- 1 mLの蒸留水で細胞をすすいでください。
- 70%イソプロパノール1 mLを加え、5分間インキュベートします。
- イソプロパノールの過剰を捨てる。PBS洗浄は、この時点では必要ありません。
- オイルレッドO溶液を1mL加え、30分間インキュベートします。
- オイルレッドO溶液の超過分を捨てます。
- 蒸留水1mLですすります。
- 500 μLのヘマトキシリン溶液を加えます。3分間インキュベートします。
- 過剰のヘマトキシリン溶液を捨てる。
- 蒸留水1mLですすります。
- 顕微鏡下で400x(目標40x、眼球10倍)の倍率で観察します。
脂質内容物のモルフォメトリック評価
- ウェルの完全な領域から10個の光学フィールドの写真をランダムに選択してキャプチャします。すべての井戸のために繰り返します。
- フェレイラとラズバンド33に従って ImageJ ソフトウェアのカラーしきい値ツールを使用して、赤い染色面積の割合を評価します。
- フェレイラとラズバンド33に従って ImageJ ソフトウェアのパーティクルを分析ツールを使用して、光学フィールドの完全な領域と染色領域を比較します。
- すべてのウェルの平均パーセンテージを計算します。
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Representative Results
すべてのウェルの表面上の発育を表示するステア原性培地で培養された肝細胞;しかし、脂肪肝細胞は、対照培地で培養された細胞と比較して低い増殖速度を示す。OAとPAの提案された比率および濃度は、培養中の細胞生存を保証する。24 ウェルプレートにウェルあたり 1 x 105 個 のセルを播種すると 、図 1に示すように最適な合流点が提供されます。
培養細胞における生存率は、対照条件と比較して、軟熱性群、軽度および重度において低かった。実際、培養時間が増加するにつれて生存率は徐々に低下し、重度のスティーアトーシスでは4日で最低の60%に達した(図2A)。したがって、脂肪原性条件下で培養した肝細胞の死亡率は高く、脂質への曝露時とともに徐々に増加した(図2B)。細胞数は増殖の結果として徐々に増加する(図2C)。しかし、3日及び4日で軽度の脊椎症では増殖率が低かった。対照的に、重度のステアトーシスは、24時間から低い増殖と関連していた。
提案されたプロトコルで培養されたHepG2細胞は、ステアトーシス、細胞内脂質蓄積の最も重要な特徴を示す。オイルレッドOを用いた細胞の染色は、 図3 および 図4に示すように、脂肪原性条件下で培養した細胞における脂質滴の少なくとも2倍の増加を観察することを許した。細胞内脂肪は、脂肪原性培地における培養の暴露時に応じて増加した(図3)。軽度の脂肪症では、脂質含量は2日目から増加し、重度の脂肪症では24時間から有意に高かった。
図1:細胞増殖HepG2肝細胞培養物の制御(図1A-D)および軽度のステア原性条件(図1E-H)写真は、1-4日間の文化からの成長を示しています。スケールバー= 500 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: 生存率と死亡率( A) 生存率(B) 死亡率。(C) セル番号。対照的および染色原性条件下のHepG2肝細胞培養物を、トリパンブルー染色により生存率および死亡率について評価した。SD±平均します。文化の時間ごとに三重化の2つの独立した実験。円: 制御条件;正方形:軽度のステアトーシス;三角形:重度の断茶化。一方向の分散分析は、同じ条件の条件と培養時間を比較するために使用されました。p < 0.05 は重要と考えられて: "*" - コントロール対重度のステアトーシス;"§"- コントロール対軽度のステアトーシス;"¶"- 軽度対重度の断血症。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: 脂質蓄積 HepG2肝細胞培養物の対照および脂肪原性条件下で、油赤O染色による脂質内容物の評価を行い、その後ImageJソフトウェアを用いた形態測定解析(NIH、USA)を用いた。脂質の割合は、分析された各光学フィールドの完全面積として100%を考慮した油赤O(脂質)によって染色された面積の割合を指す。SD±平均します。文化の時間ごとに三重化の2つの独立した実験。円: 制御条件;正方形:軽度のステアトーシス;三角形:重度の断茶化。一方向の分散分析は、同じ条件の条件と培養時間を比較するために使用されました。p < 0.05 は重要と考えられて: "*" - コントロール対重度のステアトーシス;"§"- コントロール対軽度のステアトーシス;"¶"- 軽度対重度の断血症。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:体外におけるステアトーシス対照下にあるHepG2肝細胞培養物(図4A-D)、軽度の脂肪原性(図4E-H)および重度の脂肪原性(図4I-L)条件は、油性赤色O染色により脂質内容物について評価した。写真は、24時間から4日間の肝細胞脂質滴を示す。スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、 体外でステアトーシスを研究するための戦略を提供することを目的としています。細胞培養は、細胞、分子、生化学的、および異なる条件にさらされた細胞の毒性学的側面を研究するための強力なツールです。このアプローチにより、脂肪症は、MAFLDである複雑な疾患の段階としてだけでなく、脂質への過剰暴露およびそのような暴露に起因する可能性のある結果として視覚化することができる。したがって、その適用は、MAFLDの生理病理学に限定されるのではなく、脂肪肝の患者が、脂肪除去によって影響を受ける可能性のある他の条件の中で、治療薬、汚染物質にさらされるという事実に限定されない。したがって、このプロトコルは、毒物学、薬理学、および疾患の治療対象の同定における潜在的な用途を有する。
このプロトコルの開発に関して、最も重要なステップの1つは、ステアトゲンミックスの調製である:パルミチン酸の1部:2日目からステアトーシスを誘発するオレ酸塩の2部(図3、図4)、肝細胞が生存率の緩やかな低下と死亡率の増加にもかかわらず増殖することを可能にする(図2)。しかし、生存率の低下は、長期的に続く可能性のあるものではなく毒性効果を表す可能性があるため、30%〜40%を超えてはならない。肝性脂肪症は、脂質への長期過剰暴露の結果である。この意味で、脂質は、最初は、このモデルで観察されるように、肝細胞に軽度の愛情を持って蓄積します。もう一つの特徴は、脂質滴プロファイルです。軽度の脂肪取りでは、培養の進行中に脂質滴のサイズが増加することが観察される(図4E-H)。重度の脂肪取りでは、液滴サイズは軽度の脂肪化症(図4I-L)に比べてかなり高いが、対照は脂質滴サイズの変化を示さない(図4A-D)。
軽度および重度のステアトゲン培地を4°Cで1週間まで保存することが好ましい。その後、新鮮なステア原性培地を調製することをお勧めします。ただし、OA在庫は-20°Cで1ヶ月まで保存できますが、PA在庫は最大1ヶ月間4°Cで保管できます。提案された時間の後にこれらのストック溶液を使用することは、脂肪酸の分解のリスクを表す可能性があります。使用前に溶液の適切な濃度を確保するために、非エステル化脂肪酸(NEFA)アッセイキットで脂肪酸濃度を測定することが推奨されます。
PAとOAは、それぞれの塩と同様に、脂質蓄積を誘導するために別々に使用されてきた。しかし、すべての脂肪酸16、20に対して違いが認められる。一方で、単独で使用されるパルミチンは、ステアトシスの優れたインダクタである。それは、細胞死を誘発する、肝インスリン抵抗性、ミトコンドリア機能不全、網状ストレス16、34、35、36。しかしながら、パルミチンは毒性が高い16、34であり、培養で単独で使用すると予想される結果は、PAおよびOA16、20の混合物と比較して、より低い生存率および高い死亡率を含む。一方、オレ酸は、また、ステアトス症を誘発する。それは、デノボリポジェネシス、インスリン抵抗性37、38、および過増殖38を誘導する。しかし、オレイン酸で観察される結果は、パルミテと混合物16,20と比較して穏やかであることが多い。これは、その保護の役割に関連している可能性があります。Oleate はオリーブオイルの主要なコンポーネント, 地中海の食事の重要な成分, MAFLD39に対する有名な成功した戦略の一つ.
このプロトコルは、その再現性と結果を得るのにかかる短い時間のために、ステアトーシスを研究するための素晴らしいツールと考えられるかもしれません。これは、MAFLDの実験モデルを使用することと比較して、げっ歯類モデルの使用に固有の倫理的問題を意味していないという事実を追加します。このプロトコルは、ステアト原性培地が24時間ごとにリフレッシュされることを受けて数日間続くことを可能にする。このモデルはまた費用効果が大きく、適用の広い範囲を所有している。また、他の細胞株に調整することができます, 肝細胞だけでなく, 肥満の間に脂質の過剰暴露の影響を受ける細胞の広い範囲.このプロトコルの制限の1つは、HepG2細胞の使用である。これは発がん性細胞株であるため、いくつかの結果を隠したり、増加させる可能性があります。しかし、これらのタイプの研究におけるHepG2細胞の適用は、健康な肝細胞40への脂質代謝に類似しているため広く受け入れられている。混合物PA:2OAの使用はまた、NAFLD/MAFLD患者41の血液中で観察されたNEFAのプロファイルに完全に似ていないので、議論の余地があることを証明するかもしれません。リノレン酸またはステアリン酸を含む他の脂肪酸は、このプロトコルのさらなる修正および改良に含まれる可能性があります。もう一つの制限は、1つの細胞タイプ、肝細胞、研究され、中弦内皮、クファー、肝星状細胞などを含む肝臓に存在する他の肝細胞との相互作用を欠いている、MAFLDの進行に従事していることである。また、これは脂肪性肝炎や線維化に対する進行を伴わない、脂肪症を排他的に誘導するモデルである。
結論として、この研究は、脂肪肝の文脈における肝細胞機能と同様に、ステアトーシスの研究における幅広い応用と実装が容易で、再現性のある肝細胞ステアトーシスの インビトロ プロトコルを提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この作品は、コンセホ・ナシオナル・デ・シエンシア・イ・テクノロジア(Conacyt、CB-221137)によって資金提供されました。アドリアナ・カンポスは、プログラム・デ・ドクマド・エン・シエンシアス・バイオメディカ、ナシオナル・エウトノマ・デ・メヒコ大学の博士課程の学生で、コナシト(CVU:1002502)によってサポートされました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
References
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