Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टैटिक ट्यूमर विकास का अध्ययन और लक्ष्य करने के लिए एक पूर्व वीवो मस्तिष्क स्लाइस मॉडल

Published: September 22, 2021 doi: 10.3791/62617
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2,4, 3,4, 2, 1,4
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, 2Department of Pharmacology and Physiology, Drexel University College of Medicine, 3Department of Radiation Oncology, Thomas Jefferson University, 4Sidney Kimmel Cancer Center, Thomas Jefferson University

Summary

हम एक organotypic मस्तिष्क टुकड़ा मॉडल में स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टैटिक कोशिकाओं की वास्तविक समय की दवा और विकिरण प्रतिक्रिया को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। विधियाँ एक मात्रात्मक परख प्रदान करने के लिए मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट इंटरफ़ेस के भीतर एक पूर्व vivo तरीके से स्तन कैंसर से मस्तिष्क मेटास्टेसिस पर विभिन्न उपचारों के चिकित्सीय प्रभावों की जांच करने के लिए।

Abstract

मस्तिष्क मेटास्टेसिस महिलाओं के लिए स्तन कैंसर का एक गंभीर परिणाम है क्योंकि इन ट्यूमर का इलाज करना मुश्किल है और खराब नैदानिक परिणामों से जुड़ा हुआ है। स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टैटिक (बीसीबीएम) विकास के प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल उपयोगी हैं, लेकिन महंगे हैं, और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर जीवित कोशिकाओं और ट्यूमर सेल आक्रमण को ट्रैक करना मुश्किल है। यहां प्रस्तुत पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस संस्कृतियों के लिए एक प्रोटोकॉल है, जिसमें इंट्राक्रैनियल रूप से इंजेक्ट किए गए स्तन कैंसर मस्तिष्क की मांग करने वाले क्लोनल सबलाइन शामिल हैं। एमडीए-एमबी -231बीआर लूसिफेरस टैग की गई कोशिकाओं को न्यू / नू मादा चूहों के दिमाग में इंट्राक्रैनियल रूप से इंजेक्ट किया गया था, और ट्यूमर गठन के बाद, मस्तिष्क को अलग, कटा हुआ और सुसंस्कृत पूर्व विवो किया गया था। ट्यूमर स्लाइस को लूसिफेरस को व्यक्त करने वाली ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान करने और 10 दिनों तक मस्तिष्क पैरेन्काइमा में उनके प्रसार और आक्रमण की निगरानी करने के लिए चित्रित किया गया था। इसके अलावा, प्रोटोकॉल आयनीकरण विकिरण या कीमोथेरेपी के साथ उपचार के बाद ट्यूमर कोशिकाओं के विकास और आक्रामक व्यवहार की छवि के लिए समय-अंतराल माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन करता है। उपचार के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की प्रतिक्रिया को लाइव-इमेजिंग माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना की जा सकती है, बायोल्यूमिनेसेंस तीव्रता को मापने और बीसीबीएम कोशिकाओं वाले मस्तिष्क के टुकड़े पर हिस्टोलॉजी का प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रकार, यह पूर्व विवो स्लाइस मॉडल अकेले उपन्यास चिकित्सीय एजेंटों के तेजी से परीक्षण के लिए एक उपयोगी मंच हो सकता है या विकिरण के साथ संयोजन में मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर एक व्यक्तिगत रोगी के स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेटिक विकास को लक्षित करने के लिए व्यक्तिगत दवाओं की पहचान करने के लिए।

Introduction

स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस (बीसीबीएम) तब विकसित होता है जब कोशिकाएं प्राथमिक स्तन ट्यूमर से मस्तिष्क तक फैलती हैं। स्तन कैंसर फेफड़ों के कैंसर के बाद मस्तिष्क मेटास्टेसिस का दूसरा सबसे आम कारण है, जिसमें मेटास्टेसिस 10-16% रोगियों में होताहै। दुर्भाग्य से, मस्तिष्क मेटास्टेसिस लाइलाज रहते हैं क्योंकि >80% रोगी अपने मस्तिष्क-मेटास्टेसिस निदान के बाद एक वर्ष के भीतर मर जाते हैं, और न्यूरोलॉजिकल डिसफंक्शन2 के कारण उनके जीवन की गुणवत्ता बिगड़ा हुआ है। अधिक प्रभावी उपचार विकल्पों की पहचान करने की तत्काल आवश्यकता है। मोनोलेयर दो आयामी या तीन आयामी संस्कृति मॉडल प्रयोगशाला में चिकित्सीय एजेंटों के परीक्षण में सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीके हैं। हालांकि, वे जटिल बीसीबीएम माइक्रोएन्वायरमेंट की नकल नहीं करते हैं, जो ट्यूमर फेनोटाइप और विकास का एक प्रमुख चालक है। यद्यपि ये मॉडल उपयोगी हैं, वे जटिल ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन, अद्वितीय चयापचय आवश्यकताओं और ट्यूमर 3 की विषमता पर कब्जा नहीं करतेहैं। ट्यूमर-स्ट्रोमल इंटरैक्शन और माइक्रोएन्वायरमेंट विषमता को और अधिक ईमानदारी से दोहराने के लिए, हमारे समूह और अन्य लोगों ने रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं (प्राथमिक या मेटास्टैटिक) या कैंसर सेल लाइनों 4,5,6 के साथ ऑर्गेनोटाइपिक मस्तिष्क मेटास्टेसिस "स्लाइस" संस्कृतियों को उत्पन्न करना शुरू कर दिया है। इन विट्रो सिस्टम में शास्त्रीय की तुलना में, यह अल्पकालिक पूर्व वीवो मॉडल बड़े पशु समूहों में प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन से पहले नए चिकित्सीय की स्क्रीनिंग के लिए अधिक प्रासंगिक स्थितियां प्रदान कर सकता है।

पूर्व विवो मॉडल का निर्माण किया गया है और मुख्य रूप से विभिन्न कैंसर के सफल उपचार की पहचान के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है। उन्हें कुछ दिनों के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है और इसके अतिरिक्त रोगी-विशिष्ट दवा स्क्रीनिंग के अनुरूप बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मानव मूत्राशय और प्रोस्टेट कैंसर पूर्व विवो ऊतकों ने डोसेटाक्सेल और गेमिसिटाबाईन 7 की खुराक-निर्भर एंटी-ट्यूमर प्रतिक्रिया दिखाईहै। इसी तरह के कोलोरेक्टल कार्सिनोमा पूर्व विवो ऊतकों को कीमोथेरेपी दवाओं Oxaliplatin, Cetuximab, और Pembrolizumab 8 स्क्रीन करने के लिए विकसितकिया गया था। इस आवेदन को व्यापक रूप से अग्नाशय के कैंसर में इस्तेमाल किया गया है, स्ट्रोमल पर्यावरण और अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा 9,10 के जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक विशेषताओं के बीच आवश्यक बातचीत पर विचार करते हुए। इसके अलावा, इस तरह के ऑर्गेनोटाइपिक मॉडल को सिर, गर्दन, गैस्ट्रिक और स्तन ट्यूमर11,12 में समान स्क्रीनिंग के लिए विकसित किया गया है।

यहां, उनके माइक्रोएन्वायरमेंट में स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टैटिक ट्यूमर कोशिकाओं का एक पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस मॉडल उत्पन्न किया जा रहा है। चूहों को इंट्राक्रैनियल रूप से स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेटिक मस्तिष्क ट्रॉफिक एमडीए-एमबी -231 बीआर कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया गया था13 सेरेब्रल कॉर्टेक्स पार्श्विका लोब में- टीएनबीसी मेटास्टेसिस14,15 की एक आम साइट और ट्यूमर विकसित करने की अनुमति दी गई थी। मस्तिष्क के स्लाइस इन जानवरों से उत्पन्न किए गए थे और16,17 वर्णित के रूप में ऑर्गेनोटाइपिक संस्कृतियों के रूप में पूर्व विवो को बनाए रखा गया था। यह उपन्यास पूर्व विवो मॉडल मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर बीसीबीएम सेल के विकास के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और इसका उपयोग मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं पर चिकित्सीय एजेंटों और विकिरण प्रभावों का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल को अनुमोदित किया गया था और Drexel University College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) द्वारा पशु देखभाल दिशानिर्देशों का पालन किया गया था। Nu / Nu एथाइमिक मादा चूहों (6-8 सप्ताह पुराने) का उपयोग इस अध्ययन में किया गया था।

1. ट्यूमर कोशिकाओं के Intracranial इंजेक्शन

  1. नसबंदी पाउच में 45 मिनट तक के लिए एक आटोक्लेव के सूखे चक्र के तहत सभी उपकरणों (चिमटी, कैंची, हाथ ड्रिल) को निष्फल करें, जिसमें नसबंदी संकेतक भी शामिल है। यदि कई जानवरों पर सर्जरी का संचालन करते हैं, तो गर्म मनका स्टरलाइज़र (3x तक) का उपयोग करके जानवरों के बीच उपकरणों को निष्फल करें।
  2. उपयोगकर्ताओं के पशु देखभाल प्रोटोकॉल (उदाहरण के लिए, आइसोफ्लुरेन (प्रेरण के लिए 4%, 1-2% रखरखाव) के अनुसार चूहों को बेहोश करें और सर्जरी की शुरुआत से पहले एनाल्जेसिया (चमड़े के नीचे, 0.1मिलीग्राम / किग्रा ब्यूप्रेनोर्फिन एसआर-लैब) का प्रशासन करें। एक पैर की अंगुली चुटकी के साथ इष्टतम संज्ञाहरण गहराई सुनिश्चित करें।
  3. चूहों को एक स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में रखें और मानक कान सलाखों (चित्रा 1 ए) का उपयोग करके सिर को स्थिर करें। नेत्र मरहम को आंखों पर लगाएं।
  4. चीरा से पहले आयोडीन स्वैब और 70% इथेनॉल के दोहराए गए, वैकल्पिक अनुप्रयोग (3x) द्वारा सिर की सतह को निष्फल करें।
  5. एक सर्जिकल स्केलपेल का उपयोग करें ताकि त्वचा के माध्यम से 1 सेमी मिडलाइन चीरा बनाया जा सके, जो काल्पनिक रेखा के लिए थोड़ा विकर्ण कोण पर होता है जो खोपड़ी को उजागर करने के लिए चूहों के मस्तिष्क को दो सममित हिस्सों में विभाजित करता है। एक कपास झाड़ू के साथ किसी भी रक्त को पोंछें।
  6. इंजेक्शन साइट को उजागर करने के लिए त्वचा को पार्श्व रूप से विक्षेपित करें: दाईं ओर 2 मिमी, ब्रेग्मा के संदर्भ में 1 मिमी आगे (+2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC)।
  7. खोपड़ी +2ML, +1RC को ब्रेग्मा में घुसने के लिए एक bur bit (0.73 मिमी) का उपयोग करें और मामूली दबाव और घुमा गति का उपयोग करके एक छेद ड्रिल करें।
  8. एक मस्तिष्क इंजेक्शन सिरिंज का उपयोग करने के लिए एक 100,000 MDA-MB-231BR (stably व्यक्त GFP-Luciferase) कोशिकाओं /
  9. सिरिंज को 2 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें। इसे लगभग 1 मिमी तक खींचें, और 2 मिनट के बाद, धीरे-धीरे मात्रा की पहली छमाही को इंजेक्ट करें।
  10. बाकी इंजेक्शन लगाने से पहले एक और 2 मिनट तक प्रतीक्षा करें, और फिर अंतिम इंजेक्शन के 3 मिनट बाद धीरे-धीरे सिरिंज खींचें।
    नोट: धीमी गति से इंजेक्शन मस्तिष्क के ऊतकों द्वारा वॉल्यूम को अच्छी तरह से अवशोषित करने की अनुमति देने में अनुभवजन्य है और सिरिंज को खींचने के बाद रिसाव नहीं पैदा करता है, जिससे कैंसर कोशिकाएं इच्छित साइट के बाहर बढ़ सकती हैं।
  11. खोपड़ी पर इंजेक्शन साइट पर हड्डी मोम लागू करें और फिर ऊतक को सीवन करने के लिए पॉलीप्रोपाइलीन टांके का उपयोग करें। चूहों संज्ञाहरण को हटाने के बाद 5 मिनट के भीतर ठीक हो जाएगा।
  12. सर्जरी के ठीक बाद लगभग 10 मिनट, 3 घंटे बाद और अगले दिन के लिए उनके व्यवहार की निगरानी करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि क्या खारा इंजेक्शन, नरम भोजन, आदि सहित विशेष उपचार, त्वरित वसूली में मदद करने के लिए आवश्यक हैं।
  13. इमेजिंग सिस्टम पर बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग के माध्यम से ट्यूमर के विकास की निगरानी करें।
    1. इसके लिए सबसे पहले इमेजिंग सिस्टम पर ऑक्सीजन और आइसोफ्लुरेन को ऑन करें। दोनों को इमेजिंग बॉक्स के बाहर अलग-अलग कक्ष में वितरित करने की अनुमति दें।
    2. फिर, सॉफ़्टवेयर चालू करें, उपकरण को प्रारंभ करें और पूरे माउस शरीर को विज़ुअलाइज़ करने और कैप्चर करने के लिए उपयुक्त विकल्प चुनें।
  14. आइसोफ्लुरेन के साथ चूहों को अलग कक्ष में रखें और पैर की अंगुली की चुटकी के साथ इष्टतम संज्ञाहरण गहराई सुनिश्चित करें। 30 मिलीग्राम / एमएल लूसिफेरिन के 200 μL के साथ चूहों को इंट्रापेरिटोनियल रूप से इंजेक्ट करें।
  15. चूहों के पेट को ऑक्सीजन और आइसोफ्लुरेन के साथ आपूर्ति की गई इमेजिंग चैंबर के नोजलेट में नीचे स्थानांतरित करें। कक्ष को लॉक करें, और इमेजिंग शुरू करने के लिए 2 मिनट का समय एक्सपोजर चुनें।
  16. ट्यूमर के बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल को मापने के लिए सॉफ़्टवेयर के ROI (ब्याज का क्षेत्र) उपकरण का उपयोग करें।
  17. ट्यूमर के आकार का विश्लेषण करने के लिए, सर्कल आकार उपकरण चुनें, इसे ट्यूमर के आकार और आकार के आसपास फिट करें। ROI को मापें और कुल रीडिंग की रिपोर्ट करें।
  18. मस्तिष्क स्लाइस उत्पन्न करने से पहले 12-14 दिनों के लिए ठोस ट्यूमर के विकास की अनुमति दें (या जब तक लूसिफेरस लगभग 7.0 x 106 इकाइयों तक नहीं पहुंच जाता है) (चित्रा 1 बी)।
    नोट: इंजेक्ट की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या बढ़ाने से तेजी से ट्यूमर की वृद्धि होगी; इसलिए, मस्तिष्क स्लाइस की पीढ़ी 12 दिनों से पहले हो सकती है। दूसरी ओर, एक बड़ा ट्यूमर अधिक जीएफपी + स्लाइस का कारण बनेगा यदि 14 दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति दी जाती है। 14 दिनों के बाद, चूहों का स्वास्थ्य तेजी से बिगड़ना शुरू हो जाता है; इसलिए पशु स्वास्थ्य की निगरानी को 10-दिन के समय बिंदु के बाद दैनिक रूप से एक बार बढ़ाया जाना चाहिए, और दर्द और / या असुविधा के लक्षण प्रदर्शित करने वाले किसी भी चूहे का उपयोग स्लाइस उत्पन्न करने के लिए किया जाना चाहिए।

2. मस्तिष्क स्लाइस उत्पन्न

नोट: एक बाँझ लैमिनर प्रवाह हुड में मस्तिष्क अलगाव के बाद चरणों का प्रदर्शन करें। एमडीए-एमबी-231बीआर कोशिकाओं (चित्रा 1 सी) के साथ इंजेक्ट किए गए एक माउस से ट्यूमर कोशिकाओं (लूसिफेरस सिग्नल) वाले 35-40 व्यक्तिगत स्लाइस उत्पन्न करना आमतौर पर संभव है।

  1. एक आटोक्लेव में सभी सर्जिकल उपकरणों को निष्फल करें। बाँझ लैमिनर प्रवाह हुड में ऊतक स्लाइसर रखें और 70% इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों और उपकरणों को साफ करें।
  2. इंट्राक्रैनियल एमडीए-एमबी-231बीआर सेल इंजेक्शन के बाद 12-14 दिनों के बाद, उपयोगकर्ताओं के पशु देखभाल प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों को एनेस्थेटिकाइज़ करें जैसा कि 1.2 में वर्णित है। एक पैर की अंगुली चुटकी के साथ इष्टतम संज्ञाहरण गहराई सुनिश्चित करें।
  3. निकालें और तेजी से (45 s के भीतर) बर्फ-ठंडा (4 °C) सुक्रोज-ACSF निम्नलिखित से बना में अपने दिमाग जगह: 280 mM सुक्रोज, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 20 mM ग्लूकोज, 10 mM HEPES, 5 mM Na + -ascorbate, 3 mM thiourea, 2m Na+, 29 mM पाइरूवेट; pH = 7.3.
  4. एक तेज, बाँझ स्केलपेल या रेजर ब्लेड का उपयोग करके, मस्तिष्क के अतिरिक्त हिस्सों को काट दें जिसमें मस्तिष्क के निचले हिस्से सहित सभी पक्षों से कोई ट्यूमर नहीं होता है।
  5. स्लाइसिंग की सुविधा के लिए 60 मिमी डिश ढक्कन पर एसीएसएफ गीले फिल्टर पेपर पर फ्लैट बैठने के लिए मस्तिष्क के आकार को एक गैर-सही घन में लाएं।
    नोट: मस्तिष्क के अतिरिक्त ऊतक जहां ट्यूमर के बढ़ने की संभावना नहीं है, ज्यादातर जीएफपी + स्लाइस की पीढ़ी की अनुमति देने के लिए स्लाइसिंग से पहले हटा दिया जाता है और मस्तिष्क का एक आकार बनाता है जो उपकरण की सतह पर स्थिर होता है और स्लाइसिंग के कारण कंपन से परेशान नहीं होगा।
  6. पूर्व गीला (ACSF के साथ) फिल्टर कागज हलकों के कई चादरें काटने के मंच पर रखें और इस ऊपर अवरुद्ध ऊतक जगह.
  7. 200-250 μm वर्गों में ऊतक टुकड़ा करने के लिए प्रदान किए गए शासक पर 2 या 2.5 इकाइयों के लिए उपकरण पर कट आकार सेट करें।
    नोट: 350 μm तक स्लाइस या 100 μm के रूप में पतली व्यवहार्य हैं। स्लाइस <200 μm के लिए, एक वाइब्रेटोम या compresstome का उपयोग करें।
  8. सुक्रोज एसीएसएफ युक्त एक डिश में मस्तिष्क स्लाइस को स्थानांतरित करने के लिए एक पेंटब्रश (सेबल) का उपयोग करें और 27 जी सुइयों का उपयोग करके प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइस को अलग करें।
  9. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत जीएफपी सकारात्मक स्लाइस की पहचान करें और उन्हें एक नए 60 मिमी डिश में स्थानांतरित करें जिसमें वयस्क स्लाइस मीडिया के 2-3 मिलीलीटर (न्यूरोबेसल माध्यम ए, 2% बी 12 पूरक, 1% एन 2 पूरक, 1% ग्लूटामाइन, 0.5% ग्लूकोज, 10 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन) का उपयोग करके एक बाँझ 1 एमएल टूटा हुआ पिपेट (व्यापक उद्घाटन) का उपयोग करके।
    नोट: मस्तिष्क स्लाइस जिसमें मस्तिष्क की सतह पर बढ़ने वाली ट्यूमर कोशिकाएं होती हैं (शायद इंजेक्शन सेल रिसाव, आदि के कारण) को बाहर रखा जाता है।
  10. प्रत्येक 30 मिमी पर 3-5 स्लाइस स्थानांतरित करें, 0.4 μm रंध्र आकार ऊतक संस्कृति एक दूरी पर 6-अच्छी तरह से प्लेटों में सम्मिलित करें जो एक दूसरे में बढ़ने की अनुमति नहीं देता है।
  11. एक P1000 पिपेट का उपयोग कर सम्मिलित करें की सतह से अतिरिक्त माध्यम को निकालें, प्रत्येक सम्मिलित करें के नीचे वयस्क माउस स्लाइस माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और स्लाइसिंग से पहले इनक्यूबेटर में मीडिया को संतुलित करें।
  12. इमेजिंग से पहले 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता पर ऊतकों को इनक्यूबेट करें।

3. स्लाइस के IVIS इमेजिंग

नोट: एक बाँझ लैमिनर प्रवाह हुड में लूसिफेरस और अवरोधक अतिरिक्त कदम निष्पादित करें।

  1. 30 मिलीग्राम / एमएल लूसिफेरिन समाधान के पिपेट 5 μL संदंश के साथ सम्मिलित करने और उन्हें अच्छी तरह से मीडिया में लूसिफेरिन के अलावा के बाद अच्छी तरह से रखने के द्वारा आवेषण के नीचे माध्यम में।
  2. स्थिर कैमरे के नीचे उपकरण के इमेजिंग कक्ष के अंदर ढक्कन के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेट रखें और कक्ष के दरवाजे को लॉक करें।
  3. सॉफ़्टवेयर खोलें और उपकरण को प्रारंभ करें।
  4. कैमरा सेटिंग्स चुनें जो विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देती हैं और प्रति छवि केवल एक अच्छी तरह से कैप्चर करती हैं। चरण को ऊपर ले जाएं (5 सेमी का एफओवी) और अच्छी तरह से रखें जिसे सीधे कैमरे के नीचे चित्रित किया जाना चाहिए।
  5. इमेजिंग समय को लूसिफेरस की तीव्रता के आधार पर सबसे उपयुक्त पर सेट करें जो ट्यूमर उत्सर्जित करेगा, जो 10 एस से 5 मिनट तक भिन्न हो सकता है। इसे 10 सेकंड पर सेट करने के साथ शुरू करें और फिर यदि सिग्नल कम है तो बढ़ाएं, लेकिन इसे प्रयोग के अंत तक सभी समय बिंदुओं और स्थितियों के लिए सुसंगत रखें (चित्रा 1 डी)।
  6. ROI उपकरण (सर्कल आकार उपकरण) का उपयोग करें, इसे ट्यूमर के आकार और आकार के चारों ओर फिट करें, ROI को मापें, और स्लाइस पर प्रत्येक ट्यूमर के बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल को मापने के लिए कुल रीडिंग की रिपोर्ट करें।
  7. प्लेट को बाँझ लैमिनर प्रवाह हुड पर वापस लाएं, अच्छी तरह से डालने को थोड़ा उठाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
  8. माध्यम aspirate, ताजा माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ इसे प्रतिस्थापित करें और अच्छी तरह से वापस डालने जगह.
  9. प्रयोगों के लिए जहां स्लाइस को विभिन्न यौगिकों जैसे अवरोधकों, चयापचयों, आदि के साथ इलाज किया जा रहा है, 1.5 एमएल ट्यूब में मस्तिष्क स्लाइस मीडिया के 1.2 मिलीलीटर में अभिकर्मक की उचित एकाग्रता तैयार करें और फिर स्लाइस युक्त कुएं में 1 एमएल स्थानांतरित करें।
  10. अध्ययन की अवधि के लिए हर 48 घंटे में इस प्रक्रिया को दोहराएं।

4. पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में ट्यूमर के विकास की लाइव इमेजिंग

नोट:: आपूर्ति पर्याप्त माध्यम (1.5 mL) के साथ आवेषण प्रयोग की लंबाई पिछले के रूप में यह लाइव इमेजिंग के दौरान अतिरिक्त माध्यम जोड़ने के लिए संभव नहीं है के रूप में पिछले करने के लिए।

  1. इनक्यूबेटर के अंदर स्वचालित माइक्रोस्कोप प्लेट धारक पर 6-अच्छी तरह से प्लेट रखें (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 95% आर्द्रता)।
  2. सॉफ़्टवेयर खोलें, स्लाइस को देखने के लिए आवश्यक एक्सपोज़र को समायोजित करने के लिए पहले चतुर्थांश पर ब्राइटफील्ड चालू करें। स्लाइस की स्थिति (निर्देशांक "xy") को खोजने के लिए, माइक्रोस्कोप के निर्देशांक "xyz" को नियंत्रित करने के लिए दूसरे चतुर्थांश पर "xy" के साथ नेविगेट करें।
  3. इस प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले लैबवेयर के रूप में 6-अच्छी तरह से प्लेट का चयन करें। ROI मानचित्र संपादक का चयन करें और एक नया ROI का चयन करके उस स्थिति को पंजीकृत करें, उस ROI को जोड़ें और सहेजें।
  4. अन्य कुओं में रुचि के अन्य सभी क्षेत्रों के लिए एक ही कदम दोहराएं। सभी आरओआई जोड़ने के बाद, सभी आरओआई को सहेजें।
  5. प्रोटोकॉल के तहत, मौजूदा साफ़ करें का चयन करें और अधिग्रहण के तहत टाइम-लैप्स का चयन करें, इसके बाद ब्याज के चैनलों का चयन करें (इस मामले में GFP)।
  6. फ़ोकस सेटअप में ऑटोफ़ोकस बंद करें और मैन्युअल रूप से सभी स्लाइस के लिए उपयुक्त फ़ोकस में समायोजित करें. अंत में, Brightfield तीव्रता और फ्लोरोसेंट चैनल उत्तेजना और एक्सपोजर समय को उचित स्तर पर समायोजित करें।
  7. 48 घंटे के लिए हर 15 मिनट में छवियों को प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल सेट करें।
  8. सहेजें और प्रोटोकॉल चलाएँ। प्रयोग के अंत में, सहेजी गई फ़ाइल में प्रत्येक ROI के लिए कैप्चर की गई ब्राइटफील्ड और GFP छवियां दोनों शामिल होंगी।
  9. एक वीडियो में छवियों को संयोजित करने के लिए, एक ही नाम के साथ ब्याज की सभी छवियों का नाम बदलें, जिसके बाद एक बाइनरी नंबर उन्हें उस क्रम में व्यवस्थित करने के लिए रखा गया था जिस क्रम में उन्हें कैप्चर किया गया था (उदाहरण के लिए, ROI1 (1), RO1 (2) ...)
  10. ImageJ खोलें और फ़ाइल पर क्लिक करके छवियों को आयात करें > छवि अनुक्रम आयात >। किसी सूची में दिखाई देने वाले फ़ाइल नामों का चयन करें, और फ़ाइलों के नाम की सामग्री को फ़ाइल नाम में लिखें जिसमें फ़ाइल का नाम शामिल है बॉक्स जो वीडियो के लिए चयनित उन फ़ाइलों की पहचान करने के लिए दिखाई देगा.
  11. फ़ाइल के अंतर्गत संयुक्त छवियों को सहेजें > के रूप में सहेजें > AVI.

5. एमटीएस परख और पूर्व विवो मस्तिष्क ऊतक के immunohistochemistry

  1. एमटीएस परख
    1. ऊतक के किनारों के साथ प्रत्येक स्लाइस के नीचे ऊतक संस्कृति झिल्ली को काटकर स्लाइस को एक्साइज करें और ऊतक को स्थानांतरित करें, जो अभी भी झिल्ली से जुड़ा हुआ है, एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में।
    2. प्रत्येक कुएं में 120 μL की कुल मात्रा में, ऊतक में समाधान के प्रवेश की अनुमति देने के लिए संस्कृति मीडिया और 0.01% ट्राइटन (1x) के साथ 1: 5 अनुपात में मिश्रित एमटीएस अभिकर्मक जोड़ें।
    3. मस्तिष्क स्लाइस को अव्यवहार्य प्रदान करने के लिए एक एजेंट के रूप में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का उपयोग करें, और इस प्रकार इस प्रयोग के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण। MTS परख के साथ आगे बढ़ने से पहले 4° C पर 1 ज के लिए 4% PFA में ब्याज के मस्तिष्क टुकड़ा विसर्जित करें या 4 °C पर रात भर।
    4. एमटीएस अभिकर्मक को 4 घंटे के लिए स्लाइस पर प्रतिक्रिया करने की अनुमति दें, कुओं से स्लाइस को हटा दें और सभी स्थितियों के लिए 490 एनएम पर अवशोषण को मापें, जिसमें संदर्भ के रूप में कोई स्लाइस नहीं होने के साथ एक खाली कुएं भी शामिल हैं।
    5. ऊतक स्लाइस क्षेत्र के एक समारोह के रूप में रीडिंग की रिपोर्ट करें, जिसे डिजिटल कैलिपर शासक के साथ मापा जाता है।
  2. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तैयारी
    1. झिल्ली डालने की सतह से जुड़े मस्तिष्क के स्लाइस को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 10% फॉर्मेलिन में विसर्जित करें।
    2. एम्बेडिंग, प्रसंस्करण, अवरुद्ध और ऊतक की unstained स्लाइड उत्पन्न प्रदर्शन करें। H &E, Ki-67, गामा-H2AX, CC3, GFAP, GFP, DAPI के लिए दाग करने के लिए मानक immunohistochemistry धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करें

6. पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में ट्यूमर के विकिरण

  1. 6 Gy (310 kVp एक्स-रे) के साथ ट्यूमर को विकिरणित करें।
    नोट: 6 Gy की कुल खुराक प्राप्त करने के लिए दर्ज की गई इकाइयां R इकाइयों (विक्टोरिन इलेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके मापा जाता है) पर विचार करने के बाद 3522 इकाइयां हैं और थिंबल, वायु घनत्व और cGy / R के लिए सुधार जैसा कि पहले वर्णित18 था। एक्सपोजर समय 130.9 सेकंड है।
  2. 0.25 मिमी Cu +1 मिमी अल निस्पंदन जोड़ा निस्पंदन, 50 सेमी SSD, 125 cGy प्रति मिनट का उपयोग करें.
  3. एक प्राथमिक मानक के खिलाफ कैलिब्रेट किए गए इन-द-बीम आयनीकरण कक्ष द्वारा डॉसिमेट्री निष्पादित करें।
  4. आर्द्रता, तापमान और बैरोमेट्रिक दबाव के लिए दैनिक सुधार करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

एमडीए-एमबी-231बीआर-जीएफपी-लूसिफेरस कोशिकाओं को इंट्राक्रैनियल रूप से 4-6 सप्ताह पुराने एनयू / एनयू चूहों के दाहिने गोलार्ध में इंजेक्ट किया गया था जैसा कि ऊपर बताया गया है (चित्रा 1 ए) और 12-14 दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति दी गई थी, जिसके दौरान बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (चित्रा 1 बी) द्वारा ट्यूमर के विकास की निगरानी की गई थी। हमने 100,000 कैंसर कोशिकाओं को इंट्राक्रैनियल रूप से इंजेक्ट किया, जैसा कि अन्य समूहों19 द्वारा रिपोर्ट किया गया है, लेकिन 20,000 सेल20 के रूप में कम इंजेक्ट करना संभव है। मस्तिष्क स्लाइस पीढ़ी (चित्रा 1 सी) के बाद, जैसा कि ऊपर वर्णित है, स्लाइस को 24 घंटे इनक्यूबेशन के बाद बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के माध्यम से ट्यूमर की उपस्थिति निर्धारित करने के लिए आईवीआईएस पर चित्रित किया गया था। इसे दिन 0 के रूप में माना जाता है। ट्यूमर की वृद्धि की निगरानी बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नलिंग को हर 48 घंटे में परिमाणित करके की गई थी, जिसने 6 दिनों में प्रगतिशील विकास का संकेत दिया था (चित्रा 1 डी)। एच एंड ई धुंधला और जीएफपी-सकारात्मक प्रतिदीप्ति मस्तिष्क स्लाइस (चित्रा 1 डी) में ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि करते हैं। हम प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स के दाग का पता लगाने में भी सक्षम थे, ग्लियल फिब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन (जीएफएपी) के लिए धुंधला करके कल्पना की गई थी- सकारात्मक कोशिकाएं, कैंसर कोशिकाओं के क्लस्टर (जीएफपी-पॉजिटिव) (चित्रा 1 डी) के बीच दिखाई देती हैं, जैसा कि विवो21 में देखा जाता है। उन मॉडलों के विपरीत जो माउस मस्तिष्क स्लाइस22 में कैंसर कोशिकाओं को पूर्व विवो को संक्रमित करते हैं, इस मॉडल में प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स होते हैं जो बीसीबीएम ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का एक महत्वपूर्ण पहलू है। हम यह भी पता लगाते हैं कि बढ़ी हुई Ki-67 धुंधला कैंसर कोशिकाओं की पुष्टि अत्यधिक proliferative हैं (चित्रा 1 डी). इस प्रकार, मस्तिष्क पैरेन्काइमा के भीतर ट्यूमर कोशिकाएं जीवित रह सकती हैं और कई दिनों के लिए मस्तिष्क स्लाइस पूर्व विवो के भीतर फैल सकती हैं और इसमें ट्यूमर से जुड़े स्ट्रोमा भी शामिल हैं।

विकिरण (आईआर) उन रोगियों के लिए उपचार की पहली पंक्तियों में से एक है जो क्लिनिक में मस्तिष्क मेटास्टेसिस के साथ मौजूद हैं। यह समझने के लिए कि पूर्व विवो स्लाइस मॉडल इस तरह के उपचार का जवाब कैसे देगा, एमडीए-एमबी -231 बीआर-जीएफपी लूसिफेरस ट्यूमर वाले मस्तिष्क स्लाइस को 6जी विकिरण के संपर्क में लाया गया था। मस्तिष्क स्लाइस में ट्यूमर जो विकिरण के संपर्क में नहीं थे, ने पूर्व विवो को बढ़ाना जारी रखा, जबकि विकिरण के संपर्क में आने वाले ट्यूमर ने एक रुकी हुई वृद्धि दिखाई (चित्रा 2 ए)। एमडीए-एमबी-231बीआर-जीएफपी-लूसिफेरस ट्यूमर वाले मस्तिष्क स्लाइस को भी आईआर उपचार (चित्रा 2 बी) के बाद मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट में ट्यूमर के विकास की कल्पना करने के लिए दिन 4 के बाद 48 घंटे के लिए लाइव इमेजिंग के माध्यम से निगरानी की गई थी। बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग के अनुरूप, नियंत्रण कैंसर कोशिकाओं को तेजी से बढ़ते हुए देखा जाता है क्योंकि जीएफपी तीव्रता बढ़ जाती है और कई कोशिकाओं को मस्तिष्क पैरेन्काइमा (वीडियो 1) पर हमला करते हुए देखा जाता है। इसके विपरीत, 6Gy IR के साथ इलाज किए गए मस्तिष्क स्लाइस में कैंसर कोशिकाएं साइटोस्टेटिक हैं, और जीएफपी तीव्रता बनाए रखी जाती है (वीडियो 2)। एच एंड ई धुंधला आईआर-उपचारित कोशिकाओं में छोटे ट्यूमर की पुष्टि करता है (चित्रा 2 सी)। हमने बड़ी मल्टीन्यूक्लिएटेड कैंसर कोशिकाओं का भी पता लगाया और आईआर उपचारित कैंसर कोशिकाओं में डीएनए क्षति मार्कर जी-एच 2 एएक्स के दाग में वृद्धि हुई (चित्रा 2 सी)। आईआर उपचारित स्लाइस में एपोप्टोसिस में कोई वृद्धि का पता नहीं चला था, यह सुझाव देते हुए कि आईआर प्रसार को कम कर सकता है (चित्रा 2 सी)। फिर भी, प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स में धुंधला होने में वृद्धि का पता लगाया गया था, जिसे जीएफएपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए धुंधला करके कल्पना की गई थी, जो आईआर (चित्रा 2 सी) द्वारा इलाज किए गए कैंसर कोशिकाओं (जीएफपी-पॉजिटिव) के क्लस्टर के आसपास दिखाई देते हैं। इससे पता चलता है कि यह पूर्व विवो मॉडल यह समझने में भी उपयोगी हो सकता है कि कुछ ट्यूमर-स्ट्रोमा घटक उपचार का जवाब कैसे देते हैं। इसके अतिरिक्त, हमने ट्यूमर मुक्त मस्तिष्क माउस स्लाइस (चित्रा 2 डी) के आईआर उपचार के कारण किसी भी एपोप्टोसिस का पता नहीं लगाया।

हमने यह भी परीक्षण किया कि क्या मस्तिष्क स्लाइस में एमडीए-एमबी -231बीआर प्रीफॉर्म्ड ट्यूमर कीमोथेरेपी का जवाब देगा। एमडीए-एमबी -231बीआर ट्यूमर वाले मस्तिष्क स्लाइस को पैक्लिटेक्सल (चित्रा 3 ए) की विभिन्न सांद्रता के लिए इलाज किया गया था, जो स्तन कैंसर के रोगियों में उपयोग की जाने वाली एक कीमोथेरेपी दवाहै। उपचार ने बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नलिंग द्वारा परिमाणित ट्यूमर के आकार को कम कर दिया, लेकिन यह निषेध केवल उपचार के 10 वें दिन (चित्रा 3 ए) के बाद महत्वपूर्ण था। यह पैक्लिटेक्सल पूर्व विवो के लिए एक विषम प्रतिक्रिया के कारण हो सकता है। उदाहरण के लिए, अच्छी तरह से इलाज किए गए 40 एनएम में, ट्यूमर (शीर्ष) युक्त एक टुकड़ा कम हो जाता है जबकि उसी कुएं में ट्यूमर (नीचे) बढ़ रहा है। इसके अलावा, कुछ छोटे ट्यूमर पैक्लिटेक्सल के प्रति अधिक संवेदनशील लग रहे थे और कम बायोल्यूमिनेसेंस का प्रदर्शन करते थे, जबकि बड़े ट्यूमर दुर्दम्य लग रहे थे (चित्रा 3 ए, 80 एनएम उपचार)। कम ट्यूमर के आकार के अनुरूप, एपोप्टोसिस में वृद्धि नियंत्रण (चित्रा 3 बी) की तुलना में पैक्लिटेक्सल-उपचारित ट्यूमर कोशिकाओं में पाई गई थी। महत्वपूर्ण रूप से, एक व्यवहार्यता एमटीएस परख का उपयोग करते हुए Mews et al. से अनुकूलित के रूप में triton24 के उपयोग को शामिल करने के लिए, हमने परीक्षण किया कि अवरोधक उपचार ने मस्तिष्क ऊतक व्यवहार्यता (ट्यूमर की अनुपस्थिति में) को नहीं बदला (चित्रा 3 सी)। इस परिणाम के अनुरूप, हमने एपोप्टोसिस का पता नहीं लगाया और वृद्धि नहीं की, जैसा कि पैक्लिटेक्सल-उपचारित ट्यूमर-मुक्त माउस मस्तिष्क स्लाइस (चित्रा 3 डी) में क्लीव्ड 3 स्टेनिंग द्वारा मापा जाता है। इन आंकड़ों से पता चलता है कि यह मॉडल मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर बीसीबीएम की कीमोथेरेपी प्रतिक्रिया और प्रतिरोध को समझने में सहायक हो सकता है। मॉडल की प्रकृति के कारण, एक पूर्व विवो सेटिंग जो मस्तिष्क-ट्यूमर गुणों और बातचीत को संरक्षित करती है, इसकी अनिवार्यता कीमोथेरेपी अभिकर्मकों के लिए बीसीबीएम की प्रतिक्रिया के प्राथमिक सबूत प्रदान करने में खड़ी है और इस प्रकार उन दवाओं को खत्म करती है जो भविष्य से विवो परीक्षणों में इस मॉडल में ट्यूमर को सिकोड़ते नहीं हैं, जो अभी भी इस मॉडल में सकारात्मक परिणाम प्रदान करने वाली दवाओं के प्रभाव को मान्य करने में आवश्यक हैं, जीव में प्रणालीगत प्रतिक्रिया, और रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने की क्षमता।

Figure 1
चित्र 1. इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन, मस्तिष्क स्लाइस पीढ़ी, और बीसीबीएम विकास पूर्व विवो। (ए) एक स्टीरियोटैक्टिक उपकरण के तहत इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन के दौरान माउस का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) 4-6 सप्ताह पुराने एनयू / एनयू चूहों से ट्यूमर के बायोल्यूमिनेसेंट का पता लगाने की प्रतिनिधि छवियां 5 x 105 एमडीए-एमबी-231बीआर-जीएफपी-लूसिफेरस कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट की गई 12 दिन बाद इंजेक्शन। (सी) (बी) से पूर्व विवो माउस मस्तिष्क स्लाइस की पीढ़ी का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (डी) चूहों से व्युत्पन्न ऑर्गेनोटाइपिक मस्तिष्क स्लाइस में ट्यूमर की वृद्धि को दर्शाने वाली प्रतिनिधि छवियां 6 दिनों में बायोल्यूमिनेसेंस के माध्यम से पता लगाए गए एमडीए-एमबी-231बीआर-जीएफपी-लूसिफेरस कोशिकाओं के साथ इंट्राक्रैनियल रूप से इंजेक्ट की गई हैं। H &E & Ki-67, GFP (ट्यूमर कोशिकाओं) GFAP (प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स) DAPI (नाभिक) ट्यूमर के साथ एक प्रतिनिधि मस्तिष्क टुकड़ा के धुंधला (छवि आवर्धन 20x, स्केल बार: 200 μm). ट्यूमर की वृद्धि का परिमाणीकरण दिन 0 (एन = 3) के सापेक्ष बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल का प्रतिनिधित्व करता है। छात्र के टी-टेस्ट को एसईएम ± मतलब के रूप में रिपोर्ट किया गया, * पी < 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. विकिरण के साथ BCBM organotypic मस्तिष्क स्लाइस का उपचार. (ए) चूहों से व्युत्पन्न ऑर्गेनोटाइपिक मस्तिष्क स्लाइस में ट्यूमर की वृद्धि को दर्शाने वाली प्रतिनिधि छवियां इंट्राक्रैनियल रूप से एमडीए-एमबी-231बीआर-जीएफपी-लूसिफेरस कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट की गई हैं, जो बायोल्यूमिनेसेंस के माध्यम से पता लगाया गया है। ट्यूमर को कोई विकिरण या 6 Gy विकिरण (एक खुराक) के संपर्क में नहीं लाया जाता है और संकेतित दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति दी जाती है। संकेतित दिन में ट्यूमर की वृद्धि का परिमाणीकरण (नियंत्रण n = 3; 6Gy, n = 3)। छात्र के टी-टेस्ट को SEM के ± मतलब के रूप में रिपोर्ट किया गया है। * पी < 0.05। (बी) मस्तिष्क स्लाइस को हर 15 मिनट में 48 घंटे के लिए चित्रित किया गया था। गैर-विकिरणित और विकिरणित नमूनों के वीडियो की प्रतिनिधि छवियां ट्यूमर के विकास का संकेत देती हैं। (सी) स्लाइस, जैसा कि (ए) में इलाज किया गया था, एच एंड ई, जी-एच 2 एएक्स, डीएपीआई, क्लीव्ड-3 (सीसी 3), और जीएफपी स्टेनिंग (छवि आवर्धन 20x, स्केल बार: 200 μm) के लिए तय और परखा गया था। (डी) ट्यूमर मुक्त माउस मस्तिष्क स्लाइस (ए) के रूप में इलाज किया गया था और तय किया गया था और CC3 और DAPI (छवि आवर्धन 20x, स्केल बार: 200 μm) के लिए परखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. पैक्लिटेक्सल के साथ BCBM organotypic मस्तिष्क स्लाइस का उपचार। (ए) चूहों से व्युत्पन्न मस्तिष्क स्लाइस इंट्राक्रैनियल रूप से एमडीए-एमबी-231बीआर-जीएफपी-लूसिफेरस कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किए गए डीएमएसओ के साथ इलाज किया जाता है या 40 एनएम, 80 एनएम, 160 एनएम और 320 एनएम पर 10 दिनों के लिए पैक्लिटेक्सल के उपचार के बाद, हर 48 घंटे में माध्यम को फिर से भरना और संकेतित दिनों (छवि आवर्धन 20x, स्केल बार: 200 μm) के लिए बढ़ने की अनुमति दी जाती है। संकेतित दिन में ट्यूमर की वृद्धि का परिमाणीकरण (नियंत्रण एन = 6, पैक्लिटेक्सल एन = 3) (नीचे)। छात्र के टी-टेस्ट को SEM के ± मतलब के रूप में रिपोर्ट किया गया है। * पी < 0.05। (बी) पूर्व विवो मस्तिष्क टुकड़ा के रूप में (ए) में या तो डीएमएसओ या 320 एनएम पैक्लिटेक्सल के साथ इलाज किया गया था, जीएफपी, सीसी 3, और डीएपीआई (छवि आवर्धन 20x, स्केल बार: 200 μm) के लिए एकत्र, तय किया गया था, और परखा गया था। (सी) पूर्व विवो मस्तिष्क टुकड़ा के रूप में (ए) (ट्यूमर के बिना) में इलाज किया गया या तो DMSO या 320 nM पैक्लिटेक्सल के साथ दिन 10 पर एकत्र किया गया था और सेल व्यवहार्यता (एमटीएस परख) के लिए विश्लेषण किया गया था। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, स्लाइस को पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ इलाज किया गया था जो मस्तिष्क स्लाइस को अव्यवहार्य (एन = 3) छात्र के टी-टेस्ट को एसईएम ± माध्य के रूप में रिपोर्ट किया गया < था। (डी) पूर्व विवो मस्तिष्क टुकड़ा के रूप में (ए) (ट्यूमर के बिना) में इलाज किया गया या तो DMSO या 320 nM पैक्लिटेक्सल के साथ एकत्र किया गया था, तय किया गया था, और CC3 और DAPI (छवि आवर्धन 20x, स्केल बार: 200 μm) के लिए परखा गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1. BCBM organotypic मस्तिष्क स्लाइस की लाइव इमेजिंग. चूहों से व्युत्पन्न मस्तिष्क स्लाइस इंट्राक्रैनियल रूप से एमडीए-एमबी -231बीआर-जीएफपी-लूसिफेरस कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किए गए थे, उन्हें 4 दिनों के लिए बढ़ने की अनुमति दी गई थी और फिर 48 घंटे के लिए एक लाइव छवि माइक्रोस्कोप के नीचे रखा गया था जहां छवियों को हर 15 मिनट में लिया गया था और इमेजजे का उपयोग करके एक वीडियो बनाने के लिए संयुक्त किया गया था। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2. विकिरणित BCBM organotypic मस्तिष्क स्लाइस की लाइव इमेजिंग. चूहों से व्युत्पन्न मस्तिष्क स्लाइस इंट्राक्रैनियल रूप से एमडीए-एमबी-231बीआर-जीएफपी-लूसिफेरस कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किए गए स्लाइस को स्लाइस उत्पन्न होने के एक दिन बाद विकिरणित किया गया था और 4 दिन बाद 48 घंटे के लिए हर 15 मिनट में चित्रित किया गया था ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह अध्ययन मस्तिष्क ट्यूमर के लिए एक उपन्यास पूर्व विवो मस्तिष्क संस्कृति विधि स्थापित करता है। हम दिखाते हैं कि बीसीबीएम कोशिकाएं एमडीए-एमबी -231बीआर कोशिकाएं इंट्राक्रैनियल रूप से चूहों के मस्तिष्क में इंजेक्ट की जाती हैं और पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस में जीवित रह सकती हैं और बढ़ सकती हैं। अध्ययन ने इंट्राक्रैनियल रूप से इंजेक्ट किए गए U87MG ग्लियोब्लास्टोमा (GBM) कोशिकाओं का भी परीक्षण किया और यह भी पाया कि ये कैंसर कोशिकाएं जीवित रहती हैं और मस्तिष्क स्लाइस (डेटा नहीं दिखाया गया है) में बढ़ती हैं। हमारा मानना है कि इस मॉडल को बीसीबीएम और जीबीएम से परे अन्य कैंसर तक विस्तारित किया जा सकता है जो फेफड़ों के कैंसर और मेलेनोमा सहित मस्तिष्क को आसानी से मेटास्टेसाइज़ करते हैं। स्तन कैंसर मस्तिष्क ट्रॉफिक कोशिकाओं के इंट्राक्रैनियल इंजेक्शन को चुना गया था क्योंकि यह मस्तिष्क ट्यूमर उत्पन्न करने के लिए एक सरल और तेज़ तरीका है और इसे मस्तिष्क मैक्रोमेटास्टेसिस25 के लिए एक उपयुक्त मॉडल के रूप में माना जाता है। हालांकि, इसी तरह के ट्यूमर स्लाइस मॉडल को प्राथमिक वसा पैड में इंट्राकार्डियक इनोक्यूलेशन या ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन से विकसित किया जा सकता है। सीरम मुक्त माध्यम में वयस्क मस्तिष्क स्लाइस को बढ़ाकर और हर 48 घंटे में ताजा माध्यम की आपूर्ति करके संस्कृति की स्थिति का अनुकूलन ऊतक व्यवहार्यता और अस्तित्व और ट्यूमर के विकास का बेहतर संरक्षण प्रदान करता है। इनक्यूबेटर की हाइपरोक्सिक परिस्थितियों के तहत उपयोग किए जाने वाले 0.4 μm आवेषण पूर्व विवो मस्तिष्क स्लाइस के लिए संरचनात्मक समर्थन के रूप में कार्य करते हैं और रक्त की आपूर्ति की अनुपस्थिति में ऊतक और ट्यूमर कोशिकाओं को पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की कृत्रिम आपूर्ति के लिए एक कनेक्शन भी प्रदान करते हैं जो संस्कृति में कम से कम दस दिनों के लिए ऊतक व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए पर्याप्त प्रतीत होता है। लाइव इमेजिंग जीएफपी सिग्नल वृद्धि के एक समारोह के रूप में ट्यूमर के विकास का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, सॉफ़्टवेयर में अधिकतम जीएफपी चमक की एक सीमा है जो संकेत को संतृप्त करती है और मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट में एकल-सेल गतिशीलता की उचित पहचान की अनुमति नहीं देती है। माइक्रोस्कोपिक-सॉफ़्टवेयर सिग्नल डिटेक्शन के भविष्य के संशोधन से ट्यूमर के विकास के एक कार्य के रूप में जीएफपी सिग्नल में अस्थायी वृद्धि की सटीक रिपोर्ट करने की क्षमता में सुधार होगा।

यह मॉडल इम्यूनोहिस्टोकेमिकल स्टेनिंग के माध्यम से ट्यूमर के विकास और व्यवहार्यता की निगरानी के लिए भी अनुमति देता है। महत्वपूर्ण रूप से, यह मॉडल मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट में उगाए गए ट्यूमर के छोटे अणु अवरोधकों के साथ या बिना विकिरण संवेदनशीलता की प्रभावकारिता के तेजी से परीक्षण की अनुमति देगा। हम दिखाते हैं कि यह मॉडल विकिरण और कीमोथेरेपी के साथ दोनों उपचारों के लिए उपयुक्त है। इसके अलावा, इस प्रणाली का उपयोग प्रोटिओमिक्स, मेटाबोलोमिक्स और जीनोमिक्स जैसे ओमिक्स अध्ययनों के लिए किया जा सकता है ताकि कैंसर के विकास और मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर उपचार की प्रतिक्रिया को और अधिक समझा जा सके। इसके अलावा, एक छोटे जोखिम के बाद अवरोधकों को हटाने पर ट्यूमर के संभावित रिलैप्स का परीक्षण मस्तिष्क माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर कैंसर कोशिकाओं के लिए अद्वितीय कीमोरिस्टेंट मार्गों की आगे की समझ की अनुमति देगा।

संक्षेप में, हमने एक उपन्यास पूर्व विवो मस्तिष्क टुकड़ा विकसित किया है जो ट्यूमर ऊतक संवर्धन का एक उपन्यास विकसित किया है जो ट्यूमर के विकास और मस्तिष्क ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ बातचीत की निगरानी करेगा और मस्तिष्क में ट्यूमर के विकास को अवरुद्ध करने के लिए चिकित्सीय एजेंटों की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए कोई वित्तीय संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम जूलिया Farnan, Kayla ग्रीन, और Tiziana DeAngelis को उनकी तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को पेंसिल्वेनिया कॉमनवेल्थ रिसर्च एन्हांसमेंट ग्रांट प्रोग्राम (MJR, JGJ), UO1CA244303 (MJR), R01CA227479 (NLS), R00CA207855 (EJH), और W.W. Smith Charitable Trusts (EjH) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe, slip tip BD 309659
30 G1/2 Needles BD 305106
6-well plates Genessee 25-105
Automated microscope and LUMAVIEW software Etaluma LS720
B27 (GEM21) Gemini Bio-Products 400-160
Beaker 50 mL Fisher 10-210-685
Blunt sable paintbrush, Size #5/0 Electron Microscopy Sciences 66100-50
Bone Wax ModoMed DYNJBW25
Brain injection Syringe Hamilton Company 80430
CaCl2 Fisher Scientific BP510-250
Cleaved caspase 3 Antibody Cell Signaling 14220S
DAPI Invitrogen P36935
D-Luciferin Potassium Salt Perkin Elmer 122799
Double edge razor blade VWR 55411-060(95-0043)
Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm Fisher 09-805a (1001-042)
Fine sable paintbrush #2/0 Electron Microscopy Sciences 66100-20
Forceps Fine Science Tools 11251-20
Gamma-H2AX antibody Millipore 05-636
GFAP antibody Thermo Fisher 13-0300
GFP antibody Santa Cruz SC-9996
Glucose Sigma Aldrich G8270
Glutamine (200 mM) Corning cellgrow 25-005-Cl
H&E and KI-67 Jefferson Core Facility Pathology staining
Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits Amazon YCQ2851920086082DJ
HEPES, free acid Fisher Scientific BP299-1
Just for mice Stereotaxic Frame Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). 72-6049, 72-6044
KCl Fisher Scientific S271-10
Large surgical scissors Fine Science Tools 14001-18
MDA-MB-231BR cells Kindly provided by Dr. Patricia Steeg Ref 14
MgCl2·6H2O Fisher Scientific M33-500
Mice imaging device Perkin Elmer IVIS 200 system
Mice imaging software Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). Living Image Software
Microplate Reader Tecan Spark
Mounting solution Invitrogen P36935
MTS reagent Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution (Cat:G3582)
N2 supplement Life Technologies 17502-048
Neurobasal medium Life Technologies 21103049
Nu/Nu athymic mice Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)
Paraformaldehyde Affymetrix 19943
Pen/Strep Life Technologies 145140-122
Polypropylene Suture Medex supply ETH-8556H
Povidone Iodine Swab sticks DME Supply USA Cat: 689286X
Scalpel blade #11 (pk of 100) Fine Science Tools 10011-00
Scalpel handle #3 Fine Science Tools 10003-12
Sodium Pyruvate Sigma Aldrich S8636
Spatula/probe Fine Science Tools 10090-13
SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) VWR 55411-060
Sucrose Amresco 57-50-1
Surgical Scalpel Exelint International D29702
Tissue Chopper Brinkman (McIlwain type)
Tissue culture inserts Millipore PICMORG50 or PICM03050
X-ray machine Precision 250 kVp

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
  2. Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
  3. Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  4. Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
  5. Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
  6. Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
  7. van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
  8. Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
  9. Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
  10. Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
  11. Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
  12. Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
  13. Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
  14. Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
  15. Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
  16. Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
  17. Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
  18. Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
  19. Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
  20. Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
  21. Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
  22. Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
  23. Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
  24. Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
  25. Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).

Tags

कैंसर अनुसंधान अंक 175 पूर्व विवो मॉडल मस्तिष्क ट्यूमर intracranial ट्यूमर इंजेक्शन स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टेसिस
स्तन कैंसर मस्तिष्क मेटास्टैटिक ट्यूमर विकास का अध्ययन और लक्ष्य करने के लिए एक <em>पूर्व वीवो</em> मस्तिष्क स्लाइस मॉडल
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ciraku, L., Moeller, R. A., Esquea,… More

Ciraku, L., Moeller, R. A., Esquea, E. M., Gocal, W. A., Hartsough, E. J., Simone, N. L., Jackson, J. G., Reginato, M. J. An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth. J. Vis. Exp. (175), e62617, doi:10.3791/62617 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter