Summary
乳がん脳転移細胞の薬物および放射線応答を器官型脳スライスモデルでリアルタイムに測定するためのプロトコルを紹介します。本方法は、脳微小環境界面内での乳癌からの脳転移に対する様々な治療の治療効果を ex vivo 方式で調査するための定量的アッセイを提供する。
Abstract
脳転移は、これらの腫瘍が治療が困難であり、臨床転帰不良と関連しているため、女性にとって乳癌の重篤な結果である。乳癌脳転移(BCBM)増殖の前臨床マウスモデルは有用であるが高価であり、脳実質内での生細胞および腫瘍細胞浸潤を追跡することは困難である。ここに提示されるのは、頭蓋内注射された乳癌脳シーククローンサブラインを含む異種移植マウスからの ex vivo 脳スライス培養のためのプロトコールである。 MDA-MB-231BR ルシフェラーゼタグ付き細胞をNu/Nu雌マウスの脳に頭蓋内注射し、腫瘍形成後、脳を単離、スライス、 エクスビボで培養した。腫瘍スライスを画像化して、ルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞を同定し、脳実質におけるそれらの増殖および浸潤を最大10日間モニターした。さらに、このプロトコルは、電離放射線または化学療法による治療後の腫瘍細胞の増殖および浸潤挙動を画像化するためのタイムラプス顕微鏡の使用を記載している。治療に対する腫瘍細胞の応答は、ライブイメージング顕微鏡、生物発光強度の測定、およびBCBM細胞を含む脳スライスの組織学の実施によって視覚化することができる。したがって、この エキソビボ スライスモデルは、脳微小環境内の個々の患者の乳癌脳転移増殖を標的とするようにパーソナライズされた薬物を同定するために、新規治療薬を単独で、または放射線と組み合わせて迅速に試験するための有用なプラットフォームであり得る。
Introduction
乳がんの脳転移(BCBM)は、原発性乳房腫瘍から脳に細胞が広がると発症します。乳がんは、肺がんに次いで脳転移の2番目に頻繁な原因であり、転移は患者の10〜16%で起こる1。残念なことに、患者の>80%が脳転移診断後1年以内に死亡し、神経機能障害のために生活の質が損なわれているため、脳転移は依然として不治の病のままです2。より効果的な治療選択肢を特定することが急務です。単層二次元または三次元培養モデルは、実験室で治療薬を試験する際に最も一般的に使用される方法である。しかし、それらは、腫瘍表現型および増殖の主要な要因である複雑なBCBM微小環境を模倣していない。これらのモデルは有用であるが、腫瘍の複雑な間質相互作用、固有の代謝要求、および腫瘍の不均一性を捉えていない3。腫瘍間質相互作用と微小環境の不均一性をより忠実に再現するために、我々のグループと他のグループは、患者由来の腫瘍細胞(原発性または転移性)または癌細胞株を用いて有機型脳転移「スライス」培養物を生成し始めている4,5,6。古典的なin vitroシステムと比較して、この短期のex vivoモデルは、大型動物コホートにおける前臨床評価の前に新しい治療法をスクリーニングするためのより関連性の高い条件を提供する可能性がある。
エクスビボモデルは、主に様々な癌の成功した治療法の同定のために構築され、首尾よく使用されてきた。評価には数日が必要であり、さらに患者固有の薬物スクリーニングに合わせて調整することができます。例えば、ヒト膀胱および前立腺癌エクスビボ組織は、ドセタキセルおよびゲムシタビンの用量依存的な抗腫瘍応答を示している7。同様の結腸直腸癌のエクスビボ組織が、化学療法薬オキサリプラチン、セツキシマブ、およびペムブロリズマブ8をスクリーニングするために開発された。この用途は、間質環境と膵管腺癌の遺伝子型および表現型特性との間の本質的な相互作用を考慮して、膵臓癌において広く使用されている9,10。さらに、このような有機型モデルが、頭部、頸部、胃、および乳房腫瘍における同様のスクリーニングのために開発されている11、12。
ここで、異種移植乳癌脳転移性腫瘍細胞のエクスビボ脳スライスモデルをそれらの微小環境において生成させている。マウスに乳癌脳転移性脳栄養性MDA-MB-231BR細胞13を大脳皮質頭頂葉-TNBC転移14、15の共通部位に頭蓋内注射し、腫瘍を発症させた。脳スライスを、これらの異種移植動物から生成し、16、17に記載のように器官型培養物としてエクスビボで維持した。この新規なエクスビボモデルは、脳実質内のBCBM細胞の成長の分析を可能にし、脳微小環境内の腫瘍細胞に対する治療薬および放射線効果の試験に使用することができる。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
このプロトコルは、ドレクセル大学医学部施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、動物ケアガイドラインに従っています。Nu/Nu無胸腺雌マウス(6〜8週齢)を本研究に使用した。
1. 腫瘍細胞の頭蓋内注射
- 滅菌インジケータを含む滅菌パウチで、オートクレーブの乾燥サイクル下ですべての機器(ピンセット、はさみ、縫合はさみ、ハンドドリル)を滅菌します。複数の動物に対して手術を行う場合は、加熱ビーズ滅菌器(最大3倍)を使用して動物間のツールを滅菌してください。
- ユーザーの動物ケアプロトコル(例えば、イソフルラン(誘導用4%、維持1〜2%)に従ってマウスを麻酔し、手術開始前に鎮痛(皮下、0.1mg / kgブプレノルフィンSR-LABの0.1mL)を投与する。つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。
- マウスを定位フレームに入れ、標準的なイヤーバーを使用して頭を固定します(図1A)。眼科用軟膏を目に塗布する。
- 切開前にヨウ素綿棒と70%エタノールを繰り返し交互に塗布(3倍)して、頭部の表面を滅菌する。
- 外科用メスを使用して、マウスの脳を2つの対称的な半分に分割して頭蓋骨を露出させる虚線に対してわずかに斜めの角度で皮膚を通る1cmの正中線切開を行う。綿棒で血を拭きます。
- 皮膚を横方向にそらして注射部位を露出させる:右側2mm、ブレグマ(+2平側(+2ML)、+1吻側/尾側(+1RC)を参照して前方に1mm)。
- バービット(0.73 mm)を使用して頭蓋骨+2ML、+1RCをブレグマに貫通し、わずかな圧力とねじれ運動を使用して穴を開けます。
- 脳注射器を使用して、最初にシリンジを脳に深さ3.5mm挿入することにより、滅菌1x PBSに100,000個のMDA-MB-231BR(GFP-ルシフェラーゼを安定発現する)細胞/μL溶液5 μLを注入する。
- シリンジを2分間落ち着かせます。それを約1mm引き上げ、2分後、体積の前半をゆっくりと注入する。
- 残りを注入する前にさらに2分間待ってから、最終注射の3分後にシリンジをゆっくりと引きます。
注:低速注射は、体積が脳組織によく吸収され、シリンジを引っ張った後に漏れを生じさせないようにするために経験的であり、癌細胞が意図した部位の外側に増殖する可能性がある。 - 頭蓋骨の注射部位に骨ワックスを塗布し、ポリプロピレン縫合糸を使用して組織を縫合する。マウスは麻酔の除去後5分以内に回復する。
- 手術直後の行動を約10分間、3時間後、翌日に監視し、生理食塩水注射、柔らかい食べ物などの特別な治療が迅速な回復に役立つかどうかを判断します。
- イメージングシステム上の生物発光イメージングを介して腫瘍の成長を監視します。
- このためには、まず、イメージングシステムの酸素とイソフルランをオンにします。両方をイメージングボックスの外側の別々のチャンバに分配できるようにします。
- 次に、ソフトウェアの電源を入れ、機器を初期化し、マウス本体全体を視覚化してキャプチャするための適切なオプションを選択します。
- イソフルランでマウスを別々のチャンバーに入れ、つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。マウスに200 μLの30 mg/mLルシフェリンを腹腔内に注射する。
- マウスの胃を、酸素とイソフルランを供給した画像チャンバーの鼻先に移す。チャンバーをロックし、2分間の露光を選択してイメージングを開始します。
- ソフトウェアのROI(関心領域)ツールを使用して、腫瘍の生物発光シグナルを定量化します。
- 腫瘍のサイズを分析するには、円の形状ツールを選択し、腫瘍の形状とサイズの周りに合わせます。ROIを測定し、合計測定値を報告します。
- 脳スライスを生成する前に、固形腫瘍の増殖を12〜14日間(またはルシフェラーゼが約7.0 x106 単位に達するまで)許可する(図1B)。
注:注射する細胞の数を増やすと、腫瘍の増殖が速くなります。したがって、脳スライスの生成は12日より早く起こり得る。一方、腫瘍が大きくなると、14日間増殖させるとGFP+スライスが増えます。14日後、マウスの健康は急速に悪化し始める。したがって、動物の健康モニタリングは、10日間の時点以降に1日1回に増加し、痛みおよび/または不快感の徴候を示すマウスはスライスを生成するために使用されるべきである。
2.脳スライスを生成する
メモ: 脳の分離後に、滅菌層流フードで手順を実行します。典型的には、MDA-MB-231BR細胞を注射した1匹のマウスから腫瘍細胞(ルシフェラーゼシグナル)を含む35〜40個の個々のスライスを生成することが可能である(図1C)。
- オートクレーブ内のすべての手術器具を滅菌する。滅菌層流フードに組織スライサーを置き、すべてのツールと器具を70%エタノールで洗浄します。
- 頭蓋内MDA-MB-231BR細胞注射後12〜14日後に、1.2に記載されているように、ユーザーの動物ケアプロトコルに従ってマウスを麻酔する。つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。
- 280 mM スクロース、5 mM KCl、2 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、20 mM グルコース、10 mM HEPES、5 mM Na+-アスコルビン酸塩、3 mM チオ尿素、2 mM Na+、29 mM ピルビン酸で構成される氷冷(4°C)スクロース-ACSFに脳を素早く(45秒以内に)除去して配置する。pH=7.3。
- 鋭利で滅菌されたメスまたはカミソリの刃を使用して、脳の底部を含むすべての側面から腫瘍を含まない脳の余分な部分を切り取ります。
- 脳の形を完璧でない立方体に持ってきて、スライスを容易にするために60mmの皿蓋の上のACSF濡れろ紙の上に平らに座ります。
注:腫瘍が成長した可能性が低い脳の余分な組織は、スライス前に除去され、主にGFP +スライスを生成し、器具の表面上で安定し、スライスによって引き起こされる振動によって動揺しない脳の形状を作り出す。 - プリウェット(ACSF付き)ろ紙を数枚切断プラットフォーム上に置き、ブロックされた組織をこの上に置きます。
- 付属の定規で装置のカットサイズを2または2.5単位に設定して、組織を200〜250μmのセクションにスライスします。
メモ: 最大 350 μm または 100 μm の薄さのスライスは実行可能です。<200μmのスライスの場合は、ビブラトームまたは圧縮トームを使用します。 - ペイントブラシ(クロテン)を使用して、脳のスライスをスクロースACSFを含む皿に移し、27G針を使用して光学顕微鏡下でスライスを分離する。
- 蛍光顕微鏡下でGFP陽性スライスを同定し、滅菌1mLの切断ピペット(広い開口部)を使用して、2〜3mLの成人スライス培地(Neurobasal medium A、2% B12サプリメント、1%N2サプリメント、1%グルタミン、0.5%グルコース、10U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン)を含む新しい60mmディッシュに移す。
注:脳表面上に増殖する腫瘍細胞を含む脳スライス(おそらく注射細胞漏出などによる)は除外される。 - 3~5枚のスライスを、各30 mm、0.4 μmの孔径の組織培養インサート上に、互いに成長できない距離で6ウェルプレートに移す。
- P1000ピペットを用いてインサートの表面から過剰の培地を取り出し、各インサートの下に1mLの成体マウススライス培地を加え、スライスする前にインキュベーター内の培地を平衡化します。
- イメージング前に、組織を37°C、5%CO2、 および95%湿度で24時間インキュベートする。
3. スライスのIVISイメージング
注: ルシフェラーゼおよび阻害剤の添加手順は、滅菌層流フード内で行います。
- インサートの下の培地に30 mg/mLルシフェリン溶液5 μLをピペットで入れ、インサートを鉗子で持ち上げ、ウェル内の培地にルシフェリンを添加した後、ウェルに戻します。
- 固定カメラの下の機器の撮像チャンバ内に蓋付きの6ウェルプレートを置き、チャンバドアをロックします。
- ソフトウェアを開き、計測器を初期化します。
- 画像ごとに 1 つのウェルのみの視覚化とキャプチャを可能にするカメラ設定を選択します。ステージを上に移動し(視野5cm)、カメラの真下に撮影する必要がある井戸を置きます。
- イメージング時間を、腫瘍が放出するルシフェラーゼの強度に応じて最も適切なものに設定します(10秒から5分まで変化します)。まず10秒に設定し、信号が低い場合は増やしますが、実験が終了するまですべての時点と条件について一貫性を保ちます(図1D)。
- ROIツール(円形状ツール)を使用し、腫瘍の形状と大きさの周りにそれを合わせ、ROIを測定し、スライス上の各腫瘍の生物発光シグナルを定量化するために総測定値を報告する。
- プレートを滅菌層流フードに戻し、鉗子を使用してインサートをウェルからわずかに持ち上げます。
- 培地を吸引し、1mLの新鮮な培地と交換し、インサートをウェルに戻す。
- スライスをインヒビター、代謝産物などの各種化合物で処理する実験では、1.5 mLチューブ内の1.2 mLの脳スライス培地に適切な濃度の試薬を調製し、スライスを含むウェルに1 mLを移します。
- 研究期間中、このプロセスを48時間ごとに繰り返します。
4. 生体外 脳スライスにおける腫瘍増殖のライブイメージング
注: インサートには、ライブイメージング中に培地を追加することはできないため、実験の長さを持続させるのに十分な培地 (1.5 mL) をインサートに供給してください。
- 6ウェルプレートをインキュベーター内の自動顕微鏡プレートホルダー(37°C、5%CO2、 湿度95%)の上に置きます。
- ソフトウェアを開き、最初の象限の明視野をオンにして、スライスを表示するために必要な露出を調整します。スライスの位置(座標「xy」)を見つけるには、2番目の象限で「xy」でナビゲートして、顕微鏡の座標「xyz」を制御します。
- この実験に使用したラボウェアとして6ウェルプレートを選択します。ROIマップエディタを選択し、新しいROIを選択してその位置を登録し、そのROIを追加して保存する。
- 他の井戸の他のすべての関心領域についても同じ手順を繰り返します。すべてのROIを追加したら、すべてのROIを保存します。
- [プロトコル]で、[既存のクリア]を選択し、[集録]で[タイムラプス]を選択してから、目的のチャネル(この場合はGFP)を選択します。
- フォーカス設定で オート フォーカスをオフにし、すべてのスライスの適切な フォーカス に手動で調整します。最後に、 明視野強度 と 蛍光チャンネルの励起 と 露光時間を 適切なレベルに調整します。
- 48 時間の間、15 分ごとに画像を取得するようにプロトコルを設定します。
- プロトコルを保存して実行します。実験の終了時に、保存されたファイルには、ROIごとにキャプチャされた明視野画像とGFP画像の両方が含まれます。
- ビデオ内の画像を組み合わせるには、関心のあるすべての画像の名前を同じ名前に変更し、その後に2進数を付けて、キャプチャされた順序で整理します(ROI1(1)、RO1(2) など)。
- ImageJを開き、[ファイル]をクリックして画像 >インポートし、画像シーケンス>インポートします。リストに表示されるファイル名を選択し、ビデオ用に選択されたファイルを識別するために表示される [ファイル名を含む] ボックスにファイル名の内容を書き込みます。
- 結合された画像を 「ファイル」>「名前を付けて保存」> AVI に保存します。
5. MTSアッセイと生体外 脳組織の免疫組織化学
- MTSアッセイ
- 組織の縁に沿って各スライスの下の組織培養膜を切断することによってスライスを切除し、まだ膜に付着したままの組織を96ウェルプレートに移す。
- 培養培地および0.01%トリトン(1x)と1:5の比率で混合したMTS試薬を、各ウェルに120μLの総容量で組織に溶液を浸透させるために加える。
- 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を、脳スライスを生存不能にするための薬剤として使用し、したがって、この実験のための陽性対照とする。MTSアッセイを進める前に、目的の脳スライスをRT(室温)で1時間、または4°Cで一晩浸漬する。
- MTS試薬をスライスに4時間反応させ、ウェルからスライスを取り出し、スライスを基準として持たない空のウェルを含むすべての条件について490nmでの吸光度を測定します。
- デジタルノギス定規で測定した組織スライス面積の関数として測定値を報告します。
- 免疫組織化学製剤
- メンブレンインサート表面に付着した脳スライスを10%ホルマリンに4°Cで一晩浸漬する。
- 埋め込み、処理、ブロッキングを行い、組織の染色されていないスライドを生成します。標準的な免疫組織化学染色プロトコルを使用して、H&E、Ki-67、γ-H2AX、CC3、GFAP、GFP、DAPI を染色する
6. 生体外 脳スライスにおける腫瘍の照射
- 腫瘍に6Gy(310kVpのX線)を照射する。
注:6 Gyの総線量を得るために入力された単位は、前述のようにR単位(Victoreen電気計を使用して測定)とシンブル、空気密度、およびcGy/Rの補正を考慮した後、3522単位です18。露光時間は130.9秒です。 - 0.25 mm Cu + 1 mm Al添加ろ過、50 cm SSD、125 cGy/分を使用してください。
- 一次標準に対して較正されたインザビームイオン化チャンバによって線量測定を行う。
- 湿度、温度、気圧を毎日修正します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を、上記で説明したように4~6週齢のNu/Nuマウスの右半球に頭蓋内注射し(図1A)、12~14日間増殖させ、その間、腫瘍の成長を生物発光イメージングによってモニターした(図1B)。他のグループ19で報告されているように、100,000個のがん細胞を頭蓋内に注射しましたが、20,000個の細胞20個まで注射することは可能です。脳スライス生成(図1C)に続いて、上述のように、スライスをIVIS上で画像化し、24時間インキュベーション後に生物発光イメージングを介して腫瘍存在を決定した。これは 0 日目と見なされます。腫瘍増殖は、48時間ごとに生物発光シグナル伝達を定量化することによってモニターされ、これは6日間にわたる漸進的な増殖を示した(図1D)。H&E染色およびGFP陽性蛍光は、脳スライスにおける腫瘍の存在を確認する(図1D)。我々はまた、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)陽性細胞の染色によって可視化された反応性アストロサイトの染色を検出することもできたが、これは癌細胞のクラスター間(GFP陽性)(図1D)で見られるものと類似している21。癌細胞をマウス脳スライス22にエクスビボで接種するモデルとは異なり、このモデルはBCBM腫瘍微小環境の重要な側面である反応性アストロサイトを含む。また、Ki-67染色の増加も検出し、がん細胞が高度に増殖性であることを確認しました(図1D)。したがって、脳実質内の腫瘍細胞は、数日間、脳スライスエクスビボで生存および増殖することができ、また、腫瘍関連間質を含む。
照射(IR)は、診療所で脳転移を呈する患者のための治療の最初の行の1つです。 エクスビボ スライスモデルがこのような治療にどのように反応するかを理解するために、ルシフェラーゼ腫瘍のMDA-MB-231BR-GFPを含む脳スライスを6Gy照射に曝露した。照射に曝されなかった脳スライスの腫瘍は、 エクスビボで増殖し続けたが、放射線照射に曝された腫瘍は、停滞した成長を示した(図2A)。MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ腫瘍を含む脳スライスも、IR治療後の脳微小環境における腫瘍増殖を可視化するために、4日目から48時間ライブイメージングを介してモニターされた(図2B)。生物発光イメージングと一致して、対照癌細胞はGFP強度が増加するにつれて急速に成長し、多くの細胞が脳実質に侵入することが見られる(ビデオ1)。対照的に、6GyIRで処理された脳スライスの癌細胞は細胞増殖抑制性であり、GFP強度は維持されている(ビデオ2)。H&E染色は、IR処理細胞におけるより小さな腫瘍を確認する(図2C)。また、IR処理したがん細胞において、大きな多核がん細胞とDNA損傷マーカーg-H2AXの染色の増加も検出しました(図2C)。IR処理したスライスではアポトーシスの増加は検出されず、IRが増殖を減少させ得ることが示唆された(図2C)。それにもかかわらず、反応性アストロサイトの染色の増加が検出され、IRによって処理された癌細胞(GFP陽性)のクラスターの周囲に見えるGFAP陽性細胞の染色によって可視化された(図2C)。このことは、この エクスビボ モデルが、いくつかの腫瘍間質成分が治療にどのように反応するかを理解する上でも有用であり得ることを示唆している。さらに、腫瘍のない脳マウススライスのIR処理によって引き起こされるアポトーシスは検出されなかった(図2D)。
また、脳スライス中のMDA-MB-231BR既成腫瘍が化学療法に反応するかどうかも試験した。MDA−MB−231BR腫瘍を含む脳スライスを、乳癌患者において使用される化学療法薬であるパクリタキセルの異なる濃度(図3A)に処置した23。治療は、生物発光シグナル伝達によって定量化されるように腫瘍のサイズを減少させたが、この阻害は、治療の10日目にしか有意ではなかった(図3A)。これは、 エクスビボでのパクリタキセルに対する不均一な応答に起因し得る。例えば、40nM処理ウェルでは、腫瘍(上)を含む1つのスライスが減少し、同じウェル内の腫瘍(下)は成長しているように見える。また、小さな腫瘍のいくつかはパクリタキセルに対してより感受性があり、生物発光が減少したように見えたが、大きな腫瘍は難治性に見えた(図3A、80nM治療)。腫瘍サイズの減少と一致して、対照と比較してパクリタキセル処理腫瘍細胞においてアポトーシスの増加が検出された(図3B)。重要なことに、Triton24の使用を組み込むためにMewsらから適合した生存率MTSアッセイを用いて、我々は、インヒビター処置が(腫瘍の非存在下で)脳組織の生存率を変化させなかったことを試験した(図3C)。この結果と一致して、我々は、パクリタキセル処置腫瘍を含まないマウス脳スライスにおける切断カスパーゼ3染色によって測定されたアポトーシスを検出および増加させなかった(図3D)。これらのデータは、このモデルが脳微小環境におけるBCBMの化学療法応答および耐性を理解するのに役立つ可能性があることを示唆している。脳腫瘍特性および相互作用を保存する エクスビボ 設定であるモデルの性質上、その本質性は、化学療法試薬に対するBCBMの応答の主要な証拠を提供することに立っており、したがって、このモデルにおいて腫瘍を縮小しない薬物を将来の in vivo 試験から排除し、このモデルにおいて肯定的な結果をもたらす薬物の効果を検証する上で依然として不可欠である。 生物における全身反応、および血液脳関門を通過する能力。
図1.頭蓋内注射、脳スライス生成、およびエクスビボでのBCBM増殖が挙げられる。(a)定位器具下での頭蓋内注射時のマウスの模式図。(B)注射後12日目に5 x 105 MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を注射した4~6週齢のNu/Nuマウスからの腫瘍の生物発光検出の代表的な画像。(C)(B)からのエキソビボマウス脳スライスの生成の模式図。(d)MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を頭蓋内注射したマウス由来の有機型脳スライスにおける腫瘍増殖を6日間にわたって生物発光を介して検出した代表的な画像。H&E & Ki−67、GFP(腫瘍細胞)GFAP(反応性アストロサイト)DAPI(核)染色、腫瘍を有する代表的な脳スライス(画像倍率20倍、スケールバー:200μm)。腫瘍増殖の定量化は、0日目(n=3)に対する生物発光シグナルを表す。スチューデントのt検定はSEM±平均として報告され、*p<0.05であった。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2.放射線によるBCBM有機型脳スライスの治療。 (a)生物発光により検出されたMDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を頭蓋内注射したマウス由来の有機型脳スライスにおける腫瘍増殖を描写した代表的な画像。腫瘍は、無照射または6Gy照射(1回投与)に曝露され、指示された数日間増殖させられる。示された日における腫瘍増殖の定量化(対照. n = 3; 6Gy, n=3)。スチューデントのt検定はSEM±平均として報告された* p <0.05であった。(B)脳スライスを15分ごとに48時間画像化した。非照射および照射されたサンプルのビデオの代表的な画像は、腫瘍の増殖を示す。(C)(A)で処理したように、スライスを固定し、H&E、g−H2AX、DAPI、切断−カスパーゼ−3(CC3)、およびGFP染色についてアッセイした(画像倍率20倍、スケールバー:200μm)。(d)無腫瘍マウス脳スライスを(A)のように処理し、CC3およびDAPIについて固定およびアッセイした(画像倍率20x、スケールバー:200μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3.パクリタキセルによるBCBM器官型脳スライスの治療。 (a)MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼをDMSOで処理した細胞を頭蓋内注射したマウス由来の脳スライスを、パクリタキセルを40nM、80nM、160nMおよび320nMで10日間処理した後、48時間ごとに培地を補充し、指示された日間増殖させた(画像倍率20倍、スケールバー:200μm)。示された日(対照n=6、パクリタキセルn=3)における腫瘍増殖の定量(下段)。スチューデントのt検定はSEM±平均として報告された* p <0.05であった。(B)(A)で処理した Exvivo 脳スライスをDMSOまたは320nMパクリタキセルのいずれかで収集、固定し、GFP、CC3、およびDAPIについてアッセイした(画像倍率20倍、スケールバー:200μm)。(C)(A)(腫瘍なし)で処理した Exvivo 脳スライスをDMSOまたは320nMパクリタキセルのいずれかで10日目に回収し、細胞生存率について分析した(MTSアッセイ)。陽性対照として、脳スライスを生存不能にするパラホルムアルデヒド(PFA)で処理したスライス(n=3)を平均±として報告したスチューデントのt検定SEM. * p<0.05。(d)(A)で処理した Exvivo 脳スライス(腫瘍なし)をDMSOまたは320nMパクリタキセルのいずれかで収集し、固定し、CC3およびDAPIについてアッセイした(画像倍率20倍、スケールバー:200μm)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ 1.BCBM有機型脳スライスのライブイメージング。 MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を頭蓋内注射したマウス由来の脳スライスを4日間増殖させた後、ライブ画像顕微鏡下に48時間置き、15分毎に画像を撮影して組み合わせ、ImageJを用いてビデオを作成した。 このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ 2.照射されたBCBM有機型脳スライスのライブイメージング。 MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を頭蓋内注射したマウス由来の脳スライスを、スライスが作製された翌日に照射し、4日後に15分毎に48時間画像化しました 。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
この研究は、外植異種移植片脳腫瘍のための新規なex vivo 脳培養方法を確立する。我々は、マウスの脳に頭蓋内注射されたBCBM細胞MDA-MB-231BR細胞が 、エクスビボ 脳スライス中で生存および増殖し得ることを示す。この研究はまた、頭蓋内注射されたU87MG膠芽腫(GBM)細胞を試験し、これらの癌細胞が脳スライスで生き残り、増殖することも見出した(データは示されていない)。このモデルは、BCBMやGBMを超えて、肺がんや黒色腫など、脳に容易に転移する他のがんにも拡張できると考えています。乳癌脳栄養細胞の頭蓋内注射は、脳腫瘍を発生させるための単純かつ迅速な方法であり、脳大転移の適切なモデルとみなされるため、選択された25。しかしながら、同様の腫瘍スライスモデルは、心臓内接種または原発性脂肪パッドへの同所性注射のいずれかから開発することができる。無血清培地中で成体脳スライスを増殖させ、48時間ごとに新鮮な培地を供給することによる培養条件の最適化は、組織生存率および腫瘍の生存および増殖のより良い保存をもたらした。インキュベーターの高酸素条件下で利用される0.4μmのインサートは、 エクスビボ 脳スライスの構造的サポートとして機能し、また、培養中に少なくとも10日間組織生存率を維持するのに適切と思われる血液供給がない場合、組織および腫瘍細胞への栄養素および酸素の人工供給への接続を提供する。ライブイメージングは、GFPシグナル増加の関数として腫瘍増殖を表す。しかし、このソフトウェアには、信号を飽和させる最大GFP光度の閾値があり、脳微小環境における単一細胞運動性の適切な同定を可能にしない。顕微鏡ソフトウェアシグナル検出の将来の修正は、腫瘍増殖の関数としてGFPシグナルの時間的増加を正確に報告する能力を改善するであろう。
このモデルはまた、免疫組織化学染色による腫瘍増殖および生存率のモニタリングを可能にする。重要なことに、このモデルは、脳微小環境で増殖した腫瘍の小分子阻害剤の有無にかかわらず、放射線感受性の有効性の迅速な試験を可能にする。我々は、このモデルが放射線による治療と化学療法の両方に対応していることを示している。さらに、このシステムは、プロテオミクス、メタボロミクス、ゲノミクスなどのオミクス研究に利用され、がんの増殖および脳微小環境内の治療に対する応答をさらに理解することができる。さらに、短い曝露後に阻害剤を除去した際の腫瘍の潜在的な再発を試験することは、脳微小環境内の癌細胞に特有の化学耐性経路のさらなる理解を可能にするであろう。
要約すると、我々は、腫瘍増殖および脳腫瘍微小環境との相互作用を監視し、脳内の腫瘍増殖をブロックする治療薬の迅速なスクリーニングのために、異種移植片腫瘍組織培養の新規 ex vivo 脳スライスを開発した。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は宣言する財政的な矛盾はありません。
Acknowledgments
ジュリア・ファーナン、ケイラ・グリーン、ティツィアナ・デアンジェリスの技術支援に感謝します。この研究は、ペンシルベニア州ユニバーサル研究強化助成金プログラム(MJR、JGJ)、UO1CA244303(MJR)、R01CA227479(NLS)、R00CA207855(EJH)、およびW.W. Smith Charitable Trusts(EjH)によって部分的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G1/2 Needles | BD | 305106 | |
| 6-well plates | Genessee | 25-105 | |
| Automated microscope and LUMAVIEW software | Etaluma | LS720 | |
| B27 (GEM21) | Gemini Bio-Products | 400-160 | |
| Beaker 50 mL | Fisher | 10-210-685 | |
| Blunt sable paintbrush, Size #5/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-50 | |
| Bone Wax | ModoMed | DYNJBW25 | |
| Brain injection Syringe | Hamilton Company | 80430 | |
| CaCl2 | Fisher Scientific | BP510-250 | |
| Cleaved caspase 3 Antibody | Cell Signaling | 14220S | |
| DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| Double edge razor blade | VWR | 55411-060(95-0043) | |
| Filter Paper (#1), quantitative circles, 4.25 cm | Fisher | 09-805a (1001-042) | |
| Fine sable paintbrush #2/0 | Electron Microscopy Sciences | 66100-20 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gamma-H2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
| GFAP antibody | Thermo Fisher | 13-0300 | |
| GFP antibody | Santa Cruz | SC-9996 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8270 | |
| Glutamine (200 mM) | Corning cellgrow | 25-005-Cl | |
| H&E and KI-67 | Jefferson Core Facility Pathology staining | ||
| Hand Drill Set with Micro Mini Twist Drill Bits | Amazon | YCQ2851920086082DJ | |
| HEPES, free acid | Fisher Scientific | BP299-1 | |
| Just for mice Stereotaxic Frame | Harvard Apparatus (Holliston, MA, USA). | 72-6049, 72-6044 | |
| KCl | Fisher Scientific | S271-10 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-18 | |
| MDA-MB-231BR cells | Kindly provided by Dr. Patricia Steeg | Ref 14 | |
| MgCl2·6H2O | Fisher Scientific | M33-500 | |
| Mice imaging device | Perkin Elmer | IVIS 200 system | |
| Mice imaging software | Caliper Life Sciences (Waltham, MA, USA). | Living Image Software | |
| Microplate Reader | Tecan Spark | ||
| Mounting solution | Invitrogen | P36935 | |
| MTS reagent | Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution | (Cat:G3582) | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103049 | |
| Nu/Nu athymic mice | Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA) | ||
| Paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
| Pen/Strep | Life Technologies | 145140-122 | |
| Polypropylene Suture | Medex supply | ETH-8556H | |
| Povidone Iodine Swab sticks | DME Supply USA | Cat: 689286X | |
| Scalpel blade #11 (pk of 100) | Fine Science Tools | 10011-00 | |
| Scalpel handle #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma Aldrich | S8636 | |
| Spatula/probe | Fine Science Tools | 10090-13 | |
| SS Double edge uncoated razor blades (American safety razor co (95-0043)) | VWR | 55411-060 | |
| Sucrose | Amresco | 57-50-1 | |
| Surgical Scalpel | Exelint International | D29702 | |
| Tissue Chopper | Brinkman | (McIlwain type) | |
| Tissue culture inserts | Millipore | PICMORG50 or PICM03050 | |
| X-ray machine | Precision 250 kVp |
References
- Watase, C., et al. Breast cancer brain metastasis-overview of disease state, treatment options and future perspectives. Cancers. 13 (5), Basel. (2021).
- Niikura, N., et al. Treatment outcomes and prognostic factors for patients with brain metastases from breast cancer of each subtype: a multicenter retrospective analysis. Breast Cancer Research and Treatment. 147 (1), 103-112 (2014).
- Fong, E. L., et al. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
- Parker, J. J., et al. A human glioblastoma organotypic slice culture model for study of tumor cell migration and patient-specific effects of anti-invasive drugs. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e53557 (2017).
- Chuang, H. N., et al. Coculture system with an organotypic brain slice and 3D spheroid of carcinoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50881 (2013).
- Hohensee, I., et al. PTEN mediates the cross talk between breast and glial cells in brain metastases leading to rapid disease progression. Oncotarget. 8 (4), 6155-6168 (2017).
- van de Merbel, A. F., et al. An ex vivo Tissue culture model for the assessment of individualized drug responses in prostate and bladder cancer. Frontiers in Oncology. 8, 400 (2018).
- Martin, S. Z., et al. Ex vivo tissue slice culture system to measure drug-response rates of hepatic metastatic colorectal cancer. BMC Cancer. 19 (1), 1030 (2019).
- Orimo, A., Weinberg, R. A. Stromal fibroblasts in cancer: a novel tumor-promoting cell type. Cell Cycle. 5 (15), 1597-1601 (2006).
- Lim, C. Y., et al. Organotypic slice cultures of pancreatic ductal adenocarcinoma preserve the tumor microenvironment and provide a platform for drug response. Pancreatology. 18 (8), 913-927 (2018).
- Gerlach, M. M., et al. Slice cultures from head and neck squamous cell carcinoma: a novel test system for drug susceptibility and mechanisms of resistance. British Journal of Cancer. 110 (2), 479-488 (2014).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Palmieri, D., et al. Her-2 overexpression increases the metastatic outgrowth of breast cancer cells in the brain. Cancer Research. 67 (9), 4190-4198 (2007).
- Kyeong, S., et al. Subtypes of breast cancer show different spatial distributions of brain metastases. PLoS One. 12 (11), 0188542 (2017).
- Hengel, K., et al. Attributes of brain metastases from breast and lung cancer. International Journal of Clinical Oncology. 18 (3), 396-401 (2013).
- Jackson, J. G., et al. Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters. Journal of Neuroscience. 34 (5), 1613-1624 (2014).
- Farnan, J. K., Green, K. K., Jackson, J. G. Ex vivo imaging of mitochondrial dynamics and trafficking in astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 92 (1), 94 (2020).
- Simone, N. L., et al. Ionizing radiation-induced oxidative stress alters miRNA expression. PLoS One. 4 (7), 6377 (2009).
- Couturier, C. P., et al. Single-cell RNA-seq reveals that glioblastoma recapitulates a normal neurodevelopmental hierarchy. Nature Communications. 11 (1), 3406 (2020).
- Candolfi, M., et al. Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression. Journal of Neuro-Oncology. 85 (2), 133-148 (2007).
- Fitzgerald, D. P., et al. Reactive glia are recruited by highly proliferative brain metastases of breast cancer and promote tumor cell colonization. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (7), 799-810 (2008).
- Kondru, N., et al. An Ex Vivo Brain Slice Culture Model of Chronic Wasting Disease: Implications for Disease Pathogenesis and Therapeutic Development. Scientific Reports. 10 (1), (2020).
- Abu Samaan, T. M., et al. Paclitaxel's mechanistic and clinical effects on breast cancer. Biomolecules. 9 (12), (2019).
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice--a model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), 45017 (2012).
- Valiente, M., et al. Brain metastasis cell lines panel: A public resource of organotropic cell lines. Cancer Research. 80 (20), 4314-4323 (2020).
