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Biology

माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग

Published: May 3, 2021 doi: 10.3791/62618
Automatic Translation
1
1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

Summary

यह विधि लेख पैच-क्लैंप तकनीक के साथ आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली में एच + रिसाव को मापने में मुख्य चरणों का विवरण देता है, जो माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस (जिसे माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग के रूप में भी जाना जाता है) चयापचय सिंड्रोम से निपटने के लिए ऊर्जा व्यय बढ़ाने के लिए सबसे आशाजनक लक्ष्यों में से एक है। थर्मोजेनिक ऊतक जैसे भूरे और बेज वसा गर्मी उत्पादन के लिए अत्यधिक विशिष्ट माइटोकॉन्ड्रिया विकसित करते हैं। अन्य ऊतकों के माइटोकॉन्ड्रिया, जो मुख्य रूप से एटीपी का उत्पादन करते हैं, कुल माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा उत्पादन के 25% तक गर्मी में परिवर्तित होते हैं और इसलिए, पूरे शरीर के शरीर विज्ञान पर काफी प्रभाव डाल सकते हैं। माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस न केवल शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए आवश्यक है, बल्कि आहार-प्रेरित मोटापे को भी रोकता है और कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाने के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को कम करता है। चूंकि माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सेलुलर चयापचय का एक प्रमुख नियामक है, इसलिए इस मौलिक प्रक्रिया की एक यांत्रिक समझ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े कई विकृतियों का मुकाबला करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में मदद करेगी। महत्वपूर्ण रूप से, सटीक आणविक तंत्र जो माइटोकॉन्ड्रिया में थर्मोजेनेसिस के तीव्र सक्रियण को नियंत्रित करते हैं, खराब रूप से परिभाषित हैं। जानकारी की यह कमी काफी हद तक अनकपलिंग प्रोटीन के प्रत्यक्ष माप के तरीकों की कमी के कारण है। माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप पद्धति के हालिया विकास ने पहली बार, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस की उत्पत्ति पर घटना का प्रत्यक्ष अध्ययन, आईएमएम के माध्यम से एच + रिसाव, और इसके लिए जिम्मेदार माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्टरों का पहला बायोफिजिकल लक्षण वर्णन सक्षम किया, अनकपलिंग प्रोटीन 1 (यूसीपी 1), भूरे और बेज वसा के विशिष्ट, और अन्य सभी ऊतकों के लिए एडीपी / यह अनूठा दृष्टिकोण एच + रिसाव और माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले तंत्रों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा और चयापचय सिंड्रोम का मुकाबला करने के लिए उन्हें कैसे लक्षित किया जा सकता है। यह पेपर आईएमएम के माध्यम से एच + धाराओं को सीधे मापकर उनकी थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप पद्धति का वर्णन करता है।

Introduction

माइटोकॉन्ड्रिया सेल का पावरहाउस होने के लिए प्रसिद्ध हैं। दरअसल, वे रासायनिक ऊर्जा, एटीपी का प्रमुख स्रोत हैं। क्या कम ज्ञात है कि माइटोकॉन्ड्रिया भी गर्मी उत्पन्न करता है। वास्तव में, प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियन लगातार दो प्रकार की ऊर्जा (एटीपी और गर्मी) उत्पन्न करता है और दो ऊर्जा रूपों के बीच एक अच्छा संतुलन चयापचय सेल होमियोस्टेसिस (चित्रा 1) को परिभाषित करता है। एटीपी और गर्मी के बीच माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा कैसे वितरित करता है, यह निश्चित रूप से बायोएनर्जेटिक्स के क्षेत्र में सबसे मौलिक प्रश्न है, हालांकि यह अभी भी काफी हद तक अज्ञात है। हम जानते हैं कि माइटोकॉन्ड्रियल गर्मी उत्पादन (जिसे माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस कहा जाता है) में वृद्धि, और इसके परिणामस्वरूप एटीपी उत्पादन को कम करने से ऊर्जा व्यय बढ़ जाता है और यह चयापचय सिंड्रोम1 से निपटने के सर्वोत्तम तरीकों में से एक है।

माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस आंतरिक माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (आईएमएम) में एच + रिसाव से उत्पन्न होता है, जिससे गर्मी के परिणामी उत्पादन के साथ सब्सट्रेट ऑक्सीकरण और एटीपी संश्लेषण का विघटन होता है, इसलिए नाम "माइटोकॉन्ड्रियल अनकपलिंग" 1 (चित्रा 1)। यह एच + रिसाव माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्टर्स पर निर्भर करता है जिसे अनकपलिंग प्रोटीन (यूसीपी) कहा जाता है। यूसीपी 1 पहचाना गया पहला यूसीपी था। यह केवल थर्मोजेनिक ऊतकों, भूरे रंग की वसा और बेज वसा में व्यक्त किया जाता है जिसमें माइटोकॉन्ड्रिया गर्मी उत्पादन 2,3,4 के लिए विशिष्ट होते हैं। कंकाल की मांसपेशियों, हृदय और यकृत जैसे गैर-वसा ऊतकों में यूसीपी की पहचान विवादास्पद बनी हुई है। इन ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रिया में गर्मी में परिवर्तित कुल माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा का लगभग 25% हो सकता है, जो पूरे शरीर के शरीर विज्ञान को काफी प्रभावित कर सकताहै 1. कोर शरीर के तापमान को बनाए रखने के अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस कैलोरी को कम करके आहार-प्रेरित मोटापे को भी रोकता है। इसके अलावा, यह कोशिकाओं को ऑक्सीडेटिव क्षति से बचाने के लिए माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को कम करताहै 1. इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सामान्य उम्र बढ़ने, उम्र से संबंधित अपक्षयी विकारों और ऑक्सीडेटिव तनाव से जुड़ी अन्य स्थितियों में शामिल है, जैसे कि इस्किमिया-रीपरफ्यूजन। इसलिए, माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस सेलुलर चयापचय का एक शक्तिशाली नियामक है, और इस मौलिक प्रक्रिया की एक यांत्रिक समझ माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े कई विकृतियों का मुकाबला करने के लिए चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को बढ़ावा देगी।

माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन सेलुलर चयापचय में माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस की महत्वपूर्ण भूमिका को प्रकट करने वाली पहली तकनीक थी और अभी भी समुदाय1 में सबसे लोकप्रिय है। यह तकनीक माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) द्वारा ऑक्सीजन की खपत के माप पर आधारित है जो माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव सक्रिय होने पर बढ़ जाती है। यह तकनीक, हालांकि वाद्य, सीधे आईएमएम1 में माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव का अध्ययन नहीं कर सकती है, जिससे इसके लिए जिम्मेदार प्रोटीन की सटीक पहचान और लक्षण वर्णन मुश्किल हो जाता है, खासकर गैर-वसा ऊतकों में जिसमें एटीपी उत्पादन की तुलना में गर्मी उत्पादन माध्यमिक होता है। हाल ही में, माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप तकनीक के विकास ने विभिन्न ऊतकों 5,6,7 में पूरे आईएमएम में एच + रिसाव का पहला प्रत्यक्ष अध्ययन प्रदान किया।

पूरे आईएमएम के माइटोकॉन्ड्रियल पैच-क्लैंप को पहली बार किरिचोक एट अल द्वारा प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से स्थापित किया गया था। उन्होंने सीओएस -7 सेल लाइनों 8 से मिटोप्लास्ट का उपयोग करके 2004 में माइटोकॉन्ड्रियल कैल्शियम यूनिपोर्टर (एमसीयू) धाराओं के पहले प्रत्यक्ष माप का वर्णनकिया। बाद में, किरिचोक प्रयोगशाला ने माउस9 और ड्रोसोफिला ऊतकों9 के आईएमएम से कैल्शियम धाराओं को दिखाया। अन्य प्रयोगशालाएं अब नियमित रूप से एमसीयू10,11,12,13,14 के बायोफिजिकल गुणों का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करती हैं। पोटेशियम और क्लोराइड आचरण का पूरा आईएमएम पैच-क्लैंप विश्लेषण भी संभव है और कई पत्रों में उल्लेख किया गया है लेकिन अभी तक प्रकाशन 6,7,9 का मुख्य विषय नहीं रहा है। आईएमएम में एच + धाराओं का पहला माप 2012 में माउस ब्राउन वसा माइटोकॉन्ड्रिया6 से और 20177 में माउस बेज वसा माइटोकॉन्ड्रिया से रिपोर्ट किया गया था। यह वर्तमान थर्मोजेनिक ऊतकों, यूसीपी 1 6,7 के विशिष्ट अनकपलिंग प्रोटीन के कारण है। 2019 में प्रकाशित हालिया काम ने एएसी को दिल और कंकाल की मांसपेशियों जैसे गैर-वसा ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव के लिए जिम्मेदार मुख्य प्रोटीन के रूप में वर्णितकिया।

यह अनूठा दृष्टिकोण अब माइटोकॉन्ड्रियल आयन चैनलों और माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार ट्रांसपोर्टरों के प्रत्यक्ष उच्च-रिज़ॉल्यूशन कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। विधि के विस्तार को सुविधाजनक बनाने के लिए और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन जैसे अन्य अध्ययनों के पूरक के लिए, यूसीपी 1 और एएसी द्वारा किए गए एच + धाराओं को मापने के लिए नीचे एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है। तीन महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन किया गया है: 1) माउस ब्राउन वसा से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव एएसी-निर्भर एच + वर्तमान का विश्लेषण करने के लिए दिल से यूसीपी 1-निर्भर एच + वर्तमान और माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव का विश्लेषण करने के लिए, 2) बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली (ओएमएम) के यांत्रिक टूटने के लिए फ्रांसीसी प्रेस के साथ मिटोप्लास्ट की तैयारी, 3) पूरे आईएमएम में यूसीपी 1 और एएसी-निर्भर एच + धाराओं की पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगात्मक प्रक्रियाएं जो राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के दिशानिर्देशों के अनुरूप थीं और कैलिफ़ोर्निया विश्वविद्यालय लॉस एंजिल्स संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित की गई थीं।

नोट: माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव प्रक्रिया अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन पर आधारित है और ऊतक से ऊतक में थोड़ा भिन्न होती है। उदाहरण के लिए, चूंकि भूरे रंग के वसा ऊतक लिपिड में बेहद समृद्ध होते हैं, इसलिए माइटोकॉन्ड्रिया की कटाई से पहले लिपिड चरण से सेल मलबे और ऑर्गेनेल को अलग करने के लिए एक अतिरिक्त कदम की आवश्यकता होती है। भ्रम से बचने के लिए, दो माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव प्रक्रियाएं (एक भूरे रंग की वसा से और दूसरा दिल से) नीचे विस्तृत हैं।

1. माउस इंटरस्केपुलर ब्राउन वसा से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव (बर्थोलेट एट अल से संशोधित।

  1. 6 पुरुष माउस सीओ2 श्वासावरोध और बाद में ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करते हुए, जैसा कि अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन पैनल और आईएसीयूसी समिति द्वारा अनुशंसित है।
  2. मेज का सामना करना पड़ अपने पेट के साथ माउस की स्थिति के बाद, बालों को साफ और गीला करने के लिए स्प्रे अल्कोहल (मान एट अल से संशोधित।
  3. चिमटी के साथ त्वचा को पकड़ने के बाद ऊपरी पीठ में 2 सेमी का चीरा बनाएं।
  4. माउस के भूरे रंग के इंटरस्केपुलर वसा को निकालें जो तितली आकार16 के साथ दो-लोब वाले अंग से मेल खाती है।
  5. भूरे रंग की वसा को 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जो 5 एमएल ठंडे अलगाव बफर (तालिका 1) से भरा हुआ है जो पहले बर्फ पर रखा गया था।
  6. एक दूरबीन के नीचे सफेद वसा से भूरे रंग की वसा को साफ करें।
  7. भूरे रंग की वसा को 5 मिलीलीटर ठंडे अलगाव बफर (तालिका 1) के साथ 10 मिलीलीटर बीकर में स्थानांतरित करें ताकि इसे पतले टुकड़ों में काट दिया जा सके। बर्फ-ठंडा 10 एमएल ग्लास होमोजेनाइज़र (प्लास्टिक सामग्री पॉलीटेट्राफ्लोरोथिलीन (पीटीएफई) मूसल) में स्थानांतरण।
  8. मिनट की नियंत्रित गति पर छह कोमल स्ट्रोक के साथ बर्फ पर पूर्व-कट ऊतक को समरूप करने के लिए एक ओवरहेड उत्तेजक का उपयोग करें।
  9. एक 15 मिलीलीटर बर्फ-ठंड शंक्वाकार ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8,500 एक्स जी पर होमोजेनेट को अपकेंद्रित्र करें। लिपिड चरण युक्त सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  10. बर्फ-ठंडे अलगाव बफर (तालिका 1) के 5 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें और दूसरी बार, 275 रोटेशन / मिनट की गति से छह धीमी गति से स्ट्रोक के साथ बर्फ पर निलंबन।
  11. एक 15 मिलीलीटर बर्फ-ठंड शंक्वाकार ट्यूब में होमोजेनेट को स्थानांतरित करें और इसे सभी नाभिक और अखंड कोशिकाओं को गोली देने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 700 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र करें।
  12. एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए और इसे बर्फ पर रखें।
  13. माइटोकॉन्ड्रिया युक्त एक गोली प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8,500 एक्स जी पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र।
  14. बर्फ-ठंडे हाइपरटोनिक-मैनीटोल बफर (तालिका 2) के 3.8 एमएल में माइटोकॉन्ड्रिया युक्त गोली को फिर से निलंबित करें और 10-15 मिनट के लिए बर्फ पर माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को सेते हैं।

2. माउस दिल से माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव (गर्ग एट अल से संशोधित।

  1. 6 पुरुष माउस सीओ2 श्वासावरोध और बाद में ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग करते हुए, जैसा कि अमेरिकन वेटरनरी मेडिकल एसोसिएशन पैनल और आईएसीयूसी समिति द्वारा अनुशंसित है।
  2. माउस को अपनी पीठ पर रखने के बाद, बालों को साफ और गीला करने के लिए अल्कोहल स्प्रे करें। फिर, चिमटी के साथ त्वचा को पकड़ने के बाद छाती पर 2 सेमी चीरा बनाएं।
  3. जानवर की छाती से दिल को विच्छेदित करें और ठंड अलगाव समाधान (तालिका 1) के 5 एमएल के साथ 10 एमएल बीकर में सभी रक्त को हटाने के लिए इसे कुल्लाएं।
  4. एक बार जब दिल रक्त के निशान से साफ हो जाता है, तो इसे पतले टुकड़ों में काटने के लिए 5 मिलीलीटर ठंडे अलगाव बफर (तालिका 1) वाले एक और 10 एमएल बीकर में स्थानांतरित करें। फिर, एक बर्फ-ठंडा 10 एमएल ग्लास होमोजेनाइज़र (पीटीएफई मूसल) में स्थानांतरित करें।
  5. मिनट की नियंत्रित गति पर छह कोमल स्ट्रोक के साथ बर्फ पर पूर्व-कट ऊतक को समरूप करने के लिए एक ओवरहेड उत्तेजक का उपयोग करें।
  6. होमोजेनेट को 15 एमएल बर्फ-ठंडे शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 700 एक्स जी पर गोली नाभिक और अखंड कोशिकाओं में अपकेंद्रित्र करें।
  7. एक ताजा 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए और इसे बर्फ पर रखें।
  8. माइटोकॉन्ड्रिया युक्त एक गोली प्राप्त करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 8,500 एक्स जी पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र।
  9. बर्फ-ठंडे हाइपरटोनिक-मैनिटोल बफर (तालिका 2) के 3.8 एमएल में माइटोकॉन्ड्रियल गोली को फिर से निलंबित करें और 10-15 मिनट के लिए बर्फ पर माइटोकॉन्ड्रियल निलंबन को सेते हैं।

3. ओएमएम के यांत्रिक टूटने के लिए फ्रांसीसी प्रेस के साथ मिटोप्लास्ट की तैयारी।

नोट: फ्रांसीसी प्रेस प्रक्रिया आईएमएम को मैट्रिक्स और क्रिस्टा (चित्रा 2) 18 सहित संरक्षित अपनी अखंडता के साथ ओएमएम से जारी करने की अनुमति देती है। माइटोकॉन्ड्रिया को हाइपरटोनिक-मैनिटोल बफर (तालिका 2) में पूर्व-इनक्यूबेट किया जाता है और ओएमएम के टूटने पर आईएमएम के किसी भी कठोर खिंचाव से बचने के लिए फ्रांसीसी प्रेस प्रक्रिया के दौरान कम दबाव के अधीन होता है।

  1. फ्रांसीसी प्रेस (चित्रा 3 ए) के एक प्रशीतित मिनी दबाव सेल (पिस्टन व्यास 3/8 ") में माइटोकॉन्ड्रियल-हाइपरटोनिक-मैनिटोल निलंबन भरें।
  2. फ्रेंच प्रेस के मध्यम मोड का चयन करें और भूरे रंग के वसा माइटोकॉन्ड्रिया के लिए फ्रेंच प्रेस के डायल पर 110 पर मिनी दबाव सेल के माध्यम से निलंबन को संपीड़ित करें और हृदय माइटोकॉन्ड्रिया (~ 2,000 साई) के लिए 140 पर।  सुनिश्चित करें कि निलंबन मिनी दबाव सेल से लगभग 1 बूंद /
  3. एक 15 मिलीलीटर बर्फ ठंडा शंक्वाकार ट्यूब में बूंदों ले लीजिए।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 10,500 एक्स जी पर निलंबन अपकेंद्रित्र।
  5. बर्फ-ठंडे हाइपरटोनिक-केसीएल बफर (तालिका 3) के 0.5-2 एमएल में मिटोप्लास्ट गोली को फिर से निलंबित करें और बर्फ पर निलंबन को स्टोर करें।
    नोट: ब्राउन वसा और दिल के मिटोप्लास्ट पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए तैयार हैं और लगभग 3-6 घंटे के लिए उपयोग करने योग्य रहना चाहिए।

4. यूसीपी 1 और एएसी 5,7,15 के माध्यम से एच + रिसाव की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग

नोट: निम्नलिखित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सेटअप (चित्रा 3 बी) का उपयोग करें: अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी), 60 एक्स पानी विसर्जन उद्देश्य, कंपन अलगाव तालिका और एक फैराडे पिंजरे के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप, कम शोर रिकॉर्डिंग का समर्थन करने वाला एक मानक एम्पलीफायर, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सेटअप के लिए उपयोग किया जाने वाला एक मानक डिजिटाइज़र, पीक्लैंप 10, एक माइक्रोमैनिपुलेटर, स्नान संदर्भ इलेक्ट्रोड (3 एम केसीएल-अगर नमक पुल एक माइक्रोइलेक्ट्रोड धारक के भीतर डाला गया जिसमें चांदी / धारक शरीर में (लियू एट अल में वर्णित 2021)19, 0.13 मिमी ग्लास कवरस्लिप तल के साथ छिड़काव कक्ष, एक गुरुत्वाकर्षण-खिलाया छिड़काव प्रणाली से जुड़ा हुआ है।

  1. एक माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करके रिकॉर्डिंग के दिन बोरोसिलिकेट ग्लास फिलामेंट्स को खींचें। पुनरुत्पादन क्षमता20 की एक उच्च डिग्री के साथ विंदुक पैदा करने के लिए इस्तेमाल पुलर पर एक कार्यक्रम सेट करें।
    नोट: इस प्रोग्राम डिज़ाइन को आईएमएम पैच-क्लैंप के लिए ऑप्टिमाइज़ किए गए पिपेट प्राप्त करने के लिए कई प्रयासों की आवश्यकता होती है। एक मानक विंदुक में प्रगतिशील शंकु आकार के साथ ठीक युक्तियां होती हैं।
  2. खींचने वाले के भीतर एक ग्लास फिलामेंट डालें और एक बोरोसिलिकेट फिलामेंट से लगभग दो समान पैच पिपेट प्राप्त करने के लिए खींचें।
  3. कार्यक्रम को समायोजित करें जब पिपेट खींचने वाले के हीटिंग बॉक्स फिलामेंट की उम्र बढ़ने के कारण चक्र खींचने के बीच असंगत हो जाते हैं।
  4. विंदुक पॉलिशर के अंदर विंदुक की स्थिति और आग पॉलिश करने के लिए 100x आवर्धन के तहत फिलामेंट के पास टिप जगह यह.
  5. टिप वक्र को बंद किए बिना या नुकसान पहुंचाए बिना फिलामेंट को गर्म करने के लिए पैर पेडल को कई बार दबाएं।
  6. टीएमए-आधारित विंदुक समाधान (टेट्रामेथिलअमोनियम हाइड्रॉक्साइड, तालिका 4 के लिए टीएमए) से भरे जाने पर 25 और 35 एम Ω के बीच प्रतिरोध के साथ पिपेट प्राप्त किए जाने तक पॉलिश करें।
  7. मिटोप्लास्ट आसंजन को कम करने और उन्हें मिटोप्लास्ट निलंबन जमा करने से पहले केसीएल स्नान समाधान (तालिका 5) के साथ कुल्ला करने के लिए 0.1% जिलेटिन के साथ प्री-इनक्यूबेट कवरलिप्स (5 मिमी व्यास, 0.1 मिमी मोटाई)।
  8. केसीएल स्नान समाधान (तालिका 5) के 500 μL के साथ केंद्रित मिटोप्लास्ट निलंबन के ~ 35 μL को मिलाकर एक कच्चे कमजोर पड़ने को तैयार करें और इसे पहले 4-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में रखे गए कवरलिप्स पर रखें।
  9. कवरस्लिप पर तलछट के लिए मिटोप्लास्ट के लिए 15 से 20 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं।
  10. केसीएल स्नान समाधान (तालिका 5) के ~ 50 μL के साथ स्नान कक्ष को पूरी तरह से भरें।
  11. एक मुड़ी हुई नोक के साथ पतली माइक्रोडिसेक्शन चिमटी का उपयोग करके कक्ष के भीतर मिटोप्लास्ट के साथ एक कवरस्लिप स्थानांतरित करें।
  12. कक्ष के तल पर कवरस्लिप को व्यवस्थित करें। कवरस्लिप पर मिटोप्लास्ट स्थिर रखने के लिए कक्ष को प्रभावित न करें।
  13. 60x उद्देश्य के साथ माइक्रोस्कोप के तहत कवरस्लिप को स्कैन करके 8 के आकार में एक व्यक्तिगत गैर-चिपकने वाला मिटोप्लास्ट चुनें।
  14. विंदुक समाधान (~ 50 μL) के साथ विंदुक लोड और पिपेट धारक में यह जगह है।
  15. एक माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ स्नान समाधान में विंदुक लाओ और आईएमएम के करीब आने के लिए चयनित मिटोप्लास्ट के ठीक ऊपर पहुंचें। एम्पलीफायर कार्यक्रम स्नान समाधान में होने के बाद विंदुक का प्रतिरोध देता है। 0 एमवी पर झिल्ली क्षमता पकड़ो और एम्पलीफायर कार्यक्रम में झिल्ली परीक्षण कमांड का उपयोग करके 10 एमवी दालों को लागू करें।
  16. आईएमएम (चित्रा 2 बी) के साथ जल्दी से एक गीगासल बनाने के लिए थोड़ा नकारात्मक दबाव लागू करें।
  17. प्रयोग के दौरान विंदुक बहाव के कारण सील टूटने से बचने के लिए उन्हें कवरस्लिप से दूर रखने के लिए संलग्न मिटोप्लास्ट के साथ विंदुक वृद्धि।
  18. ब्रेक-इन के बाद मिटोप्लास्ट झिल्ली के लिए सही समाई (सेमी) माप प्राप्त करने के लिए पूरे-मिटोप्लास्ट कॉन्फ़िगरेशन का परीक्षण करने से पहले एम्पलीफायर प्रोग्राम में "झिल्ली परीक्षण" कमांड के साथ आवारा समाई यात्रियों की भरपाई करें।
  19. कांच विंदुक के तहत झिल्ली पैच टूटना और पूरे-मिटोप्लास्ट कॉन्फ़िगरेशन (चित्रा 2 सी) को प्राप्त करने के लिए एम्पलीफायर कार्यक्रम के साथ अल्पकालिक (5-15 एमएस) वोल्टेज दालों (250-600 एमवी) लागू करें। सफल ब्रेक-इन समाई यात्रियों के पुन: प्रकट होने से परिलक्षित होता है।
  20. ब्रेक-इन के बाद, झिल्ली समाई (मिटोप्लास्ट के आकार को दर्शाते हुए) और इसके एक्सेस प्रतिरोध आरए (पूरे-मिटोप्लास्ट कॉन्फ़िगरेशन की गुणवत्ता को दर्शाते हुए) का आकलन करने के लिए एम्पलीफायर प्रोग्राम के झिल्ली परीक्षण विकल्प के साथ समाई यात्रियों को फिट करें। ब्रेक-इन के बाद, आरए 40 और 80 एम Ω के बीच होना चाहिए। पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाने वाले मेटोप्लास्ट (आकार में 2-6 μm) में आमतौर पर 0.5-1.1 पीएफ की झिल्ली समाई होती है।
  21. ब्रेक-इन के तुरंत बाद, छिड़काव शुरू करके एचईपीईएस स्नान समाधान (तालिका 6) के साथ केसीएल स्नान समाधान (तालिका 5) को बदलें।
  22. एम्पलीफायर प्रोग्राम के साथ डिज़ाइन किए गए 850 एमएस रैंप प्रोटोकॉल को लागू करें, -160 एमवी से +100 एमवी तक 5 एस अंतराल के साथ, जबकि 0 एमवी पर मेटोप्लास्ट पकड़ते हुए। यह प्रोटोकॉल यूसीपी 1 6,7,15 और एएसी 5 अध्ययन (चित्रा 4 और चित्रा 5) के लिए काम करता है।
    नोट: यूसीपी 1 और एएसी-निर्भर एच + वर्तमान माप के लिए 10 किलोहर्ट्ज पर सभी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल डेटा प्राप्त करने और एम्पलीफायर और डिजिटाइज़र को चलाने वाले पर्याप्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके 1 किलोहर्ट्ज पर फ़िल्टर करने की सिफारिश की जाती है।

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Representative Results

माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप पद्धति के विकास ने आईएमएम और माइटोकॉन्ड्रियल ट्रांसपोर्टर्स, यूसीपी 1 और एएसी के माध्यम से एच + रिसाव का पहला प्रत्यक्ष अध्ययन प्रदान किया, जो इसके लिए जिम्मेदार हैं। यूसीपी 1- और एएसी-निर्भर एच + लीक का इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता की पहली नज़र प्रदान कर सकता है। परिणाम अनुभाग यूसीपी 1 और एएसी के माध्यम से एच + रिसाव को मापने के लिए मानक प्रक्रियाओं का वर्णन करता है।

यूसीपी 1-निर्भर एच + वर्तमान माप (चित्रा 4) 6,7,15
वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल का अनुप्रयोग बहिर्जात फैटी एसिड (एफए), यूसीपी (चित्रा 4 ए) के आवश्यक उत्प्रेरकों के अलावा के बिना भूरे रंग की वसा के आईएमएम में एक बड़े आयाम एच + वर्तमान को प्रेरित करता है। झिल्ली से जुड़ी फॉस्फोलिपेज़ गतिविधि द्वारा एफए के स्थानीय उत्पादन के कारण यह भूरे और बेज वसा आईएमएम की एक विशिष्ट विशेषता है। जब रैंप प्रोटोकॉल के जवाब में एच + वर्तमान विकसित होता है, तो वर्तमान आयाम को स्थिर करने की प्रतीक्षा करना महत्वपूर्ण है। यूसीपी 1 के माध्यम से एच + वर्तमान आयाम की मात्रा का ठहराव एक शून्य यूसीपी 1 वर्तमान के अनुरूप आधार रेखा के निर्धारण की आवश्यकता होती है। एक बार एच + वर्तमान आयाम की स्थिरता तक पहुंच जाने के बाद, अंतर्जात झिल्ली एफए निष्कर्षण, चित्रा 4 बी, ब्लैक ट्रेस के लिए यूसीपी 1 अवरोधक गुआनोसिन डिफॉस्फेट (जीडीपी - 1 एमएम, चित्रा 4 ए) या एफए चेलेटर (0.5% एफए-मुक्त गोजातीय सीरम एल्बुमिन, नहीं दिखाया गया) या 10 एमएम मिथाइल बीटा साइक्लोडेक्सट्रिन (एमसीडी) को प्रभावित करने की सिफारिश की जाती है। अवशिष्ट वर्तमान वर्तमान है जिसमें से यूसीपी 1 धाराओं का आयाम निर्धारित किया जाएगा। विभिन्न मिटोप्लास्ट में यूसीपी 1 धाराओं के आयामों की तुलना करने में मदद करने के लिए, प्रत्येक मिटोप्लास्ट के वर्तमान घनत्व (पीए / पीएफ) की गणना यूसीपी 1 धाराओं को मिटोप्लास्ट समाई (सेमी) 5,7 के साथ सामान्य करके की जाती है। वर्तमान को एराकिडोनिक एसिड (एए) या ओलिक एसिड (ओए) (1-2 μM) का उपयोग करके बहिर्जात लंबी श्रृंखला एफए के अलावा पुन: सक्रिय किया जा सकता है। चूंकि भूरे और बेज वसा आईएमएम दोनों में पीएलए 2 गतिविधि होती है, इसलिए अंतर्जात झिल्ली एफए आंशिक रूप से स्नान से एमसीडी / एल्ब्यूमिन को धोने के कुछ ही मिनटों के भीतर पुनर्जीवित होते हैं, जिससे यूसीपी 1 6,7 के माध्यम से एच + वर्तमान का पुनर्सक्रियन होता है। जैसा कि अपेक्षित था, यह वर्तमान यूसीपी 1-/- चूहों (चित्रा 4 ए) 6,7 के आईएमएम में पूरी तरह से गायब हो जाता है।

एक ही ऊतक के विभिन्न मिटोप्लास्ट के घनत्व और गतिविधि की तुलना करने का एक और सटीक तरीका या विभिन्न ऊतकों (भूरे और बेज वसा) से मायोप्लास्ट के यूसीपी 1 की गतिविधि की तुलना करना आईएमएम 6,7 की सतह पर एफए एकाग्रता को नियंत्रित करना है। दरअसल, एच + वर्तमान आयाम प्रति आईएमएम यूसीपी 1 प्रोटीन राशि के कारण लेकिन अंतर्जात एफए के उत्पादन के कारण भी मिटोप्लास्ट के बीच भिन्न हो सकता है। इस प्रकार, आईएमएम से अंतर्जात एफए निकालने और ज्ञात एकाग्रता पर बहिर्जात एफए जोड़कर यूसीपी 1-निर्भर एच + वर्तमान को फिर से सक्रिय करने की सिफारिश की जाती है। ऐसा करने के लिए, अंतर्जात एफए को पहले आईएमएम से एक एचईपीईएस स्नान समाधान (तालिका 6) को 10 एमएम एमसीडी युक्त करके निकाला जाना चाहिए। फिर, बहिर्जात एफए की केवल एक सटीक एकाग्रता द्वारा यूसीपी 1 के माध्यम से एच + वर्तमान के पुनर्सक्रियन की अनुमति देने के लिए, बाद में आईएमएम से उत्पादित एफए को लगातार निकालने के लिए एचईपीईएस /

यूसीपी 1 के लिए बाध्यकारी के लिए प्यूरीन न्यूक्लियोटाइड और एफए के बीच प्रतिस्पर्धा का अध्ययन पैच-क्लैंप तकनीक 6,7,15 के साथ भी संभव है। प्यूरीन न्यूक्लियोटाइड्स (उदाहरण के लिए, एमजी2 + मुक्त एटीपी) द्वारा यूसीपी 1 के निषेध की तुलना एफए के दो अलग-अलग सांद्रता (आदर्श रूप से 10 गुना) से की जा सकती है। इस उद्देश्य के लिए, अंतर्जात झिल्ली एफए को पहले 10 एमएम एमसीडी (चित्रा 4 बी, ब्लैक ट्रेस) लागू करके हटा दिया जाता है। बहिर्जात एफए का अनुप्रयोग (उदाहरण के लिए, यहां, केवल 0.5 एमएम एफए दिखाए जाते हैं) 10 एमएम एम की पृष्ठभूमि पर लागू होते हैं एमसीडी एफए को सक्रिय करने की एकाग्रता के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है क्योंकि स्थानीय रूप से उत्पादित एफए तुरंत झिल्ली से निकाले जाते हैं। इस स्थिति में, बहिर्जात एफए मुख्य रूप से एच + वर्तमान के विकास के लिए जिम्मेदार हैं। एटीपी की विभिन्न सांद्रता को बाद में परीक्षण किए गए प्रत्येक एफए एकाग्रता के लिए आईसी 50एटीपी का आकलन करने के लिए ओए / एमसीडी समाधान में जोड़ा जाता है और इस प्रकार, यह स्थापित करता है कि क्या एफए यूसीपी 1 के लिए बाध्यकारी के लिए प्यूरीन न्यूक्लियोटाइड के साथ प्रतिस्पर्धा करता है।

एएसी-निर्भर एच + वर्तमान माप (चित्रा 5)5
भूरे रंग की वसा के विपरीत, कंकाल की मांसपेशियों और हृदय जैसे गैर-वसा ऊतकों का आईएमएम ब्रेक-इन (चित्रा 5, काले निशान) के तुरंत बाद एक औसत दर्जे का एच + विकसित नहीं करता है। एएसी के माध्यम से एक औसत दर्जे का एच + वर्तमान को प्रेरित करने के लिए, एचईपीईएस स्नान समाधान (तालिका 6) को लागू करना आवश्यक है जिसमें बहिर्जात एफए (एए, चित्रा 5 ए, लाल ट्रेस) के 1-2 μM शामिल हैं। यह इंगित कर सकता है कि गैर-वसा ऊतकों के आईएमएम में आईएमएम में एफए उत्पादन मशीनरी नहीं है जैसा कि भूरे और बेज वसा के आईएमएम में पाया जाता है।

एएसी के माध्यम से एच + वर्तमान आयाम की मात्रा का ठहराव के लिए बेसलाइन (या शून्य वर्तमान) एफए के अलावा से पहले आईएमएम की सतह पर एचईपीईएस स्नान समाधान (तालिका 6) से मेल खाती है। यह पुष्टि करने के लिए कि मापा गया एच + वर्तमान एएसी द्वारा किया जाता है, एएसी के विशिष्ट अवरोधकों को एफए में जोड़ा जाता है, कार्बोक्सियाट्रेक्टिलोसाइड (सीएटीआर, चित्रा 5 ए) के 1 μ एम या बोन्कग्रेकिक एसिड (बीकेए, नहीं दिखाया गया) 5 के 4 μ एम, जो लगभग पूरी तरह से एच + वर्तमान को रोकते हैं। यह वर्तमान एएसी 1-/- चूहों (चित्रा 5 ए) के आईएमएम में पूरी तरह से गायब हो जाता है, एएसी 1 हृदय5 में प्रमुख आइसोफॉर्म है।

एफए-निर्भर एच + रिसाव और न्यूक्लियोटाइड्स के बीच बातचीत का पैच-क्लैंप विश्लेषण एएसी5 के साथ भी संभव है। हालांकि, एएसी और यूसीपी 1 के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर है: एएसी न केवल एच + वहन करता है बल्कि इसका मुख्य कार्य एडेनिन न्यूक्लियोटाइड एडीपी और एटीपी21 को परिवहन करना है। अध्ययन करने के लिए कि एडेनिन न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज एफए-निर्भर एच + रिसाव को कैसे प्रभावित करता है, 1 एमएम एमजी2 + मुक्त एडीपी को विंदुक समाधान में जोड़ा जाता है। फिर, एफए को एएसी के माध्यम से एच + वर्तमान को सक्रिय करने के लिए संक्रमित किया जाता है। पिपेट समाधान में केवल एडीपी एच + वर्तमान5 के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है। एक बार एक स्थिर एच + वर्तमान आयाम तक पहुंचने के बाद, एडीपी एफए के साथ एक साथ संक्रमित हो जाता है। केवल जब एडीपी एएसी के माध्यम से एक सक्रिय न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज उत्पन्न करने के लिए झिल्ली के दोनों किनारों पर मौजूद होता है, तो एच + रिसाव का एक निरंतर लेकिन कभी भी पूर्ण अवरोध प्राप्त नहीं होता है (चित्रा 5 बी)। यह इंगित कर सकता है कि एएसी (एफए-एच + वर्तमान और एडीपी / एटीपी एक्सचेंज) के दो परिवहन मोड प्रतिस्पर्धा करते हैं और एक ही स्थानान्तरण मार्ग के माध्यम से होने की संभावना है। एडीपी होमोएक्सचेंज को शारीरिक एडीपी / एटीपी हेटरोएक्सचेंज5 से जुड़े अतिरिक्त वर्तमान से बचने के लिए चुना गया था।

Figure 1
चित्रा 1: गर्मी और एटीपी उत्पादन के बीच माइटोकॉन्ड्रियल ऊर्जा वितरण। माइटोकॉन्ड्रियल एटीपी और गर्मी उत्पादन के तंत्र। माइटोकॉन्ड्रिया में दो झिल्ली [ओएमएम (बैंगनी) और आईएमएम (नारंगी)] होते हैं, जिनमें एटीपी और गर्मी उत्पादन के लिए मशीनरी होती है। ईटीसी आईएमएम में एच + का एक इलेक्ट्रोकेमिकल ग्रेडिएंट उत्पन्न करता है, जिसका उपयोग एटीपी सिंथेस (एएस) द्वारा एटीपी का उत्पादन करने के लिए किया जाता है और गर्मी उत्पन्न करने के लिए यूसीपी द्वारा उपयोग किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: माइटोकॉन्ड्रियल पैच-क्लैंप तकनीक (बर्थोलेट एट अल से संशोधित 2020) 15. (ए) माइटोकॉन्ड्रिया को सेंट्रीफ्यूजेशन (बैंगनी में ओएमएम और नारंगी में आईएमएम) द्वारा ऊतक लाइसेट से अलग किया जाता है। (बी) कम दबाव वाले फ्रांसीसी प्रेस आईएमएम को जारी करने के लिए ओएमएम को तोड़ देता है जो एक मिटोप्लास्ट देता है। बाएं पैनल एक मिटोप्लास्ट का प्रतिनिधित्व करता है, जो आईएमएम से जुड़े ओएमएम के अवशेषों के साथ 8-आकार का रूप मानता है। एक ग्लास विंदुक को एक गीगाओहम सील (मिटोप्लास्ट-संलग्न कॉन्फ़िगरेशन) बनाने के लिए आईएमएम से संपर्क किया जाता है। मिटोप्लास्ट-संलग्न कॉन्फ़िगरेशन की एक तस्वीर सही पैनल में दिखाई गई है। (सी) पूरे आईएमएम (बाएं पैनल में आरेख) का विन्यास कई वोल्टेज दालों (200-500 एमवी) द्वारा विंदुक के तहत झिल्ली पैच को तोड़ने के बाद प्राप्त किया जाता है। पूरे आईएमएम कॉन्फ़िगरेशन की एक तस्वीर सही पैनल में दिखाई गई है। आवक धाराएं (I, लाल) नकारात्मक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: फ्रेंच प्रेस और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सेटअप। (ए) फ्रेंच प्रेस की तस्वीर, जो आईएमएम जारी करने के लिए ओएमएम को तोड़ने में मदद करती है। (बी) एक फैराडे पिंजरे की तस्वीर, अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी), 60 एक्स पानी विसर्जन उद्देश्य, एक कंपन अलगाव तालिका, और एक माइक्रोमैनिपुलेटर के साथ उल्टे माइक्रोस्कोप। मानक एम्पलीफायर, एक मानक डिजिटाइज़र, और पीसी कंप्यूटर चित्र में नहीं दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: भूरे रंग की वसा में यूसीपी 1 के माध्यम से एच + वर्तमान (ए) प्रतिनिधि यूसीपी 1-निर्भर एच + वर्तमान डब्ल्यूटी (ऊपरी पैनल) और यूसीपी 1−/- चूहों (निचले पैनल) से अलग भूरे रंग के वसा मिटोप्लास्ट से दर्ज किया गया है। काले रंग में दिखाए गए नियंत्रण एच + वर्तमान निशान आईएमएम टूटने के बाद स्थिर वर्तमान आयाम के अनुरूप हैं। 1 एमएम जीडीपी को तब स्नान समाधान (नारंगी) में जोड़ा जाता है। वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल डब्ल्यूटी निशान के ऊपर दिखाया गया है। स्नान और विंदुक समाधान के पीएच विंदुक-मिटोप्लास्ट आरेख में दिखाए जाते हैं। (ख) "भूरे रंग की वसा में प्यूरीन न्यूक्लियोटाइड्स द्वारा यूसीपी 1 का निषेध". थर्मोन्यूट्रलिटी में चूहों के भूरे रंग की वसा के आईएमएम के साइटोसोलिक चेहरे पर एटीपी की विभिन्न सांद्रता में प्रतिनिधि यूसीपी 1-निर्भर एच + वर्तमान निशान। यूसीपी 1-निर्भर एच + वर्तमान को 0.5 एमएम ओलेइक एसिड (ओए) के साथ 10 एमएम एमसीडी के साथ मिश्रित किया गया था। निचले पैनल में, एक ही ट्रेस का प्रतिनिधित्व किया जाता है लेकिन मिटोप्लास्ट झिल्ली समाई के साथ सामान्यीकृत नहीं किया जाता है। इस आंकड़े में भूरे रंग के वसा वाले मिटोप्लास्ट में 0.624 पीएच की झिल्ली समाई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: दिल के मिटोप्लास्ट में एएसी के माध्यम से एफए-निर्भर एच + वर्तमान। (ए) प्रतिनिधि एएसी-निर्भर एच + वर्तमान जब डब्ल्यूटी दिल मिटोप्लास्ट में स्नान समाधान (ऊपरी पैनल, नारंगी) में 2 μM एए लागू किया जाता है और 1 μM CATR (बैंगनी) द्वारा बाधित होता है। एएसी 1 -/- हार्ट मिटोप्लास्ट में दर्ज प्रतिनिधि ट्रेस निचले पैनल में हैं। नियंत्रण वर्तमान काले रंग में है। वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल डब्ल्यूटी निशान के ऊपर दिखाया गया है। स्नान और विंदुक समाधान के पीएच विंदुक-मिटोप्लास्ट आरेख में दिखाए जाते हैं। (बी) जबकि विंदुक समाधान में 1 एमएम एडीपी होता है, एएसी-निर्भर एच + वर्तमान 2 μM एए (नारंगी) द्वारा प्रेरित होता है और स्नान (बैंगनी) के लिए 1 एमएम एडीपी के अलावा बाधित होता है। वोल्टेज रैंप प्रोटोकॉल ट्रेस के ऊपर दिखाया गया है। स्नान और विंदुक समाधान के पीएच विंदुक-मिटोप्लास्ट आरेख में दिखाए जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
शर्करा 250 mM
HEPES 10 mM
EGTA 1 mM
पीएच TrisBase के साथ 7.2 करने के लिए समायोजित

तालिका 1: माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव बफर (टोनिसिटी ~ 300 एमएमओएल प्रति किलो)

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
शर्करा 140 m M
डी-मैनिटोल 440 m MM
HEPES 10 mM
EGTA 1 mM
पीएच TrisBase के साथ 7.2 करने के लिए समायोजित

तालिका 2: हाइपरटोनिक-मैनीटोल बफर

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
केसीएल 750 m MM
HEPES 20 mM
EGTA 1 mM
पीएच TrisBase के साथ 7.2 करने के लिए समायोजित

तालिका 3: हाइपरटोनिक-केसीएल बफर

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
टीएमए 130 mM
HEPES 100 mM
EGTA 1 mM
यूसीपी 1 रिकॉर्डिंग के लिए एमजीसीएल2 2 mM
नहीं तो
एएसी रिकॉर्डिंग के लिए ट्राइससीएल
पीएच डी-ग्लूकोनिक एसिड के साथ 7.0 या 7.5 में समायोजित किया गया

तालिका 4: टीएमए-आधारित विंदुक समाधान (टोनिसिटी ~ 360 एमएमओएल प्रति किलो)

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
केसीएल 150 m MM
HEPES 10 mM
EGTA 1 mM
पीएच TrisBase के साथ 7.0 करने के लिए समायोजित

तालिका 5: केसीएल स्नान समाधान (टोनिसिटी ~ 300 एमएमओएल प्रति किलो)

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) अंतिम एकाग्रता
शर्करा यूसीपी 1 रिकॉर्डिंग के लिए 100 एमएम
नहीं तो
एएसी रिकॉर्डिंग के लिए 150 एमएम
HEPES यूसीपी 1 रिकॉर्डिंग के लिए 150 एमएम
नहीं तो
एएसी रिकॉर्डिंग के लिए 100 एमएम
1 mM EGTA
पीएच TrisBase के साथ 7.0 करने के लिए समायोजित

तालिका 6: एचईपीईएस स्नान समाधान (टोनिसिटी ~ 300 एमएमओएल प्रति किलो)

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Discussion

इस विधि लेख का उद्देश्य हाल ही में माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप तकनीक को प्रस्तुत करना है, जो माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस 5,6,7,15 के लिए जिम्मेदार आईएमएम के माध्यम से सीधे एच + रिसाव का अध्ययन करने के लिए एक नया दृष्टिकोण है। यह तकनीक ऊतकों तक ही सीमित नहीं है और इसका उपयोग एचएपी 1, सीओएस 7, सी 2 सी 12 और एमईएफ कोशिकाओं जैसे विभिन्न मानक मानव और सेल मॉडल में एच + रिसाव और आईएमएम के अन्य आचरण का विश्लेषण करने के लिए भी किया जा सकता है। हालांकि, प्रत्येक माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव के लिए प्रत्येक कोशिका या ऊतक प्रकार के लिए विशिष्ट कुछ पुन: समायोजन की आवश्यकता होती है।

भूरे रंग के वसा 5,6 और हृदय 5 के आईएमएम के माध्यम से एच + धाराओं के प्रत्यक्ष माप में मुख्य चरणों को विशेष थर्मोजेनिक और गैर-वसा ऊतकों में माइटोकॉन्ड्रियल थर्मोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार तंत्र को चित्रित करने के लिए यहां संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है। दरअसल, पहली बार इस तकनीक का विकास महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक स्थितियों के सटीक नियंत्रण के साथ अपने मूल झिल्ली वातावरण में दो मुख्य यूसीपी (यूसीपी 1 और एएसी) के उच्च-रिज़ॉल्यूशन कार्यात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है जैसे: 1) विंदुक का पीएच और स्नान समाधान, 2) आईएमएम में झिल्ली क्षमता का नियंत्रण, और 3) एच + के अलावा आईएमएम के लिए पारगम्य किसी भी आयनों और मेटाबोलाइट्स को बाहर करने के लिए समाधान की सटीक संरचना। टीएमए-आधारित विंदुक (तालिका 4) और एचईपीईएस स्नान समाधान (तालिका 6) एच + धाराओं को रिकॉर्ड करने के लिए तैयार किए जाते हैं और इसमें केवल लवण होते हैं जो बड़े आयनों में अलग हो जाते हैं और आमतौर पर आईएमएम के लिए अभेद्य होते हैं। जबकि स्नान समाधान को छिड़काव प्रणाली का उपयोग करके बदला जा सकता है, जिससे झिल्ली के साइटोसोलिक पक्ष पर विभिन्न उपचार लागू किए जा सकते हैं, इंट्रापिपेट समाधान की संरचना को बदलना संभव नहीं है। यह मैट्रिक्स पक्ष पर होने वाले नियामक तंत्र की समझ को सीमित करता है। दरअसल, यौगिकों को पिपेट भरने के समय इंट्रापिपेट समाधान के भीतर मौजूद होना चाहिए। इसलिए, एच + रिसाव का अध्ययन अन्य धाराओं के अलगाव में किया जा सकता है। औषधीय अध्ययन और केओ चूहों का उपयोग विभिन्न ऊतकों 5,6,7 के आईएमएम के माध्यम से एच + वर्तमान के लिए जिम्मेदार प्रोटीन के लक्षण वर्णन और पहचान के लिए आवश्यक थे। इन परिणामों ने स्थापित किया कि यूसीपी 1 भूरे और बेज वसा का मुख्य यूसीपी है, और गैर-वसा ऊतकों में एएसी है। हम यूसीपी 1 और एएसी द्वारा मध्यस्थता नहीं किए गए अन्य एच + धाराओं के अस्तित्व की संभावना को पूरी तरह से बाहर नहीं कर सकते हैं। हालांकि, यदि अन्य एच + धाराएं मौजूद हैं, तो उनका आयाम हमारे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल सेटअप के संकल्प से परे था। हम इस पत्र में वर्णित शर्तों के तहत ईटीसी के एच + पंपिंग को नहीं मापते हैं। एक बार जब हम पूरे आईएमएम कॉन्फ़िगरेशन तक पहुंच जाते हैं, तो माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स को इंट्रा-विंदुक समाधान के छिड़काव द्वारा धोया जाता है। फ्रेंच प्रेस के साथ ओएमएम को तोड़ने के कदम के बाद से इंटरमेम्ब्रेन स्पेस अब मौजूद नहीं है। ईटीसी के माध्यम से एच + पंपिंग के लिए महत्वपूर्ण श्वसन परिसरों के कोई सब्सट्रेट नहीं जोड़े गए हैं। इसलिए यहां विस्तृत इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल स्थितियों के तहत सक्रिय एच + पंपिंग विकसित करने की संभावना नहीं है।

उत्पादित पैच की एकल चैनल रिकॉर्डिंग इस आलेख में वर्णित नहीं हैं। यद्यपि आईएमएम में यूसीपी 1- और एएसी-निर्भर एच + धाराएं उनके उच्च प्रोटीन घनत्व के कारण मजबूत हैं, एकल-चैनल उद्घाटन को हल नहीं किया जा सका क्योंकि यूसीपी 1 और एएसी एकात्मक धाराओं का आयाम शायद बहुत छोटा है।

जैव रासायनिक अध्ययनों के विपरीत, इस लेख में वर्णित माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव को माइटोकॉन्ड्रियल शुद्धता के उच्च स्तर के परिणामस्वरूप होने की आवश्यकता नहीं है। दरअसल, व्यक्तिगत मिटोप्लास्ट और सेल मलबे की भीड़ से युक्त माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी को माइक्रोस्कोप के नीचे स्कैन किया जाता है ताकि पैच के लिए एक 8-आकार का मिटोप्लास्ट मिल सके। मिटोप्लास्ट का 8-आकार का रूप फ्रांसीसी प्रेस प्रक्रिया (चित्रा 2) के कारण ओएमएम में एक छेद के माध्यम से आईएमएम की रिहाई के कारण होता है। कम घने लोब आईएमएम15,17 से मेल खाती है। एक उपयुक्त तैयारी को स्वतंत्र रूप से चलती मिटोप्लास्ट द्वारा परिभाषित किया जा सकता है जिसे सेलुलर मलबे से आसानी से अलग किया जा सकता है। हालांकि, आईएमएम के संदूषण से बचने के लिए मलबे की संख्या को कम करना महत्वपूर्ण है, जो झिल्ली के साथ ग्लास विंदुक की मुहर की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। माइक्रोस्कोप के तहत यह स्कैनिंग चरण ओएमएम द्वारा सीमांकित एक की तुलना में कम घने लोब द्वारा मान्यता प्राप्त उच्च आईएमएम अखंडता के साथ एक मिटोप्लास्ट चुनना संभव बनाता है और इसलिए एक सफल ब्रेक-इन की संभावना बढ़ जाती है।

इस तकनीक ने पहली बार अपने मूल झिल्ली के भीतर यूसीपी 1- और एएसी-निर्भर एच + धाराओं का प्रत्यक्ष माप प्रदान किया। हालांकि, ओएमएम और शायद क्रिस्टी के टूटने के कारण माइटोकॉन्ड्रियल अखंडता और कंपार्टमेंटलाइजेशन अब मौजूद नहीं है। इसलिए बरकरार माइटोकॉन्ड्रिया में नए विशेषता प्रोटीन की शारीरिक भूमिका की पुष्टि करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन जैसे अन्य शास्त्रीय तरीकों के साथ पैच-क्लैंप विश्लेषण को पूरक करना आवश्यक है।

माइटोकॉन्ड्रिया पर लागू पैच-क्लैंप तकनीक माइटोकॉन्ड्रियल एच + रिसाव और थर्मोजेनेसिस के लिए जिम्मेदार आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए नई संभावनाएं प्रदान करती है। आधुनिक सेलुलर और आणविक तकनीकों के साथ संयुक्त, यह अभिनव दृष्टिकोण उन तंत्रों में नई अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा जो माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता को नियंत्रित करते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन से जुड़े रोगों का मुकाबला करने के लिए उन्हें कैसे लक्षित किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करता है।

Acknowledgments

यूरी किरिचोक को उस महान विज्ञान के लिए धन्यवाद देता हूं जिसका मैं अपनी प्रयोगशाला में हिस्सा था और सहायक चर्चाओं के लिए किरिचोक प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं। मैं एएसी 1 नॉकआउट चूहों को प्रदान करने के लिए डॉ डगलस सी वालेस को भी धन्यवाद देता हूं। फंडिंग: एएमबी को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन करियर डेवलपमेंट अवार्ड 19सीडीए 34630062 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% gelatin Millipore ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 Olympus UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries Sutter Instruments BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer Molecular Devices
Faraday cage Homemade
French Press Glen Mills 5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope Olympus IX71 or IX73
Micro Forge (Narishige) MF-830
Micromanupulator MPC-385 Sutter Instruments FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge World Precision Instruments MEH3F4515
Micropipette Puller (Sutter Instruments) P97
Mini Cell for French Press Glen Mills 5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM Cole Parmer EW-50705-50
Objective 100X magnification Nikon  lens MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10 Molecular Devices
Perfusion chamber Warner Instruments RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml Wheaton 358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD Thermo Scientific 75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness Warner Instruments 640700
Vibration isolation table Newport VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid Sigma Aldrich G1951
D-mannitol  Sigma Aldrich M4125
EGTA  Sigma Aldrich 3777
HEPES  Sigma Aldrich H7523
KCl  Sigma Aldrich 60128
MgCl2  Sigma Aldrich 63068
sucrose  Sigma Aldrich S7903
TMA  Sigma Aldrich 331635
TrisBase  Sigma Aldrich T1503
TrisCl  Sigma Aldrich T3253

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References

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जीवविज्ञान अंक 171
माइटोकॉन्ड्रिया की थर्मोजेनिक क्षमता का अध्ययन करने के लिए पैच-क्लैंप तकनीक का उपयोग
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Bertholet, A. M. The Use of the… More

Bertholet, A. M. The Use of the Patch-Clamp Technique to Study the Thermogenic Capacity of Mitochondria. J. Vis. Exp. (171), e62618, doi:10.3791/62618 (2021).

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