Summary
Este artículo de método detalla los principales pasos para medir la fuga de H + a través de la membrana mitocondrial interna con la técnica patch-clamp, un nuevo enfoque para estudiar la capacidad termogénica de las mitocondrias.
Abstract
La termogénesis mitocondrial (también conocida como desacoplamiento mitocondrial) es uno de los objetivos más prometedores para aumentar el gasto de energía para combatir el síndrome metabólico. Los tejidos termogénicos como las grasas marrones y beige desarrollan mitocondrias altamente especializadas para la producción de calor. Las mitocondrias de otros tejidos, que producen principalmente ATP, también convierten hasta el 25% de la producción total de energía mitocondrial en calor y, por lo tanto, pueden tener un impacto considerable en la fisiología de todo el cuerpo. La termogénesis mitocondrial no solo es esencial para mantener la temperatura corporal, sino que también previene la obesidad inducida por la dieta y reduce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) para proteger las células del daño oxidativo. Dado que la termogénesis mitocondrial es un regulador clave del metabolismo celular, una comprensión mecanicista de este proceso fundamental ayudará en el desarrollo de estrategias terapéuticas para combatir muchas patologías asociadas con la disfunción mitocondrial. Es importante destacar que los mecanismos moleculares precisos que controlan la activación aguda de la termogénesis en las mitocondrias están mal definidos. Esta falta de información se debe en gran medida a la escasez de métodos para la medición directa de proteínas de desacoplamiento. El reciente desarrollo de la metodología patch-clamp aplicada a las mitocondrias permitió, por primera vez, el estudio directo del fenómeno en el origen de la termogénesis mitocondrial, fuga de H+ a través de la IMM, y la primera caracterización biofísica de los transportadores mitocondriales responsables de la misma, la proteína desacoplamiento 1 (UCP1), específica de las grasas marrones y beige, y el transportador ADP/ATP (AAC) para todos los demás tejidos. Este enfoque único proporcionará nuevos conocimientos sobre los mecanismos que controlan la fuga de H + y la termogénesis mitocondrial y cómo se pueden dirigir para combatir el síndrome metabólico. Este artículo describe la metodología patch-clamp aplicada a las mitocondrias para estudiar su capacidad termogénica midiendo directamente las corrientes H+ a través del IMM.
Introduction
Las mitocondrias son famosas por ser la central eléctrica de la célula. De hecho, son la principal fuente de energía química, el ATP. Lo que es menos conocido es que las mitocondrias también generan calor. De hecho, cada mitocondria genera constantemente los dos tipos de energías (ATP y calor) y un fino equilibrio entre las dos formas de energía define la homeostasis de las células metabólicas (Figura 1). Cómo las mitocondrias distribuyen la energía entre el ATP y el calor es sin duda la pregunta más fundamental en el campo de la bioenergética, aunque todavía es en gran parte desconocida. Sabemos que el aumento de la producción de calor mitocondrial (llamado termogénesis mitocondrial) y, en consecuencia, la reducción de la producción de ATP aumenta el gasto de energía y esta es una de las mejores maneras de combatir el síndrome metabólico1.
La termogénesis mitocondrial se origina a partir de la fuga de H + a través de la membrana mitocondrial interna (IMM), lo que lleva al desacoplamiento de la oxidación del sustrato y la síntesis de ATP con la consiguiente producción de calor, de ahí el nombre de "desacoplamiento mitocondrial"1 (Figura 1). Esta fuga de H + depende de transportadores mitocondriales llamados proteínas de desacoplamiento (UCP). UCP1 fue el primer UCP identificado. Solo se expresa en tejidos termogénicos, grasa marrón y grasa beige en los que las mitocondrias están especializadas para la producción de calor 2,3,4. La identidad de la UCP en tejidos no adiposos como el músculo esquelético, el corazón y el hígado, ha seguido siendo controvertida. Las mitocondrias en estos tejidos pueden tener alrededor del 25% de la energía mitocondrial total convertida en calor, lo que puede afectar significativamente la fisiología de todo el cuerpo1. Además de mantener la temperatura corporal central, la termogénesis mitocondrial también previene la obesidad inducida por la dieta al reducir las calorías. Además, reduce la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) por las mitocondrias para proteger a las células del daño oxidativo1. Por lo tanto, la termogénesis mitocondrial está involucrada en el envejecimiento normal, los trastornos degenerativos relacionados con la edad y otras afecciones que involucran estrés oxidativo, como la isquemia-reperfusión. Por lo tanto, la termogénesis mitocondrial es un poderoso regulador del metabolismo celular, y una comprensión mecanicista de este proceso fundamental promoverá el desarrollo de estrategias terapéuticas para combatir muchas patologías asociadas con la disfunción mitocondrial.
La respiración mitocondrial fue la primera técnica en revelar el papel crucial de la termogénesis mitocondrial en el metabolismo celular y sigue siendo la más popular en la comunidad1. Esta técnica se basa en la medición del consumo de oxígeno por la cadena de transporte de electrones mitocondrial (ETC) que aumenta cuando se activa la fuga mitocondrial de H+. Esta técnica, aunque instrumental, no puede estudiar directamente la fuga mitocondrial de H+ a través de la IMM1, lo que dificulta la identificación y caracterización precisa de las proteínas responsables de ella, particularmente en tejidos no adiposos en los que la producción de calor es secundaria en comparación con la producción de ATP. Recientemente, el desarrollo de la técnica patch-clamp aplicada a las mitocondrias, proporcionó el primer estudio directo de fuga de H + a través de toda la IMM en varios tejidos 5,6,7.
El parche-pinza mitocondrial de toda la IMM fue establecido por primera vez de forma reproducible por Kirichok et al.8. Describieron la primera medición directa de las corrientes de uniporter de calcio mitocondrial (MCU) en 2004 utilizando mitplastos de líneas celulares COS-78. Más tarde, el laboratorio de Kirichok mostró corrientes de calcio de IMM de ratón9 y tejidos de Drosophila 9. Otros laboratorios ahora usan rutinariamente esta técnica para estudiar las propiedades biofísicas de MCU 10,11,12,13,14. El análisis completo de la pinza de parche IMM de la conductancia de potasio y cloruro también es posible y se ha mencionado en varios artículos, pero aún no ha sido el tema principal de una publicación 6,7,9. La primera medición de las corrientes H + a través de la IMM se informó en 2012 de las mitocondrias de grasa marrónde ratón 6, y de las mitocondrias de grasa beige de ratón en 20177. Esta corriente se debe a la proteína desacoplamiento específica de los tejidos termogénicos, UCP1 6,7. Un trabajo reciente publicado en 2019 caracterizó la CAA como la principal proteína responsable de la fuga mitocondrial de H + en tejidos no adiposos como el corazón y el músculo esquelético5.
Este enfoque único ahora permite el análisis funcional directo de alta resolución de los canales iónicos mitocondriales y los transportadores responsables de la termogénesis mitocondrial. Para facilitar la expansión del método y complementar otros estudios como la respiración mitocondrial, a continuación se describe un protocolo detallado para medir las corrientes H + transportadas por UCP1 y AAC. Se describen tres pasos importantes: 1) aislamiento mitocondrial de la grasa marrón del ratón para analizar la corriente H + dependiente de UCP1 y aislamiento mitocondrial del corazón para analizar la corriente H + dependiente de CAA, 2) preparación de mitplastos con una prensa francesa para la ruptura mecánica de la membrana mitocondrial externa (OMM), 3) registros de pinza de parche de las corrientes H + dependientes de UCP1 y CAA en toda la IMM.
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Protocol
Todos los procedimientos experimentales con animales que se realizaron cumplen con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de California en Los Ángeles (IACUC).
NOTA: El procedimiento de aislamiento mitocondrial se basa en la centrifugación diferencial y varía ligeramente de un tejido a otro. Por ejemplo, dado que el tejido adiposo marrón es extremadamente rico en lípidos, requiere un paso adicional para separar los restos celulares y los orgánulos de la fase lipídica antes de cosechar las mitocondrias. Para evitar confusiones, los dos procedimientos de aislamiento mitocondrial (uno de la grasa marrón y el otro del corazón) se detallan a continuación.
1. Aislamiento mitocondrial de la grasa marrón interescapular de ratón (modificada de Bertholet et al. 2020)15
- Sacrificar al ratón macho C57BL/6 utilizando asfixia por CO2 y posterior luxación cervical, según lo recomendado por el Panel de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y el Comité de la IACUC.
- Después de colocar el ratón con el vientre mirando hacia la mesa, rocíe alcohol para limpiar y mojar el cabello (modificado de Mann et al., 2014)16.
- Haga una incisión de 2 cm en la parte superior de la espalda después de agarrar la piel con pinzas.
- Extrae la grasa interescapular marrón del ratón que corresponde a un órgano de dos lóbulos con forma de mariposa16.
- Transfiera la grasa marrón a una placa de Petri de 35 mm llena de 5 ml de tampón de aislamiento en frío (Tabla 1) previamente colocada sobre hielo.
- Limpie la grasa marrón de la grasa blanca debajo de un binocular.
- Transfiera la grasa marrón a un vaso de precipitados de 10 ml con 5 ml de tampón de aislamiento en frío (Tabla 1) para cortarla en trozos delgados. Transfiera al homogeneizador de vidrio de 10 ml refrigerado por hielo (material plástico politetrafluoroetileno (PTFE) mortero).
- Use un agitador superior para homogeneizar el tejido precortado en hielo con seis golpes suaves a una velocidad controlada de 275 rotaciones / min.
- Centrifugar el homogeneizado a 8.500 x g durante 10 min a 4 °C en un tubo cónico helado de 15 ml. Deseche el sobrenadante que contiene la fase lipídica.
- Resuspendir el pellet en 5 mL de tampón de aislamiento helado (Tabla 1) y homogeneizar, por segunda vez, la suspensión sobre hielo con seis golpes lentos a una velocidad de 275 rotación/min.
- Transfiera el homogeneizado en un tubo cónico helado de 15 ml y centrífuguelo a 700 x g durante 10 min a 4 °C para granular todos los núcleos y células intactas.
- Recoge el sobrenadante en un tubo fresco de 15 ml y colócalo sobre hielo.
- Centrifugar el sobrenadante a 8.500 x g durante 10 min a 4 °C para obtener un pellet que contenga mitocondrias.
- Resuspend pellet que contiene mitocondrias en 3,8 mL de tampón hipertónico-manitol helado (Tabla 2) e incubar la suspensión mitocondrial en hielo durante 10-15 min.
2. Aislamiento mitocondrial del corazón de ratón (modificado de Garg et al. 2019)17
- Sacrificar al ratón macho C57BL/6 utilizando asfixia por CO2 y posterior luxación cervical, según lo recomendado por el Panel de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria y el Comité de la IACUC.
- Después de colocar el ratón sobre su espalda, rocíe alcohol para limpiar y mojar el cabello. Luego, haga una incisión de 2 cm en el tórax después de agarrar la piel con pinzas.
- Diseccionar el corazón del pecho del animal y enjuagarlo para extraer toda la sangre en un vaso de precipitados de 10 ml con 5 ml de la solución de aislamiento en frío (Tabla 1).
- Una vez que el corazón haya sido limpiado de rastros de sangre, transfiéralo a otro vaso de precipitados de 10 ml que contenga 5 ml de tampón de aislamiento en frío (Tabla 1) para cortarlo en trozos delgados. Luego, transfiera a un homogeneizador de vidrio de 10 ml refrigerado por hielo (mortero de PTFE).
- Use un agitador superior para homogeneizar el tejido precortado en hielo con seis golpes suaves a una velocidad controlada de 275 rotaciones / min.
- Transfiera el homogeneizado a un tubo cónico helado de 15 ml y centrífuguelo a 700 x g durante 10 minutos a 4 °C a núcleos de gránulos y células intactas.
- Recoge el sobrenadante en un tubo fresco de 15 ml y colócalo sobre hielo.
- Centrifugar el sobrenadante a 8.500 x g durante 10 min a 4 °C para obtener un pellet que contenga mitocondrias.
- Resuspend el pellet mitocondrial en 3,8 mL de tampón hipertónico-manitol helado (Tabla 2) e incubar la suspensión mitocondrial en hielo durante 10-15 min.
3. Preparación de mitplastos con prensa francesa para rotura mecánica del OMM.
NOTA: El procedimiento de prensa francés permite liberar el IMM del OMM con su integridad preservada, incluyendo la matriz y la crista (Figura 2)18. Las mitocondrias se preincuban en un tampón de manitol hipertónico (Tabla 2) y se someten a una presión más baja durante el procedimiento de prensa francesa para evitar cualquier estiramiento drástico de la IMM cuando se rompe la OMM.
- Llene la suspensión mitocondrial-hipertónica-manitol en una mini celda de presión refrigerada (diámetro del pistón 3/8") de la prensa francesa (Figura 3A).
- Seleccione el modo Medio de la Prensa Francesa y comprima la suspensión a través de la mini celda de presión a 110 en el dial de la Prensa Francesa para las mitocondrias de grasa marrón y a 140 para las mitocondrias del corazón (~2,000 psi). Asegúrese de que la suspensión salga de la mini celda de presión a una velocidad de aproximadamente 1 gota / s.
- Recoge las gotas en un tubo cónico helado de 15 ml.
- Centrifugar la suspensión a 10.500 x g durante 10 min a 4 °C.
- Resusped el pellet de mitplastos en 0.5-2 mL de tampón Hypertonic-KCl helado (Tabla 3) y almacene la suspensión en hielo.
NOTA: Los miplastos de grasa marrón y corazón están listos para grabaciones de pinza de parche y deben permanecer utilizables durante aproximadamente 3-6 h.
4. Registros electrofisiológicos de fuga de H+ a través de UCP1 y AAC 5,7,15
NOTA: Utilice la siguiente configuración electrofisiológica (Figura 3B): microscopio invertido con contraste de interferencia diferencial (DIC), objetivo de inmersión en agua 60x, mesa de aislamiento de vibraciones y una jaula de Faraday, un amplificador estándar que admite grabaciones de bajo ruido, un digitalizador estándar utilizado para la configuración electrofisiológica, pClamp 10, un micromanipulador, electrodo de referencia de baño (puente de sal de 3 M KCl-agar insertado dentro de un soporte de microelectrodo que contiene un pellet de cloruro de plata / plata moldeado en el cuerpo del titular (descrito en Liu et al. 2021)19, cámara de perfusión con un fondo de cubierta de vidrio de 0,13 mm, conectada a un sistema de perfusión alimentado por gravedad.
- Tire de los filamentos de vidrio de borosilicato el día de la grabación utilizando un extractor de micropipetas. Coloque un programa en el extractor utilizado para generar pipetas con un alto grado de reproducibilidad20.
NOTA: Este diseño de programa requiere varios intentos para obtener pipetas optimizadas para la abrazadera de parche IMM. Una pipeta estándar tiene puntas finas con una forma cónica progresiva. - Inserte un filamento de vidrio dentro del extractor y tire para obtener casi dos pipetas de parche idénticas de un filamento de borosilicato.
- Ajuste el programa cuando las pipetas se vuelvan inconsistentes entre los ciclos de tracción debido al envejecimiento del filamento de la caja de calentamiento del extractor.
- Coloque la pipeta dentro del pulidor de pipetas y coloque la punta cerca del filamento con un aumento de 100x para pulirla al fuego.
- Presione el pedal varias veces para calentar el filamento sin obstruir o dañar la curva de la punta.
- Pulir hasta que se obtengan pipetas con una resistencia entre 25 y 35 MΩ cuando se llenan con solución de pipeta a base de TMA (TMA para hidróxido de tetrametilamonio, Tabla 4).
- Preincubar los cubrehojas (5 mm de diámetro, 0,1 mm de espesor) con gelatina al 0,1% para reducir la adhesión del mitoplasto y enjuagarlos con la solución de baño KCl (Tabla 5) antes de depositar la suspensión de mitoplastos.
- Prepare una dilución cruda mezclando ~ 35 μL de la suspensión de mitoplastos concentrados con 500 μL de la solución de baño KCl (Tabla 5) y colóquela en fundas previamente colocadas en un pozo de una placa de 4 pocillos.
- Incubar en hielo durante 15 a 20 min para que los mitoplastos sedimenten en la cubierta.
- Llene la cámara de baño completamente con ~ 50 μL de la solución de baño KCl (Tabla 5).
- Transfiera un coverslip con mitólogos dentro de la cámara usando pinzas de microdisección delgadas con una punta doblada.
- Coloque el cubrebocas en la parte inferior de la cámara. No perfunda la cámara para mantener los mitóticos estables en la cubierta.
- Elija un mitplasto no adhesivo individual en forma de 8 escaneando la cubierta bajo el microscopio con un objetivo de 60x.
- Cargue la pipeta con la solución de pipeta (~50 μL) y colóquela en el soporte de la pipeta.
- Lleve la pipeta a la solución de baño con un micromanipulador y acérquela justo encima del mitótico seleccionado para acercarse a la IMM. El programa amplificador da la resistencia de la pipeta una vez que está en la solución de baño. Mantenga el potencial de membrana a 0 mV y aplique pulsos de 10 mV utilizando el comando de prueba de membrana en el programa del amplificador.
- Aplique una ligera presión negativa para crear rápidamente un gigasellado con el IMM (Figura 2B).
- Levante la pipeta con el mitoplasto unido para mantenerlos alejados de la cubierta para evitar la rotura del sello debido a la deriva de la pipeta durante el experimento.
- Compense los transitorios de capacitancia extraviados con el comando "prueba de membrana" en el programa del amplificador antes de probar la configuración de mitoplasto completo para obtener una medición correcta de capacitancia (Cm) para la membrana del mitplasto después del robo.
- Aplique pulsos de voltaje de corta duración (5-15 ms) (250-600 mV) con el programa amplificador para romper el parche de membrana debajo de la pipeta de vidrio y lograr la configuración de mitoplasto completo (Figura 2C). El allanamiento exitoso se refleja en la reaparición de transitorios de capacitancia.
- Después del robo, ajuste los transitorios de capacitancia con la opción de prueba de membrana del programa amplificador para evaluar la capacitancia de la membrana (que refleja el tamaño del mitplasto) y su resistencia de acceso Ra (que refleja la calidad de la configuración de todo el mitoplasto). Después del robo, Ra debe estar entre 40 y 80 MΩ. Los mitoplastos (de 2-6 μm de tamaño) utilizados para experimentos de pinza de parche suelen tener capacitancias de membrana de 0.5-1.1 pF.
- Inmediatamente después del robo, reemplace la solución de baño KCl (Tabla 5) con la solución de baño HEPES (Tabla 6) iniciando la perfusión.
- Aplique un protocolo de rampa de 850 ms diseñado con el programa amplificador, de -160 mV a +100 mV con un intervalo de 5 s, mientras mantiene el mitótico a 0 mV. Este protocolo funciona para los estudios UCP1 6,7,15 y CAA5 (Figura 4 y Figura 5).
NOTA: Se recomienda para las mediciones de corriente H+ dependientes de UCP1 y AAC adquirir todos los datos electrofisiológicos a 10 kHz y filtrar a 1 kHz utilizando un software adecuado que impulse el amplificador y el digitalizador.
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Representative Results
El desarrollo de la metodología patch-clamp aplicada a las mitocondrias proporcionó el primer estudio directo de la fuga de H+ a través del IMM y los transportadores mitocondriales, UCP1 y AAC, que son los responsables de ello. El análisis electrofisiológico de las fugas de H+ dependientes de UCP1 y CAA puede proporcionar una primera mirada de la capacidad termogénica de las mitocondrias. La sección de resultados describe los procedimientos estándar para medir la fuga de H + a través de UCP1 y AAC.
Medición de corriente H+ dependiente de UCP1 (Figura 4)6,7,15
La aplicación del protocolo de rampa de voltaje induce una corriente H + de gran amplitud a través del IMM de grasa marrón sin la adición de ácidos grasos exógenos (FA), los activadores requeridos de UCPs (Figura 4A). Esta es una característica específica de la grasa marrón y beige IMM debido a la producción local de FA por una actividad de fosfolipasa asociada con la membrana. Cuando la corriente H + se desarrolla en respuesta al protocolo de rampa, es importante esperar a que la amplitud de la corriente se estabilice. La cuantificación de la amplitud de corriente H+ a través de UCP1 requiere la determinación de la línea de base correspondiente a una corriente UCP1 cero. Una vez alcanzada la estabilidad de la amplitud de corriente H+, se recomienda perfundir el inhibidor de UCP1 Guanosina difosfato (GDP - 1 mM, Figura 4A) o un quelante FA (albúmina sérica bovina libre de FA al 0,5%, no se muestra) o 10 mM metil beta ciclodextrina (MβCD) para la extracción endógena de membrana FA, Figura 4B, traza negra). La corriente residual es la corriente a partir de la cual se determinará la amplitud de las corrientes UCP1. Para ayudar a comparar las amplitudes de las corrientes UCP1 en diferentes mitplastos, la densidad de corriente (pA/pF) de cada mitótico se calcula normalizando las corrientes UCP1 con la capacitancia del mitplasto (Cm)5,7. La corriente puede reactivarse mediante la adición de FA exógena de cadena larga utilizando ácido araquidónico (AA) o ácido oleico (OA) (1-2 μM). Dado que tanto los IMM de grasa marrón como beige poseen actividad PLA2, los FA de membrana endógenos se regeneran parcialmente a los pocos minutos de lavar el MβCD / albúmina del baño, lo que lleva a la reactivación de la corriente H + a través de UCP1 6,7. Como era de esperar, esta corriente desaparece por completo en la IMM de ratones UCP1-/- (Figura 4A)6,7.
Una forma más precisa de comparar la densidad y la actividad de UCP1 de diferentes mitóticos del mismo tejido o de mitóticos de diferentes tejidos (grasa marrón y beige) es controlar la concentración de FA en la superficie de la IMM 6,7. De hecho, la amplitud de la corriente H + podría variar entre mitplastos debido a la cantidad de proteína UCP1 por IMM, pero también debido a la producción de FA endógena. Por lo tanto, se recomienda extraer FA endógena de la IMM y reactivar la corriente H + dependiente de UCP1 agregando FA exógena a una concentración conocida. Para ello, los FA endógenos deben extraerse primero de la IMM perfundiendo una solución de baño HEPES (Tabla 6) que contenga 10 mM MβCD. Luego, para permitir la reactivación de la corriente H + a través de UCP1 solo por una concentración precisa de FA exógenos, este último se perfundirá en un fondo HEPES / MβCD para extraer continuamente los FA producidos a partir del IMM.
El estudio de la competencia entre el nucleótido purínico y la FA para la unión a UCP1 también es posible con la técnica patch-clamp 6,7,15. La inhibición de UCP1 por nucleótidos de purina (por ejemplo, MG2+ ATP libre) se puede comparar con dos concentraciones diferentes de FA (idealmente 10 veces). Para este propósito, la membrana endógena FA se elimina primero aplicando 10 mM MβCD (Figura 4B, traza negra). La aplicación de FA exógenos (por ejemplo, aquí, solo se muestran 0,5 mM de FA) aplicados sobre un fondo de 10 mM MβCD permite un control preciso de la concentración de FA activadores porque los FA producidos localmente se extraen inmediatamente de la membrana. En esta condición, los FA exógenos son los principales responsables del desarrollo de la corriente H +. Posteriormente se agregan diferentes concentraciones de ATP a la solución OA/MβCD para evaluar elATP IC50 para cada concentración de FA ensayada y, por lo tanto, establecer si la AF compite con los nucleótidos de purina para unirse a UCP1.
Medición de corriente H+ dependiente de CAA (Figura 5)5
A diferencia de la grasa marrón, la IMM de los tejidos no adiposos como el músculo esquelético y el corazón no desarrolla un H + medible inmediatamente después del robo (Figura 5, rastros negros). Para inducir una corriente H+ medible a través de CAA, es esencial aplicar la solución de baño HEPES (Tabla 6) que contiene 1-2 μM de FA exógena (AA, Figura 5A, traza roja). Esto puede indicar que el IMM de los tejidos no adiposos no tiene una maquinaria de producción de FA en el IMM como se encuentra en el IMM de las grasas marrones y beige.
La línea de base (o corriente cero) para la cuantificación de la amplitud de la corriente H+ a través de AAC corresponde a la solución de baño HEPES (Tabla 6) perfundida en la superficie de la IMM antes de la adición de FA. Para confirmar que la corriente H+ medida es transportada por la CAA, es importante aplicar inhibidores específicos de la CAA añadidos a la FA, 1 μM de carboxiatractilósido (CATR, Figura 5A) o 4 μM de ácido bonkgrekico (BKA, no se muestra)5, que inhiben casi por completo la corriente H+ . Esta corriente desaparece por completo en el IMM de ratones AAC1-/- (Figura 5A), siendo AAC1 la isoforma predominante en el corazón5.
El análisis con abrazadera de parche de la interacción entre la fuga de H+ dependiente de FA y los nucleótidos también es posible con AAC5. Sin embargo, hay una diferencia importante entre AAC y UCP1: AAC no solo lleva H + sino que su función principal es transportar nucleótidos de adenina ADP y ATP21. Para estudiar cómo el intercambio de nucleótidos de adenina afecta la fuga de H+ dependiente de FA, se agrega 1 mM Mg2+ ADP libre a la solución de pipeta. Luego, se perfunden FA para activar la corriente H + a través de AAC. Solo ADP en la solución de pipeta no interfiere con la corriente H+ 5. Una vez que se alcanza una amplitud de corriente H + estable, ADP se perfunde simultáneamente con FA. Solo cuando ADP está presente en ambos lados de la membrana para generar un intercambio activo de nucleótidos a través de AAC se logra una inhibición constante pero nunca completa de la fuga de H + (Figura 5B). Esto puede indicar que los dos modos de transporte de CAA (corriente FA-H+ e intercambio ADP/ATP) compiten y es probable que se produzcan a través de la misma vía de translocación. El homointercambio ADP/ADP fue seleccionado para evitar la corriente adicional asociada al heterointercambio fisiológico ADP/ATP5.
Figura 1: Distribución de energía mitocondrial entre el calor y la producción de ATP. Mecanismos de producción de ATP mitocondrial y calor. Las mitocondrias tienen dos membranas [la OMM (púrpura) y la IMM (naranja)], que contienen la maquinaria para la producción de ATP y calor. El ETC genera un gradiente electroquímico de H + a través del IMM, que es utilizado por la ATP sintasa (AS) para producir ATP y utilizado por los UCP para generar calor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Técnica mitocondrial patch-clamp (modificada de Bertholet et al. 2020)15. (A) Las mitocondrias se aíslan del lisado tisular por centrifugación (OMM en púrpura e IMM en naranja). (B) La prensa francesa de baja presión rompe el OMM para liberar el IMM que da un mitplasto. El panel izquierdo representa un mitoplastia, que asume una forma de 8 con restos de la OMM unida a la IMM. Una pipeta de vidrio se acerca al IMM para formar un sello gigaohm (configuración unida a un mitoplasto). Una fotografía de la configuración adjunta al mitplasto se muestra en el panel derecho. (C) La configuración de todo el IMM (diagrama en el panel izquierdo) se obtiene después de romper el parche de membrana debajo de la pipeta por varios pulsos de voltaje (200-500 mV). Una fotografía de toda la configuración de IMM se muestra en el panel derecho. Las corrientes internas (I, rojo) son negativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Prensa francesa y configuración electrofisiológica. (A) Imagen de la prensa francesa, que ayuda a romper el OMM para liberar el IMM. (B) Imagen de una jaula de Faraday, microscopio invertido con contraste de interferencia diferencial (DIC), objetivo de inmersión en agua 60x, una mesa de aislamiento de vibraciones y un micromanipulador. El amplificador estándar, un digitalizador estándar y la computadora PC no se muestran en la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Corriente H+ vía UCP1 en grasa marrón. (A) Corriente H+ representativa dependiente de UCP1 registrada a partir de mitplastos de grasa marrón aislados de ratones WT (panel superior) y UCP1−/− (panel inferior). Las trazas de corriente H+ de control que se muestran en negro corresponden a la amplitud de corriente estabilizada después de que se haya roto el IMM. Luego se agrega 1 mM GDP a la solución de baño (naranja). El protocolo de rampa de voltaje se muestra encima de los rastros WT. El pH de las soluciones de baño y pipeta se muestran en el diagrama de pipeta-mitoplasto. (B) Inhibición de UCP1 por nucleótidos de purina en grasa marrón. Trazas representativas de corriente H+ dependientes de UCP1 en varias concentraciones de ATP en la cara citosólica de la IMM de grasa marrón de ratones en termoneutralidad. La corriente H+ dependiente de UCP1 se activó con ácido oleico (OA) de 0,5 mM mezclado con MβCD de 10 mM.El protocolo de voltaje se indica en la parte superior. En el panel inferior, se representa la misma traza pero no se normaliza con la capacitancia de membrana del mitoplasto. El mitplasto de grasa marrón en esta figura tenía una capacitancia de membrana de 0.624 pF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Corriente H+ dependiente de FA a través de CAA en mitoplastia cardíaca. (A) Corriente H+ dependiente de AAC representativa cuando se aplica 2 μM AA en la solución de baño (panel superior, naranja) en mitóticos cardíacos WT e inhibida por CATR de 1 μM (púrpura). Las trazas representativas registradas en el miplasto cardíaco AAC1 −/− se encuentran en el panel inferior. La corriente de control está en negro. El protocolo de rampa de voltaje se muestra encima de los rastros WT. El pH de las soluciones de baño y pipeta se muestran en el diagrama de pipeta-mitoplasto. (B) Mientras que la solución de pipeta contenía 1 mM de ADP, la corriente H+ dependiente de AAC es inducida por 2 μM AA (naranja) e inhibida por la adición de 1 mM de ADP al baño (púrpura). El protocolo de rampa de voltaje se muestra encima de la traza. El pH de las soluciones de baño y pipeta se muestran en el diagrama de pipeta-mitoplasto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Concentración final |
| sacarosa | 250 metros |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH ajustado a 7.2 con TrisBase |
Tabla 1: Tampón de aislamiento mitocondrial (tonicidad ~ 300 mmol por kg)
| Reactivo | Concentración final |
| sacarosa | 140 metros |
| D-manitol | 440 metros |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH ajustado a 7.2 con TrisBase |
Tabla 2: Tampón hipertónico-manitol
| Reactivo | Concentración final |
| Kcl | 750 metros |
| HEPES | 20 metros |
| EGTA | 1 mM |
| pH ajustado a 7.2 con TrisBase |
Tabla 3: Búfer Hypertonic-KCl
| Reactivo | Concentración final |
| Tma | 130 metros |
| HEPES | 100 metros |
| EGTA | 1 mM |
| MgCl2 para grabaciones UCP1 | 2 mM |
| o | |
| TrisCl para grabaciones de CAA | |
| pH ajustado a 7.0 o 7.5 con ácido D-glucónico |
Tabla 4: Solución de pipeta a base de TMA (tonicidad ~ 360 mmol por kg)
| Reactivo | Concentración final |
| Kcl | 150 metros |
| HEPES | 10 mM |
| EGTA | 1 mM |
| pH ajustado a 7.0 con TrisBase |
Tabla 5: Solución de baño KCl (tonicidad ~ 300 mmol por kg)
| Reactivo | Concentración final |
| sacarosa | 100 mM para grabaciones UCP1 |
| o | |
| 150 mM para grabaciones AAC | |
| HEPES | 150 mM para grabaciones UCP1 |
| o | |
| 100 mM para grabaciones AAC | |
| 1 mM EGTA | |
| pH ajustado a 7.0 con TrisBase |
Tabla 6: Solución de baño HEPES (tonicidad ~ 300 mmol por kg)
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Discussion
Este artículo de método tiene como objetivo presentar la técnica patch-clamp aplicada recientemente a las mitocondrias, un nuevo enfoque para estudiar directamente la fuga de H+ a través de la IMM responsable de la termogénesis mitocondrial 5,6,7,15. Esta técnica no se limita a los tejidos y también se puede utilizar para analizar la fuga de H + y otras conductancias de la IMM en diferentes modelos humanos y celulares estándar, como HAP1, COS7, C2C12 y células MEF. Sin embargo, cada aislamiento mitocondrial requiere algunos reajustes específicos para cada célula o tipo de tejido.
Los principales pasos en la medición directa de las corrientes H + a través de la IMM de grasa marrón 5,6 y el corazón5 se resumen aquí para ilustrar los mecanismos responsables de la termogénesis mitocondrial en tejidos termogénicos y no adiposos especializados. De hecho, el desarrollo de esta técnica por primera vez permite el análisis funcional de alta resolución de los dos PRINCIPALES UCP (UCP1 y AAC) en su entorno de membrana nativo con un control preciso de las condiciones experimentales críticas como: 1) pH de las soluciones de pipeta y baño, 2) control del potencial de membrana a través de la IMM, y 3) composición precisa de las soluciones para excluir cualquier iones y metabolitos permeables a la IMM que no sean H +. Las soluciones de baño a base de pipeta a base de TMA (Tabla 4) y HEPES (Tabla 6) están formuladas para registrar corrientes H + y contienen solo sales que se disocian en aniones grandes y cationes normalmente impermeables al IMM. Si bien la solución de baño se puede cambiar utilizando un sistema de perfusión, lo que permite aplicar diferentes tratamientos al lado citosólico de la membrana, no es posible cambiar la composición de la solución intrapipeta. Esto limita la comprensión de los mecanismos regulatorios que ocurren en el lado de la matriz. De hecho, los compuestos deben estar presentes dentro de la solución intrapipeta en el momento de llenar la pipeta. Por lo tanto, la fuga de H + se puede estudiar de forma aislada de otras corrientes. Los estudios farmacológicos y el uso de ratones KO fueron esenciales para la caracterización e identificación de las proteínas responsables de la corriente H+ a través de la IMM de diversos tejidos 5,6,7. Estos resultados establecieron que UCP1 es el principal UCP de la grasa marrón y beige, y AAC en tejidos no adiposos. No podemos excluir completamente la posibilidad de la existencia de otras corrientes H+ no mediadas por UCP1 y AAC. Sin embargo, si existen otras corrientes H+, su amplitud estaba más allá de la resolución de nuestra configuración electrofisiológica. No medimos el bombeo H+ del ETC en las condiciones descritas en este documento. Una vez que hemos alcanzado la configuración de IMM completa, la matriz mitocondrial se lava mediante la perfusión de la solución intra-pipeta. El espacio intermembrana ya no existe desde el paso de romper la OMM con la prensa francesa. No se han añadido sustratos de los complejos respiratorios cruciales para el bombeo de H+ a través del ETC. Por lo tanto, es poco probable que desarrolle un bombeo activo de H + bajo las condiciones electrofisiológicas detalladas aquí.
Las grabaciones de un solo canal de parches extirpados no se describen en este artículo. Aunque las corrientes H+ dependientes de UCP1 y AAC a través del IMM son robustas debido a su alta densidad de proteínas, las aberturas de un solo canal no pudieron resolverse porque la amplitud de las corrientes unitarias UCP1 y AAC es probablemente demasiado pequeña.
A diferencia de los estudios bioquímicos, el aislamiento mitocondrial descrito en este artículo no necesita dar lugar a un alto nivel de pureza mitocondrial. De hecho, la preparación mitocondrial que consiste en una multitud de mitóticos individualizados y restos celulares se escanea bajo el microscopio para encontrar un mitplasto en forma de 8 para parchear. La forma en forma de 8 del mitplasto se debe a la liberación del IMM a través de un orificio en el OMM causado por el procedimiento de prensa francés (Figura 2). El lóbulo menos denso corresponde al IMM15,17. Una preparación adecuada se puede definir mediante mitplastos que se mueven libremente y que se pueden distinguir fácilmente de los desechos celulares. Sin embargo, es importante reducir el número de desechos para evitar la contaminación del IMM, que puede afectar la calidad del sello de la pipeta de vidrio con la membrana. Este paso de escaneo bajo el microscopio permite elegir un mitótico con alta integridad de IMM reconocido por un lóbulo menos denso que el delimitado por el OMM y, por lo tanto, aumenta las posibilidades de un robo exitoso.
Esta técnica por primera vez proporcionó la medición directa de las corrientes H+ dependientes de UCP1 y AAC dentro de su membrana nativa. Sin embargo, la integridad mitocondrial y la compartimentación ya no existen debido a la ruptura de la OMM y probablemente de la cristae. Por lo tanto, es esencial complementar el análisis de patch-clamp con otros métodos clásicos como la respiración mitocondrial para confirmar el papel fisiológico de las proteínas recién caracterizadas en las mitocondrias intactas.
La técnica patch-clamp aplicada a las mitocondrias ofrece nuevas posibilidades para comprender mejor los mecanismos moleculares responsables de la fuga mitocondrial de H+ y la termogénesis. Combinado con técnicas celulares y moleculares modernas, este enfoque innovador proporcionará nuevos conocimientos sobre los mecanismos que controlan la capacidad termogénica de las mitocondrias y cómo pueden dirigirse a combatir las enfermedades asociadas con la disfunción mitocondrial.
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Disclosures
El autor no declara intereses contrapuestos.
Acknowledgments
Agradezco al Dr. Yuriy Kirichok por la gran ciencia de la que formé parte en su laboratorio y a los miembros del laboratorio Kirichok por las útiles discusiones. También agradezco al Dr. Douglas C. Wallace por proporcionar ratones knockout AAC1 . Financiamiento: A.M.B fue apoyado por un Premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana del Corazón 19CDA34630062.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B | |
| 60X water immersion objective, numerical aperture 1.20 | Olympus | UPLSAPO60XW | |
| Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | BF150-86-10 | |
| Digidata 1550B Digitizer | Molecular Devices | ||
| Faraday cage | Homemade | ||
| French Press | Glen Mills | 5500-000011 | |
| IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer | |||
| Inversed Microscope | Olympus | IX71 or IX73 | |
| Micro Forge | (Narishige) | MF-830 | |
| Micromanupulator MPC-385 | Sutter Instruments | FG-MPC325 | |
| Microelectrode holder for agar bridge | World Precision Instruments | MEH3F4515 | |
| Micropipette Puller | (Sutter Instruments) | P97 | |
| Mini Cell for French Press | Glen Mills | 5500-FA-004 | |
| MIXER IKA 6-2000RPM | Cole Parmer | EW-50705-50 | |
| Objective 100X magnification | Nikon lens | MPlan 100/0.80 ELWD 210/0 | |
| pClamp 10 | Molecular Devices | ||
| Perfusion chamber | Warner Instruments | RC-24E | |
| Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml | Wheaton | 358039 | |
| Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD | Thermo Scientific | 75 009 521 | |
| Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness | Warner Instruments | 640700 | |
| Vibration isolation table | Newport | VIS3036-SG2-325A | |
| Chemicals | |||
| D-gluconic acid | Sigma Aldrich | G1951 | |
| D-mannitol | Sigma Aldrich | M4125 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | 3777 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7523 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60128 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | 63068 | |
| sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| TMA | Sigma Aldrich | 331635 | |
| TrisBase | Sigma Aldrich | T1503 | |
| TrisCl | Sigma Aldrich | T3253 |
References
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