Summary
Nous décrivons ici un protocole pour l’emballage des pseudovirus et la mesure de l’activité neutralisante des anticorps.
Abstract
Depuis 1996, les virus H5 de la lignée A/oie/Guangdong/1/96-lignée hautement pathogène (IAHP) sont à l’origine d’épidémies de grippe chez les volailles et les oiseaux sauvages. Parfois, les humains en sont également victimes, ce qui entraîne une mortalité élevée. Néanmoins, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle doit être traitée dans des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus s’avèrent être les outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus IAHP H5. Ce protocole décrit les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests de neutralisation des pseudovirus. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests.
Introduction
Depuis 1996, les virus H5 de la grippe aviaire hautement pathogène (IAHP) de la lignée A/oie/Guangdong/1/96 sont à l’origine d’épidémies de grippe continuelles chez les volailles et les oiseaux sauvages, ce qui représente d’énormes pertes socio-économiques dans l’industrie mondiale de la volaille. Parfois, les humains sont également infectés par elle, confrontés à un taux de mortalité élevé 1,2. Cependant, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle ne peut pas être traitée en dehors des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus sont suffisamment sûrs pour être pratiqués dans des laboratoires de niveau de biosécurité 2.
Les pseudovirus IAHP H5 appartiennent à des virus chimériques constitués de noyaux de virus de substitution, d’enveloppes lipidiques avec les glycoprotéines de surface des virus de la grippe et de gènes rapporteurs. Les carottes de pseudovirus sont généralement dérivées du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) lentivirale, des rétrovirus tels que le virus de la leucémie murine (MLV) et du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV)3. Plus précisément, le système d’emballage du VIH-1 est largement utilisé pour produire le pseudovirus de la grippe, où les principaux gènes fournis sont gag et pol. Le gène gag du VIH exprime les protéines centrales. Le gène pol exprime l’intégrase et la transcriptase inverse, toutes deux nécessaires à l’expression du gène rapporteur dans les cellules transduites. Imitant le génome du virus de substitution, le gène rapporteur est intégré dans le noyau du pseudovirus sous forme d’ARN. Le gène rapporteur exprimera la protéine dans les cellules hôtes. Les niveaux d’expression génique des gènes rapporteurs peuvent être utilisés pour mesurer l’efficacité de l’infection pseudovirale 3,4. Le rapporteur principal est la luciférase luciole pour mesurer les unités de luminescence relative (RLU) ou l’activité relative de la luciférase (RLA) dans les cellules transduites. D’autres rapporteurs tels que lacZ, Gaussia et Renilla luciferase sont également utilisés, mais dans une moindre mesure5.
Les pseudovirus sont des outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus H5 HAPI. Pour mesurer le pouvoir neutralisant des anticorps, les tests de neutralisation des pseudovirus (PN)6 sont utilisés. L’hémagglutinine (HA) et la neuraminidase (NA) sont des glycoprotéines présentes à la surface du virus de la grippe A 7,8. Le HA est composé d’un domaine de tête globulaire pour la liaison au récepteur et d’un domaine souche pour la fusion membranaire. La protéine NA a l’activité sialidase pour faciliter la libération du virus 7,8. Un test NP peut mesurer des anticorps neutralisants dirigés contre les protéines HA. Les anticorps neutralisants dirigés contre la tête et la région souche de l’HA peuvent également être détectés par des tests de fixation et d’entrée virales. Par rapport aux virus de type sauvage, les expériences de neutralisation des pseudovirus ont des valeurs de détection plus sensibles, peuvent être manipulées en toute sécurité dans un laboratoire de biosécurité de niveau 2 et sont généralement plus faciles à utiliser dans la pratique.
Ce protocole présente en détail les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests PN. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests. Dans cette étude, la souche A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) des virus IAHP H5N1 a été utilisée comme exemple. Pour obtenir les sérums immunitaires utilisés dans les essais, ce protocole a sélectionné la protéine HA provenant de la souche TH comme immunogène pour immuniser les souris.
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Protocol
Toutes les opérations expérimentales liées aux pseudovirus ont été réalisées sous condition ABSL2 à l’Institut Pasteur de l’Académie chinoise des sciences de Shanghai (IPS, CAS). Les expériences sur les animaux ont été réalisées sur la base des protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’IPS, CAS.
1. Emballage de pseudovirus avec transfection de phosphate de calcium
- Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules HEK293FT (9 x 105 par mL) dans un milieu DMEM complet (tableau 1). Ajouter 10 mL des suspensions unicellulaires dans une fiole T75, incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5 % de dioxyde de carbone (CO2) pendant 20 h avant la transfection.
NOTE: HEK293FT passage bas (<20 passages) est recommandé. Assurez-vous que la monocouche cellulaire est confluente à 80-90%. - Remplacer le milieu par 10 mL de milieu complet frais contenant de la chloroquine (100 μM) 2 h avant la transfection.
- Mélanger les réactifs et l’ADN plasmidique comme indiqué dans le Tableau 2 et la Figure 1 : ddH2O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl 2 et 2x tampon HEPES. Pipeter 5 fois doucement, incuber le mélange à température ambiante (TR) pendant 20 min.
- Transférer le mélange dans le milieu au-dessus des cellules et bercer doucement la fiole. Incuber les cellules dans l’incubateur cellulaire pendant 15 h.
- Remplacer le milieu par 15 ml de milieu DMEM complet frais. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2 pendant 65 h.
REMARQUE: La couleur du milieu sera orange clair ou légèrement jaune, et au moins 80% de la cellule doit montrer l’effet cytopathique (CPE) sous le microscope à lumière inversée. - Récolter le surnageant et le centrifuger à 2095 x g pendant 20 min à 4 °C. Prélever le surnageant, l’aliquote et le conserver à -80 °C.
2. Détection de l’expression des protéines HA, NA et VIH-1 p24 du pseudovirus grippal
- Détecter l’expression de la protéine HA par le dosage de l’hémagglutinine (HA).
- Ajouter 50 μL de PBS dans les colonnes 2 à 12, rangées A, B et C d’une plaque à fond rond de 96 puits.
Remarque : Les lignes A, B et C appartiennent à 3 tests de réplication indépendants et la colonne 12 est utilisée comme contrôle négatif. - Ajouter 100 μL de pseudovirus dans les puits de la colonne 1. Transvaser 50 μL de la colonne 1 dans la colonne 2, bien mélanger en pipetant 5 fois de haut en bas, effectuer les deux dilutions jusqu’à la dernière colonne 11 et éliminer les 50 μL supplémentaires de la colonne 11.
- Ajouter 50 μL d’érythrocyte à 0,5 % dans chaque puits, le pipeter doucement de haut en bas deux fois. Incuber la plaque pendant 30-60 min à TA ou jusqu’à ce que les érythrocytes du témoin négatif forment les taches régulières au fond du puits.
- Observez et enregistrez les titres HA du pseudovirus.
REMARQUE: L’unité HA des pseudovirus est le facteur de dilution le plus élevé du virus qui peut causer une hémagglutination à 100% des globules rouges.
- Ajouter 50 μL de PBS dans les colonnes 2 à 12, rangées A, B et C d’une plaque à fond rond de 96 puits.
- Détecter l’expression des protéines HA et NA par le test Western blot.
REMARQUE: Toutes les étapes du transfert Western sont effectuées conformément au manuel de clonage moléculaire (4eédition). - Détecter l’expression de la protéine p24 du VIH-1 à l’aide du kit ELISA VIH-1 p24 (Table of Materials).
- Ajouter 50 μL du tampon de lyse dans 450 μL d’échantillon de pseudovirus. Mélangez bien.
- Ajouter 300 μL du tampon de lavage à chaque puits de la microplaque. Frappez la plaque inversée pour retirer complètement le tampon de lavage. Répétez le lavage 5 fois.
- Ajouter 200 μL de l’étalon et des échantillons à chaque puits séparément. Incuber à 37 °C pendant une nuit ou pendant 2 h.
- Aspirer le contenu de la plaque et laver la plaque comme décrit à l’étape 2.3.2.
REMARQUE: Laissez un puits de la plaque d’essai vide pour l’utiliser comme substrat vierge. - Ajouter 200 μL d’anticorps du détecteur p24 à chaque puits. Incuber à 37 °C pendant 1 h. Aspirer et laver la plaque comme décrit à l’étape 2.3.2.
- Ajouter 100 μL de la solution de travail streptavidine-peroxydase à chaque puits et les incuber à 37 °C pendant 30 min. Aspirer et laver la plaque comme décrit à l’étape 2.3.2.
- Ajouter 100 μL de la solution de travail sous-étatique à chaque puits, y compris le puits de substrat vierge, et les incuber à 37 °C pendant 30 min.
REMARQUE: La couleur bleue se développera dans les puits. - Ajouter 100 μL du tampon d’arrêt à chaque puits.
REMARQUE: La couleur bleue passera immédiatement en jaune. - Lire la densité optique à 450 nm en 15 min. Enregistrer les titres p24 du pseudovirus
3. Titrage des pseudovirus
- Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules MDCK (5 x 104 par mL) dans un milieu DMEM complet, ajouter 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 et 40000 cellules à différents puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2 pendant 20 h.
- Sortez le pseudovirus du réfrigérateur à -80 °C, décongelez-le sur la glace et vortex le pseudovirus.
- Ajouter 6 pseudovirus HAU (6x unités HA) à chaque puits de plaque à fond rond de 96 puits et reconstituer chaque puits avec du DMEM complet jusqu’à 120 μL.
- Pipeter 5 fois le mélange pour bien mélanger. Incuber la plaque de mélange dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant 1 heure.
- Transférer 100 μL du mélange dans les cellules de la plaque de 96 puits. Remettez la plaque de culture cellulaire dans l’incubateur pendant 48 h, 60 h et 72 h après l’infection virale.
- Sortez la plaque de l’incubateur et effectuez le dosage de la luciférase (Tableau des matériaux).
- Retirez soigneusement le milieu des puits de la plaque. Rincez les cellules avec 200 μL de PBS et retirez le PBS autant que possible.
REMARQUE: Retournez la plaque et jetez le surnageant en l’inversant sur du papier absorbant. Si la lignée cellulaire d’essai n’a pas pu se fixer fermement au fond, retirez soigneusement le milieu d’aspiration. - Ajouter 50 μL du tampon de lyse à chaque puits et secouer la plaque de culture plusieurs fois. Conserver la plaque à -80 °C pendant la nuit.
REMARQUE: Mélanger 1 volume de 5x tampon de lyse avec 4 volumes d’eau pour faire le tampon de lyse 1x. Équilibrer le tampon de lyse 1x à RT avant utilisation. Balancez la plaque pour vous assurer que les cellules sont complètement recouvertes du tampon de lyse. Le processus unique de congélation-décongélation peut aider la cellule à être lysée complètement. - Sortir la plaque, équilibrer à TA pendant 2 h.
REMARQUE: La cellule doit être lysée complètement. - Balancez la plaque plusieurs fois doucement et transférez tous les lysats cellulaires sur des plaques opaques à 96 puits.
- Ajouter 50 μL de substrat à chaque puits, secouer la plaque plusieurs fois doucement et bien mélanger le substrat et le tampon de lyse.
- Mesurer la lumière produite en 5 minutes à l’aide d’un luminomètre. Enregistrez les titres de luciférase du pseudovirus.
REMARQUE: Lorsqu’un substrat approprié est ajouté, la lumière est émise en tant que sous-produit via une réaction chimique dans laquelle la luciférine est convertie en oxyluciférine par l’enzyme luciférase. La quantité de lumière produite est proportionnelle à la quantité de l’enzyme luciférase.
4. Préparation du sérum immunitaire
REMARQUE: Le sérum immunitaire sera utilisé pour des expériences liées aux cellules, et l’opération expérimentale doit être effectuée dans des conditions aseptiques.
- Préparez 12 souris BALB/c femelles âgées de huit semaines. Divisez également les souris en deux groupes.
NOTE: Un groupe était le groupe DDV et l’autre était le groupe témoin négatif. - Immunisation du groupe DDV : Amorcer deux fois par voie intramusculaire avec 100 μg d’un plasmide d’ADN optimisé pour le codon codant pour la protéine HA A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) à la semaine 0 et à la semaine 3 et augmenter une fois par voie intrapéritonéale avec 512 particules pseudo-virales (VLP) HAU TH à la semaine 6.
- Immunisation du groupe témoin : amorcer deux fois par voie intramusculaire avec 100 μg d’ADN plasmidique vectoriel vide à la semaine 0 et à la semaine 3 et augmenter une fois par voie intrapéritonéale avec le VLP gag du VIH-1 à la semaine 6.
- Prélever le sang de souris 2 semaines après la dernière vaccination.
REMARQUE: Ici, les souris ont été anesthésiées avec du pentobarbital sodique (65 mg / kg) au moment de la collecte de sang. Après prélèvement sanguin dans la veine sous-maxillaire, les souris ont été euthanasiées immédiatement avec du CO2. - Gardez le sang à TA pendant 2 h, puis 4 °C pendant la nuit. Centrifuger à 900 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant. Inactiver le sérum en le plaçant à 56 °C pendant 30 min.
- Conservez les sérums immunitaires au réfrigérateur à -80 °C en vue de leur utilisation.
REMARQUE : Reportez-vous à la figure supplémentaire 1 pour obtenir l’organigramme qui décrit les principales procédures d’immunisation des souris.
5. Test de neutralisation des pseudovirus (NP)
- Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules MDCK (5 x 104 par mL) dans un milieu DMEM complet et ajouter 100 μL de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2 pendant 20 h.
- Sortez le pseudovirus et le sérum du réfrigérateur à -80 °C, décongelez-les sur la glace et vortex soigneusement.
- Diluer le sérum dans le milieu complet 20 fois et ajouter 100 μL de milieu DMEM complet dans les puits d’une plaque à fond rond de 96 puits provenant des colonnes 2 à 10.
- Ajouter 200 μL du sérum dilué dans les puits de la colonne 2, transférer 100 μL de la colonne 2 à la colonne 3, diluer les sérums sous forme 1:20, 1:40, 1:80, etc., à 1:10240 successivement de la colonne 2 à la colonne 10, et éliminer les 100 μL de la colonne 10.
- Ajouter 100 μL de milieu complet DMEM aux puits de la colonne 11 comme témoin négatif.
- Ajouter 100 μL de pseudovirus à chaque puits, pipeter le mélange 5 fois et incuber la plaque de mélange dans une plaque de mélange à 37 °C, 5% CO2 pendant 1 h.
- Transférer 100 μL du mélange de la plaque à fond rond de 96 puits au puits correspondant de la plaque de culture cellulaire de 96 puits. Remettre la plaque dans l’incubateur (37 °C, 5% CO2) pendant 60 h.
- Sortez l’assiette de l’incubateur. Effectuer le test de luciférase comme décrit aux étapes 3.7-3.12.
6. Essai d’attachement de pseudovirus
- Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules MDCK (4 x 104 par mL) dans un milieu DMEM complet et ajouter des suspensions cellulaires de 100 μL à chaque puits dans une plaque à fond plat de 96 puits. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 pendant 20 h.
- Incuber le pseudovirus avec des sérums dans du DMEM contenant 1 % de BSA à 4 °C pendant une nuit.
NOTE: Le volume du mélange est de 100 μL. - Bloquer les cellules MDCK avec 100 μL par puits de DMEM contenant 1% de BSA à 4 °C pendant 1 h.
- Inoculer le pseudovirus et le mélange de sérum (100 μL) sur la monocouche MDCK et l’incuber à 4 °C pendant 2 h.
- Lavez la plaque cellulaire 4 fois avec du PBS contenant 1% de BSA pour éliminer tout virus non lié.
- Lyser les cellules avec 100 μL de tampon de lyse de la luciférase à TA pendant 30 min.
- Quantifier la quantité de virus lié sur les cellules à l’aide d’un kit ELISA VIH-1 p24 comme décrit ci-dessus (rubrique 2.3).
7. Évaluation de l’entrée virale
- Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules MDCK (5 x 104 par mL) dans un milieu DMEM complet et ajouter 100 μL de la suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO2 pendant 20 h avant le dosage.
- Inoculer le pseudovirus (100 μL) sur une monocouche MDCK dans une plaque de 96 puits à 4 °C pendant 6 h.
- Lavez la plaque cellulaire 4 fois avec du PBS contenant 1% de BSA pour éliminer les pseudovirus non liés.
- Ajouter 100 μL de sérums immunitaires dilués en série ou de sérums provenant de souris de vaccination simulée dans du DMEM contenant 1% de BSA à la monocouche, et incuber la cellule à 4 °C pendant 2 h.
- Retirez le surnageant cellulaire et lavez la plaque de culture cellulaire 4 fois avec du PBS contenant 1% de BSA.
- Ajouter du DMEM frais aux cellules et incuber pendant 60 h dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2 .
- Mesurer l’activité relative de la luciférase (RLA) des cellules comme décrit aux étapes 3.7-3.12.
NOTE: L’entrée virale, telle qu’indiquée par RLA, a été exprimée en pourcentage de la lecture obtenue en l’absence de sérum, qui a été fixée à 100%.
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Representative Results
Expression des protéines HA, NA et VIH-1 p24 du pseudovirus de la grippe
Pour déterminer l’efficacité de l’emballage viral, les stocks de pseudovirus grippaux ont d’abord été détectés par le test HA (figure 2A). Les unités d’HA par millilitre de pseudovirus de la grippe sont de 643 (tableau 3). Le test Western blot et les tests ELISA sandwich ont été utilisés pour tester l’expression des protéines p24 HA, NA et VIH-1. Ensuite, les rapports de l’unité HA et la quantité de gag p24 pour les pseudovirus ont été calculés. Les résultats du test Western blot ont montré qu’il y avait 4 types de protéines : les protéines HA0, HA1, HA2 et NA (figure supplémentaire 2). Cela indique que les protéines d’enveloppe des pseudovirus grippaux sont similaires à celles des virus de type sauvage. Les ratios HA et Gag p24 se situaient dans une fourchette normale (tableau 3)9.
| Souches de pseudovirus | HAU/ml | 1.00E + 05 pg/mL | Rapport HAU/1,00E+05 pg* |
| P A/Thaïlande/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4,20 ± 0,17 | 152.98 |
| *Les ratios des unités HA et la quantité de VIH-1 Gag p24 dans les pseudovirus ont été calculés comme suit : unités HA / la quantité de Gag p24. | |||
Tableau 3 : Quantification du pseudovirus H5.
Titrage des pseudovirus
Pour mesurer la concentration de particules virales fonctionnelles, l’activité relative de la luciférase (RLA) du pseudovirus a été détectée. Les lectures RLA dépendent de nombreuses variables. Pour identifier l’effet de la quantité de cellules transduites sur les lectures RLA, nous avons ensemencé les cellules de 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 et 40000 par puits de plaque de 96 puits (Figure 2). Les résultats ont montré que les lectures RLA de pseudovirus sont les plus élevées, et l’erreur type de moyenne est la plus faible lorsque 5000 cellules sont ensemencées dans un puits de plaque de 96 puits (Figure 4A). Pour identifier l’effet du temps d’incubation, les lectures RLA sont détectées 48 h, 60 h et 72 h après l’infection virale. Les résultats ont montré que lorsqu’ils sont incubés pendant 60 heures, les lectures RLA du pseudovirus sont plus élevées en valeurs et meilleures en répétabilité avec une faible erreur-type de la moyenne (Figure 4B). Les résultats indiquent qu’il convient d’ensemencer 5000 cellules dans un puits d’une plaque de 96 puits et de détecter les lectures RLA 60 h après l’infection virale.
Dosages NP
Les titres de neutralisation des sérums immunitaires du groupe témoin et du groupe DDV ont été mesurés par des dosages NP (figure 5). Comme le montre la figure 5A, les sérums immuns du groupe DDV présentaient des titres de neutralisation élevés contre la souche pseudovirus A/Thailand/1(KAN)-1/04. En revanche, les sérums du groupe témoin n’ont montré aucune activité de neutralisation (figure 5B). Par rapport aux tests sérologiques traditionnels (tests HI et MN), les tests NP sont plus sensibles (les données ne sont pas présentées).
Essai de neutralisation de l’attachement
Certains anticorps de neutralisation peuvent entraver la fixation des virus aux récepteurs de l’acide sialique. Ces anticorps sont dirigés vers la tête de l’HA et sont prédominants après l’immunisation par un vaccin commercial ou l’infection par le virus de la grippe. Pour identifier l’activité neutralisante de ces anticorps, des tests de neutralisation de l’attachement sont effectués (Figure 3). Par rapport aux sérums témoins, l’activité neutralisante des sérums immunitaires est puissante, ce qui indique qu’il y a beaucoup d’anticorps dirigés contre la tête de l’HA dans les sérums immunitaires (Figure 6A).
Évaluation de l’entrée virale
Ce test est utilisé pour identifier les anticorps qui entravent la fusion de l’enveloppe virale et des membranes endosomiques lors de l’infection par le virus de la grippe. Ces anticorps sont dirigés vers le domaine de la tige HA et sont généralement moins puissants. Pour mesurer les titres de neutralisation de ces anticorps, des tests post-fixation sont effectués (Figure 3). Il existe des différences significatives entre les sérums immunitaires et les sérums témoins, ce qui indique qu’il y a des anticorps dirigés contre la région souche HA dans les sérums immunitaires (figure 6B).
Figure 1 : Organigramme de la transfection médiée par le calcium. Cet organigramme est utilisé pour décrire les principales procédures de transfection médiée par le calcium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification et titrage du pseudovirus. (A) Organigramme du test HA du pseudovirus décrivant les principales étapes du test HA du pseudovirus. (B) Organigramme du test du pseudovirus P24 décrivant les principales étapes du test du pseudovirus P24. (C) Organigramme du test de titrage des pseudovirus décrivant les principales étapes du test de titrage des pseudovirus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Tests de neutralisation basés sur des pseudovirus. (A) Organigramme du test NP décrivant les principales étapes du test NP. (B) Organigramme du test d’attachement du pseudovirus décrivant les principales étapes du test d’attachement. (C) Organigramme d’évaluation du test d’entrée virale décrivant les principales étapes du test d’entrée virale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : titrage du pseudovirus. (A) Différentes quantités de cellules par puits dans une plaque de 96 puits influencent les lectures de RLA. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 et 40000 cellules ont été ensemencées dans une plaque de 96 puits. (B) Le moment de récolte différent influence les lectures d’ALR. Les lectures RLA sont détectées 48 h, 60 h et 72 h après l’infection virale. Les données recueillies à partir de trois expériences indépendantes sont présentées sous forme de moyenne ± SEM; les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (MEB). Une ANOVA unidirectionnelle avec test de Tukey a été effectuée. P < 0,0001; ns, non significatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : réponses en anticorps neutralisants H5 détectées avec le pseudovirus. (A) Titrage des réponses en anticorps neutralisants des sérums immuns du groupe DDV. (B) Titrage des réponses en anticorps neutralisants des sérums immuns du groupe témoin. La CI 50 est définie comme les dilutions réciproques de l’anticorps neutralisant qui peut inhiber50% du pseudovirus. Les données recueillies à partir de trois expériences indépendantes sont présentées sous forme de moyenne ± SEM; les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (MEB). VSVG pseudovirus a été utilisé comme un contrôle négatif. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Détection de la puissance des anticorps de neutralisation par des tests de liaison et d’entrée virale. (A) Les sérums immuns du groupe DDV, et non ceux du groupe témoin, inhibent la fixation virale aux cellules. (B) Les sérums immunisés du groupe DDV, et non ceux du groupe témoin, inhibent partiellement l’infection virale post-attachement. Les données recueillies à partir de trois expériences indépendantes sont présentées sous forme de moyenne ± SEM; les barres d’erreur représentent l’erreur-type de la moyenne (MEB). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Composition complète du milieu DMEM | Concentration |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Sérum fœtal bovin | 10% |
| Pénicilline (1 U/mL)/streptomycine | 1 μg/ mL |
Tableau 1 : Composition complète du milieu DMEM.
| Matériaux | Concentration | Volume |
| 2x HEPES (pH 7,1) | -- | 675,0 μL |
| CaCl 2 (2,5 M) | -- | 67,5 μL |
| ddH2O | -- | 529,2 μL |
| pCMV Δ 8,9 | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27,0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13,5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
Tableau 2 : Système d’empaquetage des pseudovirus.
Figure supplémentaire 1 : Organigramme de l’immunisation des souris. Cet organigramme décrit les principales procédures d’immunisation des souris. Les sérums immunitaires ont été utilisés comme échantillons. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Expression des protéines HA, NA et VIH-1 p24 du pseudovirus de la grippe. Western blot de protéines pseudovirales. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
HEK293FT cellules sont généralement utilisées comme cellules d’emballage pour produire des pseudovirus. Une détection régulière des mycoplasmes est essentielle lors de la culture cellulaire. La contamination par les mycoplasmes peut diminuer considérablement les rendements de pseudovirus et parfois proche de zéro. Par rapport à d’autres contaminations, les contaminations par mycoplasmes n’entraînent pas de changements de la valeur du pH ou de turbidité du milieu de culture cellulaire. Même une forte concentration de mycoplasmes n’est pas visible à l’œil nu ou au microscope. Trois méthodes populaires de détection des mycoplasmes sont la culture de mycoplasmes, la coloration de l’ADN avec du DAPI fluorescent ou Hoechst 33258 et la réaction en chaîne de la polymérase (PCR). La PCR amplifiant l’ADN des mycoplasmes dans les échantillons de culture est largement utilisée pour des tests de mycoplasmes rapides, faciles et fiables10.
La transfection médiée par le phosphate de calcium est utilisée pour l’emballage des pseudovirus de la grippe depuis de nombreuses années en raison de son efficacité élevée, de son faible coût et de sa facilité d’utilisation11. Cependant, cette méthode est très sensible à la valeur du pH d’une solution tamponnée HEPES, du milieu de culture cellulaire HEK293FT et du H2O distillé à double distillation. La valeur du pH a affecté la formation du précipité et la durée du séjour du précipité sur HEK293FT cellules. Ainsi, il peut déterminer la quantité d’ADN qui est absorbée par HEK293FT cellules. Le pH d’une solution tamponnée HEPES est extrêmement étroit et restreint, allant de 7,05 à 7,1212,13,14, condition dans laquelle un précipité contenant du phosphate de calcium et de l’ADN se forme lentement dans une solution tamponnée HEPES. Si le pH est trop élevé, la taille du précipité deviendra si grande qu’elle peut même tuer les cellules HEK293T. Au contraire, si le pH est trop bas, le précipité ne peut pas être formé, ou le précipité sera trop petit pour se déposer à la surface de la cellule. De plus, le pH du milieu de culture cellulaire HEK293FT joue également un rôle dans l’efficacité de la transfection. Pendant la transfection, le milieu cellulaire doit être maintenu entre un pH de 7,2 et 7,4. Les milieux hyperacides et alcalins modifieront la taille du précipité et le temps d’adsorption du mélange d’ADN à la surface de la cellule. De plus, leH2O bidistillé avec différentes origines utilisées dans le mélange d’ADN peut modifier le pH d’une solution tamponnée HEPES. Ainsi, le maintien d’une valeur de pH stable de la solution de transfection et du milieu de culture est crucial pour garantir une efficacité de transfection élevée. De plus, l’efficacité de la transfection est également affectée par la solution de CaCl 2 2,5 M et la concentration de dioxyde de carbone (CO2) dans l’incubateur cellulaire. Pendant le processus de transfection, il est crucial de stocker correctement la solution de CaCl 2 et de stabiliser la concentration de CO2 dans l’incubateur.
Le système d’emballage le plus populaire du pseudovirus de la grippe implique une approche de co-transfection de plasmides multiples. Les gènes HA, NA, rapporteur et lentiviral gag et pol sont clonés séparément en vecteurs d’expression plasmidique, puis transfectés simultanément dans les cellules. Pour augmenter l’expression de la protéine, une séquence de consensus de Kozak est souvent ajoutée avant le site de début de la transcription.
Il est nécessaire de préparer de l’ADN plasmidique15 pur, superenroulé et exempt d’endotoxines. Puisque le rapport plasmidique affecte directement les rendements du pseudovirus. Ce protocole a optimisé le rapport plasmidique du « core: reporter: HA: NA » à 28:28:4:1 et l’a comparé à d’autres méthodes de transfection. Il est nécessaire que la quantité d’ADN plasmidique dans la transfection de phosphate de calcium atteigne jusqu’à 30,5 μg par boîte de 100 mm.
Les titres de pseudovirus sont détectés par PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR), dosage immuno-enzymatique (ELISA), test d’hémagglutination et test de détection RLA. Le test qRT-PCR est utilisé pour estimer le nombre de copies des gènes d’ARN de l’intérieur du pseudovirus5. Le test ELISA est utilisé pour détecter la teneur en protéine p24, qui est le principal composant du noyau du VIH. Le test d’hémagglutination mesure la quantité de pics d’HA à la surface des particules pseudovirales. Ces trois tests sont utilisés pour quantifier les particules virales non fonctionnelles. Le test de détection RLA est la principale méthode de mesure de la concentration de particules virales fonctionnelles qui peuvent infecter les cellules transduites et libérer des gènes rapporteurs dans le stock de pseudovirus. Les cellules MDCK sont couramment utilisées comme cellules transduites. Les cellules transduites sont ensemencées dans des plaques de culture à 96 puits, infectées par un pseudovirus, lysées par un tampon de lyse, puis transférées sur des plaques luminométriques à 96 puits pour lire les valeurs. Différentes quantités de cellules et temps d’incubation influencent les valeurs RLA. Sur la base des résultats, l’expression du gène rapporteur est élevée lorsque 5000 cellules sont ensemencées par puits sur une plaque de 96 puits, et le RLA est détecté 60 h après l’infection virale.
Les tests de neutralisation du pseudovirus (PN) H5 HPAI ont été largement appliqués pour la détection d’anticorps en raison de leur sécurité, de leur sensibilité plus élevée, de leur précision et de leur pertinence pour le dépistage à haut débit. Un protocole général de test NP comprend les quatre étapes suivantes : quantités de pseudovirus, dilution sérique, incubation pseudovirus-anticorps et détection de l’activité de la luciférase. Les quantités de pseudovirus sont normalisées en fonction des lectures RLA. Des valeurs RLA de 10à 6 par puits dans une plaque de 96 puits sont utilisées pour obtenir des résultats d’expérience reproductibles. Le point de départ de la dilution de l’échantillon de sérum doit être supérieur à 40. Le composant de l’échantillon de sérum augmentera évidemment les valeurs de luciférase du pseudovirus lorsque le facteur de dilution de l’échantillon de sérum est inférieur à 40. Le mélange pseudovirus-anticorps est incubé pendant 1 h à 37 °C, puis transféré dans des cellules MDCK, suivi d’une détection des lectures RLA en 60 h. Les niveaux de Luciférase sont généralement considérés comme un outil pour déterminer l’efficacité de l’infection par pseudovirus.
Dans le test NP, il y a quatre éléments importants: la protéine rapporteur de la luciférase, la chimie du dosage, un luminomètre et des microplaques16. Tout d’abord, le gène de la luciférase est optimisé pour le codon afin d’améliorer les niveaux d’expression des protéines dans les cellules transduites. L’ingénierie des gènes rapporteur et squelette vectoriel réduit le nombre de sites de liaison consensuels au facteur de transcription afin de réduire le risque de transcription anormale. Deuxièmement, les réactifs de détection appropriés sont sélectionnés en fonction de l’objectif de l’expérience. Les tests NP sont généralement utilisés comme méthodes à haut débit pour détecter les réponses neutralisantes des échantillons de sérum ou d’anticorps. Ce protocole utilisait le système de dosage de la luciférase bright-Glo, qui offre le signal le plus lumineux, une large plage dynamique et une sensibilité élevée. Plus important encore, la demi-vie du signal est d’environ 10 minutes et les cellules sont immédiatement testées après l’ajout du substrat. Un luminomètre est utilisé pour détecter la concentration de luciférase. De nombreux types de luminomètres sont fabriqués. Le principe de base est que la machine utilisée peut identifier avec précision les différences d’activité de la luciférase entre les différents échantillons. Des microplaques de polystyrène noir ou blanc doivent être utilisées pour l’opacité et les arrière-plans peu luminescents. Les microplaques blanches peuvent améliorer les signaux luminescents et avoir une faible luminescence de fond, tandis que les microplaques noires peuvent minimiser la diffusion de la lumière pour réduire la diaphonie du puits au puits17.
Les tests NP sont conformes aux méthodes traditionnelles de détection des réponses d’anticorps neutralisants. Cependant, en ne comprenant que les protéines HA et NA des virus grippaux de type sauvage, les pseudovirus sont loin du virus de type sauvage. L’AH peut se lier au récepteur de l’acide sialique de la cellule receveuse pour initier l’infection. Ensuite, les changements conformationnels HA dans l’endosome déclenchent la fusion des membranes virale et endosommale, libérant les ribonucléoprotéines virales (vRNP) dans le cytoplasme. Les pseudovirus grippaux ne peuvent qu’imiter ces processus et sont appliqués dans des recherches connexes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par les subventions de recherche du Projet de renforcement des capacités d’innovation de la province du Jiangsu (BM2020019), du Projet scientifique et technologique de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), le Programme de recherche prioritaire stratégique de l’Académie chinoise des sciences (XDB29030103), le Projet scientifique et technologique du Guangdong (n° 2020B1111340076) et le Programme de recherche ouvert du Laboratoire de la baie de Shenzhen (No. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
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