Summary
Qui descriviamo un protocollo per il confezionamento di pseudovirus e la misurazione dell'attività neutralizzante degli anticorpi.
Abstract
Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato epidemie influenzali nel pollame e negli uccelli selvatici. Occasionalmente, anche gli esseri umani ne sono vittime, il che si traduce in un'alta mortalità. Tuttavia, la ricerca sui virus HPAI è spesso ostacolata, considerando che deve essere gestita all'interno di laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus si dimostrano gli strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus H5 HPAI. Questo protocollo descrive le procedure e le fasi critiche dei preparativi di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi di neutralizzazione degli pseudovirus. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test.
Introduction
Dal 1996, i virus H5 dell'influenza aviaria ad alta patogenicità (HPAI) del lignaggio A/goose/Guangdong/1/96 hanno causato continue epidemie di influenza nel pollame e negli uccelli selvatici, causando enormi perdite socio-economiche nell'industria avicola globale. A volte, anche gli esseri umani vengono infettati da esso, di fronte ad un alto tasso di mortalità 1,2. Tuttavia, la ricerca sul virus HPAI è spesso ostacolata, dato che non può essere gestita al di fuori dei laboratori di livello 3 di biosicurezza. Per affrontare questo problema, gli pseudovirus sono adottati come alternativa ai virus wild-type in alcuni esperimenti di studi H5 HPAI. Gli pseudovirus sono abbastanza sicuri da essere praticati nei laboratori di livello 2 di biosicurezza.
Gli pseudovirus H5 HPAI appartengono a virus chimerici costituiti da nuclei di virus surrogati, involucri lipidici con glicoproteine superficiali da virus influenzali e geni reporter. I nuclei di pseudovirus sono solitamente derivati dal virus dell'immunodeficienza umana lentivirale (HIV), dai retrovirus come il virus della leucemia murina (MLV) e dal virus della stomatite vescicolare (VSV)3. In particolare, il sistema di confezionamento dell'HIV-1 è ampiamente utilizzato per produrre pseudovirus influenzale, dove i geni primari forniti sono gag e pol. Il gene del bavaglio dell'HIV esprime le proteine di base. Il gene pol esprime l'integrasi e la trascrittasi inversa, entrambe necessarie per l'espressione del gene reporter nelle cellule trasdotte. Imitando il genoma del virus surrogato, il gene reporter è abbracciato nel nucleo dello pseudovirus in forma di RNA. Il gene reporter esprimerà la proteina nelle cellule ospiti. I livelli di espressione genica dei geni reporter possono essere utilizzati per misurare l'efficienza dell'infezione da pseudovirus 3,4. Il reporter principale è la lucciola luciferasi per misurare le unità di luminescenza relativa (RLU) o l'attività relativa della luciferasi (RLA) nelle cellule trasdotte. Vengono utilizzati anche altri reporter come lacZ, Gaussia e Renilla luciferasi, solo in misura minore5.
Gli pseudovirus sono strumenti ideali per studiare gli anticorpi neutralizzanti contro i virus HAPI H5. Per misurare la potenza degli anticorpi neutralizzanti, vengono utilizzati i saggi di neutralizzazione dello pseudovirus (PN)6. L'emoagglutinina (HA) e la neuraminidasi (NA) sono glicoproteine sulla superficie del virus dell'influenza A 7,8. L'HA è composto da un dominio globulare per il legame del recettore e un dominio dello stelo per la fusione della membrana. La proteina NA ha l'attività sialidasi per facilitare il rilascio del virus 7,8. Un test PN può misurare gli anticorpi neutralizzanti diretti alle proteine HA. Gli anticorpi neutralizzanti diretti alla testa e alla regione dello stelo dell'HA possono anche essere rilevati mediante test di attaccamento virale e di ingresso. Rispetto ai virus wild-type, gli esperimenti di neutralizzazione degli pseudovirus hanno valori di rilevamento più sensibili, possono essere gestiti in modo sicuro in un laboratorio di biosicurezza di livello 2 e sono generalmente più facili da utilizzare nella pratica.
Questo protocollo presenta in dettaglio le procedure e le fasi critiche dei preparati di pseudovirus H5 HPAI e dei saggi PN. Inoltre, discute la risoluzione dei problemi, la limitazione e le modifiche di questi test. In questo studio, il ceppo A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) dei virus HPAI H5N1 è stato utilizzato come esempio. Per ottenere i sieri immunitari utilizzati nei saggi, questo protocollo ha selezionato la proteina HA proveniente dal ceppo TH come immunogeno per immunizzare i topi.
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Protocol
Tutte le operazioni sperimentali correlate allo pseudovirus sono state eseguite in condizioni ABSL2 presso l'Institut Pasteur dell'Accademia cinese delle scienze di Shanghai (IPS, CAS). Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti sulla base dei protocolli sugli animali approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di IPS, CAS.
1. Confezionamento di pseudovirus con trasfezione calcio-fosfato
- Effettuare sospensioni monocellulari di cellule HEK293FT (9 x 105 per ml) in mezzo DMEM completo (Tabella 1). Aggiungere 10 ml delle sospensioni monocellulari in un matraccio T75, incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO2) per 20 ore prima della trasfezione.
NOTA: HEK293FT passaggio basso (<20 passaggi) è consigliato. Assicurarsi che il monostrato cellulare sia confluente all'80-90%. - Sostituire il terreno con 10 ml di terreno completo fresco contenente clorochina (100 μM) 2 ore prima della trasfezione.
- Mescolare i reagenti e il DNA plasmidico come mostrato nella Tabella 2 e nella Figura 1: ddH 2 O, pCMV/R-HA, pCMV/R-NA, pHR-Luc, pCMV Δ 8,9, 2,5 M CaCl2e 2x tampone HEPES. Pipettare su e giù 5 volte delicatamente, incubare la miscela a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti.
- Trasferire la miscela nel mezzo sopra le cellule e scuotere delicatamente il pallone. Incubare le cellule nell'incubatore cellulare per 15 ore.
- Sostituire il fluido con 15 ml di materiale DMEM completo fresco. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 65 ore.
NOTA: Il colore del mezzo sarà arancione chiaro o leggermente giallo e almeno l'80% della cellula dovrebbe mostrare l'effetto citopatico (CPE) al microscopio ottico invertito. - Raccogliere il surnatante e centrifugarlo a 2095 x g per 20 minuti a 4 °C. Raccogliere il surnatante, aliquotarlo e conservarlo a -80 °C.
2. Rilevazione dell'espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale
- Rilevare l'espressione della proteina HA mediante il test dell'emoagglutinina (HA).
- Aggiungere 50 μL di PBS nelle colonne 2-12, righe A, B e C di una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti.
Nota : le righe A, B e C appartengono a 3 test di replica indipendenti e la colonna 12 viene utilizzata come controllo negativo. - Aggiungere 100 μL di pseudovirus nei pozzetti della colonna 1. Trasferire 50 μL dalla colonna 1 alla colonna 2, miscelare bene pipettando su e giù 5 volte, eseguire le due diluizioni doppie fino all'ultima colonna 11 ed eliminare i 50 μL supplementari dalla colonna 11.
- Aggiungere 50 μL di eritrocita allo 0,5% in ciascun pozzetto, pipettare su e giù delicatamente due volte. Incubare la piastra per 30-60 minuti a RT o fino a quando gli eritrociti del controllo negativo formano i punti regolari sul fondo del pozzetto.
- Osservare e registrare i titoli HA dello pseudovirus.
NOTA: L'unità HA degli pseudovirus è il più alto fattore di diluizione del virus che può causare emoagglutinazione al 100% dei globuli rossi.
- Aggiungere 50 μL di PBS nelle colonne 2-12, righe A, B e C di una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti.
- Rilevare l'espressione delle proteine HA e NA mediante il test western-blot.
NOTA: Tutti i passaggi western-blot sono eseguiti secondo il manuale di clonazione molecolare (4° edizione). - Rilevare l'espressione della proteina HIV-1 p24 mediante il kit ELISA HIV-1 p24 (Table of Materials).
- Aggiungere 50 μL del tampone di lisi in 450 μL di campione di pseudovirus. Mescolare accuratamente.
- Aggiungere 300 μL del tampone di lavaggio a ciascun pozzetto della micropiastra. Colpire la piastra capovolta per rimuovere completamente il tampone di lavaggio. Ripetere il lavaggio 5 volte.
- Aggiungere separatamente 200 μL dello standard e campioni a ciascun pozzetto. Incubarli a 37 °C durante la notte o per 2 ore.
- Aspirare il contenuto della piastra e lavarla come descritto al punto 2.3.2.
NOTA: Lasciare vuoto un pozzetto della piastra di analisi da utilizzare come substrato vuoto. - Aggiungere 200 μL di anticorpi del rivelatore p24 a ciascun pozzetto. Incubarli a 37 °C per 1 ora. Aspirare e lavare la piastra come descritto al punto 2.3.2.
- Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro di streptavidina-perossidasi a ciascun pozzetto e incubarli a 37 °C per 30 minuti. Aspirare e lavare la piastra come descritto al punto 2.3.2.
- Aggiungere 100 μL della soluzione di lavoro del substato a ciascun pozzetto, compreso il pozzetto bianco del substrato, e incubarli a 37 °C per 30 minuti.
NOTA: Il colore blu si svilupperà nei pozzi. - Aggiungere 100 μL del tampone di arresto a ciascun pozzetto.
NOTA: il colore blu diventerà immediatamente giallo. - Leggi la densità ottica a 450 nm entro 15 min. Registrare i titoli p24 dello pseudovirus
3. Titolazione degli pseudovirus
- Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 104 per ml) in mezzo DMEM completo, aggiungere 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 celle a diversi pozzetti di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 20 ore.
- Estrarre lo pseudovirus dal frigorifero a -80 °C, scongelarlo sul ghiaccio e vortice lo pseudovirus.
- Aggiungere 6 pseudovirus HAU (6x unità HA) a ciascun pozzetto di piastra a fondo tondo a 96 pozzetti e ricostituire ciascun pozzetto con DMEM completo fino a 120 μL.
- Pipettare su e giù per la miscela 5 volte per mescolare accuratamente. Incubare la piastra della miscela in un incubatore a 37 °C, 5 % CO2 per 1 ora.
- Trasferire 100 μL della miscela alle cellule nella piastra a 96 pozzetti. Rimettere la piastra di coltura cellulare nell'incubatore per 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione da virus.
- Estrarre la piastra dall'incubatore ed eseguire il test della luciferasi (Table of Materials).
- Rimuovere accuratamente il mezzo dai pozzetti della piastra. Risciacquare le cellule con 200 μL di PBS e rimuovere il PBS il più possibile.
NOTA: Capovolgere la piastra e scartare il surnatante schiaffeggiandolo inversamente su carta assorbente. Se la linea cellulare di prova non è stata fissata saldamente al fondo, rimuovere con cura l'aspirazione del mezzo. - Aggiungere 50 μL del tampone di lisi a ciascun pozzetto e scuotere la piastra di coltura più volte. Conservare il piatto a -80 °C per una notte.
NOTA: Mescolare 1 volume di tampone di lisi 5x con 4 volumi di acqua per ottenere il tampone di lisi 1x. Equilibrare il tampone di lisi 1x a RT prima dell'uso. Scuotere la piastra per garantire che le cellule siano completamente coperte con il tampone di lisi. Il singolo processo di congelamento-disgelo può aiutare la cellula a essere completamente lisata. - Estrarre il piatto, equilibrare a RT per 2 ore.
NOTA: la cella deve essere completamente lisata. - Scuotere la piastra più volte delicatamente e trasferire tutti i lisati cellulari in piastre opache a 96 pozzetti.
- Aggiungere 50 μL del substrato a ciascun pozzetto, scuotere delicatamente la piastra più volte e mescolare accuratamente il substrato e il tampone di lisi.
- Misurare la luce prodotta entro 5 minuti utilizzando un luminometro. Registrare i titoli luciferasi dello pseudovirus.
NOTA: Quando viene aggiunto un substrato appropriato, la luce viene emessa come sottoprodotto attraverso una reazione chimica in cui la luciferina viene convertita in ossiluciferina dall'enzima luciferasi. La quantità di luce prodotta è proporzionale alla quantità dell'enzima luciferasi.
4. Preparazione dei sieri immunitari
NOTA: Il siero immunitario sarà utilizzato per esperimenti correlati alle cellule e l'operazione sperimentale deve essere eseguita in condizioni asettiche.
- Preparare 12 topi BALB / c femmina di otto settimane. Dividi equamente i topi in due gruppi.
NOTA: un gruppo era il gruppo DDV e l'altro era il gruppo di controllo negativo. - Immunizzazione del gruppo DDV: Prime due volte per via intramuscolare con 100 μg di un plasmide del DNA ottimizzato per il codone che codifica la proteina A/Thailand/(KAN-1)/2004 (TH) HA alla settimana 0 e alla settimana 3 e aumenta una volta per via intraperitoneale con 512 particelle simili al virus HAU TH (VLP) alla settimana 6.
- Immunizzazione del gruppo di controllo: Prime due volte per via intramuscolare con 100 μg di DNA plasmidico vettore vuoto alla settimana 0 e alla settimana 3 e aumenta una volta per via intraperitoneale con HIV-1 gag VLP alla settimana 6.
- Raccogliere il sangue del topo 2 settimane dopo l'ultima immunizzazione.
NOTA: Qui, i topi sono stati anestetizzati con pentobarbital sodico (65 mg / kg) al momento della raccolta del sangue. Dopo la raccolta di sangue dalla vena sottomandibolare, i topi sono stati immediatamente eutanasizzati. - Mantenere il sangue a RT per 2 ore, poi 4 °C durante la notte. Centrifugare a 900 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante. Inattivare i sieri posizionandoli a 56 °C per 30 minuti.
- Conservare i sieri immuni in frigorifero a -80 °C per l'uso.
NOTA: fare riferimento alla Figura 1 supplementare per il diagramma di flusso che descrive le principali procedure di immunizzazione del topo.
5. Saggio di neutralizzazione degli pseudovirus (PN)
- Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 104 per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere 100 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 per 20 ore.
- Estrarre lo pseudovirus e i sieri dal frigorifero a -80 °C, scongelarli sul ghiaccio e vortice accuratamente.
- Diluire i sieri nel mezzo completo 20 volte e aggiungere 100 μL di mezzo DMEM completo ai pozzetti di una piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti dalle colonne 2-10.
- Aggiungere 200 μL dei sieri diluiti nei pozzetti della colonna 2, trasferire successivamente 100 μL dalla colonna 2 alla colonna 3, diluire i sieri come 1:20, 1:40, 1:80, ecc., a 1:10240 successivamente dalla colonna 2 alla colonna 10 ed eliminare i 100 μL dalla colonna 10.
- Aggiungere 100 μL di mezzo completo DMEM ai pozzetti della colonna 11 come controllo negativo.
- Aggiungere 100 μL di pseudovirus a ciascun pozzetto, pipettare su e giù per la miscela 5 volte accuratamente e incubare la piastra della miscela in 37 °C, 5% CO2 per 1 ora.
- Trasferire 100 μL della miscela dalla piastra a fondo rotondo a 96 pozzetti al pozzetto corrispondente della piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti. Rimettere la piastra nell'incubatore (37 °C, 5% CO2) per 60 ore.
- Estrarre il piatto dall'incubatore. Eseguire il test della luciferasi come descritto nei punti 3.7-3.12.
6. Saggio di attaccamento di pseudovirus
- Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (4 x 104 per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere sospensioni di celle da 100 μL a ciascun pozzetto in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 20 ore.
- Incubare lo pseudovirus con sieri in DMEM contenente 1% BSA a 4 °C durante la notte.
NOTA: Il volume della miscela è di 100 μL. - Bloccare le cellule MDCK con 100 μL per pozzetto di DMEM contenente l'1% di BSA a 4 °C per 1 ora.
- Inoculare lo pseudovirus e la miscela di siero (100 μL) sul monostrato MDCK e incubarlo a 4 °C per 2 ore.
- Lavare la piastra cellulare 4 volte con PBS contenente l'1% di BSA per rimuovere qualsiasi virus non legato.
- Lisare le cellule con 100 μL di tampone di lisi luciferasi a RT per 30 minuti.
- Quantificare la quantità di virus legato sulle cellule con un kit ELISA HIV-1 p24 come descritto sopra (paragrafo 2.3).
7. Valutazione dell'ingresso virale
- Effettuare sospensioni a cella singola di cellule MDCK (5 x 104 per ml) in mezzo DMEM completo e aggiungere 100 μL della sospensione cellulare a ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C, 5% CO2 per 20 ore prima del test.
- Inoculare lo pseudovirus (100 μL) su un monostrato MDCK in una piastra da 96 pozzetti a 4 °C per 6 ore.
- Lavare la piastra cellulare 4 volte con PBS contenente l'1% di BSA per rimuovere gli pseudovirus non legati.
- Aggiungere 100 μL dei sieri o sieri immunitari diluiti in serie da topi con vaccinazione fittizia in DMEM contenente l'1% di BSA al monostrato e incubare la cellula a 4 °C per 2 ore.
- Rimuovere il surnatante cellulare e lavare la piastra di coltura cellulare 4 volte con PBS contenente BSA all'1%.
- Aggiungere DMEM fresco alle cellule e incubare per 60 ore in un incubatore a 37 °C, 5% CO2 .
- Misurare l'attività relativa della luciferasi (RLA) delle cellule come descritto nei passaggi 3.7-3.12.
NOTA: L'ingresso virale, come indicato da RLA, è stato espresso come percentuale della lettura ottenuta in assenza di sieri, che è stata impostata come 100%.
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Representative Results
Espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale
Per identificare l'efficienza del confezionamento virale, le scorte di pseudovirus influenzali sono state rilevate per la prima volta mediante saggio HA (Figura 2A). Le unità HA per millilitro di pseudovirus influenzali sono 643 (Tabella 3). Il saggio western-blot e i saggi ELISA sandwich sono stati utilizzati per testare l'espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1. Quindi sono stati calcolati i rapporti dell'unità HA e la quantità di gag p24 per gli pseudovirus. I risultati del test western-blot hanno mostrato che c'erano 4 tipi di proteine: proteine HA0, HA1, HA2 e NA (Figura supplementare 2). Ciò indica che le proteine avvolgenti degli pseudovirus influenzali sono simili a quelle dei virus wild-type. I rapporti di HA e Gag p24 erano all'interno di un intervallo normale come riportato (Tabella 3) 9.
| Ceppi di pseudovirus | HAU/mL | 1,00E + 05 pg/mL | Rapporto HAU/1,00E+05 pg* |
| P A/Thailandia/(KAN-1)/2004 | 642,52 ± 30,26 | 4,20 ± 0,17 | 152.98 |
| *I rapporti delle unità HA e la quantità di HIV-1 Gag p24 negli pseudovirus sono stati calcolati come segue: unità HA/quantità di Gag p24. | |||
Tabella 3: Quantificazione dello pseudovirus H5.
Titolazione pseudovirus
Per misurare la concentrazione di particelle virali funzionali, è stata rilevata l'attività relativa della luciferasi (RLA) dello pseudovirus. Le letture RLA dipendono da molte variabili. Per identificare l'effetto della quantità di cellule trasdotte sulle letture RLA, abbiamo seminato le cellule di 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 per pozzetto di piastra a 96 pozzetti (Figura 2). I risultati hanno mostrato che le letture RLA dello pseudovirus sono le più alte e l'errore standard della media è il più basso quando 5000 cellule sono seminate in un pozzo di piastra a 96 pozzetti (Figura 4A). Per identificare l'effetto del tempo di incubazione, le letture RLA vengono rilevate a 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione da virus. I risultati hanno mostrato che quando incubati per 60 ore, le letture RLA dello pseudovirus sono più alte nei valori e migliori nella ripetibilità con un basso errore standard della media (Figura 4B). I risultati indicano che è adatto a seminare 5000 cellule in un pozzetto di una piastra da 96 pozzetti e rilevare le letture RLA 60 ore dopo l'infezione da virus.
Saggi PN
I titoli di neutralizzazione dei sieri immunitari del gruppo di controllo e del gruppo DDV sono stati misurati mediante saggi PN (Figura 5). Come mostrato nella Figura 5A, i sieri immunitari del gruppo DDV hanno mostrato titoli di neutralizzazione elevati contro il ceppo pseudovirus A/Thailand/1(KAN)-1/04. Al contrario, i sieri del gruppo di controllo non hanno mostrato alcuna attività di neutralizzazione (Figura 5B). Rispetto ai test sierologici tradizionali (saggi HI e MN), i test PN sono più sensibili (i dati non sono mostrati).
Saggio di neutralizzazione dell'allegato
Alcuni anticorpi di neutralizzazione possono ostacolare l'attaccamento dei virus ai recettori dell'acido sialico. Questi anticorpi sono diretti alla testa HA e sono predominanti dopo l'immunizzazione con vaccino commerciale o infezione del virus dell'influenza. Per identificare l'attività neutralizzante di questi anticorpi, vengono eseguiti saggi di neutralizzazione dell'attaccamento (Figura 3). Rispetto ai sieri di controllo, l'attività neutralizzante dei sieri immunitari è potente, il che indica che ci sono molti anticorpi diretti alla testa HA nei sieri immunitari (Figura 6A).
Valutazione dell'ingresso virale
Questo test viene utilizzato per identificare gli anticorpi che ostacolano la fusione dell'involucro virale e delle membrane endosomiali durante l'infezione da virus influenzale. Questi anticorpi sono diretti al dominio del gambo HA e sono comunemente meno potenti. Per misurare i titoli di neutralizzazione di questi anticorpi, vengono eseguiti saggi post-attacco (Figura 3). Ci sono differenze significative tra i sieri immunitari e i sieri di controllo, il che indica che ci sono anticorpi diretti alla regione dello stelo HA nei sieri immunitari (Figura 6B).
Figura 1: Diagramma di flusso della trasfezione mediata dal calcio. Questo diagramma di flusso è usato per descrivere le principali procedure di trasfezione mediata dal calcio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Quantificazione e titolazione dello pseudovirus. (A) Diagramma di flusso del saggio HA sugli pseudovirus che descrive le fasi principali del saggio HA sugli pseudovirus. (B) Diagramma di flusso del saggio sullo pseudovirus P24 che descrive le fasi principali del test sullo pseudovirus P24. (C) Diagramma di flusso del saggio di titolazione degli pseudovirus che descrive le fasi principali del saggio di titolazione degli pseudovirus. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Saggi di neutralizzazione basati su pseudovirus. (A) Diagramma di flusso del saggio PN che descrive le fasi principali del test PN. (B) Diagramma di flusso del saggio di attaccamento di pseudovirus che descrive le fasi principali del test di attaccamento. (C) Diagramma di flusso della valutazione del saggio di ingresso virale che descrive le fasi principali del test di ingresso virale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Titolazione di pseudovirus. (A) Diverse quantità di celle per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti influenzano le letture RLA. 1250, 2500, 5000, 10000, 20000 e 40000 cellule sono state seminate in una piastra da 96 pozzetti. (B) Il diverso tempo di raccolta influenza le letture della RLA. Le letture RLA vengono rilevate a 48 ore, 60 ore e 72 ore dopo l'infezione da virus. I dati raccolti da tre esperimenti indipendenti sono presentati come media ± SEM; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). È stato eseguito un test ANOVA unidirezionale con Tukey. P < 0,0001; ns, non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Risposte anticorpali neutralizzanti H5 rilevate con pseudovirus. (A) Titolazione delle risposte anticorpali neutralizzanti dei sieri immunitari dal gruppo DDV. (B) Titolazione delle risposte anticorpali neutralizzanti dei sieri immunitari dal gruppo di controllo. L'IC50 è definito come le diluizioni reciproche dell'anticorpo neutralizzante che può inibire il 50% dello pseudovirus. I dati raccolti da tre esperimenti indipendenti sono presentati come media ± SEM; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Lo pseudovirus VSVG è stato usato come controllo negativo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Rilevazione della potenza degli anticorpi di neutralizzazione mediante test di legame e di ingresso virale. (A) I sieri immunitari del gruppo DDV, non quelli del gruppo di controllo, inibiscono l'attaccamento virale alle cellule. (B) I sieri immunitari del gruppo DDV, non quelli del gruppo di controllo, inibiscono parzialmente l'infezione virale post-attaccamento. I dati raccolti da tre esperimenti indipendenti sono presentati come media ± SEM; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Composizione completa del mezzo DMEM | Concentrazione |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | 1x |
| Siero bovino fetale | 10% |
| Penicillina (1 U / ml) / streptomicina | 1 μg/ mL |
Tabella 1: Composizione completa del mezzo DMEM.
| Materiali | Concentrazione | Volume |
| 2x HEPES (pH 7,1) | -- | 675,0 μL |
| CaCl 2 (2,5 M) | -- | 67,5 μL |
| ddH2O | -- | 529,2 μL |
| pCMV Δ 8,9 | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
| pCMV/R-HA | 100 ng/μL | 27,0 μL |
| pCMV/R-NA | 50 ng/μL | 13,5 μL |
| pHR-Luc | 1000 ng/μL | 18,9 μL |
Tabella 2: Sistema di confezionamento di pseudovirus.
Figura supplementare 1: Diagramma di flusso dell'immunizzazione del topo. Questo diagramma di flusso descrive le principali procedure di immunizzazione del topo. I sieri immunitari sono stati utilizzati come campioni. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare 2: Espressione delle proteine p24 di HA, NA e HIV-1 dello pseudovirus influenzale. Western-blot di proteine pseudovirali. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
HEK293FT cellule sono solitamente utilizzate come cellule di imballaggio per produrre pseudovirus. Il rilevamento regolare del micoplasma è essenziale durante la coltura cellulare. La contaminazione da micoplasma può ridurre drasticamente i raccolti di pseudovirus e talvolta vicino allo zero. Rispetto ad altre contaminazioni, le contaminazioni da micoplasma non portano a variazioni del valore del pH o torbidità del terreno di coltura cellulare. Anche un'alta concentrazione di micoplasma non è visibile ad occhio nudo o al microscopio. Tre metodi popolari di rilevamento del micoplasma sono la coltura di micoplasma, la colorazione del DNA con DAPI fluorescente o Hoechst 33258 e la reazione a catena della polimerasi (PCR). La PCR che amplifica il DNA del micoplasma nei campioni di coltura è ampiamente utilizzata per test del micoplasma rapidi, facili e affidabili10.
La trasfezione mediata dal fosfato di calcio è stata utilizzata per il confezionamento di pseudovirus influenzali per molti anni grazie alla sua elevata efficienza, basso costo e facilità d'uso11. Tuttavia, questo metodo è molto sensibile al valore del pH di una soluzione tamponata HEPES, al terreno di coltura cellulare HEK293FT e all'H2O a doppia distillazione. Il valore del pH ha influenzato la formazione del precipitato e il tempo di durata della permanenza del precipitato sulle cellule HEK293FT. Pertanto, può determinare la quantità di DNA assorbita dalle cellule HEK293FT. Il pH per una soluzione tamponata HEPES è estremamente ristretto, compreso tra 7,05-7,1212,13,14, condizione in cui un precipitato contenente fosfato di calcio e DNA si forma lentamente in soluzione tamponata HEPES. Se il pH è troppo alto, la dimensione del precipitato diventerà così grande che può persino uccidere le cellule HEK293T. Al contrario, se il pH è troppo basso, il precipitato non può formarsi o il precipitato sarà troppo piccolo per depositarsi sulla superficie cellulare. Inoltre, anche il pH del terreno di coltura cellulare HEK293FT svolge un ruolo nell'efficienza della trasfezione. Durante la trasfezione, il mezzo cellulare deve essere mantenuto tra un pH di 7,2-7,4. Sia i mezzi iperacidi che quelli alcalini cambieranno le dimensioni del precipitato e il tempo di adsorbimento della miscela di DNA sulla superficie cellulare. Inoltre, H2O a doppia distillazione con origini diverse utilizzate nella miscela di DNA può alterare il pH di una soluzione tamponata HEPES. Pertanto, mantenere un valore pH stabile della soluzione di trasfezione e del terreno di coltura è fondamentale per garantire un'elevata efficienza di trasfezione. Inoltre, l'efficienza di trasfezione è influenzata anche dalla soluzione di 2,5 M CaCl 2 e dalla concentrazione di anidride carbonica (CO2) nell'incubatore cellulare. Durante il processo di trasfezione, è fondamentale conservare correttamente la soluzione di CaCl 2 e stabilizzare la concentrazione di CO2 nell'incubatore.
Il sistema di confezionamento più popolare dello pseudovirus influenzale prevede un approccio di co-trasfezione di plasmidi multipli. I geni HA, NA, reporter e lentiviral gag e pol vengono clonati separatamente nei vettori di espressione plasmidica e quindi trasfettati nelle cellule contemporaneamente. Per aumentare l'espressione proteica, una sequenza di consenso Kozak viene spesso aggiunta prima del sito di inizio della trascrizione.
È necessario preparare DNA plasmidico puro, superavvolgente e privo di endotossine15. Poiché il rapporto plasmidico influenza direttamente le rese dello pseudovirus. Questo protocollo ha ottimizzato il rapporto plasmidico del "core: reporter: HA: NA" a 28:28:4:1 e lo ha confrontato con altri metodi di trasfezione. È necessario che la quantità di DNA plasmidico nella trasfezione del fosfato di calcio raggiunga fino a 30,5 μg per piatto da 100 mm.
I titoli pseudovirali sono rilevati mediante PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR), saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA), saggio di emoagglutinazione e saggi di rilevamento RLA. Il test qRT-PCR viene utilizzato per stimare il numero di copie dei geni RNA degli pseudovirus interni5. Il test ELISA viene utilizzato per rilevare il contenuto della proteina p24, che è il componente principale del nucleo dell'HIV. Il saggio di emoagglutinazione misura la quantità di picco di HA sulla superficie delle particelle di pseudovirus. Questi tre saggi sono impiegati per quantificare le particelle virali non funzionali. Il test di rilevamento RLA è il metodo principale per misurare la concentrazione di particelle virali funzionali che possono infettare le cellule trasdotte e rilasciare geni reporter in stock di pseudovirus. Le cellule MDCK sono comunemente usate come cellule trasdotte. Le cellule trasdotte vengono seminate in piastre di coltura a 96 pozzetti, infettate da pseudovirus, lisate mediante tampone di lisi e quindi trasferite su piastre luminometriche a 96 pozzetti per leggere i valori. Diverse quantità di cellule e tempi di incubazione influenzano i valori di RLA. Sulla base dei risultati, l'espressione genica del reporter è elevata quando 5000 cellule sono seminate per pozzetto su una piastra a 96 pozzetti e RLA viene rilevato a 60 ore dopo l'infezione virale.
I saggi di neutralizzazione dello pseudovirus (PN) H5 HPAI sono stati ampiamente applicati per il rilevamento degli anticorpi a causa della loro sicurezza, maggiore sensibilità, accuratezza e idoneità per lo screening ad alta produttività. Un protocollo generale di analisi PN comprende le seguenti quattro fasi: quantità di pseudovirus, diluizione del siero, incubazione di pseudovirus-anticorpi e rilevamento dell'attività della luciferasi. Le quantità di pseudovirus sono normalizzate in base alle letture RLA. Valori RLA di 106 per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti vengono utilizzati per ottenere risultati dell'esperimento riproducibili. Il punto iniziale della diluizione del campione di siero deve essere superiore a 40. Il componente del campione di siero aumenterà ovviamente i valori di luciferasi dello pseudovirus quando il fattore di diluizione del campione di siero è inferiore a 40. La miscela pseudovirus-anticorpi viene incubata per 1 ora a 37 °C e quindi trasferita alle cellule MDCK, seguita dal rilevamento delle letture RLA in 60 ore. I livelli di luciferasi sono generalmente presi come strumento per determinare l'efficienza dell'infezione da pseudovirus.
Nel saggio PN, ci sono quattro elementi importanti: la proteina reporter della luciferasi, la chimica del saggio, un luminometro e micropiastre16. In primo luogo, il gene della luciferasi è ottimizzato per il codone per migliorare i livelli di espressione proteica nelle cellule trasdotte. L'ingegnerizzazione dei geni reporter e della spina dorsale del vettore riduce il numero di siti di legame del fattore di trascrizione del consenso per ridurre il rischio di trascrizione anomala. In secondo luogo, i reagenti di rilevamento appropriati vengono selezionati in base allo scopo dell'esperimento. I saggi PN sono generalmente utilizzati come metodi ad alto rendimento per rilevare le risposte neutralizzanti di campioni di siero o anticorpi. Questo protocollo ha utilizzato il sistema di analisi della luceferasi, che offre il segnale più luminoso, un'ampia gamma dinamica e un'elevata sensibilità. Ancora più importante, l'emivita del segnale è di circa 10 minuti e le cellule vengono immediatamente testate dopo l'aggiunta del substrato. Un luminometro viene utilizzato per rilevare la concentrazione di luciferasi. Vengono prodotti molti tipi diversi di luminometri. Il principio di base è che la macchina utilizzata può identificare con precisione le differenze nell'attività della luciferasi tra diversi campioni. Le microlastre di polistirene bianco o nero dovrebbero essere utilizzate per opacità e sfondi a bassa luminescenza. Le micropiastre bianche possono migliorare i segnali luminescenti e hanno una bassa luminescenza di fondo, mentre le micropiastre nere possono ridurre la diffusione della luce per ridurre la diafonia da pozzo a pozzo17.
I saggi di PN sono in linea con i metodi tradizionali per rilevare le risposte anticorpali neutralizzanti. Tuttavia, includendo solo le proteine HA e NA provenienti da virus wild-type influenzali, gli pseudovirus sono lontani dal virus wild-typed. L'HA può legarsi al recettore dell'acido sialico della cellula ricevente per iniziare l'infezione. Quindi i cambiamenti conformazionali HA nell'endosoma innescano la fusione delle membrane virale ed endosomiale, rilasciando le ribonucleoproteine virali (vRNP) nel citoplasma. Gli pseudovirus influenzali possono solo imitare questi processi e vengono applicati nelle ricerche correlate.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle borse di ricerca dell'Innovation Capacity Building Project della provincia di Jiangsu (BM2020019), Shenzhen Scientific and Technological Project (No. JSGG20200225150702770), Programma di ricerca prioritaria strategica dell'Accademia cinese delle scienze (XDB29030103), Progetto scientifico e tecnologico del Guangdong (n. 2020B1111340076) e Programma di ricerca aperta del laboratorio della baia di Shenzhen (n. SZBL202002271003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | -- | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | -- | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
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