Method Article

주사 전자 현미경을 이용한 멤브레인 러플 형성 시각화

DOI:

10.3791/62658

⸱

May 27th, 2021

 ,  ,  , 
1Vascular Biology Center, Medical College of Georgia at Augusta University, 2Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 3Department of Pharmacology and Toxicology, Medical College of Georgia at Augusta University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macropinocytosis는 막 프릴이라고도 알려진 F-actin이 풍부한 시트 형 막 돌기의 형성에 의해 시작된 고도로 보존 된 내시세포 과정입니다. 거대 피노사이토틱 용질 내재화의 증가된 속도는 다양한 병리학적 조건에 연루되어 왔다. 이 프로토콜은 주사 전자 현미경을 사용하여 시험관 내에서 막 프릴 형성을 정량화하는 방법을 제시한다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

막 프릴링은 새로 중합된 액틴 필라멘트의 메쉬워크를 함유하는 운동성 원형질막 돌출부의 형성이다. 막 프릴은 자발적으로 또는 성장 인자, 염증성 사이토카인, 및 포볼 에스테르에 반응하여 형성될 수 있다. 막 돌출부 중 일부는 원위 여백에서 융합되는 원형 막 주름으로 재구성되어 마크로 피노솜이라고 불리는 크고 이질적인 액포로 세포질에 닫히고 분리되는 컵을 형성 할 수 있습니다. 이 과정에서 프릴은 거대 피노좀 내에서 내재화되는 세포 외 유체와 용질을 포획합니다. 고해상도 주사 전자 현미경 (SEM)은 세포 표면의 막 프릴 형성, 원형 돌출부 및 폐쇄 된 거대 피노시스 컵을 시각화하고 정량화하는 데 일반적으로 사용되는 이미징 기술입니다. 다음 프로토콜은 세포 배양 조건, 시험관 내에서 막 프릴 형성의 자극, 및 SEM을 사용하여 이미징을 위해 세포를 고정, 탈수 및 준비하는 방법을 기술한다. 멤브레인 프릴링의 정량화, 데이터 정규화, 및 막 프릴 형성의 자극기 및 억제제가 또한 기재되어 있다. 이 방법은 생리 학적 및 병리학 적 과정에서 대식세포증의 역할에 대한 주요 질문에 답하고, 막 프릴 형성을 조절하는 새로운 표적을 조사하고, 아직 특징이 없는 생리적 자극제뿐만 아니라 거대 세포증의 새로운 약리학 적 억제제를 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Macropinocytosis는 막 프릴1이라고 불리는 역동적이고 액틴 구동 원형질막 돌출부의 형성을 통해 다량의 세포외 유체와 그 함량을 내재화하는 내시성 과정입니다. 이러한 막 프릴 중 많은 부분이 세포에 근접하고 다시 융합되어 원형질막으로부터 분리되는 컵을 형성하여 마크로피노솜1로도 알려진 크고 이질적인 세포 내 엔도솜으로 알려져 있습니다. 대식세포증은 광범위한 세포 유형에서 대식세포 콜로니 자극 인자(M-CSF) 및 표피 성장 인자(EGF)와 같은 성장 인자에 의해 유도되지만, 구성적 거대세포증으로 알려진 추가적인 독특하고 칼슘-의존적 과정은 선천적 면역 세포 2,3,4,5,6,7,8에서도 관찰되었다.

거대 세포증을 통해 세포외 물질을 내....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고: 다음은 SEM 현미경을 사용하여 RAW 264.7 대식세포에서 막 프릴 형성을 정량화하는 데 사용되는 일반적인 프로토콜입니다. 최적화는 상이한 세포 유형에 대해 요구될 수 있다.

1. 세포주 및 세포배양

  1. 37°C 및 5% CO2의 가습 배양기에서 10%(vol/vol) 열 불활성화된 태아 소 혈청(FBS), 페니실린 100IU/mL 및 스트렙토마이신 100μg/mL로 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에서 RAW 264.7 대식세포를 성장시킨다. 격일로 성장 매체를 교체하십시오.
  2. 세포가 80% 합류하게 되면, 멸균 PBS를 사용하여 플레이트를 두 번 세척한다.
  3. 1,000 μL의 0.5% 트립신-EDTA를 첨가하여 세포를 분리하고, 세포 배양 플레이트를 37°C의 가습 인큐베이터에서 3-5분 동안 인큐베이션한다.
  4. 세포 해리를 확인하기 위해 광학 현미경으로 플레이트를 검사하십시오. 트립신을 불활성화시키기 위해 10% FBS를 함유하는 성장 배지 10 mL를 첨가한다.
  5. 세포 현탁액을 50 mL 원뿔형 튜브에 수집하고, 실온에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리한다. 완전한 세포 배양 배지에서 세포를 부드럽....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서는 제시된 기술의 결과를 설명합니다. 도 1에 도시된 대표적인 SEM 이미지는 PMA 및 M-CSF로 처리한 후 RAW 264.7 대식세포에서 막 프릴 형성을 입증한다. 이미지는 먼저 정량화 목적으로 3,500x의 배율로 캡처 한 다음 더 높은 배율 (8,500x ~ 16,000x)에서 캡처하여 원형질막을 더 자세히 보여줍니다. 대식세포를 대식세포증 억제제 EIPA로 전처리하여 막프릴 형성을 감쇠시켰다(도 1). Macropinocytosis-associated 원형질막 활성은 5 개의 연속적인 단계로 나눌 수 있습니다 : 1) 막 주름의 개시, 2) 원형화, 3) 컵 형성, 4) 컵 폐쇄, 5) 거대 피노좀 형성을 통한 세포외 유체 및 그의 관련 용질의 내재화. 도 2는 M-CSF 자극 이후에도 이러한 형태학적으로 구별되는 원형질막 활성의 대표적인 이미지를 보여.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 SEM 이미징 프로토콜은 시험관 내에서 세포 표면 상의 막 프릴 형성, 원형 돌출부 및 마크로피노시스 컵을 시각화하고 정량화하는 도구를 제공한다. 현재의 프로토콜은 대식세포에 초점을 맞추고 있지만, 연구 결과에 따르면 막 프릴 형성은 수지상 세포, 섬유 아세포, 뉴런 및 암 세포11,12,14,21,30을 포함한 다양한 다른 세포 유형에서도 발생합니다. 이를 감안할 때, 세포 배양 조건의 최적화 및 상이한 자극기 또는 치료 조건의 사용은 다른 세포 유형에서 막 프릴의 시각화를 위해 요구될 수 있다.

샘플 준비에는 약간의 여유가 있지만, 세포 표면 구조를 보존하기 위해 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 SEM 샘플 준비에 도움을 주신 Libby Perry (Augusta University)에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 [R01HL139562 (G.C.) 및 K99HL146954 (B.S.)] 및 미국 심장 협회 [17POST33661254 (B.S.)]의 지원을 받았다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.5% 트립신-EDTAGibco15400-054
2% 글루타르알데히드전자 현미경 과학16320
4% 파라포름알데히드산타크루즈 생명공학281692
5-(N-에틸-N-이소프로필)-아밀로라이드시그마 생명 과학A3085
Accuri C6 유세포 분석기
탄소 접착 탭전자 현미경 과학77825-09
디메틸 설폭사이드코닝25-950-CQC
Dulbecco's Modified Eagle MediumCytiva Life SciencesSH30022.01
Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture PlateFalcon353047
Fetal Bovine SerumGemini Bio900-108
FitC-dextranThermo Fisher ScientificD1823
FM 4-64Thermo Fisher ScientificT13320
HERAcell 150i CO2 인큐베이터Thermo Fisher Scientific51026282
Hummer Model 6.2 Sputter CoaterAnatech USA58565
JSM-IT500HR 주사 전자 현미경
현미경 커버 유리Thermo Fisher Scientific12-545-82
펜 연쇄상 구균Gibco15140-122
phorbol 12-myristate 13-acetateMillipore Sigma524400
RAW 264.7 대식 세포ATCCATCC TIB-71
재조합 인간 M-CSFPeprotech300-25
Samdri-790 Critical Point DryerTousimis Research Corporation8778B
SEM 알루미늄 시료 마운트전자 현미경 과학75220
카코딜산 나트륨전자 현미경 과학12300
Texas red-dextraThermo Fisher ScientificD1864
Trypan Blue SolutionThermo Fisher Scientific15250061
Zeiss LSM 780 컨포칼 현미경

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
  2. Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role....

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