Summary
Macropinocistose é um processo endoctico altamente conservado iniciado pela formação de projeções de membrana semelhantes a folhas f-actin, também conhecidas como babados de membrana. O aumento da taxa de internalização do soluto macropinocético tem sido implicado em várias condições patológicas. Este protocolo apresenta um método para quantificar a formação de babados de membrana in vitro usando microscopia eletrônica de varredura.
Abstract
O babado da membrana é a formação de saliências de membrana plasmática motil contendo uma malha de filamentos de actina recém-polimerizados. Os babados de membrana podem se formar espontaneamente ou em resposta a fatores de crescimento, citocinas inflamatórias e ésteres de phorbol. Algumas das saliências da membrana podem se reorganizar em babados de membrana circular que se fundem em suas margens distais e formam copos que fecham e se separam no citoplasma como vacuoles grandes e heterogêneos chamados macropinossomos. Durante o processo, babados prendem fluido extracelular e solutos que internalizam dentro de macropinossomos. Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (SEM) é uma técnica de imagem comumente usada para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos fechados na superfície celular. O protocolo a seguir descreve as condições de cultura celular, estimulação da formação de babados de membrana in vitro e como corrigir, desidratar e preparar células para imagem usando SEM. Quantificação de babados de membrana, normalização de dados e estimuladores e inibidores da formação de babados de membrana também são descritos. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre o papel da macropinocistose nos processos fisiológicos e patológicos, investigar novos alvos que regulam a formação de babados de membrana e identificar estimuladores fisiológicos ainda não característicos, bem como novos inibidores farmacológicos da macropinocise.
Introduction
Macropinocistose é um processo endocítico responsável por internalizar uma grande quantidade de fluido extracelular e seu conteúdo através da formação de saliências dinâmicas e de membrana plasmática acionadas por atolética chamadas babadosde membrana 1. Muitos desses babados de membrana formam copos que se aproximam e se fundem de volta à célula e se separam da membrana plasmática como endosários intracelulares grandes e heterogêneos também conhecidos como macropinossomos1. Embora a macropinocitose seja induzida por fatores de crescimento como fator estimulante da colônia de macrófago (M-CSF) e fator de crescimento epidérmico (EGF) em uma ampla gama de tipos celulares, um processo adicional único, dependente de cálcio conhecido como macropinocose constitutiva também foi observado em imunes inatas 2,3,4, 5, 6, 7,8.
A capacidade das células de internalizar material extracelular via macropinocise tem mostrado desempenhar um papel importante em uma variedade de processos fisiológicos que vão desde a captação de nutrientes até a captura de patógenos e apresentação de antígenos 9,10,11. No entanto, como esse processo não é seletivo e induível, também foi implicado em uma série de condições patológicas. De fato, estudos anteriores sugeriram que a macropinocitose desempenha um papel importante na doença de Alzheimer, doença de Parkinson, câncer, nefriese e aterosclerose 12,13,14,15,16. Além disso, certas bactérias e vírus têm mostrado utilizar a macropinocitose para obter entrada em células hospedeiras e induzir a infecção17,18. Curiosamente, a estimulação da macropinocitose também pode ser explorada para a entrega direcionada de agentes terapêuticos em diversas condições da doença19,20.
Estudos anteriores exploraram a macropinocitose quantificando marcadores internalizados de fase fluida com marcação fluorescente na ausência e presença de agentes farmacológicos que inibem a macropinocitose usando citometria de fluxo e imagem confocal21,22. Atualmente, as ferramentas farmacológicas disponíveis que inibem a macropinocistose estão limitadas e compreendem 1) inibidores de polimerização de actina (citochalasina D e latrunculinas), 2) bloqueadores pi3K (LY-290042 e wortmannin) e 3) inibidores de trocadores de hidrogênio de sódio (NHE) (amiloride e EIPA)5,14,15,23,24,25 . No entanto, como esses inibidores têm efeitos independentes da endocitose, é difícil determinar seletivamente a contribuição da macropinocise para a absorção de solutos e patogênese da doença especialmente in vivo21.
A microscopia eletrônica de varredura (SEM) é um tipo de microscópio eletrônico que produz imagens de ultra-alta resolução de células usando um feixe focalizado de elétrons26. Na pesquisa de macropinocistose, a imagem SEM é considerada a técnica padrão-ouro para visualizar características topográficas e morfológicas da membrana plasmática, quantificar a formação de babados de membrana e investigar sua progressão para a internalização macropinosa. Além disso, a varredura da microscopia eletrônica combinada com a quantificação da absorção de soluto, na presença e ausência de bloqueadores de macropinocise, fornece uma estratégia confiável para examinar a internalização do soluto macropinocistótico in vitro. Este artigo fornece um protocolo detalhado sobre como preparar células para SEM, visualizar a superfície celular, quantificar a formação de babados e examinar seu progresso para o fechamento do copo e internalização macropinosa.
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Protocol
NOTA: O seguinte é um protocolo geral usado para quantificar a formação de babados de membrana em macrófagos RAW 264.7 utilizando microscopia SEM. A otimização pode ser necessária para diferentes tipos de células.
1. Linha celular e cultura celular
- Grow RAW 264,7 macrófagos no DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco (DMEM) complementados com 10% (vol/vol) de bovino fetal inativado térmico (FBS), 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL streptomicina em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% DE CO2. Substitua a mídia de crescimento a cada dois dias.
- Quando as células se tornarem 80% confluentes, lave a placa duas vezes usando PBS estéril.
- Despegar células adicionando 1.000 μL de 0,5% de trippsina-EDTA e incubar a placa de cultura celular por 3-5 min em uma incubadora umidificada a 37 °C.
- Examine a placa sob um microscópio leve para confirmar a dissociação celular. Adicione 10 mL de mídia de crescimento contendo 10% de FBS para inativar trippsina.
- Colete a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e centrífuga a 400 x g por 5 min a temperatura ambiente. Resuspend suavemente células no meio completo da cultura celular e determinam a contagem de células e a viabilidade usando a coloração do Trypan Blue (0,4%) .
NOTA: A viabilidade celular mínima recomendada para este experimento é >90%. - Coloque tampas de vidro estéreis em poços de uma placa de 24 poços usando fórceps autoclavados. As células de sementes em deslizamentos de cobertura a uma densidade de 1 x 106 células/mL e incubam a placa durante a noite em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de CO2.
- Mude a mídia de cada poço com mídia completa de 500 μL fresca antes do tratamento. Macrófagos pré-tratados com veículo (DMSO ou outros solventes usados para dissolver o EIPA) ou o inibidor de macropinocise 5-(N-ethyl-N-isopropil)-Amiloride (EIPA, 25 μM21) por 30 min.
- Tratar células com veículo e estimuladores de macropinocitose para promover o babado de membrana: phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA, 1 μM, 30 min21) e fator estimulante da colônia de macrófago (M-CSF, 100 ng/mL, 30 min3).
NOTA: Inibidores alternativos [por exemplo, latrunculina A (1 μM, 30 min) ou citochalasina D (1 μM, 30 min)] e estimuladores [por exemplo, fator de crescimento epidérmico (EGF, 100 ng/mL, 10 min) ou fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF, 100 ng/mL, 15 min)] de macropinocose também pode ser usado para caracterizar macropinocise em macrófagos e outros tipos celulares16,27, 28,29. As células podem exigir fome de soro durante a noite antes do tratamento com estimuladores fisiológicos da macropinocise. É importante notar que as concentrações mais eficazes e os tempos de incubação terão que ser determinados para estimular a macropinocitose em outros tipos de células.
2. Fixação SEM
- Após o tratamento, aspire a mídia de poços e lave tampas com PBS gelado duas vezes.
- Fixar células (4% de paraformaldeído e 2% glutaraldeído em 0,1 M de cacodilato de sódio) por 30 min à temperatura ambiente, seguido de incubação durante a noite no fixador a 4 °C.
- Lave suavemente e incubar tampas com 500 μL de reagentes seguintes sem perturbar a monocamada celular.
- Lave uma vez em 0,1 M de cacodilato de sódio e incubar por 15 min.
- Lave duas vezes com dH2O com incubação de 10 minutos em cada lavagem.
- Lave duas vezes com 25% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lave duas vezes com 50% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lave duas vezes com 75% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lave duas vezes com 80% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lave duas vezes com 95% de etanol com 10 min de incubação em cada lavagem.
- Lave duas vezes com 100% de etanol. Realize 10 min de incubação em cada lavagem.
NOTA: A troca/substituição dos reagentes deve ser feita rapidamente para evitar a secagem do ar das células. As tampas podem ser deixadas em 100% de etanol por vários dias a 4 °C. Para armazenamento a longo prazo, adicione 100% de etanol adicional e cubra poços com parafilm para evitar a secagem do ar da amostra.
3. Secagem de pontos críticos
- Coloque as tampas em um Secador de Ponto Crítico e cubra com 100% de etanol. Pressione o botão Ligar e abra o tanque de CO2 .
- Pressione o botão Esfriar por aproximadamente 30 s até que a temperatura diminua para 0 °C. Pressione o botão Encher até que uma bolha apareça na janela da câmara.
- Pressione o botão Desatenção até que o cheiro de etanol do escapamento do expurgo desapareça. Pressione novamente o botão Esfriar até que a temperatura diminua para 0 °C.
- Pressione os botões Encher e Limpar para desligá-los e fechar o tanque de CO2 . Pressione o botão Esfriar para desligá-lo e pressione o botão Aquecer.
- Coloque a temperatura em 42 °C e a pressão em 1.200 psi. Uma vez que a pressão e a temperatura estabilizem, pressione o botão Sangrar para permitir que a pressão diminua lentamente.
- Quando a pressão da câmara atingir 150 psi, pressione o botão Vent e espere até que a pressão diminua para 0 psi. Desligue o secador de ponto crítico e remova as tampas.
- As tampas de montagem em montagens de alumínio SEM são montadas usando abas adesivas de carbono e sujeitas ao revestimento sputter usando ouro/paládio em um revestimento de sputter.
- Ligue o botão Ligar e espere até que o vácuo atinja 30 mTorr. Lave a câmara para remover a umidade e o ar desligando o interruptor de gás e girando a válvula de gás fina no sentido anti-horário.
- Uma vez que o vácuo aumenta para 200 mTorr desligue o interruptor de gás e espere até que o vácuo atinja 30 mTorr. Repita este passo 3 vezes.
- Pressione o botão Temporizador e ajuste o botão de tensão até que o medidor leia 10 mA. Remova as tampas revestidas da câmara.
NOTA: Siga as instruções do fabricante para realizar a secagem de pontos críticos e o revestimento da amostra.
4. Imagem e quantificação
- Inserir manchas de amostra na câmara de um microscópio eletrônico de varredura. Feche a porta e pressione o botão Evac .
- Abra o software de operação SEM. Coloque a tensão acelerada em 15 kv e a distância de trabalho para 10 mm.
- Pressione o botão Coordenadas e mova-se ao redor do controlador até que as células apareçam no centro da tela de observação. Defina a ampliação em 3.500x e imagem da amostra clicando no botão Foto.
NOTA: Use um nível mais elevado de ampliação (8.500x a 16.000x) para mostrar a membrana plasmática em maiores detalhes. - Faça imagens de pelo menos 10 locais aleatórios nas tampas, certificando-se de que cada campo microscópico contenha múltiplas células. Salvar imagens como .tif arquivos.
- A partir das imagens, localize os babados de membrana, definidos como dobras salientes semelhantes a uma manta da membrana plasmática, com um tamanho superior a 500 nm (Figura 1). Conte o número de babados por célula.
NOTA: Os babados em forma de C foram identificados como saliências de membrana curva que não se fundiram em suas extremidades laterais [(Figura 1 (tratamento M-CSF) e Figura 2B]. Babados de membrana circular fundido, antes de seu fechamento, foram identificados como copos macropinocéticos (Figura 2C). - Normalizar o número de babados de membrana para o número total de células no campo microscópico avaliado. Repita esta análise para as amostras de cada grupo.
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Representative Results
Aqui, descrevemos os resultados da técnica apresentada. As imagens representativas da SEM mostradas na Figura 1 demonstram a formação de babados de membrana em macrófagos RAW 264,7 após o tratamento com PMA e M-CSF. As imagens foram capturadas pela primeira vez em uma ampliação de 3.500x para fins de quantificação e, em seguida, em níveis mais elevados de ampliação (8.500x a 16.000x) para mostrar a membrana plasmática em maiores detalhes. Pré-tratamento de macrófagos com o inibidor de macropinocitose EIPA atenuada formação de babado de membrana (Figura 1). As atividades de membrana plasmática associada à macropinotose podem ser divididas em cinco etapas consecutivas: 1) iniciação de babando de membrana, 2) circularização, 3) formação de copos, fechamento de copos e 5) internalização do fluido extracelular e seus solutos associados através da formação macropinosa. A Figura 2 mostra imagens representativas dessas atividades de membrana plasmática morfologicamente distintas após a estimulação de M-CSF. Grandes babados em forma de folha (Figura 2A), babados circularizados em forma de C (Figura 2B) e copos macropinocíticos (Figura 2C) foram capturados a uma ampliação de 6.000x a 7.000x. A microscopia eletrônica de varredura pode ser usada para fornecer imagens de alta resolução da superfície celular, mas não pode ser utilizada para visualizar macropinossos internalizados. A quantificação dos babados de membrana após o tratamento PMA e M-CSF é mostrada na Figura 3. A formação macropinosa pode ser confirmada por técnicas alternativas de imagem, incluindo microscopia confocal, como mostrado na Figura 4. Por fim, a quantificação SEM do babado de membrana deve ser complementada pela quantificação da citometria de fluxo de um marcador fluorescente de fase de fluido (por exemplo, FITC- ou Texas red-dextran) para confirmar a estimulação da macropinocitose (Figura 5).
Figura 1: Escaneando imagens de microscopia eletrônica de macrófagos RAW 264.7. Os macrófagos RAW 264,7 foram pré-tratados com veículo (controle DMSO) ou EIPA (25 μM) por 30 min e incubados com PMA (1 μM, 30 min) ou M-CSF (100 ng/mL, 30 min) para estimular o babado da membrana. Imagens à direita mostram maior ampliação da superfície celular. Setas vermelhas: babados de membrana. Arqueiro verde: babado em forma de C. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estágios morfológicos da macropinotose capturados pela microscopia eletrônica de varredura. Os macrófagos RAW 264,7 foram tratados com M-CSF (100 ng/mL) por 30 min e as células foram processadas para imagem SEM. (A) saliência de membrana em forma de folha, (B) babado de membrana em forma de C e (C) copo macropinocítico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Quantificação da formação de babados de membrana. Os macrófagos RAW 264,7 foram pré-tratados com veículo (controle DMSO) ou EIPA (25 μM) por 30 min e incubados com PMA (1 μM, 30 min) ou M-CSF (100 ng/mL, 30 min) para estimular o babado da membrana. O gráfico da barra mostra o número de babados de membrana normalizados para o número total da célula (n = 3). Os dados representam a média ± MEI ANOVA unidirecional; *p < 0,05 vs. veículo, #p < 0,05 vs. TRATAMENTO PMA ou M-CSF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Formação macropinosso. As células foram pré-tratadas com PMA por 30 min e incubadas com texas red-dextran (25 μg/mL, vermelho) e FM4-64 (5 μg/mL, verde) por 10 min. As imagens foram realizadas utilizando um microscópio confocal. Setas azuis: babados de membrana, setas amarelas: macropinossomo contendo Texas red-dextran, setas verdes: macropinosomos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação da macropinocitose. Os macrófagos RAW 264,7 foram pré-tratados com veículo (controle DMSO) ou EIPA (25 μM) por 30 min e incubados com PMA (1 μM) e FITC-dextran (100 μg/mL; 70.000 MW) por 2h. O gráfico da barra mostra a variação média da intensidade da fluorescência (IFA) normalizada para o tratamento do veículo (n = 3, realizada em triplicados). Os dados representam a média ± MEI ANOVA unidirecional; *p < 0,05 vs. veículo, #p < 0,05 vs. PMA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O presente protocolo de imagem SEM fornece uma ferramenta para visualizar e quantificar a formação de babados de membrana, saliências circulares e copos macropinócticos na superfície celular in vitro. Embora o protocolo atual se concentre em macrófagos, estudos têm demonstrado que a formação de babados de membrana também ocorre em vários outros tipos celulares, incluindo células dendríticas, fibroblastos, neurônios e células cancerosas 11,12,14,21,30. Diante disso, a otimização das condições de cultura celular e o uso de diferentes estimuladores ou condições de tratamento podem ser necessárias para a visualização de babados de membrana em outros tipos celulares.
Embora exista alguma margem de manobra para a preparação da amostra, as etapas de desidratação e secagem de pontos críticos devem ser seguidas exatamente para preservar a arquitetura da superfície celular. Além disso, a presença de água ou outros solventes, como o etanol, perturbaria o vácuo, que é essencial para a imagem SEM e, portanto, deve ser removido de forma controlada para manter a morfologia do espécime intacta14.
Microscópios eletrônicos usam um feixe de elétrons acelerados como fonte de iluminação. Os primeiros microscópios eletrônicos foram desenvolvidos quando o comprimento de onda tornou-se o fator limitante nos microscópiosleves 31. Os elétrons têm comprimentos de onda muito mais curtos, portanto, os microscópios eletrônicos têm um poder de resolução maior do que os microscópios de luz e podem ser usados para fornecer imagens de alta resolução e investigar a ultraestrutura de uma ampla gama de espécimes biológicos. Uma grande limitação deste método gira em torno do fato de que a SEM fornece apenas um instantâneo da morfologia da membrana plasmática, em oposição à imagem celular viva fluorescente, que permitiria a visualização de babados de membrana, sua transição para copos macropinocíticos e formação de macropinossos. Imagens de células vivas, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e ensaios fluorescentes de captação de dextran podem ser usados para investigar a internalização de solutos fluorescentes via macropinocistose, translocação e maturação macropinossóicas e mecanismos de sinalização intracelular que regulam a macropinocistose. Como o SEM requer fixação em deslizamentos de cobertura, apenas o lado dorsal e a região periférica da célula podem ser visualizados, o que é outra limitação a essa técnica.
Gostaríamos de acrescentar que às vezes é difícil distinguir entre a formação independente da macropinotose de saliências de membrana e o babamento da membrana macropinócítica. Padronizamos nossa quantificação identificando babados de membrana com pelo menos 0,5 μm de distância mínima entre dois pontos na borda da saliência. O número de babados de membrana por célula é altamente variável e depende de inúmeros fatores, incluindo o estimulante, sua concentração, tempo de incubação e tipocelular 32. Com PMA e M-CSF, vimos células com múltiplos babados de membrana, mas escolhemos imagens representativas que melhor representam nossos dados quantificados (1-2 babados por célula). O SEM continua sendo a técnica padrão-ouro para avaliar características topográficas e morfológicas da membrana plasmática in vitro. A combinação deste método juntamente com a análise de imagem celular viva e citometria de fluxo da internalização soluto fornece uma estratégia confiável para analisar a macropinocistose em vários tipos de células.
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Disclosures
Os autores não declaram conflitos de interesse.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Libby Perry (Universidade Augusta) por sua ajuda com a preparação da amostra SEM. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [R01HL139562 (G.C.) e K99HL146954 (B.S.)] e American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
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