Summary
Macropinozytose ist ein hochkonservierter endozytischer Prozess, der durch die Bildung von F-Aktin-reichen blattartigen Membranprojektionen, auch bekannt als Membranrüschen, ausgelöst wird. Eine erhöhte Rate der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe wurde mit verschiedenen pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in vitro mittels Rasterelektronenmikroskopie dar.
Abstract
Membran-Ruffling ist die Bildung von beweglichen Plasmamembranvorsprüngen, die ein Geflecht aus neu polymerisierten Aktinfilamenten enthalten. Membranrüschen können sich spontan oder als Reaktion auf Wachstumsfaktoren, entzündliche Zytokine und Phorbolester bilden. Einige der Membranvorsprünge können sich zu kreisförmigen Membranrüschen reorganisieren, die an ihren distalen Rändern verschmelzen und Becher bilden, die sich als große, heterogene Vakuolen, die Makropinosomen genannt werden, schließen und in das Zytoplasma trennen. Während des Prozesses fangen Rüschen extrazelluläre Flüssigkeit und gelöste Stoffe ein, die sich in Makropinosomen verinnerlichen. Die hochauflösende Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist ein häufig verwendetes bildgebendes Verfahren zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und geschlossenen makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche. Das folgende Protokoll beschreibt die Zellkulturbedingungen, die Stimulation der Membranrüschenbildung in vitro und die Fixierung, Dehydrierung und Vorbereitung von Zellen für die Bildgebung mit REM. Die Quantifizierung von Membranrüschen, Datennormalisierung sowie Stimulatoren und Inhibitoren der Membranrüschenbildung werden ebenfalls beschrieben. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen über die Rolle der Makropinozytose in physiologischen und pathologischen Prozessen zu beantworten, neue Ziele zu untersuchen, die die Bildung von Membranrüschen regulieren, und noch nicht charakterisierte physiologische Stimulatoren sowie neuartige pharmakologische Inhibitoren der Makropinozytose zu identifizieren.
Introduction
Macropinozytose ist ein endozytärer Prozess, der für die Internalisierung einer großen Menge extrazellulärer Flüssigkeit und ihres Gehalts durch die Bildung von dynamischen und aktingetriebenen Plasmamembranvorsprüngen, den sogenannten Membranrüschen,verantwortlich ist 1. Viele dieser Membranrüschen bilden Tassen, die sich schließen und wieder mit der Zelle verschmelzen und sich von der Plasmamembran als große, heterogene intrazelluläre Endosomen, auch Makropinosomen 1 genannt, trennen. Obwohl die Makropinozytose durch Wachstumsfaktoren wie den Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) in einer Vielzahl von Zelltypen induziert wird, wurde ein weiterer einzigartiger, kalziumabhängiger Prozess, der als konstitutive Makropinozytose bekannt ist, auch in angeborenen Immunzellenbeobachtet 2,3,4,5,6,7,8.
Es hat sich gezeigt, dass die Fähigkeit von Zellen, extrazelluläres Material durch Makropinozytose zu internalisieren, eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von physiologischen Prozessen spielt, die von der Nährstoffaufnahme über den Erregerfang bis hin zur Antigenpräsentationreichen 9,10,11. Da dieser Prozess jedoch nicht selektiv und induzierbar ist, wurde er auch mit einer Reihe von pathologischen Zuständen in Verbindung gebracht. Tatsächlich deuteten frühere Studien darauf hin, dass die Makropinozytose eine wichtige Rolle bei der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit, Krebs, Nephrolithiasis und Atherosklerosespielt 12,13,14,15,16. Darüber hinaus haben bestimmte Bakterien und Viren gezeigt, dass sie Makropinozytose nutzen, um in Wirtszellen einzudringen und eine Infektion zu induzieren17,18. Interessanterweise kann die Stimulation der Makropinozytose auch für die gezielte Abgabe von Therapeutika bei verschiedenen Krankheitszuständen genutzt werden19,20.
Frühere Studien haben die Makropinozytose untersucht, indem internalisierte fluoreszenzmarkierte Fluidphasenmarker in Abwesenheit und Vorhandensein von pharmakologischen Wirkstoffen, die die Makropinozytose hemmen, mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Bildgebungquantifiziert wurden 21,22. Derzeit verfügbare pharmakologische Werkzeuge, die die Makropinozytose hemmen, sind beschränkt auf und umfassen 1) Aktinpolymerisationsinhibitoren (Cytochalasin D und Latrunculine), 2) PI3K-Blocker (LY-290042 und Wortmannin) und 3) Inhibitoren von Natrium-Wasserstoff-Austauschern (NHE) (Amilorid und EIPA)5,14,15,23,24,25 . Da diese Inhibitoren jedoch endozytoseunabhängige Wirkungen haben, ist es schwierig, den Beitrag der Makropinozytose zur Aufnahme von gelösten Stoffen und zur Krankheitspathogenese selektiv zu bestimmen, insbesondere in vivo21.
Die Rasterelektronenmikroskopie (REM) ist eine Art Elektronenmikroskop, das ultrahochauflösende Bilder von Zellen mit einem fokussierten Elektronenstrahl26 erzeugt. In der Makropinozytoseforschung gilt die REM-Bildgebung als die Goldstandardtechnik, um topographische und morphologische Eigenschaften der Plasmamembran zu visualisieren, die Bildung von Membranrüschen zu quantifizieren und ihr Fortschreiten zur Makropinosomenverinnerlichung zu untersuchen. Darüber hinaus bietet die Rasterelektronenmikroskopie in Kombination mit der Quantifizierung der Aufnahme gelöster Stoffe in Gegenwart und Abwesenheit von Makropinozytoseblockern eine zuverlässige Strategie zur Untersuchung der makropinozytotischen Internalisierung gelöster Stoffe in vitro. Dieses Papier enthält ein detailliertes Protokoll, wie Zellen auf REM vorbereitet, die Zelloberfläche visualisiert, die Rüschenbildung quantifiziert und ihr Fortschritt in Richtung Cup-Verschluss und Makropinosom-Internalisierung untersucht werden.
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Protocol
HINWEIS: Das Folgende ist ein allgemeines Protokoll zur Quantifizierung der Membranrüschenbildung in RAW 264.7-Makrophagen mittels REM-Mikroskopie. Für verschiedene Zelltypen kann eine Optimierung erforderlich sein.
1. Zelllinie und Zellkultur
- Züchten Sie RAW 264,7 Makrophagen in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% (vol/vol) hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), 100 I.E./ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2. Ersetzen Sie Wachstumsmedien jeden zweiten Tag.
- Wenn die Zellen zu 80% konfluieren, waschen Sie die Platte zweimal mit sterilem PBS.
- Die Zellen werden durch Zugabe von 1.000 μL 0,5% Trypsin-EDTA abgelöst und die Zellkulturplatte für 3-5 min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C inkubiert.
- Untersuchen Sie die Platte unter einem Lichtmikroskop, um die Zelldissoziation zu bestätigen. Fügen Sie 10 ml Wachstumsmedien hinzu, die 10% FBS enthalten, um Trypsin zu inaktivieren.
- Sammeln Sie die Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 400 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Suspendieren Sie die Zellen sanft im gesamten Zellkulturmedium und bestimmen Sie die Zellzahl und Lebensfähigkeit mit Trypan Blue (0,4%) Färbung.
HINWEIS: Die empfohlene Mindestzelllebensfähigkeit für dieses Experiment beträgt >90%. - Platzieren Sie sterile Glasabdeckungen in Vertiefungen einer 24-Well-Platte mit autoklavierten Pinzetten. Samen Sie Zellen auf Deckgläser mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml und inkubieren Sie die Platte über Nacht in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
- Wechseln Sie das Medium jeder Vertiefung vor der Behandlung mit frischen 500 μL Vollmedien. Vorbehandlung von Makrophagen mit Vehikel (DMSO oder anderen Lösungsmitteln zur Auflösung von EIPA) oder dem Makropinozytoseinhibitor 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amilorid (EIPA, 25 μM21) für 30 min.
- Behandeln Sie Zellen mit Vehikel und Stimulatoren der Makropinozytose, um das Membran-Ruffling zu fördern: Phorbol 12-Myrisat 13-Acetat (PMA, 1 μM, 30 min21) und Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF, 100 ng / ml, 30 min3).
HINWEIS: Alternative Inhibitoren [z. B. Latrunculin A (1 μM, 30 min) oder Cytochalasin D (1 μM, 30 min)] und Stimulatoren [z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF, 100 ng/ml, 10 min) oder von Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] der Makropinozytose können auch zur Charakterisierung der Makropinozytose bei Makrophagen und anderen Zelltypenverwendet werden 16,27, 28,29 Zellen können vor der Behandlung mit physiologischen Stimulatoren der Makropinozytose über Nacht Serumhunger erfordern. Es ist wichtig zu beachten, dass die effektivsten Konzentrationen und Inkubationszeiten bestimmt werden müssen, um die Makropinozytose in anderen Zelltypen zu stimulieren.
2. SEM-Fixierung
- Nach der Behandlung die Medien aus den Vertiefungen absaugen und Deckgläser zweimal mit eiskaltem PBS waschen.
- Fixieren Sie Zellen (4% Paraformaldehyd und 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylat) für 30 min bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Inkubation über Nacht im Fixiermittel bei 4 ° C.
- Deckgläser mit 500 μL Folgereagenzien schonend waschen und inkubieren, ohne die Zellmonoschicht zu stören.
- Einmal in 0,1 M Natriumcacodylat waschen und 15 min inkubieren.
- Zweimal mit dH2O waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
- Zweimal mit 25% Ethanol mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche waschen.
- Zweimal mit 50% Ethanol waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
- Zweimal mit 75% Ethanol waschen mit 10 min Inkubation in jeder Wäsche.
- Waschen Sie zweimal mit 80% Ethanol mit 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche.
- Waschen Sie zweimal mit 95% Ethanol mit 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche.
- Zweimal mit 100% Ethanol waschen. Führen Sie 10 Minuten Inkubation in jeder Wäsche durch.
HINWEIS: Das Wechseln / Ersetzen von Reagenzien sollte schnell erfolgen, um ein Austrocknen der Zellen an der Luft zu verhindern. Deckgläser können in 100% Ethanol für mehrere Tage bei 4 °C belassen werden. Für die Langzeitlagerung fügen Sie zusätzliches 100% Ethanol hinzu und bedecken Sie die Vertiefungen mit Parafilm, um ein Austrocknen der Probe an der Luft zu verhindern.
3. Kritische Punktetrocknung
- Legen Sie die Deckgläser in einen Critical Point Dryer und bedecken Sie sie mit 100% Ethanol. Drücken Sie die Power-Taste und öffnen Sie den CO2-Tank .
- Drücken Sie die Cool-Taste ca. 30 s lang, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt. Drücken Sie die Taste "Füllen", bis im Kammerfenster eine Blase angezeigt wird.
- Drücken Sie die Löschtaste , bis der Geruch von Ethanol aus dem Spülauspuff verschwindet. Drücken Sie die Taste Cool erneut, bis die Temperatur auf 0 °C sinkt.
- Drücken Sie die Tasten Fill und Purge, um sie auszuschalten und den CO2-Tank zu schließen. Drücken Sie die Taste Cool, um sie auszuschalten, und drücken Sie die Taste Heat .
- Stellen Sie die Temperatur auf 42 °C und den Druck auf 1.200 psi ein. Sobald sich der Druck und die Temperatur stabilisiert haben, drücken Sie die Bleed-Taste , damit der Druck langsam abnimmt.
- Sobald der Kammerdruck 150 psi erreicht hat, drücken Sie die Entlüftungstaste und warten Sie, bis der Druck auf 0 psi sinkt. Schalten Sie den kritischen Punkttrockner aus und entfernen Sie die Deckgläser.
- Montieren Sie Deckgläser auf REM-Aluminiumprobenhalterungen mit Carbon-Klebelaschen und unterliegen einer Sputterbeschichtung mit Gold / Palladium in einem Sputterbeschichter.
- Schalten Sie den Netzschalter ein und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Spülen Sie die Kammer, um Feuchtigkeit und Luft zu entfernen, indem Sie den Gasschalter ausschalten und das Feingasventil gegen den Uhrzeigersinn drehen.
- Sobald das Vakuum auf 200 mTorr ansteigt, schalten Sie den Gasschalter aus und warten Sie, bis das Vakuum 30 mTorr erreicht. Wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal.
- Drücken Sie die Timer-Taste und stellen Sie den Spannungsregler so lange ein, bis das Messgerät 10 mA anzeigt. Entfernen Sie beschichtete Deckgläser aus der Kammer.
HINWEIS: Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um eine kritische Punkttrocknung und Sputterbeschichtung der Probe durchzuführen.
4. Bildgebung und Quantifizierung
- Probendeckel in die Kammer eines Rasterelektronenmikroskops einführen. Schließen Sie die Tür und drücken Sie die Evac-Taste .
- Öffnen Sie die SEM-Betriebssoftware. Stellen Sie die Beschleunigungsspannung auf 15 kV und den Arbeitsabstand auf 10 mm ein.
- Drücken Sie die Taste Koordinaten und bewegen Sie sich um den Controller herum, bis die Zellen in der Mitte des Beobachtungsbildschirms angezeigt werden. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 3.500-fache ein und stellen Sie die Probe ab, indem Sie auf die Schaltfläche Foto klicken.
HINWEIS: Verwenden Sie eine höhere Vergrößerungsstufe (8.500x bis 16.000x), um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen. - Nehmen Sie Bilder von mindestens 10 zufälligen Stellen auf den Deckgläsern auf und stellen Sie sicher, dass jedes mikroskopische Feld mehrere Zellen enthält. Speichern Sie Bilder als .tif Dateien.
- Aus den Bildern finden Sie Membranrüschen, definiert als hervorstehende deckenartige Falten der Plasmamembran mit einer Größe von mehr als 500 nm (Abbildung 1). Zählen Sie die Anzahl der Rüschen pro Zelle.
HINWEIS: C-förmige Rüschen wurden als gekrümmte Membranvorsprünge identifiziert, die an ihren seitlichen Enden nicht verschmolzen [(Abbildung 1 (M-CSF-Behandlung) und Abbildung 2B]. Verschmolzene kreisförmige Membranrüschen wurden vor ihrem Verschluss als makropinozytotische Becher identifiziert (Abbildung 2C). - Normalisieren Sie die Anzahl der Membranrüschen auf die Gesamtzahl der Zellen im ausgewerteten mikroskopischen Feld. Wiederholen Sie diese Analyse für die Proben aus jeder Gruppe.
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Representative Results
Hier beschreiben wir die Ergebnisse der vorgestellten Technik. Repräsentative REM-Bilder, die in Abbildung 1 gezeigt werden, zeigen die Bildung von Membranrüschen in RAW 264,7-Makrophagen nach der Behandlung mit PMA und M-CSF. Die Bilder wurden zuerst mit einer Vergrößerung von 3.500x zu Quantifizierungszwecken und dann mit höheren Vergrößerungsgraden (8.500x bis 16.000x) aufgenommen, um die Plasmamembran in größeren Details zu zeigen. Vorbehandlung von Makrophagen mit dem Makropinozytose-Inhibitor EIPA attenuierte Membranrüschenbildung (Abbildung 1). Macropinozytose-assoziierte Plasmamembranaktivitäten können in fünf aufeinanderfolgende Schritte unterteilt werden: 1) Einleitung des Membran-Rüschens, 2) Zirkularisierung, 3) Cup-Formation, 4) Cup-Verschluss und 5) Internalisierung der extrazellulären Flüssigkeit und der damit verbundenen gelösten Stoffe durch Makropinosomenbildung. Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder dieser morphologisch unterschiedlichen Plasmamembranaktivitäten nach M-Liquor Stimulation. Große blattartige Rüschen (Abbildung 2A), kreisförmige C-förmige Rüschen (Abbildung 2B) und makropinozytäre Becher (Abbildung 2C) wurden bei einer Vergrößerung von 6.000x bis 7.000x eingefangen. Die Rasterelektronenmikroskopie kann verwendet werden, um hochauflösende Bilder der Zelloberfläche zu liefern, kann jedoch nicht zur Visualisierung internalisierter Makropinosomen verwendet werden. Die Quantifizierung von Membranrüschen nach PMA- und M-CSF-Behandlung ist in Abbildung 3 dargestellt. Die Bildung eines Macropinosoms kann durch alternative bildgebende Verfahren, einschließlich konfokaler Mikroskopie, bestätigt werden, wie in Abbildung 4 dargestellt. Schließlich sollte die REM-Quantifizierung des Membran-Rufflings durch die Durchflusszytometrie-Quantifizierung eines fluoreszierenden Fluidphasenmarkers (z. B. FITC- oder Texas-Red-Dextran) ergänzt werden, um die Stimulation der Makropinozytose zu bestätigen (Abbildung 5).
Abbildung 1: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von RAW 264.7 Makrophagen. RAW 264,7 Makrophagen wurden 30 min lang mit Vehikel (DMSO-Kontrolle) oder EIPA (25 μM) vorbehandelt und mit PMA (1 μM, 30 min) oder M-CSF (100 ng/ml, 30 min) inkubiert, um das Membran-Ruffling zu stimulieren. Bilder auf der rechten Seite zeigen eine höhere Vergrößerung der Zelloberfläche. Rote Pfeile: Membranrüschen. Grüner Pfeil: C-förmige Rüsche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Morphologische Stadien der Makropinozytose, die durch Rasterelektronenmikroskopie erfasst wurden. RAW 264,7 Makrophagen wurden 30 min lang mit M-CSF (100 ng/ml) behandelt und Zellen für die REM-Bildgebung verarbeitet. (A ) blattartiger Membranvorsprung, ( B ) C-förmige Membranrüsche und (C) makropinozytäre Tasse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Quantifizierung der Membranrüschenbildung. RAW 264,7 Makrophagen wurden 30 min lang mit Vehikel (DMSO-Kontrolle) oder EIPA (25 μM) vorbehandelt und mit PMA (1 μM, 30 min) oder M-CSF (100 ng/ml, 30 min) inkubiert, um das Membran-Ruffling zu stimulieren. Das Balkendiagramm zeigt die Anzahl der Membranrüschen, die auf die Gesamtzahl der Zellen normalisiert sind (n = 3). Die Daten stellen den Mittelwert ± REM dar. Einweg-ANOVA; *p < 0,05 vs. Fahrzeug, #p < 0,05 vs. PMA- oder M-CSF-Behandlung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Macropinosom-Formation. Die Zellen wurden 30 min lang mit PMA vorbehandelt und mit Texas Red-Dextran (25 μg/ml, rot) und FM4-64 (5 μg/ml, grün) für 10 min inkubiert. Die Bildgebung wurde mit einem konfokalen Mikroskop durchgeführt. Blaue Pfeile: Membranrüschen, gelbe Pfeile: Makropinosom mit Texas Red-Dextran, grüne Pfeile: Makropinosomen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Quantifizierung der Makropinozytose. RAW 264,7 Makrophagen wurden 30 min lang mit Vehikel (DMSO-Kontrolle) oder EIPA (25 μM) vorbehandelt und mit PMA (1 μM) und FITC-Dextran (100 μg/ml; 70.000 MW) für 2 h inkubiert. Das Balkendiagramm zeigt die Faltenänderung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) normalisiert auf die Fahrzeugbehandlung (n = 3, durchgeführt in Dreifachpackungen). Die Daten stellen den Mittelwert ± REM dar. Einweg-ANOVA; *p < 0,05 vs. Fahrzeug, #p < 0,05 vs. PMA. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Das vorliegende REM-Bildgebungsprotokoll bietet ein Werkzeug zur Visualisierung und Quantifizierung von Membranrüschenbildung, kreisförmigen Vorsprüngen und makropinozytären Bechern auf der Zelloberfläche in vitro. Obwohl sich das aktuelle Protokoll auf Makrophagen konzentriert, haben Studien gezeigt, dass die Bildung von Membranrüschen auch bei verschiedenen anderen Zelltypen auftritt, darunterdendritische Zellen, Fibroblasten, Neuronen und Krebszellen 11,12,14,21,30. Vor diesem Hintergrund kann eine Optimierung der Zellkulturbedingungen und die Verwendung verschiedener Stimulatoren oder Behandlungsbedingungen für die Visualisierung von Membranrüschen in anderen Zelltypen erforderlich sein.
Obwohl ein gewisser Spielraum für die Probenvorbereitung besteht, müssen die Dehydratisierungs- und kritischen Trocknungsschritte genau befolgt werden, um die Zelloberflächenarchitektur zu erhalten. Darüber hinaus würde das Vorhandensein von Wasser oder anderen Lösungsmitteln wie Ethanol das Vakuum stören, was für die REM-Bildgebung unerlässlich ist, und daher muss es kontrolliert entfernt werden, um die Probenmorphologie intaktzu halten 14.
Elektronenmikroskope verwenden einen Strahl beschleunigter Elektronen als Beleuchtungsquelle. Die ersten Elektronenmikroskope wurden entwickelt, als die Wellenlänge zum limitierenden Faktor in Lichtmikroskopenwurde 31. Elektronen haben viel kürzere Wellenlängen, so dass Elektronenmikroskope ein höheres Auflösungsvermögen als Lichtmikroskope haben und verwendet werden können, um hochauflösende Bilder zu liefern und die Ultrastruktur einer Vielzahl von biologischen Proben zu untersuchen. Eine wesentliche Einschränkung dieser Methode dreht sich um die Tatsache, dass SEM nur eine Momentaufnahme der Plasmamembranmorphologie liefert, im Gegensatz zur fluoreszierenden Lebendzellbildgebung, die die Visualisierung von Membranrüschen, ihren Übergang zu makropinozytären Bechern und die Bildung von Makropinosomen ermöglichen würde. Lebendzellbildgebung, Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und fluoreszierende Dextran-Aufnahmeassays können verwendet werden, um die Internalisierung fluoreszierender gelöster Stoffe durch Makropinozytose, Makropinosomentranslokation und -reifung sowie intrazelluläre Signalmechanismen, die die Makropinozytose regulieren, zu untersuchen. Da REM eine Fixierung auf Deckgläser erfordert, können nur die dorsale Seite und der periphere Bereich der Zelle sichtbar gemacht werden, was eine weitere Einschränkung dieser Technik darstellt.
Wir möchten hinzufügen, dass es manchmal schwierig ist, zwischen makropinozytoseunabhängiger Bildung von Membranvorsprüngen und makropinozytärem Membranrüschen zu unterscheiden. Wir standardisierten unsere Quantifizierung, indem wir Membranrüschen mit einem Mindestabstand von mindestens 0,5 μm zwischen zwei beliebigen Punkten am Rand des Vorsprungs identifizierten. Die Anzahl der Membranrüschen pro Zelle ist sehr variabel und hängt von zahlreichen Faktoren ab, darunter das Stimulans, seine Konzentration, Inkubationszeit und Zelltyp32. Mit PMA und M-CSF sahen wir Zellen mit mehreren Membranrüschen, wählten aber repräsentative Bilder, die unsere quantifizierten Daten besser repräsentieren (1-2 Rüschen pro Zelle). REM bleibt die Goldstandardtechnik zur Beurteilung der topographischen und morphologischen Eigenschaften der Plasmamembran in vitro. Die Kombination dieser Methode zusammen mit der Lebendzellbildgebung und der Durchflusszytometrie-Analyse der Internalisierung gelöster Stoffe bietet eine zuverlässige Strategie zur Analyse der Makropinozytose in verschiedenen Zelltypen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken Libby Perry (Augusta University) für ihre Hilfe bei der SEM-Probenvorbereitung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) und K99HL146954 (B.S.)] und der American Heart Association [17POST33661254 (B.S.)] unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
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