Summary
Makropinocytos är en mycket bevarad endocytisk process initierad genom bildandet av F-aktinrika arkliknande membranprojektioner, även kända som membranvolanger. Ökad hastighet av makropinocytotisk internalisering av löst ämne har varit inblandad i olika patologiska tillstånd. Detta protokoll presenterar en metod för att kvantifiera membranrufflebildning in vitro med hjälp av svepelektronmikroskopi.
Abstract
Membranruffling är bildandet av rörliga plasmamembranutsprång innehållande ett nät av nyligen polymeriserade aktinfilament. Membranvolanger kan bildas spontant eller som svar på tillväxtfaktorer, inflammatoriska cytokiner och phorbolestrar. Några av membranutsprången kan omorganiseras till cirkulära membranvolanger som smälter samman vid sina distala marginaler och bildar koppar som stänger och separerar i cytoplasman som stora, heterogena vakuoler som kallas makropinosomer. Under processen fångar volanger extracellulär vätska och lösta ämnen som internaliseras inom makropinosomer. Högupplöst svepelektronmikroskopi (SEM) är en vanlig bildteknik för att visualisera och kvantifiera membranrufflebildning, cirkulära utsprång och slutna makropinocytiska koppar på cellytan. Följande protokoll beskriver cellodlingsförhållandena, stimulering av membranrufflebildningen in vitro och hur man fixar, dehydrerar och förbereder celler för avbildning med SEM. Kvantifiering av membranruffling, datanormalisering och stimulatorer och hämmare av membranrufflebildning beskrivs också. Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor om makropinocytos roll i fysiologiska och patologiska processer, undersöka nya mål som reglerar membranrufflebildning och identifiera ännu okarakteriserade fysiologiska stimulatorer samt nya farmakologiska hämmare av makropinocytos.
Introduction
Makropinocytos är en endocytisk process som är ansvarig för att internalisera en stor mängd extracellulär vätska och dess innehåll via bildandet av dynamiska och aktindrivna plasmamembranutsprång som kallas membranvolanger1. Många av dessa membranvolanger bildar koppar som stängs och smälter tillbaka till cellen och separeras från plasmamembranet som stora, heterogena intracellulära endosomer, även kända som makropinosomer1. Även om makropinocytos induceras av tillväxtfaktorer såsom makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF) och epidermal tillväxtfaktor (EGF) i ett brett spektrum av celltyper, har en ytterligare unik, kalciumberoende process som kallas konstitutiv makropinocytos också observerats i medfödda immunceller 2,3,4,5,6,7,8.
Cellernas förmåga att internalisera extracellulärt material via makropinocytos har visat sig spela en viktig roll i en mängd olika fysiologiska processer, allt från näringsupptag till patogenfångst och antigenpresentation 9,10,11. Men eftersom denna process är icke-selektiv och inducerbar har den också varit inblandad i ett antal patologiska tillstånd. Faktum är att tidigare studier föreslog att makropinocytos spelar en viktig roll i Alzheimers sjukdom, Parkinsons sjukdom, cancer, nefrolitiasis och ateroskleros 12,13,14,15,16. Dessutom har vissa bakterier och virus visat sig använda makropinocytos för att få inträde i värdceller och inducera infektion17,18. Intressant nog kan stimulering av makropinocytos också utnyttjas för riktad leverans av terapeutiska medel vid olika sjukdomstillstånd19,20.
Tidigare studier har undersökt makropinocytos genom att kvantifiera internaliserade fluorescerande taggade vätskefasmarkörer i frånvaro och närvaro av farmakologiska medel som hämmar makropinocytos med hjälp av flödescytometri och konfokal avbildning21,22. För närvarande tillgängliga farmakologiska verktyg som hämmar makropinocytos är begränsade till och består av 1) aktinpolymerisationshämmare (cytokalasin D och latrunkuliner), 2) PI3K-blockerare (LY-290042 och wortmannin) och 3) hämmare av natriumväteväxlare (NHE) (amilorid och EIPA)5,14,15,23,24,25 . Eftersom dessa hämmare har endocytosoberoende effekter är det emellertid svårt att selektivt bestämma makropinocytos bidrag till löst upptag och sjukdomspatogenes, särskilt in vivo21.
Svepelektronmikroskopi (SEM) är en typ av elektronmikroskop som producerar ultrahögupplösta bilder av celler med hjälp av en fokuserad stråle av elektroner26. I makropinocytosforskning betraktas SEM-avbildning som guldstandardtekniken för att visualisera topografiska och morfologiska egenskaper hos plasmamembranet, kvantifiera membranrufflebildning och undersöka deras progression mot makropinosom internalisering. Vidare ger svepelektronmikroskopi i kombination med kvantifiering av löst upptag, i närvaro och frånvaro av makropinocytosblockerare, en tillförlitlig strategi för att undersöka makropinocytotisk lösningsmedelsin internalisering in vitro. Detta dokument ger ett detaljerat protokoll om hur man förbereder celler för SEM, visualiserar cellytan, kvantifierar volangbildning och undersöker deras framsteg mot koppförslutning och makropinosom internalisering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Följande är ett allmänt protokoll som används för att kvantifiera membranrufflebildning i RAW 264.7 makrofager med SEM-mikroskopi. Optimering kan krävas för olika celltyper.
1. Cellinje och cellodling
- Odla RAW 264,7 makrofager i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) kompletterat med 10% (vol/vol) värmeinaktiverat Fetal Bovine Serum (FBS), 100 IE/ml penicillin och 100 μg/ml streptomycin i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2. Byt ut tillväxtmedia varannan dag.
- När cellerna blir 80% sammanflytande, tvätta plattan två gånger med steril PBS.
- Lossa celler genom att tillsätta 1 000 μL 0,5 % trypsin-EDTA och inkubera cellodlingsplattan i 3–5 minuter i en fuktad inkubator vid 37 °C.
- Undersök plattan under ett ljusmikroskop för att bekräfta celldissociation. Tillsätt 10 ml tillväxtmedier som innehåller 10% FBS för att inaktivera trypsin.
- Samla cellsuspensionen i ett 50 ml koniskt rör och centrifug vid 400 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Resuspendera försiktigt celler i hela cellodlingsmediet och bestäm cellantalet och livskraften med Trypan Blue (0,4%) färgning.
OBS: Den rekommenderade minsta cellviabiliteten för detta experiment är >90%. - Placera sterila glasöverdrag i brunnar på en 24-brunnsplatta med autoklaverade pincett. Fröceller på täckglas med en densitet av 1 x 106 celler/ml och inkubera plattan över natten i en fuktad inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Byt media för varje brunn med färska 500 μL kompletta medier före behandling. Förbehandla makrofager med vehicid (DMSO eller andra lösningsmedel som används för att lösa upp EIPA) eller makropinocytoshämmaren 5-(N-etyl-N-isopropyl)-Amilorid (EIPA, 25 μM21) i 30 min.
- Behandla celler med fordon och stimulatorer av makropinocytos för att främja membranruffling: phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA, 1 μM, 30 min21) och makrofagkolonistimulerande faktor (M-CSF, 100 ng / ml, 30 min3).
OBS: Alternativa hämmare [t.ex. latrunkulin A (1 μM, 30 min) eller cytokalasin D (1 μM, 30 min)] och stimulatorer [t.ex. epidermal tillväxtfaktor (EGF, 100 ng/ml, 10 min) eller trombocythärledd tillväxtfaktor (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] av makropinocytos kan också användas för att karakterisera makropinocytos i makrofager och andra celltyper16,27, 28,29. Celler kan kräva serumsvält över natten före behandling med fysiologiska stimulatorer för makropinocytos. Det är viktigt att notera att de mest effektiva koncentrationerna och inkubationstiderna måste bestämmas för att stimulera makropinocytos i andra celltyper.
2. SEM-fixering
- Efter behandlingen, aspirera media från brunnar och tvätta täckglas med iskall PBS två gånger.
- Fixera celler (4 % paraformaldehyd och 2 % glutaraldehyd i 0,1 M natriumkakodylat) i 30 min vid rumstemperatur, följt av inkubation över natten i fixeringsmedlet vid 4 °C.
- Tvätta och inkubera försiktigt täckglas med 500 μL av följande reagenser utan att störa cellmonoskiktet.
- Tvätta en gång i 0,1 M natriumkakodylat och inkubera i 15 min.
- Tvätta två gånger med dH2O med 10 min inkubation i varje tvätt.
- Tvätta två gånger med 25% etanol med 10 min inkubation i varje tvätt.
- Tvätta två gånger med 50% etanol med 10 min inkubation i varje tvätt.
- Tvätta två gånger med 75% etanol med 10 min inkubation i varje tvätt.
- Tvätta två gånger med 80% etanol med 10 min inkubation i varje tvätt.
- Tvätta två gånger med 95% etanol med 10 min inkubation i varje tvätt.
- Tvätta två gånger med 100% etanol. Utför 10 minuters inkubation i varje tvätt.
OBS: Byte / byte av reagenser bör göras snabbt för att förhindra lufttorkning av celler. Täckglas kan lämnas i 100% etanol i flera dagar vid 4 °C. För långvarig lagring, tillsätt ytterligare 100% etanol och täck brunnar med parafilm för att förhindra lufttorkning av provet.
3. Torkning av kritisk punkt
- Placera täckglas i en kritisk punkttork och täck med 100% etanol. Tryck på strömbrytaren och öppna CO2-tanken .
- Tryck på knappen Kyl i cirka 30 s tills temperaturen sjunker till 0 °C. Tryck på knappen Fyll tills en bubbla visas i kammarfönstret.
- Tryck på rensningsknappen tills lukten av etanol från reningsavgaserna försvinner. Tryck på knappen Kyl igen tills temperaturen sjunker till 0 °C.
- Tryck tillbaka påfyllnings- och rensningsknapparna för att stänga av dem och stänga CO2-tanken. Tryck på knappen Cool (Cool) för att stänga av den och tryck på knappen Heat (Heat).
- Ställ in temperaturen på 42 °C och tryck på 1 200 psi. När trycket och temperaturen har stabiliserats trycker du på Avluftningsknappen så att trycket kan minska långsamt.
- När kammartrycket når 150 psi, tryck på Vent-knappen och vänta tills trycket minskar till 0 psi. Stäng av den kritiska punkttorkaren och ta bort täckglasen.
- Montera täckglas på SEM-aluminiumprovfästen med kolhäftande flikar och utsätts för sputterbeläggning med guld / palladium i en sputter coater.
- Slå på strömbrytaren och vänta tills vakuumet når 30 mTorr. Spola kammaren för att ta bort fukt och luft genom att stänga av gasomkopplaren och vrida fingasventilen moturs.
- När vakuumet ökar till 200 mTorr stänger du av gasomkopplaren och väntar tills vakuumet når 30 mTorr. Upprepa detta steg 3 gånger.
- Tryck på timerknappen och justera spänningsratten tills mätaren läser 10 mA. Ta bort belagda täckglas från kammaren.
OBS: Följ tillverkarens instruktioner för att utföra kritisk punkttorkning och sputterbeläggning av provet.
4. Avbildning och kvantifiering
- Sätt in provöverdrag i kammaren i ett svepelektronmikroskop. Stäng dörren och tryck på Evac-knappen .
- Öppna SEM-driftprogramvaran. Ställ in accelerationsspänningen på 15 kv och arbetsavståndet på 10 mm.
- Tryck på knappen Koordinater och flytta runt handkontrollen tills cellerna visas i mitten av observationsskärmen. Ställ in förstoringen på 3 500x och avbilda provet genom att klicka på knappen Foto.
OBS: Använd en högre förstoringsnivå (8 500x till 16 000x) för att visa plasmamembranet vid större detaljer. - Ta bilder från minst 10 slumpmässiga platser på omslagsglasen och se till att varje mikroskopiskt fält innehåller flera celler. Spara bilder som .tif filer.
- Från bilderna, lokalisera membranvolanger, definierade som utskjutande filtliknande veck i plasmamembranet, med en storlek större än 500 nm (Figur 1). Räkna antalet volanger per cell.
OBS: C-formade volanger identifierades som böjda membranutsprång som inte smälte samman i sina laterala ändar [(Figur 1 (M-CSF-behandling) och figur 2B]. Smälta cirkulära membranvolanger, före stängningen, identifierades som makropinocytota koppar (figur 2C). - Normalisera antalet membranvolanger till det totala antalet celler i det mikroskopiska fältet som utvärderas. Upprepa denna analys för proverna från varje grupp.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här beskriver vi resultaten från den presenterade tekniken. Representativa SEM-bilder som visas i figur 1 visar membranrufflebildning i RAW 264.7 makrofager efter behandling med PMA och M-CSF. Bilder togs först med en förstoring på 3 500x för kvantifieringsändamål och sedan vid högre förstoringsnivåer (8 500x till 16 000x) för att visa plasmamembranet vid större detaljer. Förbehandla makrofager med makropinocytoshämmaren EIPA dämpad membranrufflebildning (Figur 1). Makropinocytosassocierade plasmamembranaktiviteter kan delas in i fem på varandra följande steg: 1) initiering av membranruffling, 2) cirkularisering, 3) koppbildning, 4) koppförslutning och 5) internalisering av extracellulär vätska och dess associerade lösta ämnen via makropinosombildning. Figur 2 visar representativa bilder av dessa morfologiskt distinkta plasmamembranaktiviteter efter M-CSF-stimulering. Stora arkliknande volanger (figur 2A), cirkulariserade C-formade volanger (figur 2B) och makropinocytiska koppar (figur 2C) fångades vid en förstoring av 6 000x till 7 000x. Svepelektronmikroskopi kan användas för att ge högupplösta bilder av cellytan men kan inte användas för att visualisera internaliserade makropinosomer. Kvantifiering av membranvolanger efter PMA- och M-CSF-behandling visas i figur 3. Makropinosombildning kan bekräftas med alternativa avbildningstekniker, inklusive konfokalmikroskopi, som visas i figur 4. Slutligen bör SEM-kvantifiering av membranruffling kompletteras med flödescytometrikvantifiering av en fluorescerande vätskefasmarkör (t.ex. FITC- eller Texas red-dextran) för att bekräfta stimulering av makropinocytos (figur 5).
Figur 1: Svepelektronmikroskopibilder av RAW 264.7 makrofager. RAW 264,7 makrofager förbehandlades med agens (DMSO-kontroll) eller EIPA (25 μM) i 30 min och inkuberades med PMA (1 μM, 30 min) eller M-CSF (100 ng/ml, 30 min) för att stimulera membranruffling. Bilder till höger visar högre förstoring av cellytan. Röda pilar: membranvolanger. Grön pil: c-formad volang. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologiska stadier av makropinocytos fångad genom svepelektronmikroskopi. RAW 264,7 makrofager behandlades med M-CSF (100 ng/ml) i 30 minuter och celler bearbetades för SEM-avbildning. (A) arkliknande membranutsprång, (B) C-formad membranvolang och (C) makropinocytisk kopp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Kvantifiering av membranrufflebildning. RAW 264,7 makrofager förbehandlades med agens (DMSO-kontroll) eller EIPA (25 μM) i 30 min och inkuberades med PMA (1 μM, 30 min) eller M-CSF (100 ng/ml, 30 min) för att stimulera membranruffling. Stapeldiagram visar antalet membranvolanger normaliserade till totalt cellantal (n = 3). Data representerar medelvärdet ± SEM. *p < 0,05 mot fordon, #p < 0,05 mot PMA- eller M-CSF-behandling. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Makropinosombildning. Cellerna förbehandlades med PMA i 30 minuter och inkuberades med Texas red-dextran (25 μg/ml, rött) och FM4-64 (5 μg/ml, grönt) i 10 min. Avbildning utfördes med hjälp av ett konfokalmikroskop. Blå pilar: membran ruffling, gula pilar: makropinosom innehållande Texas röd-dextran, gröna pilar: makropinosomer. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Kvantifiering av makropinocytos. RAW 264,7 makrofager förbehandlades med abojor (DMSO-kontroll) eller EIPA (25 μM) i 30 min och inkuberades med PMA (1 μM) och FITC-dextran (100 μg/ml; 70 000 MW) i 2 timmar. Stapeldiagram visar den genomsnittliga fluorescensintensiteten (MFI) vikningsförändring normaliserad till vealbehandling (n = 3, utförd i tre exemplar). Data representerar medelvärdet ± SEM. *p < 0,05 mot fordon, #p < 0,05 mot PMA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det nuvarande SEM-bildprotokollet ger ett verktyg för att visualisera och kvantifiera membranrufflebildning, cirkulära utsprång och makropinocytiska koppar på cellytan in vitro. Även om det nuvarande protokollet fokuserar på makrofager har studier visat att membranrufflebildning också förekommer på olika andra celltyper inklusive dendritiska celler, fibroblaster, neuroner och cancerceller 11,12,14,21,30. Med tanke på detta kan optimering av cellodlingsförhållanden och användning av olika stimulatorer eller behandlingsbetingelser krävas för visualisering av membranvolanger i andra celltyper.
Även om det finns ett visst utrymme för provberedning, måste uttorknings- och kritiska punkttorkningssteg följas exakt för att bevara cellytans arkitektur. Dessutom skulle närvaron av vatten eller andra lösningsmedel såsom etanol störa vakuumet, vilket är väsentligt för SEM-avbildning och därför måste det avlägsnas på ett kontrollerat sätt för att hålla provets morfologi intakt14.
Elektronmikroskop använder en stråle av accelererade elektroner som en ljuskälla. De första elektronmikroskopen utvecklades när våglängden blev den begränsande faktorn i ljusmikroskop31. Elektroner har mycket kortare våglängder, så elektronmikroskop har en högre upplösningskraft än ljusmikroskop och kan användas för att ge högupplösta bilder och undersöka ultrastrukturen hos ett brett spektrum av biologiska prover. En stor begränsning av denna metod kretsar kring det faktum att SEM endast ger en ögonblicksbild av plasmamembranmorfologin, i motsats till den fluorescerande levande cellavbildningen, vilket skulle möjliggöra visualisering av membranvolanger, deras övergång till makropinocytiska koppar och bildning av makropinosomer. Levande cellavbildning, transmissionselektronmikroskopi (TEM) och fluorescerande dextranupptagningsanalyser kan användas för att undersöka internaliseringen av fluorescerande lösta ämnen via makropinocytos, makropinosomtranslokation och mognad och intracellulära signalmekanismer som reglerar makropinocytos. Eftersom SEM kräver fixering på täckglas kan endast dorsalsidan och den perifera regionen av cellen visualiseras, vilket är en annan begränsning av denna teknik.
Vi vill tillägga att det ibland är svårt att skilja mellan makropinocytosoberoende bildning av membranutsprång och makropinocytisk membranruffling. Vi standardiserade vår kvantifiering genom att identifiera membranvolanger med minst 0,5 μm minsta avstånd mellan två punkter vid kanten av utsprånget. Antalet membranvolanger per cell är mycket varierande och beror på många faktorer, inklusive stimulansen, dess koncentration, inkubationstid och celltyp32. Med PMA och M-CSF såg vi celler med flera membranvolanger men valde representativa bilder som bättre representerar våra kvantifierade data (1-2 volanger per cell). SEM är fortfarande guldstandardtekniken för att bedöma topografiska och morfologiska egenskaper hos plasmamembranet in vitro. Kombinationen av denna metod tillsammans med levande cellavbildning och flödescytometrianalys av löst internalisering ger en tillförlitlig strategi för analys av makropinocytos i olika celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar Libby Perry (Augusta University) för hennes hjälp med SEM-provberedningen. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health [R01HL139562 (G.C.) och K99HL146954 (BS)] och American Heart Association [17POST33661254 (BS)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 2% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| 4% Paraformaldehyde | Santa Cruz Biotechnology | 281692 | |
| 5-(N-ethyl-N-isopropyl)-Amiloride | Sigma Life Science | A3085 | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | |||
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825-09 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Corning | 25-950-CQC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Cytiva Life Sciences | SH30022.01 | |
| Falcon 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Falcon | 353047 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| FitC-dextran | Thermo Fisher Scientific | D1823 | |
| FM 4-64 | Thermo Fisher Scientific | T13320 | |
| HERAcell 150i CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Hummer Model 6.2 Sputter Coater | Anatech USA | 58565 | |
| JSM-IT500HR scanning electron microscope | |||
| Microscope Cover Glass | Thermo Fisher Scientific | 12-545-82 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate | Millipore Sigma | 524400 | |
| RAW 264.7 macrophage | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Human M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| Samdri-790 Critical Point Dryer | Tousimis Research Corporation | 8778B | |
| SEM Aluminum Specimen Mounts | Electron Microscopy Sciences | 75220 | |
| Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | |
| Texas red-dextra | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Trypan Blue Solution | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| Zeiss LSM 780 confocal microscope |
References
- Bohdanowicz, M., Grinstein, S. Role of phospholipids in endocytosis, phagocytosis, and macropinocytosis. Physiological Reviews. 93 (1), 69-106 (2013).
- Canton, J. Macropinocytosis: New Insights Into Its Underappreciated Role in Innate Immune Cell Surveillance. Frontiers in Immunology. 9, 2286 (2018).
- Racoosin, E. L., Swanson, J. A. M-CSF-induced macropinocytosis increases solute endocytosis but not receptor-mediated endocytosis in mouse macrophages. Journal of Cell Science. 102, Pt 4 867-880 (1992).
- Yoshida, S., et al. Differential signaling during macropinocytosis in response to M-CSF and PMA in macrophages. Frontiers in Physiology. 6, 8 (2015).
- Ghoshal, P., et al. Nox2-Mediated PI3K and Cofilin Activation Confers Alternate Redox Control of Macrophage Pinocytosis. Antioxidant and Redox Signal. 26 (16), 902-916 (2017).
- Bryant, D. M., et al. EGF induces macropinocytosis and SNX1-modulated recycling of E-cadherin. Journal of Cell Science. 120, Pt 10 1818-1828 (2007).
- West, M. A., Bretscher, M. S., Watts, C. Distinct endocytotic pathways in epidermal growth factor-stimulated human carcinoma A431 cells. Journal of Cell Biology. 109 (6), Pt 1 2731-2739 (1989).
- Hagiwara, M., Nakase, I. Epidermal growth factor induced macropinocytosis directs branch formation of lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 507 (1-4), 297-303 (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
- Bosedasgupta, S., Pieters, J. Inflammatory stimuli reprogram macrophage phagocytosis to macropinocytosis for the rapid elimination of pathogens. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003879 (2014).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: Regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Zeineddine, R., Yerbury, J. J. The role of macropinocytosis in the propagation of protein aggregation associated with neurodegenerative diseases. Frontiers in Physiology. 6, 277 (2015).
- Yerbury, J. J. Protein aggregates stimulate macropinocytosis facilitating their propagation. Prion. 10 (2), 119-126 (2016).
- Jayashankar, V., Edinger, A. L. Macropinocytosis confers resistance to therapies targeting cancer anabolism. Nature Communication. 11 (1), 1121 (2020).
- Kanlaya, R., et al. Macropinocytosis is the major mechanism for endocytosis of calcium oxalate crystals into renal tubular cells. Cell Biochemistry and Biophysics. 67 (3), 1171-1179 (2013).
- Csanyi, G., et al. CD47 and Nox1 mediate dynamic fluid-phase macropinocytosis of native LDL. Antioxidants and Redox Signaling. 26 (16), 886-901 (2017).
- Francis, C. L., et al. Ruffles induced by Salmonella and other stimuli direct macropinocytosis of bacteria. Nature. 364 (6438), 639-642 (1993).
- Mercer, J., Helenius, A.
- Liu, X., Ghosh, D. Intracellular nanoparticle delivery by oncogenic KRAS-mediated macropinocytosis. International Journal of Nanomedicine. 14, 6589-6600 (2019).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of Royal Society of London B: Biological Sciences. 374 (1765), 20180156 (2019).
- Lin, H. P., et al. Identification of novel macropinocytosis inhibitors using a rational screen of Food and Drug Administration-approved drugs. British Journal of Pharmacology. 175 (18), 3640-3655 (2018).
- Singla, B., et al. PKCδ-Mediated Nox2 Activation Promotes Fluid-Phase Pinocytosis of Antigens by Immature Dendritic Cells. Frontiers in Immunology. 9, 537 (2018).
- Ivanov, A. I. Pharmacological inhibition of endocytic pathways: is it specific enough to be useful. Methods in Molecular Biology. 440, 15-33 (2008).
- Araki, N., et al. Effect of 3-methyladenine on the fusion process of macropinosomes in EGF-stimulated A431 cells. Cell Structure and Function. 31 (2), 145-157 (2006).
- Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
- Fischer, E. R., et al.
- Yoshida, S., et al. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131 (22), (2018).
- Nakase, I., et al. Active macropinocytosis induction by stimulation of epidermal growth factor receptor and oncogenic Ras expression potentiates cellular uptake efficacy of exosomes. Science Reports. 5, 10300 (2015).
- Gold, S., et al. A clathrin independent macropinocytosis-like entry mechanism used by bluetongue virus-1 during infection of BHK cells. PLoS One. 5 (6), 11360 (2010).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A.
- Gordon, R. E. Electron microscopy: A brief history and review of current clinical application. Methods in Molecular Biology. 1180, 119-135 (2014).
- Mahankali, M., et al. The mechanism of cell membrane ruffling relies on a phospholipase D2 (PLD2), Grb2 and Rac2 association. Cell Signaling. 23 (8), 1291-1298 (2011).
