Summary
Ce protocole présente une technique pour sonder les interactions protéine-protéine à l’aide de perles de donneur liées au glutathion avec des co-chaperons à motif TPR fusionnés GST et des perles accepteurs couplées à un peptide dérivé de Hsp90. Nous avons utilisé cette technique pour dépister de petites molécules afin de perturber les interactions Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 et identifié des inhibiteurs puissants et sélectifs de l’interaction Hsp90-FKBP51.
Abstract
Le ciblage des interactions protéine de choc thermique 90 (Hsp90)-cochaperone offre la possibilité de réguler spécifiquement les processus intracellulaires dépendants de Hsp90. Le pentapeptide MEEVD conservé à la terminaison C de Hsp90 est responsable de l’interaction avec le motif de répétition tétratricopeptide (TPR) des co-chaperons. FK506-binding protein (FKBP) 51 et FKBP52 sont deux co-chaperons similaires à motif TPR impliqués dans des maladies hormono-dépendantes stéroïdiennes avec des fonctions différentes. Par conséquent, l’identification de molécules bloquant spécifiquement les interactions entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52 offre un potentiel thérapeutique prometteur pour plusieurs maladies humaines. Nous décrivons ici le protocole d’un test homogène de proximité luminescente amplifié pour sonder les interactions entre Hsp90 et ses co-chaperons partenaires FKBP51 et FKBP52. Tout d’abord, nous avons purifié les protéines FKBP51 et FKBP52 contenant des motifs TPR sous forme marquée glutathion S-transférase (GST). En utilisant les perles de donneur liées au glutathion avec des protéines À motif TPR fusionnées à la TPS et les perles accepteurs couplées à un peptide C-terminal 10-mer de Hsp90, nous avons sondé les interactions protéine-protéine dans un environnement homogène. Nous avons utilisé ce test pour dépister de petites molécules afin de perturber les interactions Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 et identifié des inhibiteurs puissants et sélectifs de l’interaction Hsp90-FKBP51.
Introduction
Les chaperons moléculaires contribuent à l’homéostasie des protéines, y compris le repliement, le transport et la dégradation des protéines. Ils régulent plusieurs processus cellulaires et sont liés à de nombreuses maladies telles que le cancer et les maladies neurodégénératives1. La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est l’un des chaperons les plus importants dont la fonction dépend des changements conformationnels entraînés par l’hydrolyse de l’ATP et la liaison avec les protéines clientes médiées par ses co-chaperons2. Malgré un potentiel évident de Hsp90 en tant que cible thérapeutique, affiner sa fonction représente un grand défi. Il existe plusieurs inhibiteurs de Hsp90 ciblant la région de liaison de l’ATP N-terminal, qui ont été évalués dans des essais cliniques, mais aucun d’entre eux n’a été approuvé pour lacommercialisation 3. En raison de l’absence d’une poche de liaison au ligand4bien définie, le ciblage de la région C-terminale de Hsp90 a eu un succès limité4. Récemment, la perturbation des interactions Hsp90-cochaperone par de petites molécules a été étudiée comme stratégie alternative5. Le ciblage des interactions Hsp90-cochaperone ne provoquerait pas de réponse générale au stress cellulaire et offre la possibilité de réguler spécifiquement divers processus intracellulaires. Le pentapeptide MEEVD conservé à la terminaison C de Hsp90 est responsable de l’interaction avec le motif de répétition tétratricopeptide (TPR) des co-chaperons6. Sur les 736 protéines contenant des motifs TPR annotées dans la base de données des protéines humaines, environ 20 protéines différentes interagissent avec Hsp90 via ce peptide7. Les molécules en concurrence pour la liaison peptidique MEEVD perturberaient les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons contenant un domaine TPR. Le site de liaison peptidique a une structure tertiaire similaire, mais l’homologie globale entre les différents domaines du motif TPR est relativement faible7,ce qui offre la possibilité d’identifier des molécules spécifiquement capables de bloquer les interactions entre Hsp90 et des co-chaperons particuliers à motif TPR. Parmi ces co-chaperons à motif TPR, la protéine de liaison FK506 (FKBP) 51 et FKBP52 sont des régulateurs de la signalisation des récepteurs hormonaux stéroïdiens (SHR) et impliqués dans plusieurs maladies hormono-dépendantes des stéroïdes, y compris le cancer, les maladies liées au stress, les maladies métaboliques et la maladie d’Alzheimer8. Bien que FKBP51 et FKBP52 partagent > similitude de séquence de 80%, leurs fonctions diffèrent: FKBP52 est un régulateur positif de l’activité SHR, tandis que FKBP51 est un régulateur négatif dans la plupart des cas8. Par conséquent, l’identification de molécules, bloquant spécifiquement les interactions entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52, offre un potentiel thérapeutique prometteur pour les maladies connexes.
Unessai amplifié Luminescent Proximity Homogenous A(AlphaScreen) a été développé pour la première fois en 1994 par Ullman EF et al.9. Maintenant, il est largement utilisé pour détecter différents types d’interactions biologiques, telles que lepeptide 10,la protéine11,l’ADN12,l’ARN13et le sucre14. Dans cette technique, il existe deux types de perles (diamètre 200 nm), l’une est la perle donneuse et l’autre est la perle accepteuse. Les biomolécules sont immobilisées sur ces perles; leurs interactions biologiques rapprochent les perles donneuses et accepteuses. À 680 nm, un photosensibilisateur dans la perle du donneur éclaire et convertit l’oxygène en oxygène syté. Parce que l’oxygène syt a une courte durée de vie, il ne peut diffuser que jusqu’à 200 nm. Si la bille accepteur est à proximité, son dérivé de thioxène réagit avec l’oxygène singulet générant une chimiluminescence à 370 nm. Cette énergie active en outre les fluorophores dans la même bille accepteur pour émettre de la lumière à 520-620 nm15. Si les interactions biologiques sont perturbées, la perle accepteur et la perle donneuse ne peuvent pas atteindre la proximité, ce qui entraîne la désintégration de l’oxygène syulet et un faible signal produit.
Nous décrivons ici un protocole utilisant cette technique pour le criblage de petites molécules inhibant les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons TPR, en particulier FKBP51 et FKBP52. Les 10 peptides longs d’acides aminés correspondant à Hsp90 extrême C-terminus sont attachés à des billes acceptrices. Les co-chaperons TPR purifiés marqués de la TPS interagissent avec les perles de donneurs liées au glutathion. Lorsque l’interaction entre les peptides dérivés de Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR rassemble les billes, un signal amplifié est produit(Figure 1A). Si les petites molécules criblées peuvent inhiber les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR, ce signal amplifié sera diminué(Figure 1B). Leur IC50 peut être calculé par mesure quantitative. Ce protocole peut être étendu à toutes les interactions chaperon -TPR-motif co-chaperon d’intérêt et est d’une grande importance dans le développement de nouvelles molécules, bloquant spécifiquement l’interaction entre Hsp90 et FKBP51 ou FKBP52.
Figure 1: Principe de base de ce test. (A) La GST-FKBP51 purifiée interagit avec les billes de donneur liées au glutathion. Les 10 peptides longs d’acides aminés correspondant à l’extrême C-terminus de Hsp90 sont attachés à des billes acceptrices. L’interaction entre les peptides dérivés de Hsp90 et le domaine TPR de FKBP51 rapproche les perles donneuses et acceptrices. À 680 nm, un photosensibilisateur dans la perle du donneur éclaire et convertit l’oxygène en oxygène syté. Le dérivé de thioxène sur la bille accepteur réagit avec l’oxygène syt et génère une chimiluminescence à 370 nm. Cette énergie active en outre les fluorophores dans la même bille accepteur pour émettre de la lumière à 520-620 nm. (B) Lorsque de petites molécules inhibent les interactions entre Hsp90 et FKBP51, les perles donneuses et acceptatrices ne peuvent pas atteindre la proximité. Ensuite, l’oxygène syt avec une courte durée de vie se désintègre et aucun signal détectable n’est produit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
Remarque : Une vue d’ensemble de ce protocole est illustrée à la figure 2.
1. Expression et purification de la TPS-FKBP51 et de la TPS-FKBP52 (Figure 2A)
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Plasmides
REMARQUE: Obtenez des clones d’ADNc pour FKBP51 humain (id de clone: 5723416) et pour FKBP52 humain (ID de clone: 7474554) auprès du consortium IMAGE.- Amplifier l’ADN FKBP51 humain par PCR avec des amorces (en avant; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', inverse; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCCAC-3') contenant des surplombs BamHI et XhoI et cloner en vecteur pGEX6-1 sur les sites de restriction BamHI / XhoI.
- Amplifier l’ADN FKBP52 humain par PCR avec des amorces (en avant; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', inverse; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCCAC-3') contenant des surplombs EcoRI et XhoI et cloner en vecteur pGEX6-2 sur les sites de restriction EcoRI / XhoI.
REMARQUE: La configuration et les conditions de la réaction par PCR sont indiquées dans les tableaux 1 et 2. - Vérifier la séquence insérée et transformer les plasmides en E. coli chimiquement compétent selon le protocole de fabrication.
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Expression et purification des protéines
- Ajouter 25 g de bouillon Luria (LB) dans 1 L d’eau distillée pour faire la solution LB. Autoclavez-le à 121 °C pendant 15 min. Après refroidissement, ajouter 50 μg/mL d’ampicilline.
- Prendre une colonie de bactéries exprimant GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et mélanger avec 500 μL de solution LB dans un tube de 1,5 mL. Tourbillon.
- Ajouter le mélange de « 1.2.2 » dans 1 L de solution LB dans la fiole Erlenmeyer recouverte d’une feuille d’aluminium. Incuber la fiole d’Erlenmeyer dans le shaker pendant la nuit à 37 °C.
- Induire l’expression des protéines en ajoutant 1 mM d’isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) à la fiole d’Erlenmeyer et poursuivre l’incubation pendant encore 2 h.
- Pour obtenir des pastilles de cellule, centrifuger à 5 000 x g pendant 15 min. Retirez le surnageant.
REMARQUE: Les granulés de cellule peuvent être stockés à -20 ° C. - Resuspendez les pastilles cellulaires dans 40 mL de PBS et soniquez 3 x 20 s sur de la glace. Ajouter 1 mM pmSF, 1 mM EDTA et un cocktail d’inhibiteurs de protéase (1 comprimé) pour prévenir la protéolyse.
- Centrifuger la suspension pendant 30 min 50 000 x g pour éliminer les débris cellulaires et appliquer le surnageant sur une colonne de piège GST de 5 mL.
- Après avoir lavé la colonne avec 30 mL de PBS, éluez GST-FKBP51 et GST-FKBP52 avec 5 mL de glutathion de 10 mM dans du PBS.
- Protéines concentrées sur une unité de centrifugation de 15 mL 10.000 MWCO. Pour éliminer le glutathion libre, passez les concentrés à travers la colonne PD-10 équilibrés avec 0,5x PBS et concentrez-vous à nouveau sur le dispositif de centrifugeuse filtrante.
- Recueillir les fractions contenant des protéines. Vérifiez les protéines dans SDS-PAGE et ajustez les concentrations de protéines à 1 mg/mL.
REMARQUE: Le rendement en protéines typique est de 2-5 mg / L de culture. La protéine peut être stockée à -20 °C.
2. Couplage du peptide C-terminal Hsp90 aux billes acceptrices (Figure 2B)
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Préparation peptidique Hsp90
- Synthétiser dixacides aminés peptide NH 2-EDASRMEEVD-COOH correspondant aux acides aminés 714-724 de l’isoforme bêta Hsp90 humaine (UniProt ID: P08238) par un service de synthèse peptidique.
- Diluer le peptide Hsp90 dans le PBS à une concentration de 1 mg/mL.
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Préparation des perles d’accepteur
- Diluer les billes d’accepteur non conjuguées dans du PBS à une concentration de 1 mg/mL et transférer dans un tube de 1,5 mL.
- Effectuer le lavage par centrifugation à 16 000 x g pendant 15 min. Retirez soigneusement le surnageant.
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Conjugaison
- Définissez le rapport entre les perles et le peptide sur 10:1. Dans le tube de 1,5 mL contenant 1 mg de pastille de bille accepteur (préparé comme décrit ci-dessus), ajouter 1 mL de PBS (pH 7,4), 0,1 mg de peptide dilué, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL d’une solution de cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN) de 400 mM dans l’eau.
ATTENTION : NaBH3CN est toxique; utilisez une hotte et des gants. La solution de NaBH3CN doit être fraîchement préparée. - Incuber pendant 24 h à 37 °C avec agitation bout à bout (10-20 tr/min) sur un agitateur rotatif.
- Définissez le rapport entre les perles et le peptide sur 10:1. Dans le tube de 1,5 mL contenant 1 mg de pastille de bille accepteur (préparé comme décrit ci-dessus), ajouter 1 mL de PBS (pH 7,4), 0,1 mg de peptide dilué, 1,25 μL de Tween-20, 10 μL d’une solution de cyanoborohydrure de sodium (NaBH3CN) de 400 mM dans l’eau.
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Trempe par réaction et lavage des billes
- Ajouter 20 μL de solution de Tris-HCl (pH 8,0) de 1 M à la réaction pour bloquer les sites qui n’ont pas réagi. Incuber pendant 1 h à 37 °C.
- Centrifuger à 16 000 x g (ou vitesse maximale) pendant 15 min à 4 °C. Retirer le surnageant et resussuspener la pastille de bille dans 1 mL de solution de Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
- Répétez l’étape de lavage trois fois.
- Après la dernière centrifugation, remise en service des billes à 1 mg/mL dans un tampon de stockage (1 mL de 0,5 × PBS avec 0,01 % d’azide de sodium comme agent de conservation). Conserver la solution de billes accepteurs conjuguées à 4 °C à l’abri de la lumière.
ATTENTION: L’azide de sodium est toxique; utilisez une hotte et des gants.
3. Le test sondant l’interaction entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et le peptide C-terminal Hsp90, et l’inhibition avec des composés de petite masse moléculaire (Figure 2C)
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Protéines marquées GST interagissant avec des billes de donneurs de glutathion
- Mettez en place les réactions dans des plaques de 384 puits.
- Préparer la solution contenant 10 μg/mL de billes donneuses de glutathion dans 0,5x PBS, pH 7,4.
REMARQUE: Après un stockage prolongé, les perles se déposent et doivent être tourbillondées. - Ajouter GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 à une concentration finale de 10 μg/mL.
- Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 10 min.
REMARQUE: À cette étape, les protéines marquées GST interagiront avec le glutathion attaché aux perles. Pour chaque puits, 22,5 μL de ce mélange seront utilisés. La concentration des partenaires contraignants doit être déterminée empiriquement. Titrez GST-FKBP51 et GST-FKBP52 et choisissez la concentration qui donne le meilleur signal.
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Ajout de composé
- Effectuer des dilutions en série de composés d’essai dans le DMSO.
REMARQUE: Les concentrations utilisées sont généralement de 10, 30, 100, 300, 1 000 et 3 000 μM. - Ajouter 0,25 μL de DMSO (contrôle négatif) ou de peptide C-terminal Hsp90 (contrôle positif, 30 μM) ou de composés dans le DMSO au coin de chaque puits de la plaque. Utilisez des triples pour chaque concentration de composé.
- Ajouter 22,5 μL de la solution contenant des perles de donneur de glutathion avec des protéines marquées GST à chaque puits.
- Serrez l’assiette doucement avec la main mais à fond. Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 15 min.
REMARQUE: Pendant ce temps, les composés interagiront avec le domaine TPR au site de liaison peptidique Hsp90 C-terminal.
- Effectuer des dilutions en série de composés d’essai dans le DMSO.
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Ajout de perles d’accepteur
- Diluer les billes acceptatrices avec le peptide C-terminal Hsp90 attaché à 100 μg/mL dans 0,5x PBS.
- Ajouter 2,25 μL de billes d’accepteur diluées à chaque puits.
- Mélanger doucement mais bien. Incuber dans l’obscurité à 25 °C pendant 15 min.
REMARQUE: À cette étape, les billes du donneur et de l’accepteur sont rapprochées par les interactions protéine-peptide. Le volume final du mélange réactionnel est de 25 μL. Par conséquent, les concentrations finales de composés varient de 0,1 à 30 μM.
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Lecture de plaques
REMARQUE: Lisez la plaque à l’aide d’un lecteur de plaque réglé dans le mode approprié.- Allumez l’instrument et ouvrez le logiciel
- Choisissez le protocole approprié.
- Cliquez sur Modifier la carte de la plaque et sélectionnez le puits utilisé dans la plaque pour la mesure.
- Cliquez sur Suivant pour continuer et exécuter le protocole sélectionné.
- Après la mesure, cliquez sur Afficher les résultats pour afficher les résultats.
- Exportez les données.
4. Analyse des données
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Facteur Z' et rapport signal/arrière-plan (S/B)
- Calculez le facteur Z' et le rapport S/B pour le dosage à l’aide de l’équation suivante :
Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
S/B=μneg/μpos
où, σ et μ représentent les écarts-types et les moyennes des témoins positifs (Hsp90 C-terminal peptide, 30 μM) et négatifs (DMSO), respectivement. Un facteur Z' > 0,5 garantira que le test est suffisamment robuste pour le dépistage. Pour surveiller la sensibilité du test, le rapport S / B a également été calculé.
- Calculez le facteur Z' et le rapport S/B pour le dosage à l’aide de l’équation suivante :
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Courbe dose-réponse et CI 50
REMARQUE: Utilisez une analyse de régression non linéaire pour ajuster les données des inhibiteurs de l’IPP Hsp90-cochaperones par logiciel.- Créez une table de données XY dans la boîte de dialogue Bienvenue et sélectionnez X Numbers, et Y Enter 3 (si triplé) réplique les valeurs dans des colonnes côte à côte.
- Normaliser les données de signal des échantillons au groupe témoin négatif. Importez les valeurs de concentration dans la colonne X et les valeurs de signal dans la colonne Y.
- Cliquez sur Analyser et choisissez Transformer la concentration (X) sous Transformer | Normaliser. Choisissez Transformer en logarithmes.
REMARQUE: Cela transformera la concentration en une échelle logarithmique. Si votre concentration de départ est nulle, réglez-la sur un très petit nombre qui est effectivement nul (par exemple, 0,1 nM) pour ne pas perdre ces valeurs puisque le logarithme de zéro n’est pas défini. - Cliquez sur Analyser et choisissez Régression non linéaire (ajustement de courbe) sous Analyses XY, ouvrez l’inhibition dose-réponse et choisissez Log(inhibiteur) vs réponse -- Pente variable.
- Cliquez sur OK pour afficher les résultats (contenant la valeur IC50) et les graphiques.
Figure 2: Schéma de ce protocole. (A) Expression et purification de la TPS-FKBP51 et de la TPS-FKBP52. (B) Couplage du peptide C-terminal Hsp90 aux billes acceptrices. (C) Le test sondant l’interaction entre GST-FKBP51 ou GST-FKBP52 et Hsp90 C-terminal peptide. Inhibition avec des composés de petite masse moléculaire. Créé avec BioRender.com Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Dans notre essai, le facteur Z' et le rapport S/B sont respectivement de 0,82 et 13,35(figure 3A),ce qui démontre que notre essai est robuste et fiable pour le criblage à haut débit. Nous l’avons ensuite utilisé pour filtrer de petits composés de masse moléculaire. La figure 3B présente l’inhibition dose-dépendante des interactions chaperon-cochaperone avec une petite molécule sélectionnée (D10). Les courbes dose-réponse pour D10 sont générées par une analyse de régression non linéaire, sur la base de laquelle les valeurs de la CI50 sont calculées. D10 montre une inhibition dose-dépendante à la fois sur les IPP Hsp90 - GST-FKBP51 et Hsp90 - GST-FKBP52. Mais les valeurs de la CI50 sont différentes : sa CI50 pour les interactions Hsp90 - GST-FKBP51 est de 65 nM, alors que, pour les interactions Hsp90 - GST-FKBP52, l’inhibition complète n’a pas été obtenue avec la concentration de composé la plus élevée (100 μM), sa CI50 est estimée à > 30 μM. Ces résultats fournissent des preuves que l’inhibition sélective des IPP Hsp90-HKBP51 ou Hsp90-FKBP52 avec de petites molécules peut être obtenue (les domaines TPR de FKBP51 et FKBP52 ont une identité de séquence de 60% et > une similitude de séquence de 80%), et ce test peut être appliqué pour ce dépistage.
Figure 3: Analyse et résultats dutest. (A) Z' facteur et rapport signal/arrière-plan (S/B) de ce test. Les données représentent les signaux de (○) contrôle positif (peptide Hsp90 C-terminal, 30 μM) et (●) contrôle négatif (DMSO) de 48 puits. Une valeur Z' de 0,82 et un rapport S/B de 13,35 ont été calculés à partir de ces deux populations de données. (B) Inhibition du composé sélectionné (D10) sur les interactions de Hsp90 avec FKBP51 (●) ou FKBP52 (○) dans ce dosage. D10 inhibe Hsp90-FKBP51 ou Hsp90-FKBP52 dose-dépendant. Son IC50 est de 65 nM pour l’interaction Hsp90-FKBP51 mais supérieur à 30 μM pour l’interaction Hsp90-FKBP52. Les données sont normalisées dans le groupe témoin et exprimées en moyennes ± SEM. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.
| Composant de réaction | Volume (μL) |
| Tampon PCR (5 x concentré) | 4 |
| Amorce avant | 1 |
| Amorce inversée | 1 |
| Plasmide | 0.5 |
| Mélange dNTP (10 mM chacun) | 0.5 |
| Phusion ADN polymérase | 0.5 |
| Eau (qualité ADN) | 12.5 |
| Total | 20 |
Tableau 1 : Réaction PCR mise en place pour l’amplification de l’ADN FKBP51 et FKBP52 humain.
| Étape | Température (°C) | Heure | Cycles |
| Dénaturation initiale | 94 | 3 min | 1 |
| Dénaturation | 94 | 30 secondes | 35 |
| Recuit | 56 | 30 secondes | |
| Extension | 72 | 1 min | |
| Prolongation finale | 72 | 5 min | 1 |
| Remarque : La température du couvercle est de 105 °C. |
Tableau 2 : Conditions thermocyleuses pour l’amplification de l’ADN FKBP51 et FKBP52 humain.
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Discussion
Nous décrivons ici un protocole utilisant le test pour le criblage de petites molécules inhibant les interactions entre Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR, en particulier FKBP51 et FKBP52. Son score Z' élevé (>0,8) démontre la robustesse et la fiabilité d’un format à haut débit. Les résultats peuvent être obtenus en une heure et de petites quantités de perles, de protéines et de composés sont nécessaires. De plus, ce protocole pourrait facilement être étendu à toutes les interactions de co-chaperon Hsp90/Hsp70 - TPR-motif. Plusieurs co-chaperons de Hsp90 à motif TPR ont été impliqués dans divers troubles humains allant de la maladie d’Alzheimer aux maladies auto-immunes, au cancer, etc. Le protocole décrit ici fournit un test in vitro robuste et peu coûteux pour le criblage à haut débit de petites molécules inhibant les interactions chaperon-cochaperone de haute importance médicale.
En outre, les médicaments ciblant les domaines de la TPR et inhibant l’interaction avec Hsp90 doivent être évalués non seulement pour leur affinité envers la cible, mais aussi pour leur sélectivité envers d’autres protéines à motif TPR. Le génome humain code > 20 protéines de motif TPR capables d’interagir avec le peptide C-terminal Hsp90. Ce test utilisant des billes de glutathion et des protéines marquées GST permet d’évaluer l’effet du médicament sur plusieurs partenaires de TPR de liaison. Notre laboratoire possède une bibliothèque de 20 protéines TPR humaines sous leur forme marquée GST et peut obtenir des profils d’affinité et de sélectivité pour chaque petite molécule testée.
Il a déjà été démontré que l’IPP entre les co-chaperons Hsp90 et TPR est médié par le peptide C-terminal de Hsp90; la suppression de Hsp90 C-terminus abolit complètement la liaison des co-chaperons TPR-motif6. Nous avons constaté que les composés efficaces dans notre essai où le peptide C-terminal Hsp90 a été utilisé ont également été capables d’inhiber l’interaction de Hsp90 pleine longueur avec GST-FKBP51/52 dans un essai de traction utilisant des billes de sépharose de glutathion (données non montrées). Certains des composés sélectionnés montrent également l’affinité de liaison avec FKBP51 par la technologie de résonance plasmonique de surface, et leurs sites de liaison spécifiques déterminés par co-cristallisation sont actuellement à l’étude.
Une étape critique de notre protocole est l’ordre d’addition; on forme d’abord un complexe entre une petite molécule et sa cible TPR. Si des complexes entre FKBP51 et Hsp90 C-terminal peptide ont déjà été formés, des temps d’incubation plus longs et des concentrations plus élevées de composés médicamenteux sont nécessaires pour briser les IPP. Cela est principalement dû à l’obstacle stérique des billes limitant l’accès des molécules au site d’interaction.
Il est possible de coupler de manière covalente des protéines TPR et des peptides C-terminaux Hsp90 à des perles donneuses et acceptrices, respectivement, et de sonder directement les IPP. Cependant, il n’est pas recommandé d’attacher de manière covalente les deux partenaires de liaison aux billes en raison du mouvement réduit des molécules en solution affectant la cinétique des interactions. Cela augmente également le risque d’entrave stérique en raison de la taille de la perle. Par conséquent, nous choisissons des perles acceptrices couplées au peptide C-terminal Hsp90 et aux perles de donneur de glutathion qui interagissent avec les protéines marquées GST dans notre test, où plusieurs partenaires TPR peuvent être évalués.
Dans ce test, il est probable que certains composés identifiés peuvent être faussement positifs en raison de leur interférence avec la technologie d’essai, tels que la trempe de l’oxygène singulet, la trempe de la lumière et la diffusion de la lumière. Des résultats faussement positifs peuvent également être induits en perturbant la liaison de l’étiquette GST avec les perles de donneurs de glutathion. Ces résultats faussement positifs peuvent être évités lors du dépistage de molécules à la fois sur les IPP Hsp90-FKBP51 et Hsp90-FKBP52 afin d’identifier les inhibiteurs sélectifs. D’autres méthodes de détection des IPP doivent également être appliquées pour vérifier les inhibiteurs sélectionnés.
La limite de notre test est qu’il ne peut pas être utilisé pour détecter l’interaction entre Hsp90 et les co-chaperons à motif TPR dans des échantillons biologiques bruts, tels que les lysates cellulaires. Après le criblage à haut débit, les inhibitions de composés sélectionnés sur Hsp90 - IPP de co-chaperons à motif TPR dans des échantillons biologiques doivent être vérifiées par d’autres méthodes, telles que la co-immunoprécipitation et le test de ligature de proximité.
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Disclosures
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par des subventions du Conseil suédois de la recherche (2018-02843), de la Brain Foundation (Fo 2019-0140), de la Foundation for Geriatric Diseases du Karolinska Institutet, de la Gunvor and Josef Anérs Foundation, de la Magnus Bergvalls Foundation, de la Gun and Bertil Stohnes Foundation, de la Tore Nilssons Foundation for medical research, de la Margaretha af Ugglas Foundation et de la Foundation for Old Servants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
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