Summary
Dieses Protokoll stellt eine Technik zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen unter Verwendung von Glutathion-verknüpften Spenderperlen mit GST-verschmolzenen TPR-Motiv-Co-Chaperonen und Akzeptorperlen in Verbindung mit einem Hsp90-abgeleiteten Peptid vor. Wir haben diese Technik verwendet, um kleine Moleküle zu screenen, um Hsp90-FKBP51- oder Hsp90-FKBP52-Interaktionen zu stören, und potente und selektive Hsp90-FKBP51-Interaktionshemmer identifiziert.
Abstract
Das Targeting der Wechselwirkungen mit dem Hitzeschockprotein 90 (Hsp90)-Cochaperon bietet die Möglichkeit, Hsp90-abhängige intrazelluläre Prozesse gezielt zu regulieren. Das konservierte MEEVD-Pentapeptid am C-Terminus von Hsp90 ist für die Wechselwirkung mit dem Tetratricopeptid-Wiederholungsmotiv (TPR) von Co-Chaperonen verantwortlich. FK506-bindendes Protein (FKBP) 51 und FKBP52 sind zwei ähnliche TPR-Motiv-Co-Chaperone, die an steroidhormonabhängigen Erkrankungen mit unterschiedlichen Funktionen beteiligt sind. Daher bietet die Identifizierung von Molekülen, die spezifisch Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 blockieren, ein vielversprechendes therapeutisches Potenzial für mehrere menschliche Krankheiten. Hier beschreiben wir das Protokoll für einen amplifizierten lumineszierenden homogenen Näherungsassay zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und seinen Partner-Co-Chaperonen FKBP51 und FKBP52. Zunächst haben wir die TPR-motivhaltigen Proteine FKBP51 und FKBP52 in Glutathion-S-Transferase (GST)-getaggter Form gereinigt. Unter Verwendung der Glutathion-verknüpften Spenderperlen mit GST-verschmolzenen TPR-Motivproteinen und den Akzeptorperlen in Verbindung mit einem 10-mer C-terminalen Peptid von Hsp90 haben wir Protein-Protein-Interaktionen in einer homogenen Umgebung untersucht. Wir haben diesen Assay verwendet, um kleine Moleküle zu screenen, um Hsp90-FKBP51- oder Hsp90-FKBP52-Interaktionen zu stören, und potente und selektive Hsp90-FKBP51-Interaktionshemmer identifiziert.
Introduction
Molekulare Chaperone tragen zur Protein-Homöostase bei, einschließlich Proteinfaltung, Transport und Abbau. Sie regulieren mehrere zelluläre Prozesse und sind mit zahlreichen Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen verbunden1. Das Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) ist eines der wichtigsten Chaperone, dessen Funktion von Konformationsänderungen abhängt, die durch ATP-Hydrolyse und Bindung an Client-Proteine, die durch seine Co-Chaperone vermitteltwerden, angetriebenwerden 2 . Trotz eines offensichtlichen Potenzials von Hsp90 als therapeutisches Ziel stellt die Feinabstimmung seiner Funktion eine große Herausforderung dar. Es gibt mehrere Hsp90-Inhibitoren, die auf die N-terminale ATP-Bindungsregion abzielen, die in klinischen Studien untersucht wurden, aber keiner von ihnen wurde für die Vermarktung zugelassen3. Aufgrund des Fehlens einer gut definierten Ligandenbindungstasche4hatte das Targeting der C-terminalen Region von Hsp90 nur begrenzten Erfolg4. Kürzlich wurde die Störung von Hsp90-Cochaperon-Wechselwirkungen durch kleine Moleküle als alternative Strategie untersucht5. Die Ausrichtung auf die Hsp90-Cochaperon-Interaktionen würde keine allgemeine Zellstressreaktion hervorrufen und bietet die Möglichkeit, verschiedene intrazelluläre Prozesse spezifisch zu regulieren. Das konservierte MEEVD-Pentapeptid am C-Terminus von Hsp90 ist für die Wechselwirkung mit dem Tetratricopeptid-Wiederholungsmotiv (TPR) der Co-Chaperone verantwortlich6. Von den 736 TPR-motivhaltigen Proteinen, die in der humanen Proteindatenbank annotiert sind, interagieren ~20 verschiedene Proteine über dieses Peptid mit Hsp907. Moleküle, die um die MEEVD-Peptidbindung konkurrieren, würden die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und Co-Chaperonen, die eine TPR-Domäne enthalten, stören. Die Peptidbindungsstelle hat eine ähnliche tertiäre Struktur, aber die Gesamthomologie zwischen verschiedenen TPR-Motivdomänen ist relativ niedrig7, was die Möglichkeit bietet, Moleküle zu identifizieren, die spezifisch in der Lage sind, Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und bestimmten TPR-Motiv-Co-Chaperonen zu blockieren. Unter diesen TPR-Motiv-Co-Chaperonen sind FK506-bindendes Protein (FKBP) 51 und FKBP52 Regulatoren der Steroidhormonrezeptor-Signalisierung (SHR) und an mehreren Steroidhormon-abhängigen Krankheiten beteiligt, darunter Krebs, stressbedingte Krankheiten, Stoffwechselerkrankungen und Alzheimer-Krankheit8. Obwohl FKBP51 und FKBP52 > Sequenzähnlichkeit von 80% teilen, unterscheiden sich ihre Funktionen: FKBP52 ist ein positiver Regulator der SHR-Aktivität, während FKBP51 in den meisten Fällen ein negativer Regulator ist8. Daher bietet die Identifizierung von Molekülen, die spezifisch Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 blockieren, ein vielversprechendes therapeutisches Potenzial für verwandte Krankheiten.
Einmplified Luminescent Proximity Homogenous Assay (AlphaScreen) wurde erstmals 1994 von Ullman EF et al.9entwickelt. Jetzt wird es häufig verwendet, um verschiedene Arten von biologischen Interaktionen wie Peptid10, Protein11, DNA12, RNA13und Zucker14zu erkennen . Bei dieser Technik gibt es zwei Arten von Perlen (Durchmesser 200 nm), eine ist die Spenderperle und die andere ist die Akzeptorperle. Die Biomoleküle werden auf diesen Perlen immobilisiert; ihre biologischen Wechselwirkungen bringen Spender- und Akzeptorperlen in die Nähe. Bei 680 nm beleuchtet ein Photosensibilisator in der Spenderperle und wandelt Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff um. Da der Singsingstoff eine kurze Lebensdauer hat, kann er nur bis zu 200 nm diffundieren. Befindet sich die Akzeptorperle in der Nähe, reagiert ihr Thioxenderivat mit dem Singulett Sauerstoff, der bei 370 nm Chemilumineszenz erzeugt. Diese Energie aktiviert weiterhin Fluorophore in derselben Akzeptorperle, um Licht bei 520-620 nm15zu emittieren. Wenn die biologischen Wechselwirkungen gestört sind, können die Akzeptorperle und die Spenderperle keine Nähe erreichen, was zum Sauerstoffzerfall des Singuletts und zu einem schwach produzierten Signal führt.
Hier beschreiben wir ein Protokoll, das diese Technik zum Screening kleiner Moleküle verwendet, die Wechselwirkungen zwischen Hsp90- und TPR-Co-Chaperonen hemmen, insbesondere FKBP51 und FKBP52. Die 10 Aminosäuren langen Peptide, die Hsp90 extremem C-Terminus entsprechen, sind an Akzeptorperlen gebunden. Gereinigte GST-markierte TPR-Co-Chaperone interagieren mit Glutathion-verknüpften Spenderperlen. Wenn die Wechselwirkung zwischen Hsp90-abgeleiteten Peptiden und TPR-Motiv-Co-Chaperonen die Perlen zusammenbringt, wird ein verstärktes Signal erzeugt (Abbildung 1A). Wenn die gescreenten kleinen Moleküle die Wechselwirkungen zwischen Hsp90- und TPR-Motiv-Co-Chaperonen hemmen können, wird dieses verstärkte Signal verringert (Abbildung 1B). Ihr IC50 kann durch quantitative Messung berechnet werden. Dieses Protokoll kann auf alle Chaperon-TPR-Motiv-Co-Chaperon-Interaktionen von Interesse erweitert werden und ist von großer Bedeutung für die Entwicklung neuartiger Moleküle, die insbesondere die Wechselwirkung zwischen Hsp90 und FKBP51 oder FKBP52 blockieren.
Abbildung 1: Das Grundprinzip dieses Assays. (A) Gereinigte GST-FKBP51 interagiert mit Glutathion-verknüpften Spenderperlen. Die 10 Aminosäuren langen Peptide, die dem extremen C-Terminus von Hsp90 entsprechen, sind an Akzeptorperlen gebunden. Die Interaktion zwischen Hsp90-abgeleiteten Peptiden und der TPR-Domäne von FKBP51 bringt die Spender- und Akzeptorperlen in die Nähe. Bei 680 nm beleuchtet ein Photosensibilisator in der Spenderperle und wandelt Sauerstoff in Singulett-Sauerstoff um. Das Thioxenderivat auf der Akzeptorperle reagiert mit dem Singulett Sauerstoff und erzeugt eine Chemilumineszenz bei 370 nm. Diese Energie aktiviert weiterhin Fluorophore in derselben Akzeptorperle, um Licht bei 520-620 nm zu emittieren. (B) Wenn kleine Moleküle die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und FKBP51 hemmen, können die Spender- und Akzeptorperlen keine Nähe erreichen. Dann zerfällt der Singulett-Sauerstoff mit kurzer Lebensdauer und es wird kein nachweisbares Signal erzeugt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Protocol
HINWEIS: Eine Übersicht über dieses Protokoll ist in Abbildung 2 dargestellt.
1. Expression und Reinigung von GST-FKBP51 und GST-FKBP52 (Abbildung 2A)
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Plasmide
HINWEIS: Beziehen Sie cDNA-Klone für menschlicheS FKBP51 (Klon-ID: 5723416) und für menschliches FKBP52 (Klon-ID: 7474554) vom IMAGE-Konsortium.- Amplifizieren Sie die humane FKBP51-DNA durch PCR mit Primern (vorwärts; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', umgekehrt; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3'), die BamHI- und XhoI-Überhänge enthalten, und klonen Sie sie an BamHI / XhoI-Restriktionsstellen in pGEX6-1-Vektor.
- Amplifizieren Sie die humane FKBP52-DNA durch PCR mit Primern (vorwärts; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', umgekehrt; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') mit EcoRI- und XhoI-Überhängen und klonen Sie sie an EcoRI / XhoI-Restriktionsstellen in pGEX6-2-Vektor.
HINWEIS: Aufbau der PCR-Reaktion und Bedingungen sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt. - Überprüfen Sie die eingefügte Sequenz und wandeln Sie die Plasmide gemäß dem Herstellungsprotokoll in die chemisch kompetenten E. coli um.
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Proteinexpression und -reinigung
- Fügen Sie 25 g Luria Brühe (LB) Basis in 1 L destilliertes Wasser hinzu, um die LB-Lösung herzustellen. Autoklavieren Sie es bei 121 °C für 15 min. Nach dem Abkühlen 50 μg/ml Ampicillin hinzufügen.
- Nehmen Sie eine Bakterienkolonie, die GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 exprimieren, und mischen Sie sie mit 500 μL LB-Lösung in einem 1,5-ml-Röhrchen. Wirbel.
- Die Mischung aus "1.2.2" in 1 L LB-Lösung in den mit einer Aluminiumfolie bedeckten Erlenmeyerkolben geben. Den Erlenmeyerkolben über Nacht bei 37 °C im Shaker inkubieren.
- Induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-β-D-Thiogalactosid (IPTG) zum Erlenmeyerkolben und setzen Sie die Inkubation für weitere 2 h fort.
- Um Zellpellets zu erhalten, zentrifugieren Sie bei 5.000 x g für 15 min. Entfernen Sie den Überstand.
HINWEIS: Die Zellpellets können bei -20 °C gelagert werden. - Die Zellpellets in 40 ml PBS wieder auffüllen und 3 x 20 s auf Eis beschallen. Fügen Sie 1 mM PMSF, 1 mM EDTA und Protease-Inhibitor-Cocktail (1 Tablette) hinzu, um die Proteolyse zu verhindern.
- Zentrifugieren Sie die Suspension für 30 min 50.000 x g, um Zellablagerungen zu entfernen und tragen Sie den Überstand auf die 5 mL GST-Trap-Säule auf.
- Nachdem Sie die Säule mit 30 mL PBS gewaschen haben, eluieren Sie GST-FKBP51 und GST-FKBP52 mit 5 mL 10 mM Glutathion in PBS.
- Konzentrieren Sie Proteine auf 15 mL 10.000 MWCO Zentrifugationseinheit. Um freies Glutathion zu entfernen, geben Sie die Konzentrate durch die PD-10-Säule, die mit 0,5x PBS ausgeglichen ist, und konzentrieren Sie sich erneut auf die Filterzentrifuge.
- Sammeln Sie proteinhaltige Fraktionen. Überprüfen Sie die Proteine in SDS-PAGE und passen Sie die Proteinkonzentrationen auf 1 mg/ml an.
HINWEIS: Die typische Proteinausbeute beträgt 2-5 mg / L Kultur. Das Protein kann bei -20 °C gespeichert werden.
2. Kopplung des Hsp90 C-terminalen Peptids an die Akzeptorperlen (Abbildung 2B)
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Hsp90 Peptidpräparat
- Synthese von zehnAminosäurepeptid NH2-EDASRMEEVD-COOH entsprechend den Aminosäuren 714-724 der humanen Hsp90 beta-Isoform (UniProt ID: P08238) durch einen Peptidsynthesedienst.
- Verdünnen Sie das Hsp90-Peptid in PBS auf 1 mg/ml Konzentration.
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Vorbereitung von Akzeptorperlen
- Die unkonjugierten Akzeptorperlen in PBS auf 1 mg/ml Konzentration verdünnen und in ein 1,5 ml Röhrchen überführen.
- Waschen Sie durch Zentrifugation bei 16.000 x g für 15 min. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand.
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Konjugation
- Stellen Sie das Verhältnis zwischen Perlen und Peptid auf 10:1 ein. In das 1,5-ml-Röhrchen mit 1 mg Akzeptorperlenpellet (wie oben beschrieben hergestellt) 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg verdünntes Peptid, 1,25 μL Tween-20,10 μL einer 400 mM-Lösung von Natriumcyanoborohydrid (NaBH3 CN) in Wasser geben.
ACHTUNG: NaBH3CN ist giftig; Verwenden Sie eine Abzugshaube und Handschuhe. NaBH3CN Lösung sollte frisch zubereitet werden. - 24 h bei 37 °C mit End-over-End-Rührung (10-20 U/min) auf einem Rotationsschüttler inkubieren.
- Stellen Sie das Verhältnis zwischen Perlen und Peptid auf 10:1 ein. In das 1,5-ml-Röhrchen mit 1 mg Akzeptorperlenpellet (wie oben beschrieben hergestellt) 1 ml PBS (pH 7,4), 0,1 mg verdünntes Peptid, 1,25 μL Tween-20,10 μL einer 400 mM-Lösung von Natriumcyanoborohydrid (NaBH3 CN) in Wasser geben.
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Reaktionsabschreckung und Perlenwäsche
- 20 μL 1 M Tris-HCl (pH 8,0) Lösung werden der Reaktion hinzugefügt, um nicht umgesetzte Stellen zu blockieren. 1 h bei 37 °C inkubieren.
- Zentrifuge bei 16.000 x g (oder Höchstgeschwindigkeit) für 15 min bei 4 °C. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Perlenpellet in 1 ml Tris-HCl-Lösung (100 mM, pH 8,0).
- Wiederholen Sie den Waschschritt dreimal.
- Nach der letzten Zentrifugation die Perlen bei 1 mg/ml im Speicherpuffer (1 ml 0,5 × PBS mit 0,01% Natriumazid als Konservierungsmittel) wieder auffüllen. Lagern Sie die konjugierte Akzeptorperlenlösung bei 4 °C lichtgeschützt.
ACHTUNG: Natriumazid ist giftig; Verwenden Sie eine Abzugshaube und Handschuhe.
3. Der Assay, der die Wechselwirkung zwischen GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 und Hsp90 C-terminales Peptid und Hemmung mit Verbindungen mit kleiner Molekülmasse untersucht (Abbildung 2C)
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GST-markierte Proteine, die mit Glutathion-Spenderperlen interagieren
- Richten Sie die Reaktionen in 384-Well-Platten ein.
- Bereiten Sie die Lösung mit 10 μg/ml der Glutathionspenderperlen in 0,5x PBS, pH 7,4 vor.
HINWEIS: Nach längerer Lagerung setzen sich die Perlen ab und müssen vorgetexed werden. - GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 wird zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml hinzugefügt.
- Im Dunkeln bei 25 °C 10 min inkubieren.
HINWEIS: In diesem Schritt interagieren GST-markierte Proteine mit Glutathion, das an die Perlen gebunden ist. Für jede Vertiefung werden 22,5 μL dieser Mischung verwendet. Die Konzentration der Bindungspartner muss empirisch bestimmt werden. Titrieren Sie GST-FKBP51 und GST-FKBP52 und wählen Sie die Konzentration, die das beste Signal liefert.
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Zusammengesetzte Zugabe
- Machen Sie serielle Verdünnungen von Testverbindungen in DMSO.
HINWEIS: Die verwendeten Konzentrationen betragen typischerweise 10, 30, 100, 300, 1.000 und 3.000 μM. - Fügen Sie 0,25 μL DMSO (Negativkontrolle) oder Hsp90 C-terminales Peptid (Positivkontrolle, 30 μM) oder Verbindungen in DMSO in die Ecke jeder Vertiefung der Platte hinzu. Verwenden Sie Triplikate für jede Verbindungskonzentration.
- Fügen Sie 22,5 μL der Lösung, die Glutathion-Spenderperlen mit GST-markierten Proteinen enthält, zu jeder Vertiefung hinzu.
- Schütteln Sie den Teller vorsichtig mit der Hand, aber gründlich. Im Dunkeln bei 25 °C 15 min inkubieren.
HINWEIS: Während dieser Zeit interagieren Verbindungen mit der TPR-Domäne an der Hsp90 C-terminalen Peptidbindungsstelle.
- Machen Sie serielle Verdünnungen von Testverbindungen in DMSO.
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Akzeptorperlenzusatz
- Verdünnen Sie die Akzeptorperlen mit angehängtem Hsp90 C-terminalem Peptid auf 100 μg/ml in 0,5x PBS.
- Fügen Sie 2,25 μL verdünnte Akzeptorperlen zu jeder Vertiefung hinzu.
- Sanft aber gründlich mischen. Im Dunkeln bei 25 °C 15 min inkubieren.
HINWEIS: In diesem Schritt werden Spender- und Akzeptorperlen durch die Protein-Peptid-Interaktionen in die Nähe gebracht. Das Endvolumen des Reaktionsgemisches beträgt 25 μL. Daher liegen die Endkonzentrationen der Verbindungen zwischen 0,1 und 30 μM.
-
Plattenlesung
HINWEIS: Lesen Sie die Platte mit einem Plattenleser, der im entsprechenden Modus eingestellt ist.- Schalten Sie das Instrument ein und öffnen Sie die Software
- Wählen Sie das entsprechende Protokoll aus.
- Klicken Sie auf Plattenkarte bearbeiten und wählen Sie das in der Platte verwendete Bohrmittel für die Messung aus.
- Klicken Sie auf Weiter, um fortzufahren, und führen Sie das ausgewählte Protokoll aus.
- Klicken Sie nach der Messung auf Ergebnisse anzeigen, um die Ergebnisse anzuzeigen.
- Exportieren Sie die Daten.
4. Datenanalyse
-
Z-Faktor und Signal-Hintergrund-Verhältnis (S/B)
- Berechnen Sie den Z'-Faktor und das S/B-Verhältnis für den Assay mit der folgenden Gleichung:
Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
S/B=μneg/μpos
wobei σ und μ die Standardabweichungen und Mittelwerte der positiven (Hsp90 C-terminales Peptid, 30 μM) bzw. negativen (DMSO) Kontrollen darstellen. Ein Z'-Faktor > 0,5 stellt sicher, dass der Assay robust genug für das Screening ist. Zur Überwachung der Assay-Sensitivität wurde auch das S/B-Verhältnis berechnet.
- Berechnen Sie den Z'-Faktor und das S/B-Verhältnis für den Assay mit der folgenden Gleichung:
-
Dosis-Wirkungs-Kurve und IC 50
HINWEIS: Verwenden Sie die nichtlineare Regressionsanalyse, um die Daten von Hsp90-Cochaperon-PPI-Inhibitoren per Software anzupassen.- Erstellen Sie eine XY-Datentabelle im Begrüßungsdialogfeld, und wählen Sie X-Zahlenaus, und Y Geben Sie 3 ein (wenn tripliziert), replizieren Sie Werte in nebeneinander gelegenen Spalten.
- Normalisieren Sie die Signaldaten der Proben in die negative Kontrollgruppe. Importieren Sie Konzentrationswerte in die Spalte X und die Signalwerte in die Spalte Y.
- Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie unter | transformieren die Option Konzentration transformieren (X) Normalisieren. Wählen Sie Transform to Logarithms.
HINWEIS: Dadurch wird die Konzentration in eine Protokollskala transformiert. Wenn Ihre Anfangskonzentration Null ist, setzen Sie sie auf eine sehr kleine Zahl, die effektiv Null ist (z. B. 0,1 nM), um diese Werte nicht zu verlieren, da der Logarithmus von Null nicht definiert ist. - Klicken Sie auf Analysieren und wählen Sie Unter XY-Analysendie Option Nichtlineare Regression (Kurvenpassung), öffnen Sie die Dosis-Wirkungs-Hemmung und wählen Sie Log(Inhibitor) vs. Response -- Variable Steigung.
- Klicken Sie auf OK, um die Ergebnisse (mit ic50-Wert) und die Diagrammeanzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung dieses Protokolls. (A) Ausdruck und Reinigung von GST-FKBP51 und GST-FKBP52. (B) Kopplung des Hsp90 C-terminalen Peptids an die Akzeptorperlen. (C) Der Assay, der die Wechselwirkung zwischen GST-FKBP51 oder GST-FKBP52 und Hsp90 C-terminales Peptid untersucht. Hemmung mit Verbindungen mit geringer Molekülmasse. Erstellt mit BioRender.com Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Representative Results
In unserem Assay liegen der Z-Faktor und das S/B-Verhältnis bei 0,82 bzw. 13,35 (Abbildung 3A), was zeigt, dass unser Assay robust und zuverlässig für das Hochdurchsatz-Screening ist. Wir haben es dann verwendet, um Verbindungen mit kleiner molekularer Masse zu screenen. Abbildung 3B zeigt die dosisabhängige Hemmung von Chaperon-Cochaperon-Wechselwirkungen mit einem ausgewählten kleinen Molekül (D10). Die Dosis-Wirkungs-Kurven für D10 werden durch nichtlineare Regressionsanalyse generiert, auf deren Grundlage die Werte von IC50 berechnet werden. D10 zeigt eine dosisabhängige Hemmung sowohl auf Hsp90 - GST-FKBP51 als auch auf Hsp90 - GST-FKBP52 PPIs. Die Werte von IC50 sind jedoch unterschiedlich: Sein IC50 für Hsp90 - GST-FKBP51-Wechselwirkungen beträgt 65 nM, während für Hsp90-GST-FKBP52-Wechselwirkungen bei der höchsten Verbindungskonzentration (100 μM) keine vollständige Hemmung erreicht wurde, sein IC50 wird auf > 30 μM geschätzt. Diese Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass eine selektive Hemmung von Hsp90-HKBP51- oder Hsp90-FKBP52-PPIs mit kleinen Molekülen erreicht werden kann (TPR-Domänen von FKBP51 und FKBP52 haben eine Sequenzidentität von 60% und > 80% Sequenzähnlichkeit), und dieser Assay kann für dieses Screening angewendet werden.
Abbildung 3: Assay-Analyse und Ergebnisse. (A) Z'-Faktor und Signal-Hintergrund-Verhältnis (S/B) dieses Assays. Die Daten stellen Signale der (○) Positivkontrolle (Hsp90 C-terminales Peptid, 30 μM) und (●) Negativkontrolle (DMSO) aus 48 Vertiefungen dar. Aus diesen beiden Datenpopulationen wurden ein Z'-Wert von 0,82 und ein S/B-Verhältnis von 13,35 berechnet. (B) Die Hemmung der ausgewählten Verbindung (D10) auf Wechselwirkungen von Hsp90 mit FKBP51 (●) oder FKBP52 (○) in diesem Assay. D10 hemmt Hsp90-FKBP51 oder Hsp90-FKBP52 dosisabhängig. Sein IC50 ist 65 nM für Hsp90-FKBP51-Interaktion, aber über 30 μM für Hsp90-FKBP52-Interaktion. Die Daten werden auf die Kontrollgruppe normalisiert und als Mittel ± SEM ausgedrückt.
| Reaktionskomponente | Volumen (μL) |
| PCR-Puffer (5 x Konzentrat) | 4 |
| Vorwärts Grundierung | 1 |
| Umgekehrte Grundierung | 1 |
| Plasmid | 0.5 |
| dNTP-Mix (je 10 mM) | 0.5 |
| Phusion DNA Polymerase | 0.5 |
| Wasser (DNA-Grad) | 12.5 |
| Gesamt | 20 |
Tabelle 1: PCR-Reaktion für die humane FKBP51- und FKBP52-DNA-Amplifikation.
| Bühne | Temperatur (°C) | Zeit | Zyklen |
| Anfängliche Denaturierung | 94 | 3 Min. | 1 |
| Denaturierung | 94 | 30 Sek. | 35 |
| Glühen | 56 | 30 Sek. | |
| Erweiterung | 72 | 1 Min. | |
| Endgültige Erweiterung | 72 | 5 Min. | 1 |
| Hinweis: Die Deckeltemperatur beträgt 105 °C. |
Tabelle 2: Thermocylerbedingungen für die menschliche FKBP51- und FKBP52-DNA-Amplifikation.
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Discussion
Hier beschreiben wir ein Protokoll mit dem Assay zum Screening kleiner Moleküle, die Wechselwirkungen zwischen Hsp90 und TPR-Motiv-Co-Chaperonen, insbesondere FKBP51 und FKBP52, hemmen. Sein hoher Z'-Wert (>0,8) zeigt die Robustheit und Zuverlässigkeit für ein Format mit hohem Durchsatz. Ergebnisse können innerhalb einer Stunde erzielt werden, und kleine Mengen an Perlen, Protein und Verbindungen sind erforderlich. Darüber hinaus könnte dieses Protokoll leicht auf alle Hsp90 / Hsp70 - TPR-Motiv-Co-Chaperon-Interaktionen von Interesse erweitert werden. Mehrere TPR-Motiv-Co-Chaperone von Hsp90 wurden an verschiedenen menschlichen Erkrankungen beteiligt, die von der Alzheimer-Krankheit bis hin zu Autoimmunerkrankungen, Krebs usw. reichen. Das hier beschriebene Protokoll bietet einen in vitro robusten und kostengünstigen Assay für das Hochdurchsatz-Screening von kleinen Molekülen, die Chaperon-Cochaperon-Interaktionen von hoher medizinischer Bedeutung hemmen.
Darüber hinaus müssen Medikamente, die auf TPR-Domänen abzielen und die Interaktion mit Hsp90 hemmen, nicht nur auf ihre Affinität zum Ziel, sondern auch auf ihre Selektivität gegenüber anderen TPR-Motivproteinen untersucht werden. Das menschliche Genom kodiert > 20 TPR-Motivproteinen, die mit dem C-terminalen Peptid Hsp90 interagieren können. Dieser Assay mit Glutathionperlen und GST-markierten Proteinen ermöglicht die Beurteilung der Arzneimittelwirkung auf mehrere bindende TPR-Partner. Unser Labor verfügt über eine Bibliothek von 20 menschlichen TPR-Proteinen in ihrer GST-markierten Form und kann Affinitäts- und Selektivitätsprofile für jedes getestete kleine Molekül erhalten.
Es wurde bereits gezeigt, dass PPI zwischen Hsp90 und TPR-Co-Chaperonen durch das C-terminale Peptid von Hsp90 vermittelt wird; die Streichung von Hsp90 C-Terminus hebt die Bindung von TPR-Motiv-Co-Chaperonen6vollständig auf. Wir haben herausgefunden, dass Verbindungen, die in unserem Assay, in dem das Hsp90 C-terminale Peptid verwendet wurde, effizient waren, auch die Wechselwirkung von Hsp90 in voller Länge mit GST-FKBP51/52 in einem Pull-Down-Assay unter Verwendung von Glutathion-Sepharose-Perlen hemmen konnten (Daten nicht gezeigt). Einige der ausgewählten Verbindungen zeigen auch die Bindungsaffinität mit FKBP51 durch Oberflächenplasmonenresonanztechnologie, und ihre spezifischen Bindungsstellen, die durch Cokristallisation bestimmt werden, werden derzeit untersucht.
Ein kritischer Schritt in unserem Protokoll ist die Reihenfolge der Addition; Wir bilden zunächst einen Komplex zwischen einem kleinen Molekül und seinem TPR-Ziel. Wenn bereits Komplexe zwischen FKBP51 und Hsp90 C-terminales Peptid gebildet wurden, sind längere Inkubationszeiten und höhere Wirkstoffkonzentrationen erforderlich, um die PPIs aufzubrechen. Dies ist hauptsächlich auf das sterische Hindernis der Perle zurückzuführen, das den Zugang von Molekülen zum Interaktionsort einschränkt.
Es ist möglich, TPR-Proteine und Hsp90 C-terminale Peptide kovalent an Donor- bzw. Akzeptorperlen zu koppeln und PPIs direkt zu untersuchen. Es wird jedoch nicht empfohlen, beide Bindungspartner kovalent an die Perlen zu binden, da die Bewegung der Moleküle in Lösung die Kinetik der Wechselwirkungen reduziert. Dies erhöht auch das Risiko einer sterischen Behinderung aufgrund der Perlengröße. Daher wählen wir akzeptorperlen in Verbindung mit Hsp90 C-terminalem Peptid und Glutathion-Spenderperlen, die mit GST-markierten Proteinen in unserem Assay interagieren, wo mehrere TPR-Partner bewertet werden können.
In diesem Assay ist es wahrscheinlich, dass einige identifizierte Verbindungen aufgrund ihrer Interferenz mit der Assay-Technologie falsch-positiv sein können, wie z. B. das Abschrecken von Singuleinsauerstoff, das Abschrecken von Licht und das Streuen von Licht. Falsch-positive Ergebnisse können auch induziert werden, indem die Bindung des GST-Tags mit Glutathionspenderperlen gestört wird. Diese falsch-positiven Ergebnisse können vermieden werden, wenn Moleküle sowohl auf Hsp90-FKBP51- als auch auf Hsp90-FKBP52-PPIs überprüft werden, um selektive Inhibitoren zu identifizieren. Andere Methoden zum Nachweis von PPI sollten ebenfalls angewendet werden, um die ausgewählten Inhibitoren zu überprüfen.
Die Einschränkung unseres Assays besteht darin, dass er nicht verwendet werden kann, um die Wechselwirkung zwischen Hsp90- und TPR-Motiv-Co-Chaperonen in rohen biologischen Proben wie Zelllysaten nachzuweisen. Nach dem Hochdurchsatz-Screening müssen die Hemmungen ausgewählter Verbindungen auf Hsp90 - TPR-Motiv-Co-Chaperone PPI in biologischen Proben durch andere Methoden wie Co-Immunpräzipitation und Proximity-Ligation-Assay verifiziert werden.
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Disclosures
Die Autoren berichten von keinen Interessenkonflikten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse des Schwedischen Forschungsrats (2018-02843), der Brain Foundation (Fo 2019-0140), der Foundation for Geriatric Diseases am Karolinska Institutet, der Gunvor and Josef Anérs Foundation, der Magnus Bergvalls Foundation, der Gun and Bertil Stohnes Foundation, der Tore Nilssons Foundation for Medical Research, der Margaretha af Ugglas Foundation und der Foundation for Old Servants unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
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