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Immunology and Infection

Software de aquisição de dados totalmente automatizado para microscopia crio-elétron de partículas únicas

Published: July 29, 2021 doi: 10.3791/62832
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

Summary

A microscopia crio-elétron de partículas únicas exige um pacote de software adequado e um pipeline fácil de usar para aquisição automática de dados de alto rendimento. Aqui, apresentamos a aplicação de um pacote de software de aquisição de imagens totalmente automatizado, o Latitude-S, e um pipeline prático para coleta de dados de biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.

Abstract

Nos últimos anos, avanços tecnológicos e metodológicos na microscopia crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) abriram um novo caminho para a determinação da estrutura de alta resolução de macromoléculas biológicas. Apesar dos avanços notáveis no crio-EM, ainda há espaço para melhorias em vários aspectos do fluxo de trabalho de análise de partículas únicas. A análise de partículas únicas exige um pacote de software adequado para aquisição automática de dados de alto rendimento. Vários pacotes automáticos de software de aquisição de dados foram desenvolvidos para imagens automáticas para crio-EM de uma única partícula nos últimos oito anos. Este artigo apresenta a aplicação de um pipeline de aquisição de imagens totalmente automatizado para biomoléculas vitrificadas em condições de baixa dose.

Ele demonstra um pacote de software, que pode coletar dados crio-EM de forma completa, automática e precisa. Além disso, vários parâmetros microscópicos são facilmente controlados por este pacote de software. Este protocolo demonstra o potencial deste pacote de software em imagens automatizadas da proteína de pico da síndrome respiratória aguda grave-coronavírus 2 (SARS-CoV-2) com um microscópio crio-elétron de 200 keV equipado com um detector de elétrons direto (DED). Cerca de 3.000 imagens de filmes crio-EM foram adquiridas em uma única sessão (48 h) de coleta de dados, produzindo uma estrutura de resolução atômica da proteína de pico do SARS-CoV-2. Além disso, este estudo estrutural indica que a proteína do pico adota duas principais conformações, 1-RBD (domínio de ligação receptora) abertas e todas as conformidades fechadas de RBD.

Introduction

Crio-EM de partículas únicas tornou-se uma técnica de biologia estrutural convencional para determinação de estrutura de alta resolução de macromoléculas biológicas1. A reconstrução de partículas únicas depende da aquisição de um grande número de micrografos de amostras vitrificadas para extrair imagens de partículas bidimensionais (2D), que são então usadas para reconstruir uma estrutura tridimensional (3D) de uma macromolécula biológica2,3. Antes do desenvolvimento dos DEDs, a resolução obtida a partir da reconstrução de partículas únicas variou entre 4 e 30 Å4,5. Recentemente, a resolução alcançável do crio-EM de partículas únicas ultrapassou 1,8 Å6. O DED e o software automatizado de aquisição de dados têm sido os principais contribuintes para esta revolução de resolução7, onde a intervenção humana para a coleta de dados é mínima. Geralmente, a imagem crio-EM é realizada a baixas taxas de dose de elétrons (20-100 e/Å2) para minimizar os danos causados pela radiação induzida pelo feixe de elétrons de amostras biológicas, o que contribui para a baixa relação sinal-ruído (SNR) na imagem. Este baixo SNR impede a caracterização das estruturas de alta resolução das macromoléculas biológicas utilizando análise de partículas únicas.

Os detectores de elétrons de nova geração são detectores baseados em CMOS (complementar metal-óxido-semicondutor), que podem superar esses obstáculos relacionados ao SNR baixos. Essas câmeras CMOS de detecção direta permitem leitura rápida do sinal, devido à qual a câmera contribui com melhor função de spread de ponto, SNR adequado e excelente eficiência quântica de detetive (DQE) para macromoléculas biológicas. As câmeras de detecção direta oferecem alto SNR8 e baixo ruído nas imagens gravadas, resultando em um aumento quantitativo na eficiência quântica detetive (DQE)-uma medida de quanto ruído um detector adiciona a uma imagem. Essas câmeras também gravam filmes à velocidade de centenas de quadros por segundo, o que permite a aquisição rápida de dados9,10. Todas essas características tornam as câmeras de detecção direta rápida adequadas para aplicações de baixa dose.

As imagens de pilha corrigidas por movimento são usadas para o processamento de dados para calcular a classificação 2D e reconstruir um mapa de densidade 3D de macromoléculas usando vários pacotes de software como RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 e EMAN215. No entanto, para análise de partículas únicas, é necessário um enorme conjunto de dados para alcançar uma estrutura de alta resolução. Portanto, pedágios automáticos de aquisição de dados são altamente essenciais para a coleta de dados. Para registrar grandes conjuntos de dados crio-EM, vários pacotes de software foram usados na última década. Pacotes de software dedicados, como AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS e EPU, foram desenvolvidos para aquisição automatizada de dados.

Esses pacotes de software usam tarefas rotineiras para encontrar posições de furos automaticamente, correlacionando as imagens de baixa ampliação a imagens de alta ampliação, que auxilia na identificação de buracos com gelo vítreo de espessura de gelo apropriado para aquisição de imagens em condições de baixa dose. Esses pacotes de software reduziram o número de tarefas repetitivas e aumentaram o throughput da coleta de dados crio-EM, adquirindo uma vasta quantidade de dados de boa qualidade por vários dias continuamente, sem qualquer interrupção e a presença física do operador. Latitude-S é um pacote de software similar, que é usado para aquisição automática de dados para análise de partículas únicas. No entanto, este pacote de software só é adequado para DEDs K2/K3 e é fornecido com estes detectores.

Este protocolo demonstra o potencial do Latitude-S na aquisição automatizada de imagem da proteína de pico SARS-CoV-2 com um detector de elétrons direto equipado com um crio-EM de 200 keV (ver a Tabela de Materiais). Usando esta ferramenta de coleta de dados, 3.000 arquivos de filme de proteína de pico SARS-CoV-2 são automaticamente adquiridos, e mais processamento de dados é realizado para obter uma estrutura de proteína de pico de resolução 3.9-4.4 Å.

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Protocol

NOTA: Três passos importantes são necessários para a coleta de dados crio-EM: 1. preparação da grade crio-EM, 2. calibração e alinhamento do microscópio, 3. coleta automática de dados (Figura 1). Além disso, a coleta automatizada de dados é subdividida em uma. seleção de área adequada, b. otimização do Latitude-S, c. iniciar a seleção automática de furos e d. iniciar a aquisição automática de dados (Figura 1).

1. Preparação da grade Cryo-EM e carregamento de amostras para aquisição automática de dados

  1. Limpe as grades usando um descarregador de brilho e varie os parâmetros de descarga de brilho com base em requisitos experimentais (aqui, 60 s a 20 mA).
  2. Adicione uma amostra de proteína recém-preparada (3 μL) à grade descarregada por brilho e incubar por 10 s.
  3. Borrique as grades para 3-5 s a 100% de umidade e rapidamente mergulhe-as em etano líquido usando um crio-êmbolo.
  4. Fixar as grades manualmente em um anel de corte para formar o cartucho usando um anel flexível de clipe C.
  5. Carregue as grades congeladas montadas no do carregador automático e transfira o pela tampa nano para o carregador automático pré-cozido do microscópio para coleta de dados.

2. Ajuste de microscópio e alinhamento básico antes da aquisição automática de dados

  1. Mudança de viga
    1. Clique em Deslocar feixe da guia Alinhamento Direto .
    2. Reduza a ampliação e centrale o feixe para o eixo óptico usando o botão Multifuncional X e Y .
  2. Alinhamento de ponto pivô
    1. Clique na opção inclinação do feixe em Alinhamento Direto pp X da guia Alinhamento Direto .
    2. Condensar o feixe a um ponto e minimizar o movimento usando o botão Multifuncional X e Y .
  3. Centro de abertura C2
    1. Selecione a abertura do condensador na guia Alinhamento .
    2. Condensar o feixe a um ponto, centralizar o feixe para o eixo óptico e, em seguida, expandir o feixe para cobrir o círculo uniformemente.
    3. Repita estas etapas até que a abertura do Condensador 2 seja ajustada.
  4. Alinhamento sem coma
    1. Clique em Alinhamento X livre de coma da guia Alinhamento Direto para alinhar o feixe ao eixo óptico.
    2. Use o botão Multifuncional para minimizar a forma e o movimento do FFT (certifique-se de que está estável).
    3. Repita o mesmo procedimento para coma - alinhamento livre Y.
  5. Defina a iluminação paralela antes da coleta de dados no crio-EM por causa da lente c gêmea.
    1. Insira a abertura objetiva (70 μm) no modo de difração.
    2. Concentre a abertura objetiva no plano focal dianteiro da lente de difração controlando o botão de intensidade de desfocus (lente objetiva e corrente de lente C2).
    3. Certifique-se de que a borda nítida da abertura objetiva seja vista após o desfoque adequado.
    4. Insira a rolha do feixe e espalhe a intensidade até que os anéis de difração em pó de ouro sejam minimizados.
      NOTA: Se o feixe estiver bem espalhado, um anel claro de difração do pó de ouro será visível na tela, o que indica que o feixe é paralelo.
    5. Retraia a rolha do feixe após definir a iluminação paralela e altere o modo microscópio para a sonda Nano.
      NOTA: Verifique o ajuste do microscópio antes de iniciar a coleta de dados para garantir o melhor desempenho do microscópio. Todas essas configurações seriam realizadas na guia GUI de alinhamento direto do microscópio. Toda a sintonia do microscópio é realizada usando uma grade de teste antes da coleta de dados.

3. Aquisição de dados com Latitude-S

  1. Inicie o software automatizado de aquisição de dados Latitude-S.
    NOTA: A instalação do Latitude-S também requer calibração do microscópio, que será realizada antes da coleta de dados, e as configurações serão armazenadas permanentemente. Cinco estados diferentes para coleta de dados são calibrados com quatro ampliações diferentes (Figura 1 e Figura 2). O estado do Atlas e o estado da rede estão em duas ampliações diferentes no modo LM (faixas de baixa ampliação). O estado do orifício está no modo SA (faixas de alta ampliação), mas com uma ampliação moderada. O foco e o estado de dados usam o modo SA de alta ampliação.
    1. Clique no DigitalMicrograph no menu Iniciar ou clique duas vezes no ícone DigitalMicrograph na área de trabalho.
    2. Selecione o ícone de gerenciador de técnicas do DigitalMicrograph.
      NOTA: Este sistema mostrará os ícones TEM e Latitude-S (Figura 2 e Figura Suplementar S1).
    3. Selecione o ícone Latitude-S para coleta de dados automatizados de partículas únicas.
      NOTA: A câmera K2 opera em três modos: linear/integrado, contado e super-resolução. O usuário pode selecionar qualquer modo na interface do DigitalMicrograph. As imagens de dados podem ser salvas como pilhas de imagens fracionadas por dose ou como imagens resumidas em arquivos MRC, TIF ou .dm4 com diferentes profundidades de bits. Além disso, os dados podem ser salvos como imagens corrigidas por movimento para a câmera K3. Em uma câmera K2, uma pilha de imagens não processadas poderia ser salva como mrc de 4 bits, TIF de 8 bits ou arquivos .dm4 de 8 bits.
  2. Crie uma nova sessão com base nas configurações de uma sessão anterior.
    1. Verifique a caixa de seleção de sessão anterior na paleta.
    2. Selecione o botão Novo .
    3. Escolha a pasta que contém a sessão em que as configurações da nova sessão estão baseadas. Vá ao diretório da sessão anterior para criar a nova sessão. Escolha a pasta para salvar a nova sessão e os dados associados.
    4. Selecione e escolha a pasta onde a nova sessão e os dados associados serão salvos.
      NOTA: Cada estado e suas configurações subjacentes (ampliação, condições de iluminação, imagem ou projetor) e parâmetros de mudança de feixe e câmera (exposição total, exposição de quadro único e binning) serão exportados da sessão existente para a nova sessão. O caminho da pasta é mostrado como uma sequência de texto na parte inferior da paleta. Cada um dos estados e paletas de configuração tem um asterisco (*) anexado ao título para mostrar que ele já foi configurado e está pronto para usar.
  3. Continue uma sessão existente.
    1. Pressione o botão Continuar na paleta para continuar uma sessão existente.
      NOTA: A montagem do atlas não pode ser modificada.
    2. Escolha e navegue até a pasta que contém a sessão que precisa ser continuada.
  4. Comece uma sessão totalmente nova.
    1. Clique em Nova guia na paleta. Escolha a pasta que contém a sessão a ser continuada. Selecione uma pasta para salvar os dados.
      NOTA: O nome da pasta padrão é construído usando a data e a hora.
    2. Clique no ícone Configuração . Na caixa de exploração do estado Gerenciar que aparece, adicionar estado, definir a condição TEM, a condição da câmera e imagem/pilha e, em seguida, nomear o estado.
      NOTA: O fluxo de trabalho automatizado de aquisição de dados utiliza 5 estados diferentes para coleta automatizada de dados. Esses estados são configurados e armazenados em suas respectivas paletas de estado. O resumo do estado é dado na Tabela 1.
  5. Configure o estado atlas.
    1. Clique na paleta de estado atlas.
    2. Configure o estado atlas com os seguintes parâmetros: ampliação 115x modo LM em nano sonda, condições de iluminação tamanho 8 e brilho 934400, binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1.0 s para imagem em baixa ampliação. Consulte o resumo do estado dado na Tabela 1.
    3. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O estado da Atlas é o estado de ampliação mais baixo, o que fornece o levantamento de toda a rede (Figura Suplementar S2). Geralmente, este estado nos ajuda a visualizar as grades inteiras em baixa ampliação e julgar a espessura do gelo, o achatamento e o quadrado quebrado das grades. Recomenda-se gerar o atlas em diferentes áreas da rede para observar a espessura ideal do gelo e a espessura do gelo subótimo das grades (Figura Suplementar S3). Os parâmetros mencionados podem ser variados de acordo com as necessidades do usuário.
  6. Configure o estado da rede.
    1. Clique na paleta de estado Grade.
    2. Configure o estado da grade com as seguintes ópticas de imagem do microscópio (modo de ampliação 380x LM na sonda Nano), condições de iluminação (tamanho do ponto: 8 e brilho 626.200), binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1,0 s.
    3. Consulte o resumo do estado latitude-S fornecido na Tabela 1.
    4. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O estado da rede é definido em uma ampliação superior ao atlas afirma que o campo de visão é um quadrado de grade (Figura 2). Nesta ampliação particular, observa-se uma grade quadrada. Portanto, os orifícios são observados corretamente nesta ampliação, o que ajuda a verificar a espessura do gelo dos orifícios (Figura Suplementar S4). Um simples filtro de bandpass é usado no estado de grade para localizar os furos na grade de patentes. Os parâmetros mencionados podem ser variados de acordo com as necessidades do usuário.
  7. Configure o estado do buraco.
    1. Clique na paleta de furos.
    2. Configure o estado do orifício com as seguintes configurações do microscópio: óptica de imagem (ampliação 4500x modo SM na sonda Nano), condições de iluminação (tamanho do ponto: 7 e diâmetro do feixe 8,81 μm), binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1,0 s.
    3. Altere os parâmetros se necessário com base no tipo de grade. Consulte o resumo do estado fornecido na Tabela 1.
    4. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O modo SA indica uma faixa de alta ampliação no microscópio eletrônico. O estado do orifício está na faixa de ampliação SA com um campo de visão de alguns micrômetros (10-20 μm) (Figura 2 e Figura Suplementar S4). Esta faixa de ampliação é maior do que o estado atlas ou grid, mas muito menor do que o estado Focus/Data. Nesta ampliação, os buracos individuais serão visíveis. O tamanho do buraco é apropriado para observar altos graus de contaminações, buracos vazios e a espessura adequada do gelo dos buracos. Os furos para imagem são selecionados com base nessas suposições. Dois filtros são usados no estado do orifício: um para correlacionar uma imagem de referência de orifício com uma nova imagem de orifício e outro para ajustar a altura do palco à altura eucêntrica.
  8. Configure o estado de foco.
    1. Clique na paleta Focus.
    2. Configure o estado de foco com as seguintes configurações do microscópio: óptica de imagem (ampliação 45.000x modo SA em nanodusa), condições de iluminação (tamanho do ponto: 8 e brilho 934400), binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1,0 s.
    3. Concentre-se na área de carbono amorfa perto do buraco. Consulte o resumo do estado latitude-S fornecido na Tabela 1.
    4. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O modo SA indica uma faixa de alta ampliação no microscópio eletrônico. O estado Focus é a ampliação da faixa de SA mais alta. No modo de foco, o feixe é deslocado para uma área de carbono próxima do orifício alvo e executa o foco automaticamente para coletar os dados no estado de dados. Um filtro de bandpass combinado com um filtro retangular macio ou hanning é usado no estado de foco para medir o deslocamento entre duas imagens de estado de foco da mesma área (Figura 2). Os parâmetros mencionados podem ser variados de acordo com as necessidades do usuário.
  9. Configure o estado de dados.
    1. Clique na paleta Data.
    2. Configure o estado de dados com as seguintes configurações de microscópio: óptica de imagem (por exemplo, ampliação 28.000x, 45.000x, 54.000x no modo SA em nano sonda), condições de iluminação (tamanho do ponto: 8 e brilho 934400), binning: 1 e tempo de exposição da câmera: 1.0 s.
    3. Consulte o resumo do estado latitude-S dado na Tabela 1.
    4. Clique em Next para passar para o próximo estado.
      NOTA: O estado de dados é a maior ampliação selecionada com base nos requisitos de tamanho do pixel e resolução de destino (Figura 2). Geralmente, após o foco, o feixe é automaticamente deslocado para a área alvo para coletar os dados. Os parâmetros acima mencionados podem ser alterados com base nos requisitos do usuário.

4. Configuração de foco

  1. Clique na paleta de configuração Focus. Especifique a faixa de valores de desfoco e o tamanho da etapa na guia dada.
  2. Pressione o próximo botão para passar para o próximo passo.
    NOTA: Valores de desfoco mais baixos podem ser usados para aquisição de dados de alta resolução. Geralmente, valores de desfoco de -0,5 a -3,0 μm com tamanhos de passo de 0,25 ou 0,5 desfoque são usados para aquisição de imagens. Os usuários podem pular a etapa de configuração do foco se quiserem apenas exibir a amostra. Basta pressionar o botão Next na paleta para pular a etapa de configuração de foco.

5. Alinhamento fino

  1. Foco em algumas características na rede (por exemplo, contaminação por gelo no gelo); ver Figura 3.
    NOTA: Os recursos não devem ser muito grandes ou muito pequenos. Eles devem ser visíveis tanto na ampliação do estado atlas 115x (modo LA) quanto na ampliação de dados.
  2. Clique no botão Capturar . Posicione a marca da cruz vermelha na mesma característica em cada imagem de estados diferentes.
  3. Comece com foco, dados e estados de buracos porque seu campo de visão é muito maior do que os estados atlas e grade. Zoom nos estados atlas e grade para posicionar a marca da cruz vermelha no mesmo recurso nos estados atlas e grade.
  4. Clique no botão Calcular para calcular as posições de cinco estados diferentes, que calcularão as compensações entre cada um dos estados e as refletirão para a janela de saída.
    NOTA: Os valores de deslocamento são integrados aos estados para uso posterior (Figura 3). O alinhamento fino é realizado para proporcionar alta precisão da posição de cada estado (Figura 3). Este alinhamento fino ajuda a identificar a posição exata em todos os cinco estados. O Fine Alignment é fundamental para a aquisição de dados de partículas únicas. Portanto, é altamente recomendável realizar o Alinhamento Fino antes da imagem.

6. Procedimento de aquisição de dados utilizando Latitude-S

  1. Clique na paleta Capturar.
    NOTA: Geralmente, os dados do atlas são coletados em baixa ampliação (115x) para visualizar a maioria dos quadrados da grade.
  2. Escolha o tamanho do atlas para cobrir toda a grade ou parte da grade com base no requisito (por exemplo, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8, ou 8 x 12).
    NOTA: o tamanho do atlas de 16 por 16 cobre toda a grade.
  3. Clique no botão Capturar para capturar o atlas.
    NOTA: A principal janela de navegação Latitude-S abre e preenche o espaço disponível no DigitalMicrograph (Figura Suplementar S5). Três painéis de imagem na janela de navegação principal mostram imagens dos estados do sistema em três ampliações diferentes. O atlas global é atualmente exibido em seu estado atual de aquisição no painel mais à esquerda. As telhas no atlas se encherão à medida que cada captura ocorrer.
  4. Selecione o quadrado da grade com base na espessura do gelo navegando no atlas (Figura Suplementar S5). Uma vez selecionados os quadrados de grade desejados, clique no botão Agendar e observe os azulejos no quadrado da grade enquanto cada quadrado de grade é capturado.
  5. Clique no botão Agendar uma vez que os quadrados da grade sejam selecionados.
  6. Selecione um orifício representativo no quadrado da grade adicionando sua posição. Uma vez que uma imagem de furo é adquirida, defina os dados e as posições de foco e salve o layout como um modelo (Figura Suplementar S6).
  7. Clique em Auto find, dê o tamanho do furo (por exemplo, R1.2/1.3) e clique no botão Encontrar no programa, o que fará com que o programa Find encontre automaticamente os furos com base no diâmetro do orifício. Em seguida, clique no botão Marcar para adicionar o modelo (Figura 4) e adicione marcas de círculo vermelho em todos os orifícios em uma grade ou quadrado parcial da grade.
  8. Configure a intensidade para remover os orifícios do quadrado da rede e contaminação do gelo (Figura 4).
    NOTA: Finalmente, os orifícios selecionados serão marcados em amarelo para agendamento da coleta de dados.
  9. Clique no botão Agendar tarefas do Latitude depois de adicionar os furos através do Auto find.
    NOTA: Antes de agendar a coleta automatizada de dados, certifique-se de que o nível do tanque de nitrogênio líquido seja suficiente, a bomba turbo do carregador automático está desligada e o espaço de acionamento RAID é livre. O gerente de tarefas latitude-S mostra o número de estados de atlas, grid square, hole e data programados para coleta de dados (Figura 5). Na GUI Latitude-S, vários esquemas de cores serão visíveis, e o significado dos diferentes esquemas de cores será exibido: 1. Amarelo indica não programado; 2. O verde indica programado; 3. Azul indica Adquirido; 4. Vermelho indica falha.

7. Processamento de dados Cryo-EM

NOTA: O processamento de imagem crio-EM da proteína de pico é descrito em detalhes na literatura recente25.

  1. Realize o processamento de imagem da proteína de pico de SARS-CoV2 usando RELION 3.011.
  2. Tela as imagens do filme coletadas usando latitude-S manualmente e executa correção de movimento induzida por feixe dos filmes individuais usando software MotionCor29. Realize a triagem inicial dos micrografos corrigidos por movimento manualmente com a ajuda do pacote de software cisTEM14.
    NOTA: Quase 85% dos micrografos adquiridos automaticamente eram de boa qualidade, e os dados tinham sinal dentro de 3,7-5,2 Å, que é calculado utilizando o software cisTEM14 (Figura Suplementar S7A,B).
  3. Processe os dados usando o pacote de software RELION 3.011.
    1. Escolha partículas de espigão manualmente e submá-las à classificação de classe 2D (Figura Suplementar S7C). Use a melhor classe 2D como referência ao autopick 3.99.842 partículas de pico único dos micrografos usando a ferramenta de autopick RELION11.
      NOTA: Foram realizadas três rodadas de classificação 2D antes de submeter as partículas à classificação 3D (Figura Suplementar S8). Aproximadamente 2.55.982 partículas individuais foram selecionadas para classificação 3D, e o conjunto de dados foi classificado em seis classes. O último refinamento automático 3D foi realizado com a melhor classe; Foram obtidas 85.227 partículas de espigão da classificação 3D.
    2. Após o refinamento automático, realize o refinamento de partícula per partícula com parâmetros adequados de inclinação do feixe para melhoria de resolução. Em seguida, submeta as partículas ao polimento bayesiano usando o pacote de software RELION 3.011. Por fim, use o conjunto de partículas polidas para outra rodada de refinamento automático 3D usando RELION 3.011.

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Representative Results

Na atual situação pandêmica, o crio-EM desempenha um papel fundamental na caracterização das estruturas de várias proteínas do SARS-CoV-226,27,28,29, que podem ajudar a desenvolver vacinas e medicamentos contra o vírus. Há uma necessidade urgente de esforços de pesquisa acelerados com recursos humanos limitados para combater a doença coronavírus de 2019. A aquisição de dados em crio-EM de partículas únicas é um passo demorado, mas crucial na determinação da estrutura das macromoléculas. Os recentes desenvolvimentos na aquisição automática de dados crio-EM permitiram interferência humana limitada na coleta de dados. O software Latitude-S é um importante pacote automático de software de aquisição de dados usado aqui para a coleta automatizada de dados da proteína de pico SARS-CoV2 purificada.

A aquisição de dados crio-EM da proteína de pico SARS-CoV-2 foi realizada com um crio-EM de 200 keV equipado com um K2 Summit DED. Os locais para aquisição de dados na rede com desejável espessura de gelo e distribuição de partículas foram marcados manualmente. As posições foram marcadas em paralelo durante a aquisição de dados ocorrendo em segundo plano. Nas posições marcadas, o software Latitude-S realizou aquisição automatizada de dados a uma ampliação nominal de 42.200x no tamanho do pixel de 1,17 Å no nível da amostra. A configuração para coleta de dados em 42.200x de ampliação já foi pré-definida e testada. Foram registrados 40 quadros para 8 s com a dose eletrônica de 2 e−/Å2 por quadro; assim, utilizou-se uma dose total de 80 e−/Å2 para coleta de dados (Figura Suplementar S9). Os dados foram adquiridos em uma faixa de desfocus de −0,75 μm e −2,25 μm, com 3.000 arquivos de filme coletados em dois dias. A cada 4h, verificações periódicas e ajustes eram realizados pelo software para garantir que todos os arquivos de filme coletados acima de 48h fossem de boa qualidade e não houvesse mudança de feixe ou mudança de alinhamento. Os dados foram coletados independentemente sem qualquer intervenção humana. Além disso, o Latitude-S pára automaticamente a imagem no momento do enchimento líquido de nitrogênio, o que reduz a vibração desnecessária ou a deriva mecânica nas imagens.

Como mencionado na seção de protocolo, a triagem inicial de micrografos corrigidos por movimento foi realizada manualmente utilizando-se software cisTEM14. Com base na triagem, a maioria dos dados foi encontrada dentro da faixa de sinal de 3,7-5.2 Å (Figura Suplementar S7A). Isso sugere que a coleta automática de dados usando o Latitude-S é boa, e a maioria dos dados são adequados para reconstrução 3D de alta resolução. Além disso, as imagens foram coletadas na faixa de defocus (-0,75 a -2,25 μm), e várias faixas de desfocus foram verificadas manualmente pelo cisTEM14. Os dados adquiridos estavam muito próximos da faixa de desfoco de configuração em Latitude-S (Figura Suplementar S7A,B).

O processamento de dados foi realizado utilizando o pacote de software RELION 3.011. As partículas de espigão foram escolhidas manualmente para calcular as médias da classe 2D. Vários detalhes estruturais (hélice e β-folha) são visíveis nas médias da classe 2D (Figura Suplementar S7C), o que sugere fortemente que a caracterização estrutural de alta resolução é possível usando esse conjunto de dados. No entanto, a classificação 3D também indica que a proteína de pico tem domínio de ligação de receptor 1 (RBD) aberto e toda a conformação de fechamento do RBD (Figura Suplementar S8). A classificação 3D indica que a classe-1 tem o número máximo de partículas, que aparecem como uma conformação aberta de 1-RBD. Além disso, classe-3 e classe-4 têm um número semelhante de partículas, e ambos os modelos pareciam ter todos os RBD para baixo conformidade próxima. No entanto, a classe-5 apresenta uma conformação intermediária, onde o 1-RBD está em uma posição intermediária. No entanto, as conformações abertas 1-RBD da proteína de pico foram reconstruídas usando simetria C1, e a resolução geral é de 4,4 Å (Figura 6 e Figura Suplementar S10). Da mesma forma, todos os RBD para baixo conformação próxima (classe-3 e classe-4) foram refinados juntamente com a simetria C3, e a resolução geral em 0,143 FSC é ~3,9 Å (Figura 7).

O processamento geral da imagem indica que a proteína de pico adota todos os RBDs de perto e 1-RBD para cima de conformação aberta. Além disso, foi identificada uma conformação intermediária da proteína de espigão. A estrutura crio-EM de alta resolução do subdomínio S2 da proteína do pico indica as cadeias laterais de resíduos individuais de aminoácidos (Figura 6B e Figura 7C). Todas as reconstruções 3D e os resultados crio-EM são altamente semelhantes aos achados na literatura recém-publicada25. No entanto, a estrutura crio-EM de alta resolução da proteína spike foi caracterizada dentro de 15 dias, o que só é possível devido aos protocolos automáticos de aquisição de dados crio-EM e software automático de coleta de partículas. Portanto, pacotes automáticos de software de aquisição de dados, incluindo o Latitude-S, podem contribuir significativamente para a caracterização de várias estruturas crio-EM de alta resolução de macromoléculas biológicas.

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho de aquisição automatizada de dados usando Latitude-S: Etapas gerais a serem seguidas antes da coleta de dados (preparação da grade, carregamento de amostras e ajuste de microscópio). A aquisição de dados é a principal parte deste manuscrito, e o pipeline a ser seguido durante a aquisição de dados é destacado. Abreviaturas: crio-EM = microscopia crio-elétron. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Configuração de diferentes estados para coleta de dados de partículas únicas usando o pacote de software Latitude-S GUI. (A) Latitude-S para aquisição de dados em traje de software DM3. (B) Fluxo de trabalho do procedimento de aquisição de dados. (C) Expansão de cada painel. Abreviação: GUI = interface gráfica do usuário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Alinhamento fino para configurar alta precisão para foco e aquisição de imagem. O alinhamento fino é realizado em cinco estados a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Concentre cada estado colocando a marca vermelha na mesma posição. É altamente recomendável realizar o Fine Alignment antes de iniciar qualquer nova sessão, o que ajudará a realizar imagens em uma determinada posição. A aquisição de imagem em uma posição específica (sem qualquer mudança maior) depende completamente da precisão do alinhamento fino. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Seleção automática de orifícios usando Latitude-S. O auto-achado de furos para aquisição de dados é realizado automaticamente com base no tamanho do furo. (A) Mostra a posição do vetor de localização do orifício para encontrar automaticamente os orifícios. Barra de escala = 20 μm. (B) Mostra a marcação de orifícios usando o vetor de localização do orifício e ajustando a intensidade para remover o marcador da área de fronteira e contaminação do gelo. Barras de escala = 20 μm (esquerda) e 10 μm (meio). (C) Mostra a adição automática dos orifícios para imagem (amarelo). Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Visão ao vivo da aquisição de dados. (A) As posições são marcadas em amarelo, verde, azul e vermelho com base no status de aquisição de dados em cada posição. (B) Código de cor para monitorar o status da aquisição de dados. Verde: Agendado, Amarelo: Não Programado, Azul: Adquirir, Vermelho: Falhou. O painel esquerdo mostra vários buracos coloridos de verde (programado) e alguns orifícios marcados de azul (adquiridos); barra de escala = 10 μm. O painel do meio mostra ampliação de 4.300x de um orifício individual. Nesta imagem de um buraco (painel do meio), a caixa quadrada azul mostra a área de foco, e a caixa quadrada verde mostra a região de imagem; barra de escala = 1000 nm. O painel direito mostra a imagem adquirida. O painel de extrema direita mostra os números de imagens programados, o tempo total necessário para a imagem e quantas imagens estão programadas para imagens. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Modo Spike 3D com 1RBD aberto. (A) Mapa de proteína de pico auto-refinado e aguçado de 1-RBD aberto está representado nas vistas laterais, superiores e inferiores. (B) O mapa EM é equipado com estrutura cristalina para melhor visualização das cadeias laterais. As regiões destacadas no mapa têm densidades para cadeias laterais. Abreviaturas: 3D = tridimensional; RBD = domínio de ligação de receptor; EM = microscopia eletrônica; NTD = Domínio do terminal N; S1 = subunidade 1; S2 = subunidade 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Todos os RBD para baixo conformidade próxima da proteína de pico. (A) mapa de proteína de pico auto-refinado e aguçado de todas as conformações de rbd para baixo, representados em vistas laterais e superiores. (B) O mapa EM é equipado com estrutura cristalina para melhor visualização das cadeias laterais. As setas mostram que as regiões do mapa têm densidades para cadeias laterais (C). Abreviaturas: RBD = domínio de ligação receptora; EM = microscopia eletrônica; NTD = Domínio do terminal N; S1 = subunidade 1; S2 = subunidade 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Aquisição de imagem Latitude-S GUI: Vários controladores de microscópio (por exemplo, válvula de coluna aberta/fechada, inserção/retração da tela são controlados pela GUI Latitude-S. Válvula de coluna, câmera, estado da tela e enchimento de nitrogênio líquido podem ser controlados no painel esquerdo. Na parte inferior deste painel, vários parâmetros de calibração parecem verdes (por exemplo, ampliação, inclinação do feixe, foco objetivo). Se algum parâmetro aparecer preto, indica que o parâmetro não é otimizado corretamente. Portanto, todos os parâmetros devem ser otimizados antes de iniciar qualquer nova sessão. Abreviação: GUI = interface gráfica do usuário. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S2: Representação do Estado Atlas. Diferentes estados do Atlas mostrando quadrados de grade e o tipo de gelo formado. (A-F) Vários tamanhos atlas também são destacados. (A, B, D, F) Um padrão de gelo espesso é destacado. (C, D) Quadrados quebrados são destacados. Gelo espesso e regiões quebradas (marcadas na figura) não são adequadas para imagens. (E, F) Bons quadrados de grade para imagem; A, B, C, D e F mostram os quadrados de grade adequados para imagens de alta resolução. No entanto, quadrados de grade de gelo espessos e quadrados de grade quebrados devem ser excluídos. Barras de escala = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) e 25 μm (F). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S3: Representação do estado de Grade e estado de buraco. O estado da grade e o estado de furo correspondente são mostrados na imagem. (A, E) O orifício vazio, (F, G) gelo espesso, (E) contaminação do gelo, e (A, B, C, D, E e G) a espessura adequada do gelo está marcada na imagem. São selecionados orifícios adequados de espessura de gelo para a aquisição de imagens (A, B, C, D, E e G). Barras de escala = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S4: Referência de furo para imagem automática. A imagem do furo (QUANTIFOIL-Holey Carbon grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) é capturada e salva para referência futura. O tamanho da referência do furo pode ser variado com base nos diferentes tipos de grades. Recomenda-se capturar sempre a referência do orifício antes de iniciar qualquer nova sessão. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S5: Painel de captura de imagens em várias ampliações e seleção de furos. (A) O painel de captura mostra as configurações para aquisição de dados. (B) A janela de navegação principal Latitude-S mostra três ampliações consecutivas. No estado da Atlas (150x), os quadrados de grade são selecionados para aquisição de dados (painel à esquerda, barra de escala = 50 μm). Em maior ampliação (380x), um único quadrado é focado (painel médio, barra de escala = 20 μm). Ampliação ainda maior (4.300x), buracos dentro de cada quadrado são focados (painel à direita, barra de escala = 5 μm). No entanto, essas ampliações mudariam de acordo com o tamanho e a forma das grades. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S6: Criando um modelo para seleção de furos e imagem. A geração de modelos é realizada adicionando uma posição no orifício para dados, e o foco é posicionado adjacente ao orifício na superfície de carbono. O foco deve se posicionar sobre a área de carbono para que o diâmetro do feixe não toque em nenhum orifício adjacente. Barras de escala = 20 μm (painel esquerdo), 10 μm (painel médio), 1000 nm (painel direito). Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S7: Imagem crio-EM de SARS-CoV2 usando Latitude-S e exibição de imagem. (A) Triagem de micrografos adquiridos: ajuste ctf 1D, ajuste ctf 2D e parâmetros CTF; estimativa dos dados de proteína de pico SARS-CoV2 usando cisTEM. 1D CTF fit e anel Thon mostra que o sinal geral é de 4,8 Å. (B) Micrografias a dois valors diferentes de desfoco da proteína de pico são adquiridos usando Latitude-S. Barras de escala = 50 nm. (C) Média final da classe 2D. A média da classe 2D mostra vistas superiores, inferiores e laterais da proteína do pico. Todos os detalhes de alta resolução são visíveis em médias de classe 2D. Abreviaturas: crio-EM = microscopia crio-elétron; 1D = unidimensional; 2D = bidimensional; CTF = função de transferência de contraste; SARS-CoV2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S8: Processamento de dados de dados de dados de proteína de pico SARS-CoV2 adquiridos usando o software Latitude-S. A imagem mostra o fluxo de trabalho seguido para o processamento dos dados crio-EM da proteína spike. A classificação 3D da proteína de pico é realizada utilizando-se o Relion 3.0. A classe 1 mostra a conformação aberta 1-RBD. Classe-3 e Classe-4 mostram toda RBD para baixo conformação próxima de spike-protein. Classe-5 mostra a conformação intermediária da proteína de espigão. Abreviaturas: crio-EM = microscopia crio-elétron; 3D = tridimensional; RBD = domínio de ligação de receptor; SARS-CoV2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura Suplementar S9: Imagem fracionada de dose capturada como referência para aquisição final de imagem. As imagens de fracionamento de dose são capturadas com uma exposição de 8,0 s e 0,2 s/frame. Clique no botão Salvar automaticamente perto da câmera para salvar os arquivos de filme automaticamente. Após a aquisição da imagem, clique na imagem e salve os parâmetros de imagem fracionados por dose usando o botão atualizado de imagem no estado de coleta de dados. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Figura suplementar S10: Distribuição angular e correlação de conchas fourier do mapa de proteína de pico de conformação gerado SARS-CoV-2 1 RBD. (A) Distribuição angular do modelo 3D final de 1-RBD para cima a conformação aberta da proteína de espigão. O azul representa valores mais baixos, e o vermelho representa valores mais elevados da distribuição de partículas normalizadas. (B) Curva de correlação da camada de concha fourier mostrando resolução de 4,4 Å da conformação aberta de 1-RBD da proteína de espigão, estimada no corte. Abreviaturas: 3D = tridimensional; RBD = domínio de ligação de receptor; SARS-CoV2 = síndrome respiratória aguda grave coronavírus 2; FSC = Correlação da concha fourier. Clique aqui para baixar este Arquivo.

Estado de Imagem do Atlas Atlas 115
Ampliação 115, tamanho pixel 34,7 nm
Defocus indicado 4,38 mm
Tamanho do spot 8
Brilho 934400
Modo IMAGEMILM
Binning 1
Tempo de exposição 1.0 s
Estado de Pesquisa em Grade Grade 380
Ampliação 380, tamanho pixel 11,2 nm
Defocus indicado 2,37 mm
Tamanho do spot 8
Brilho 626200
Modo IMAGEMILM
Binning 1
Tempo de exposição 1.0 s
Estado de Pesquisa de Buracos Buraco 3400
Ampliação 3.400, tamanho Pixel 1.20 nm
Defocus indicado -0,75 μm
Tamanho do spot 7
Diâmetro do feixe 8,81 μm
Modo IMAGEMILM, SA, MH
Binning 1
Tempo de exposição 1.0 s
Estado focal Foco 45k
Ampliação 45.000, tamanho pixel 0.0924 nm
Defocus indicado 4,51 μm
Tamanho do spot 6
Diâmetro do feixe 0,716 μm
Modo IMAGEMILM, SA, MH
Binning 1
Tempo de exposição 1.0 s
Acqisition State Dados 45k
Ampliação 45.000, tamanho pixel 0.0924 nm
Configuração de desfoco Min: -4.500 nm, Max: -1.500 nm, Passos: 250 nm
Tamanho do spot 6
Diâmetro do feixe 0,752 μm
Modo IMAGINGILM,SA, MH
Binning 1
Tempo de exposição Total de 8 s exposição para 20 quadros
Configuração da câmera Contado, Ganho Normalizado, Defeito Corrigido
Configuração de salvamento de dados MRC

Tabela 1: Resumo da configuração do estado latitude-S.

Especificação K2 Base Cúpula K2
Tensão operacional TEM 200-400 kV
Área ativa do sensor 19,2 mm × 18,6 mm
Tamanho do sensor em pixels 3838 × 3710 7676 × 7420 Super-
Resolução
Tamanho de físico al pixel 5 μm
Binning 1-8x
Leitura do sensor Qualquer área arbitrária
Ampliação relativa ao filme 1.3-1.5x
Velocidade de leitura do sensor 50 fps completos 400 fps completos
Velocidade de transferência para computador 8 fps completos 40 fps completos
Exibição de imagem 8 fps completos 10 fps completos
Desempenho do DQE (300 kV) >0.30 (pico) >0.25 a 0,5 de Nyquist físico >0,7 (pico) >0,50 a 0,5 de Nyquist físico >0,06 a 1,25 de Nyquist físico
Software Suíte de Microscopia Gatan, incluindo DigitalMicrograph

Tabela 2: Especificações da câmera.

Opção de configuração Valor
Tipo de microscópio Talos Árticos G2
Alta Tensão 200 kV
Fonte XFEG
Lente Gêmeo Crio
Sistema de vácuo Talos TMP IGP
Carregador de amostras Autoloader

Tabela 3: Configuração do microscópio.

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Discussion

Latitude-S é uma interface de usuário intuitiva, que fornece um ambiente para configurar e coletar automaticamente milhares de micrografias de alta resolução ou arquivos de filme em dois dias. Fornece fácil navegação através das grades e mantém a posição do estágio do microscópio enquanto se move de baixa ampliação para alta ampliação. Cada etapa de aquisição de dados com o Latitude-S é eficiente em termos de tempo, com recursos como uma interface de usuário simples, streaming rápido de dados a até 4,5 GB/s de velocidade e exibição simultânea de dados durante a aquisição. Além disso, os parâmetros de fracionamento de dose pré-calibrado, taxa de dose, foco e ampliação foram facilmente recarregados para iniciar uma nova sessão de aquisição automática de dados e economizar tempo.

A aquisição de dados automaticamente na ausência de monitoramento constante e sem comprometer a qualidade do conjunto de dados é uma tarefa desafiadora e demorada. A coleta automatizada de dados usando o software Latitude-S é conveniente quando o tempo e os recursos são grandes restrições, particularmente durante esta pandemia. No entanto, várias estruturas crio-EM de várias proteínas do SARS-CoV-2 foram resolvidas nos últimos meses, o que ajudará as empresas farmacêuticas a desenvolver vacinas. Diferentes laboratórios usam diferentes tipos de pacotes automáticos de software de coleta de dados para coletar dados. Usamos latitude-S com um K2 Summit DED para coleta automática de dados crio-EM em grades de carbono furadas ou grades revestidas go caseiras30.

Esse estudo foi realizado utilizando os parâmetros acima mencionados na seção de protocolo, o que fornece fortes evidências de que o Latitude-S é um pacote de software adequado e ideal para coleta automática de dados para crio-EM de uma única partícula. No entanto, é altamente recomendável seguir certos protocolos antes de iniciar a imagem usando uma câmera K2. A câmera de detecção direta K2 requer rotinas básicas de manutenção para obter o melhor desempenho. O ressaramento regular da câmera para 50° por 24 h ajuda o sensor a funcionar de forma ideal, reduzindo o ruído de fundo e a contaminação ao nível da superfície. No entanto, após a ressarção da câmera, atualizar o ganho e as referências escuras da câmera é um passo obrigatório (leva ~45 min) antes de realizar qualquer aquisição de imagem.

Embora o Latitude-S seja um pacote de software estável e fácil de usar para coleta automática de dados crio-EM, é essencial otimizar vários parâmetros (ampliações, tamanho do ponto, brilho e taxa de dose) em 5 estados diferentes do Latitude-S no início. A ampliação de orifícios ou estados de grade depende do tamanho do orifício das redes furas ou dos tipos de grade furado (por exemplo, R2/2 ou R1.2/1.3 ou R 0,6/1). Por exemplo, o tamanho do furo da grade tipo R0.6/1 é de 0,6 μm, e o tamanho do orifício da grade R2/2 é de 2 μm. Assim, dois tipos diferentes de ampliação são necessários para visualizar adequadamente os orifícios para os tipos de grade R0.6/1 e R2/2 na grade e estados de furo em Latitude-S.

Portanto, as configurações de ampliação para vários tipos de grades em 5 estados diferentes serão variáveis. O tamanho do local e o brilho dependem muito da ampliação. Assim, esses valores podem mudar em diferentes valores de ampliação. Portanto, recomenda-se otimizar os vários parâmetros dos 5 estados diferentes do Latitude-S usando diferentes tipos de grades crio-EM antes de iniciar a aquisição automática de dados. No entanto, uma vez que todos os parâmetros são otimizados e salvos, é fácil recarregar todos os parâmetros com base na exigência do usuário e usar o Latitude-S em diferentes ampliações ou tipos de grade.

Um benefício importante do uso do K2 com Latitude-S é que os usuários podem facilmente regular a válvula de feixe aberta/fechada, inserir/retrair a câmera, inserir/retrair a tela fosfora do microscópio e regular o enchimento de nitrogênio líquido usando a GUI do Latitude-S. No entanto, quaisquer outras opções (como inclinação de arma, troca de armas, mudança de feixe, pontos de pivô, centralização de abertura C2, centro de rotação, alinhamento sem coma) não são acessíveis através da guia GUI K2 Latitude-S (Figura Suplementar S1 e Figura 2). Durante as longas horas de coleta de dados, a posição do feixe pode mudar.

O Latitude-S pode executar verificações e correções periódicas automatizadas para acompanhar a estabilidade do sistema durante todo o período de aquisição de dados. A estabilidade do sistema é mantida centralizando o feixe e atualizando as referências escuras. A verificação constante garante a alta qualidade dos dados adquiridos. No Latitude-S, a altura eucêntrica (altura Z) é corrigida apenas uma vez antes da coleta de dados, e a altura eucêntrica é calculada automaticamente pelo Latitude-S quando muda o quadrado da grade. O foco é automaticamente medido e ajustado com base no intervalo de foco definido pelo usuário. O programa redefinirá a posição estágio Z se exceder o valor de limiar dado. Esta estabilidade é controlada através da paleta Estabilidade do Sistema. No entanto, como outros pacotes automáticos de aquisição de dados, o Latitude-S também tem algumas limitações.

Latitude-S não pode calcular a altura eucêntrica (altura Z) se a grade estiver irregular. Neste cenário, ele não pode coletar nenhum dado, ou os valores de desfocus estarão completamente fora de alcance. Portanto, os usuários devem ser extremamente cautelosos para preparar suas grades sem qualquer curva e imagem apenas grades de superfície plana usando Latitude-S. Além disso, ao contrário de Leginon, SerialEM e UCSF-Image, o Latitude-S não é um pacote de software disponível livremente. O Latitude-S é compatível com câmeras Gatan, incluindo câmeras de detecção direta de base K2, K3 e K3, além de câmeras Rio e OneView. Outra desvantagem importante para os usuários é que ele não é compatível com outros DEDs populares, como o Falcon DED. No entanto, isso também é verdade para o EPU, outro pacote automático de software de aquisição de dados, que está disponível com microscópios criográficos e apenas compatível com a câmera Falcon. No entanto, o EPU também é funcional com K2/K3 com um filtro de energia (BioQuantum K3 Imaging Filter), mas não com uma câmera K2/K3 autônoma.

Latitude-S é bastante semelhante ao EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation e Leginon, que são pacotes de software usados para aquisição automática de dados para crio-EM de uma única partícula. No entanto, o Latitude-S só é compatível com k2 DED, K3 DED ou BioQuantum K3 Imaging Filter. Além disso, o suporte técnico contínuo é fornecido pela empresa para usuários do Latitude-S. Esse suporte técnico é benéfico para pequenos grupos de usuários, que precisam usar os dispositivos K2 DED, K3 DED ou BioQuantum K3 Imaging Filter para aquisição de dados e não têm conhecimento prévio sobre como configurar ou usar pacotes de software livre, como SerialEM e Leginon.

Existem muitas outras características, como difração eletrônica microcristatal (microED), tomografia e espectrometria de raios-X dispersiva de energia (EDS), que estão disponíveis em várias outras versões do Latitude. Portanto, os usuários podem usar o mesmo pacote de software para coleta de dados em outros modos. Para nosso conhecimento, a coleta de dados para microED, tomografia e EDS não está disponível em EPU ou em qualquer outro pacote de software. Portanto, este pacote de software Latitude pode ser útil para diferentes propósitos, além da aquisição automática de dados em crioEM de partículas únicas. No entanto, SerialEM e Leginon, ambos pacotes de software livre, são adequados para câmeras Falcon ou K2/K3 e são extremamente úteis para novos usuários. No entanto, o Latitude-S não está disponível livremente, o que pode ser uma desvantagem deste pacote de software.

Em resumo, a ferramenta de aquisição automática de dados Latitude-S é tão boa quanto outros pacotes automáticos de software de aquisição de dados (por exemplo, EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S é um pacote de software de aquisição de dados extremamente estável e fácil de usar, que está disponível com câmeras de detecção direta k2, K3 e K3, e base K3 filtradas, bem como câmeras Rio e OneView.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse concorrentes ou financeiros para declarar.

Acknowledgments

Reconhecemos o Departamento de Biotecnologia, Departamento de Ciência e Tecnologia (DST) e Ciência, e o Ministério do Desenvolvimento de Recursos Humanos (MHRD), Índia, para financiamento e a instalação crio-EM no IISc-Bangalore. Reconhecemos o Programa DBT-BUILDER (BT/INF/22/SP22844/2017) e o DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) para a instalação Nacional Cryo-EM no IISc, Bangalore. Reconhecemos o apoio financeiro do Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 e SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Agradecemos à Sra. Ishika Pramanick por preparar grades crio-EM, coleta de dados crio-EM e preparar a Tabela de Materiais. Agradecemos também ao Sr. Suman Mishra pelo processamento de imagens crio-EM e por nos ajudar a preparar os números. Agradecemos ao Prof. Raghavan Varadarajan por nos ajudar a obter a amostra purificada de proteína de pico para este estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blotting paper Ted Pella, INC. 47000-100 EM specimen preparation item
Capsule Thermo Fisher Scientific 9432 909 97591 EM specimen preparation unit
Cassette Thermo Fisher Scientific 1020863 EM specimen preparation unit
C-Clip Thermo Fisher Scientific 1036171 EM specimen preparation item
C-Clip Insertion Tool Thermo Fisher Scientific 9432 909 97571 EM specimen preparation tool
C-Clip Ring Thermo Fisher Scientific 1036173 EM specimen preparation item
EM grid (Quantifoil) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold
Glow discharge Machine Quorum N/A Quorum GlowQube glow discharge machine
K2 DED Gatan Inc. N/A Cryo-EM data collection device (Camera)
Latitude S Software Gatan Inc. Imaging software
Loading station Thermo Fisher Scientific 1130698 EM specimen preparation unit
Talos 200 kV Arctica Thermo Scientific™ N/A Cryo-Electron Microscope
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific N/A EM specimen preparation unit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Kumar, A., P., S., Gulati, S., Dutta, S. User-friendly, High-throughput, and Fully Automated Data Acquisition Software for Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (173), e62832, doi:10.3791/62832 (2021).

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