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Biochemistry

फेज प्रदर्शन का उपयोग करने के लिए E3 Ligases के लिए Ubiquitin संस्करण Modulators विकसित करने के लिए

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

एक महत्वपूर्ण प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है, जिसमें से कई मानव रोगों में फंस गया है। यह प्रोटोकॉल विवरण देता है कि कैसे फेज डिस्प्ले का उपयोग उपन्यास यूबिकिटिन वेरिएंट को अलग करने के लिए किया जा सकता है जो ई 3 लिगेस की गतिविधि को बांध और संशोधित कर सकता है जो विशिष्टता, दक्षता और पैटर्न को नियंत्रित करता है।

Abstract

Ubiquitin एक छोटा सा 8.6 kDa प्रोटीन है जो ubiquitin-antision system का एक मुख्य घटक है। नतीजतन, यह उच्च विशिष्टता लेकिन कम आत्मीयता के साथ प्रोटीन की एक विविध सरणी से बंध सकता है। फेज डिस्प्ले के माध्यम से, यूबिकिटिन वेरिएंट (यूबीवी) को इस तरह से इंजीनियर किया जा सकता है कि वे वाइल्डटाइप यूबिकिटिन पर बेहतर आत्मीयता प्रदर्शित करते हैं और प्रोटीन को लक्षित करने के लिए बाध्यकारी विशिष्टता बनाए रखते हैं। फेज डिस्प्ले एक फेजमिड लाइब्रेरी का उपयोग करता है, जिससे एक फिलामेंटस एम 13 बैक्टीरियोफेज के पीआईआईआई कोट प्रोटीन (चुना जाता है क्योंकि यह फेज सतह पर बाहरी रूप से प्रदर्शित होता है) यूबीवी के साथ जुड़ा हुआ है। मानव wildtype ubiquitin के विशिष्ट अवशेष नरम और यादृच्छिक हैं (यानी, देशी wildtype अनुक्रम के लिए एक पूर्वाग्रह है) UbVs उत्पन्न करने के लिए ताकि प्रोटीन संरचना में हानिकारक परिवर्तन से बचा जा सके, जबकि लक्ष्य प्रोटीन के साथ उपन्यास बातचीत को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक विविधता को पेश करते समय। फेज डिस्प्ले प्रक्रिया के दौरान, इन यूबीवी को व्यक्त किया जाता है और फेज कोट प्रोटीन पर प्रदर्शित किया जाता है और ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ पैन किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन के साथ अनुकूल बाध्यकारी इंटरैक्शन प्रदर्शित करने वाले यूबीवी को बनाए रखा जाता है, जबकि खराब बाइंडर्स को धोया जाता है और लाइब्रेरी पूल से हटा दिया जाता है। बनाए रखा UbVs, जो UbV के इसी फेजमिड युक्त फेज कण से जुड़े होते हैं, को eluted, प्रवर्धित और केंद्रित किया जाता है ताकि उन्हें फेज डिस्प्ले के एक और दौर में एक ही लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ पैन किया जा सके। आमतौर पर, फेज डिस्प्ले के पांच राउंड तक किए जाते हैं, जिसके दौरान यूबीवी के खिलाफ एक मजबूत चयन दबाव लगाया जाता है जो कमजोर रूप से और / या अस्पष्ट रूप से बांधते हैं ताकि उच्च आत्मीयता वाले लोग केंद्रित और समृद्ध हों। आखिरकार, यूबीवी जो अपने वाइल्डटाइप समकक्षों की तुलना में लक्ष्य प्रोटीन के लिए उच्च विशिष्टता और / या आत्मीयता प्रदर्शित करते हैं, उन्हें अलग-थलग कर दिया जाता है और आगे के प्रयोगों के माध्यम से इसकी विशेषता हो सकती है।

Introduction

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के आणविक विवरणों को समझना जैविक प्रक्रियाओं के सिग्नल ट्रांसडक्शन तंत्र को चित्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से वे जो नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण बीमारियों में योगदान करते हैं। हाल के वर्षों में, फेज डिस्प्ले का उपयोग प्रोटीन / पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए एक व्यावहारिक और सुलभ विधि के रूप में किया गया है, जिसमें वांछित लक्ष्य प्रोटीन 1,2,3,4 के लिए बहुत बेहतर बंधन है, जिसे बदले में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की इंट्रासेल्युलर जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

एंजाइमेटिक गतिविधियों का एक झरना है (E1 सक्रिय एंजाइम → E2 संयुग्मन एंजाइम → E3 ligases) है कि covalently संयुग्मित ubiquitin (यूबी) प्रोटीन substrates के लिए उन्हें गिरावट के लिए लक्षित करने के लिए या सेल सिग्नलिंग परिवर्तन मध्यस्थता करने के लिए। इसके अलावा, deubiquitinases प्रोटीन से ubiquitin को हटाने के लिए उत्प्रेरित. इसलिए, कोशिकाओं में, हजारों यूबी-निर्भर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन होते हैं, जिनमें से अधिकांश बड़े और विविध सतहों के माध्यम से कमजोर इंटरैक्शन की अनुमति देने के लिए कम आत्मीयता लेकिन उच्च विशिष्टता के साथ एक आम सतह को पहचानते हैं।

अर्न्स्ट एट अल ने यूबी के ज्ञात बाध्यकारी क्षेत्रों में उत्परिवर्तन पेश किया ताकि यह देखा जा सके कि क्या वे ब्याज के प्रोटीन के लिए बाध्यकारी आत्मीयता को बढ़ा सकते हैं, जबकि अभी भी उच्च चयनात्मकता को बनाए रख सकते हैं5। यूबी सतह पर पदों पर उत्परिवर्तन के साथ 10 बिलियन (7.5 x 1010) यूबी वेरिएंट (यूबीवी) की एक संयुक्त पुस्तकालय विकसित की गई थी जो ज्ञात यूबी-प्रोटीन इंटरैक्शन की मध्यस्थता करती है। इस पुस्तकालय में फेजमिड्स शामिल थे जो M13 बैक्टीरियोफेज pIII कोट प्रोटीन को विविध यूबीवी से जोड़ते हैं। इसलिए, अभिव्यक्ति पर कोट प्रोटीन के माध्यम से फेज सतह पर व्यक्तिगत यूबीवी प्रदर्शित किए जा सकते हैं। चयन प्रक्रिया के दौरान, फेज जो लक्ष्य प्रोटीन के साथ काफी बाध्यकारी इंटरैक्शन के साथ यूबीवी प्रदर्शित करता है, उसे फेज डिस्प्ले के बाद के दौर में बनाए रखा जाएगा और समृद्ध किया जाएगा, जबकि फेज प्रदर्शित करने वाले यूबीवी जो लक्ष्य प्रोटीन को खराब रूप से बांधते हैं, उन्हें धोया जाता है और फेज पूल से हटा दिया जाता है। बनाए रखा फेज कणों में उनके प्रदर्शित यूबीवी के अनुरूप फेजमिड होता है, जिससे उन्हें अनुक्रमित किया जा सकता है और एक बार अलग होने के बाद आगे की विशेषता होती है।

इस प्रोटीन इंजीनियरिंग रणनीति का उपयोग करते हुए, UbV अवरोधकों को मानव deubiquitinases5 और वायरल proteases6 के लिए विकसित किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, हमने मानव HECT-परिवार E3 लिगेस के लिए निरोधात्मक UBVs उत्पन्न किए हैं, जो E2-बाइंडिंग साइट को हाइजैक करने और UBVs को सक्रिय करने के माध्यम से है जो HECT डोमेन 7 पर यूबी-बाइंडिंग एक्सोसाइट पर कब्जा कर लेते हैं। हम E2 बाध्यकारी साइट को लक्षित करके मोनोमेरिक रिंग-परिवार E3s को भी रोक सकते हैं और होमोडिमेरिक रिंग E3s8 को सक्रिय करने के लिए UbV dimerization को प्रेरित कर सकते हैं। मल्टी-सबयूनिट रिंग E3s के लिए, UbVs रिंग सबयूनिट को लक्षित करके निषेध प्राप्त कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, APC / C complex9 के लिए) या जटिल गठन को बाधित कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, SCF E3s10 के लिए)। सामूहिक रूप से, यूबीवी को व्यवस्थित रूप से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए लाभ उठाया जा सकता है यूबी-एंटीऑक्सम सिस्टम (यूपीएस) ताकि हम यूपीएस एंजाइमों के जैव रासायनिक तंत्र को बेहतर ढंग से समझ सकें और चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए कार्यात्मक साइटों की पहचान और सत्यापन कर सकें।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि ब्याज के प्रोटीन को लक्षित करने के लिए पहले से उत्पन्न फेज प्रदर्शित यूबीवी लाइब्रेरी को कैसे नियोजित किया जाए और फेज डिस्प्ले के क्रमिक दौर के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन के साथ बातचीत करने वाले यूबीवी बाइंडर्स को कैसे समृद्ध किया जाए।

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Protocol

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. PBS (फॉस्फेट बफ़र्ड खारा): अल्ट्राप्योर H2O के 450 mL के साथ 10x PBS समाधान के 50 mL मिलाएं। निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और 4 °C या कमरे के तापमान (~ 20-25 °C) पर स्टोर करें।
  2. 10% बीएसए (गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन): धीरे-धीरे अल्ट्राप्योर एच 2 ओ के 7 एमएल में बीएसए के 1 ग्राम जोड़ें और पूरी तरह से भंग होने तक मिश्रण करें (कोई clumps नहीं)। Ultrapure H2O के साथ शीर्ष जब तक अंतिम मात्रा 10 mL है. निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. पीबी बफर (पीबीएस 1% बीएसए के साथ पूरक): धीरे-धीरे 400 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर एच 2 ओ और पीबीएस के 50 एमएल में बीएसए के 5 ग्राम जोड़ें और पूरी तरह से भंग होने तक मिश्रण करें (कोई clumps नहीं)। Ultrapure H2O के साथ शीर्ष जब तक अंतिम मात्रा 500 मिलीलीटर है. निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. पीबीटी बफर (पीबीएस 1% बीएसए और 0.05% ट्वीन 20 के साथ पूरक): धीरे-धीरे 400 मिलीलीटर अल्ट्राप्योर एच 2 ओ और पीबीएस के 50 एमएल में बीएसए के 5 ग्राम जोड़ें और पूरी तरह से भंग होने तक मिश्रण करें (कोई clumps नहीं)। Tween 20 के 250 μL जोड़ें। Ultrapure H2O के साथ शीर्ष जब तक अंतिम मात्रा 500 मिलीलीटर है. निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. पीटी बफर (पीबीएस 0.05% Tween 20 के साथ पूरक): पीबीएस के 400 मिलीलीटर के साथ Tween 20 के 1 mL मिश्रण। Ultrapure H2O के साथ ऊपर जब तक अंतिम मात्रा 2 एल है निस्पंदन द्वारा स्टरलाइज़ और 4 डिग्री सेल्सियस या कमरे के तापमान (~ 20-25 डिग्री सेल्सियस) पर स्टोर।
  6. 2YT शोरबा: tryptone के 16 ग्राम जोड़ें, खमीर निकालने के 10 ग्राम, और Ultrapure H2O के 800 mL करने के लिए NaCl के 5 ग्राम और पूरी तरह से भंग (कोई clumps) तक मिश्रण। Ultrapure H2O के साथ ऊपर जब तक अंतिम मात्रा 1 एल है autoclaving और कमरे के तापमान (~ 20-25 डिग्री सेल्सियस) पर स्टोर द्वारा Sterilize.
  7. LB/carb प्लेटें: H2O के 400 mL में 12.5 g पूर्व-निर्मित LB मिश्रण और 7.5 g आगर जोड़ें। अंतिम आयतन 500 mL होने तक अल्ट्राप्योर H2O के साथ टॉप अप करें और ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें। सुनिश्चित करें कि आगर पूरी तरह से भंग हो गया है और इसे 60 डिग्री सेल्सियस से नीचे तक ठंडा करने के लिए प्रतीक्षा करें। 100 मिलीग्राम mL carbenicillin के 500 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिश्रण, और प्लेट में डालना। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. LB/tet प्लेटें: 12.5 g पूर्व-निर्मित LB मिश्रण और 7.5 g आगर को 400 mL ultrapure H2O में जोड़ें। जब तक अंतिम आयतन 500 mL न हो जाए, तब तक ultrapure H2O के साथ टॉप अप करें और ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फल करें। सुनिश्चित करें कि आगर पूरी तरह से भंग हो गया है और इसे 60 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा करने के लिए प्रतीक्षा करें। 10 मिलीग्राम एमएल टेट्रासाइक्लिन के 500 μL जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और प्लेट में डालें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  9. 20% PEG (polyethylene glycol)/2.5 M NaCl: PEG-8000 के 50 g और NaCl के 36.5 g को Ultrapure H2O के 200 mL में जोड़ें। पूरी तरह से भंग होने तक मिश्रण करें।
    नोट: इसमें कुछ समय लग सकता है; हीटिंग मदद कर सकती है। Ultrapure H2O के साथ शीर्ष जब तक अंतिम मात्रा 250 मिलीलीटर है. निस्पंदन या ऑटोक्लेविंग द्वारा निष्फलीकरण.
  10. 0.1 M HCl: अल्ट्राप्योर H2O के 180 mL के साथ 1 M HCl के 20 mL को मिलाएं। निस्पंदन द्वारा स्टरलाइज़ करें और कमरे के तापमान (~ 20-25 °C) पर स्टोर करें।
  11. 1 M Tris (pH 11.0): Ultrapure H2O के 40 mL में Tris बेस का 6.1 g जोड़ें। HCl के साथ pH को 11.0 में समायोजित करें और तब तक मिलाएं जब तक कि Tris पूरी तरह से भंग न हो जाए। Ultrapure H2O के साथ टॉप अप करें जब तक कि अंतिम मात्रा 50 मिलीलीटर न हो। निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और कमरे के तापमान (~ 20-25 डिग्री सेल्सियस) पर स्टोर करें।
  12. 100 mg/mL (1000x) carbenicillin: 20 mL ultrapure H2O में 2 ग्राम carbenicillin disodium salt जोड़ें। पूरी तरह से भंग होने तक मिलाएं। निस्पंदन द्वारा निष्फल और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  13. 50 mg/mL (1000x) kanamycin: 20 mL ultrapure H2O में 1 ग्राम kanamycin सल्फेट जोड़ें। पूरी तरह से भंग होने तक मिश्रण करें। निस्पंदन द्वारा निष्फल और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
  14. 10 मिलीग्राम / एमएल (1000x) टेट्रासाइक्लिन: 70% इथेनॉल के 20 मिलीलीटर में 0.2 ग्राम टेट्रासाइक्लिन हाइड्रोक्लोराइड जोड़ें। पूरी तरह से भंग होने तक मिलाएं। निस्पंदन द्वारा निष्फल और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

2. प्रोटीन की तैयारी

  1. μM में लक्ष्य प्रोटीन स्टॉक की एकाग्रता निर्धारित करें। प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करने का सबसे सुविधाजनक तरीका 280 एनएम पर प्रोटीन स्टॉक के अवशोषण को मापना है। यदि एकाग्रता को मिलीग्राम / एमएल में जाना जाता है, तो लक्ष्य प्रोटीन के आणविक वजन का उपयोग करके इसे μM में परिवर्तित करें। ब्याज के प्रोटीन के आधार पर तरीकों की एक श्रृंखला का उपयोग किया जा सकता है; विवरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
    नोट: यदि प्रोटीन को छोटा कर दिया गया है (विशिष्ट प्रोटीन डोमेन / आकृति) या टैग किया गया है, तो मिलीग्राम / एमएल से μM में परिवर्तित करते समय आणविक भार में इन परिवर्तनों के लिए खाते को याद रखें।
  2. "राउंड 1", "राउंड 2/3", और "राउंड 4/5" लेबल वाले तीन माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें।
    1. 800 μL PBS में इसे 1 μM तक पतला करने के लिए आवश्यक प्रोटीन की मात्रा की गणना करें और PBS को जोड़े बिना ट्यूबों में इस मात्रा को एलीकोट करें।
      नोट: यदि उपलब्ध लक्ष्य प्रोटीन की मात्रा कम है, तो एकाग्रता को 0.25 μM के रूप में कम किया जा सकता है।

3. चयन के दौर एक के लिए तैयारी

  1. चयन के दौर दो के लिए फेज इनपुट culturing के लिए एक बीज संस्कृति तैयार करें।
    1. एक अच्छी तरह से अलग Escherichia कोलाई कॉलोनी के साथ 2YT / tet के 5 मिलीलीटर को टीका लगाएं और 200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. चयन के पहले दौर के लिए प्लेट कोट करें।
    1. पीबीएस की उचित मात्रा के साथ "राउंड 1" ट्यूब में लक्ष्य प्रोटीन को पतला करें और 96-अच्छी तरह से बाध्यकारी प्लेट (यानी, लक्ष्य प्लेट) के आठ कुओं में 100 μL को एलीकोट करें।
      नोट: फेज प्रदर्शन प्लेट के कोनों में कुओं को कोटिंग करके एक ही प्लेट पर एक साथ चार अलग-अलग प्रोटीनों के लिए किया जा सकता है।
    2. वैकल्पिक नियंत्रण: यदि लक्ष्य प्रोटीन को टैग किया गया है, जैसे कि जीएसटी या एमबीपी (माल्टोज बाइंडिंग प्रोटीन) के साथ, उचित एपिटोप टैग युक्त 1 μM समाधान के 100 μL के साथ एक और 96-अच्छी तरह से बाध्यकारी प्लेट में आठ कुओं को कोट करें। इसका उपयोग अवांछित फेज को हटाने के लिए किया जाएगा जो टैग को गैर-विशेष रूप से बांधता है।
    3. 200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेट (ओं) को हिलाएं।

4. चयन के दौर एक

  1. राउंड दो इनपुट तैयार करें।
    1. चरण 3.1 से बीज संस्कृति के 200 μL के साथ 2YT / tet के 30 मिलीलीटर को संक्रमित करें।
    2. 200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि बैक्टीरिया मध्य-लॉग चरण (OD600 0.6Equation 1 - 0.8) में न हों। इसमें लगभग तीन घंटे लगते हैं।
  2. ब्लॉक लक्ष्य प्लेट.
    1. प्लेट से कोटिंग समाधान, या दोनों प्लेटों को हटा दें यदि एक नियंत्रण प्लेट बनाई गई है, तो एक सिंक पर उलटा और हिलाकर। कागज तौलिए पर पैट सूखी.
    2. प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से करने के लिए पीबी बफर के 300 μL जोड़ें।
    3. PB बफ़र को चरण 4.2.1 के रूप में निकालें और PB बफ़र का एक और 200 μL जोड़ें।
    4. कमरे के तापमान (~ 20-25 डिग्री सेल्सियस) पर 300 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 1 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
  3. फेज लाइब्रेरी तैयार करें।
    1. बर्फ पर फेज लाइब्रेरी को पिघलाएं और इसे पीबीएस में पुस्तकालय विविधता 100x तक पतला करें। उदाहरण के लिए, यदि पुस्तकालय विविधता 1 x 1010 है और लाइब्रेरी एकाग्रता 1 x 1013 है, तो लाइब्रेरी को पतला करें ताकि एकाग्रता 1 x 1012 हो। यहां उपयोग किए जाने वाले पुस्तकालयों के लिए, पीबीएस के 9 एमएल के साथ पुस्तकालय के 1 मिलीलीटर के संयोजन से उन्हें पीबीएस में 10 गुना पतला करें।
      नोट:: लायब्रेरी विविधता लायब्रेरी निर्माण के दौरान निर्धारित किया जाना चाहिए था और आसानी से अन्यथा मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है। पुस्तकालय एकाग्रता को मध्य-लॉग चरण (OD600 0.6 - 0.8Equation 1) में ई कोलाई कोशिकाओं को टीका लगाकर और एलबी / कार्ब पर चढ़ाना द्वारा निर्धारित किया जा सकता है।
    2. PEG/NaCl की 1/5 मात्रा जोड़ें. उदाहरण के लिए, पहले से पतला लाइब्रेरी के 10 मिलीलीटर के लिए, PEG/NaCl के 2 mL जोड़ें।
    3. 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 11,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant को छोड़ दें, और शेष supernatant को नीचे खींचने के लिए 2 मिनट के लिए recentrifuge।
      नोट: दूसरी बार एक ही अभिविन्यास में रोटर में ट्यूब रखो क्योंकि यह गोली को एक ही स्थान पर रखने वाला पहला था, इसलिए, इसे देखना आसान हो गया।
    5. धीरे से प्रति प्रोटीन पीबीटी के 1 मिलीलीटर में फेज गोली resuspend. चार प्रोटीन के लिए, पीबीटी के 4 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
      नोट: गोली को छूने के लिए नहीं की कोशिश करो और हवा के बुलबुले का परिचय नहीं है.
  4. लक्ष्य प्रोटीन (ओं) के लिए फेज प्रदर्शित करें।
    1. वैकल्पिक नियंत्रण: नियंत्रण प्लेट में अच्छी तरह से लेपित प्रत्येक लेपित करने के लिए फेज लाइब्रेरी के 100 μL जोड़ें। कमरे के तापमान (~ 20-25 डिग्री सेल्सियस) पर 300 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए 1 ज के लिए इनक्यूबेट करें और नियंत्रण प्लेट से लक्ष्य प्लेट में पुस्तकालय को स्थानांतरित करें। चरण 4.4.2 छोड़ें।
    2. चरण 4.2.1 के रूप में लक्ष्य प्लेट से PB बफर निकालें और प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से करने के लिए फेज लाइब्रेरी के 100 μL जोड़ें।
    3. कमरे के तापमान (~ 20-25 डिग्री सेल्सियस) पर 300 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 1 ज के लिए इनक्यूबेट करें।
  5. एक फेज के चारों ओर एल्यूट।
    1. फेज लाइब्रेरी को हटा दें और पीटी बफर के साथ चार बार लेपित कुओं को धोएं। प्लेट को उलटें और अंतिम बूंदों को हटाने के लिए एक पेपर तौलिया पर टैप करें।
      नोट:: यदि एकाधिक लक्ष्य प्रोटीन एक प्लेट पर लेपित हैं, तो कुओं के बीच सभी बाद के समाधानों के प्रवाह को कम करने का प्रयास करें।
    2. प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से करने के लिए 0.1 M HCl के 100 μL जोड़ें और 300 rpm कक्षीय मिलाते हुए के साथ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन।
    3. प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से करने के लिए 1 M Tris-HCl (pH 11) के 12.5 μL जोड़कर पीएच बेअसर.
    4. पूल एक एकल 1.5 mL माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में सभी 8 कुओं से eluted फेज. स्थानांतरण के दौरान पिपेट ऊपर और नीचे समाधान समरूप बनाने के लिए और कुओं से सभी तरल aspirate.
    5. 1% की अंतिम एकाग्रता के लिए pooled eluted फेज के लिए 10% बीएसए जोड़ें। 950 μL के एक विशिष्ट दौर एक क्षालन मात्रा के लिए, 10% BSA के 95 μL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यह राउंड वन आउटपुट है।

5. चयन के बाद के दौर के लिए तैयारी

  1. चरण 3.1 के रूप में चयन के अगले दौर के लिए फेज इनपुट culturing के लिए एक बीज संस्कृति तैयार करें।
  2. नीचे उल्लिखित परिवर्तनों के साथ चरण 3.2 के रूप में चयन के तीसरे दौर के लिए प्लेट कोट करें।
    1. केवल एक 96-अच्छी तरह से बाध्यकारी प्लेट में प्रति प्रोटीन चार कुओं को कोट करें। उपयुक्त दौर के लिए "राउंड 2/3" या "राउंड 4/5" ट्यूबों की सामग्री के आधे का उपयोग करें। इन ट्यूबों की सामग्री को आवश्यकतानुसार पतला करें, ताकि प्रोटीन को समाधान से बाहर निकलने से बचा जा सके।
  3. चयन के अगले दौर के लिए फेज इनपुट तैयार करें।
    1. चरण 4.1 से मध्य-लॉग चरण कक्षों के 3 mL को टीका लगाने के लिए चरण 4.5.5 से राउंड एक आउटपुट के आधे का उपयोग करें। एक विशिष्ट दौर एक आउटपुट के लिए, आउटपुट के 500 μL के साथ टीका।
    2. 200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. 1 x 1010 PFU / mL की अंतिम एकाग्रता के लिए M13K07 सहायक फेज जोड़ें।
    4. 200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    5. संस्कृति के पूरे 3 मिलीलीटर को 2YT / carb / kan के 30 mL में स्थानांतरित करें। 200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ो।
    6. अगले दिन, संस्कृति को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को अवक्षेपित करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 11,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें।
    7. एक नया 50 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में supernatant decant और PEG / NaCl के 8 mL के साथ मिश्रण और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट।
    8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 11,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज, supernatant को छोड़ दें, और 2 मिनट के लिए फिर से सेंट्रीफ्यूज करें।
      नोट: दूसरी बार एक ही अभिविन्यास में रोटर में ट्यूब रखो क्योंकि यह गोली को एक ही स्थान पर रखने वाला पहला था, इसलिए, इसे देखना आसान हो गया।
    9. पीबीटी के 800 μL में फेज पैलेट को फिर से निलंबित करें ताकि यह पूरी तरह से समरूप हो और कोई clumps दिखाई न दे।
    10. एक 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज पर फेज समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 मिनट के लिए 16,200 एक्स जी पर पेलेट मलबे में स्थानांतरित करें।
    11. supernatant एक नई microcentrifuge ट्यूब के लिए स्थानांतरण. यह चयन के अगले दौर के लिए इनपुट है।
  4. वैकल्पिक: इनपुट और आउटपुट समाधान टिटर.
    1. एक ई कोलाई बीज संस्कृति के 500 μL का उपयोग करने के लिए 2YT / tet के 5 mL को टीका लगाने के लिए और 200 rpm कक्षीय मिलाते हुए 37 °C पर इनक्यूबेट करें जब तक कि बैक्टीरिया मध्य-लॉग चरण (OD600 0.6Equation 1 - 0.8) में न हो। इसमें लगभग 1 घंटे लगते हैं।
    2. पीबीएस में 10-3 - 10-5 के लिए फेज इनपुट / आउटपुट समाधानों को पतला करें और सुसंस्कृत कोशिकाओं के 90 μL में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 μL जोड़ें।
      नोट: पतला फेज समाधान का तुरंत उपयोग करें क्योंकि फेज समय के साथ ट्यूब को adsorb करेगा, और रूपांतरणों झूठी नकारात्मक का उत्पादन कर सकते हैं।
    3. 200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    4. अलग एलबी / कार्ब प्लेटों पर प्लेट 5 μL।
      नोट: मढ़वाया राशि चर है पिछले परिणामों / व्यक्तिगत वरीयता पर निर्भर करता है।

6. चयन के बाद के दौर

  1. तैयारी के साथ-साथ सभी बाद के दौर ों को करें जैसा कि क्रमशः चरण 3 और 4 में किया गया है, नीचे उल्लिखित मतभेदों के साथ।
    1. पिछले दौर में उत्पादित इनपुट का उपयोग लाइब्रेरी के बजाय फेज स्रोत के रूप में करें। पिछले दौर से प्राप्त फेज इनपुट के 100 μL के साथ प्रति लक्ष्य प्रोटीन 4 कुओं कोट करें। शेष फेज इनपुट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. चयन के प्रत्येक दौर के साथ 4.5.1 में धोने के कदम को और अधिक कठोर बनाएं। राउंड वन को 4 बार धोने की आवश्यकता होती है, राउंड दो को 6 बार की आवश्यकता होती है, राउंड तीन को 8 बार की आवश्यकता होती है, और राउंड चार और पांच दोनों को 10 बार धोने की आवश्यकता होती है।
    3. राउंड एक में उपयोग किए जाने वाले लोगों की तुलना में कुछ मात्राओं को कम करें क्योंकि बाद के दौर केवल आठ के बजाय चार कुओं को कोट करते हैं। उदाहरण के लिए, चरण 4.5.5 में फेज आउटपुट में केवल 10% बीएसए के 45 μL को जोड़ा जाता है, और चरण 5.3.1 में फेज आउटपुट के केवल 250 μL का उपयोग कोशिकाओं को टीका लगाने के लिए किया जाता है।

7. पोस्ट चयन प्रसंस्करण और फेज अलगाव

  1. चार और पांच दौर के लिए इनपुट और आउटपुट समाधान टिटर.
    1. यदि चरण 5.4 में पहले से ही नहीं किया गया है, तो चार और पांच फेज आउटपुट के दौर के लिए समान चरणों का पालन करें, आदर्श रूप से कुछ प्लेटों में 30-300 कॉलोनियों की एक श्रृंखला का उत्पादन करें।
  2. संस्कृति और फेज को अलग करना।
    1. एक 96 मिनी ट्यूब संस्कृति बॉक्स की हर ट्यूब में 2YT / carb / M13K07 के 450 μL एलीकोट।
    2. प्रत्येक ट्यूब को टीका लगाने के लिए चरण 7.1 से किसी भी प्लेट से अच्छी तरह से अलग-थलग कॉलोनियों को चुनें।
      नोट:: राउंड चार outputs के लिए बॉक्स के शीर्ष आधे और दौर पांच outputs के लिए नीचे आधे का उपयोग करें।
    3. 200 आरपीएम कक्षीय मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1,200 x g पर सेंट्रीफ्यूज।
    5. सेल गोली को परेशान किए बिना एक नए 96 मिनी ट्यूब संस्कृति बॉक्स में जितना संभव हो उतना supernatant स्थानांतरित करें और पुराने को त्याग दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. नए बॉक्स से, प्रत्येक ट्यूब से 100 μL को 96 अच्छी तरह से गैर-बाध्यकारी प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें सभी कुओं में 50% ग्लिसरॉल के 100 μL होते हैं। अच्छी तरह से मिश्रण और एक बैकअप स्टॉक के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

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Representative Results

फेज डिस्प्ले से उत्पादित बाइंडर्स को कई तरीकों से सत्यापित और विश्लेषण किया जा सकता है। यह पहले प्राइमरों के साथ फेज अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ने की सिफारिश की जाती है जो फेजेमिड लाइब्रेरी में विविध सम्मिलित करते हैं। एक आदर्श फेज डिस्प्ले प्रयोग कई अनुक्रमों (चित्रा 1) के प्रति एक स्पष्ट पूर्वाग्रह दिखाएगा। अन्य अनुक्रम भी मौजूद होंगे लेकिन कम गिनती के साथ, पृष्ठभूमि शोर के रूप में अधिक दिखाई देते हैं। प्रदान किए गए उदाहरण में, जहां फेज डिस्प्ले यूबिकिटिन वेरिएंट (यूबीवी) और वाइल्डटाइप यूबीई 4 बी के बीच किया गया था, वहां # 1-4 अनुक्रमों के प्रति एक विशेष पूर्वाग्रह है। अनुक्रमण फ़ाइलों को व्यवस्थित करने और उनका विश्लेषण करने के लिए एक उदाहरण पायथन स्क्रिप्ट प्रदान की गई है ("phageDisplaySeqAnalysis.py")। बाइंडर्स के महत्व की पुष्टि करने के लिए, एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसोर्बेंट एसेस (एलिसा) का उपयोग वाइल्डटाइप लक्ष्य प्रोटीन, उत्परिवर्तित लक्ष्य प्रोटीन, साथ ही ऑफ-टारगेट प्रोटीन (चित्रा 1) के सापेक्ष बाध्यकारी संबंध के त्वरित उपाय के रूप में किया जा सकता है। नए बाइंडर्स और वाइल्डटाइप बाइंडिंग प्रोटीन के बीच बाध्यकारी संबंधों में अंतर, जिस पर नए बाइंडर आधारित थे, को बाइंडर्स के एलिसा अवशोषण को वाइल्डटाइप प्रोटीन (नहीं दिखाया गया) या अन्य प्रोटीनों के लिए सामान्य करके निर्धारित किया जा सकता है जो लक्ष्य प्रोटीन के साथ कोई प्रशंसनीय बंधन प्रदर्शित नहीं करते हैं (चित्रा 1)। यह उदाहरण लक्षित प्रोटीन के लिए उच्च बाध्यकारी आत्मीयता रखने के लिए समृद्ध अनुक्रमों की प्रवृत्ति को दर्शाता है। अनुक्रमण फ़ाइलों को व्यवस्थित करने और उनका विश्लेषण करने के लिए एक उदाहरण पायथन स्क्रिप्ट प्रदान की गई है ("phageDisplayElisaAnalysis.py")। इसके अतिरिक्त, विशेष रूप से UbV परिणामों का विश्लेषण करने के लिए एक उदाहरण पायथन स्क्रिप्ट प्रदान की गई है ("phageDisplayUbvAnalysis.py")। आदर्श रूप से, बाइंडर अनुक्रम जो अधिक संख्या में हैं, कम कई अनुक्रमों की तुलना में उच्च सापेक्ष बाध्यकारी आत्मीयता के अधिकारी होंगे, जो संभवतः पृष्ठभूमि शोर हैं। यह संभव है कि अस्थिर बाइंडर्स संख्या में कम होंगे, लेकिन ELISAs के माध्यम से प्रशंसनीय बाध्यकारी प्रदर्शित करेंगे। इन बाइंडर्स को यह निर्धारित करने के लिए आगे की जांच की जानी चाहिए कि क्या एलिसा स्कोर कलाकृतियां हैं या यदि वे वास्तव में आगे के लक्षण वर्णन के योग्य बाइंडर हैं।

Figure 1
चित्रा 1: UBE4B के खिलाफ एक ubiquitin संस्करण (UbV) चयन के लिए प्रतिनिधि परिणाम. (A) UbVs उच्चतम से सबसे कम आवृत्ति (गिनती) के लिए आदेश दिया गया था। अनुक्रम सभी यादृच्छिक अवशेषों (विशेष रूप से, अवशेष 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68, और 70-78) के साथ यूबीवी में विविध यूबिकिटिन क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं। सभी एलिसा absorbances 96 औसत बीएसए एलिसा स्कोर और 96 औसत जीएसटी एलिसा स्कोर के खिलाफ सामान्यीकृत किया गया था। गहरा हरा मजबूत सापेक्ष बंधन का प्रतिनिधित्व करता है। जीएसटी को इस तथ्य के कारण गैर-विशिष्ट बाध्यकारी के लिए एक नियंत्रण के रूप में शामिल किया गया था कि लक्ष्य प्रोटीन जीएसटी-टैग किया गया है। (B) पैनल A से एलिसा परिणामों का ग्राफ़िकल सारांश . कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2. फेज प्रदर्शन करने के लिए चरणों का सुझाया गया क्रम। डैश्ड लाइनें उन प्रक्रियाओं को इंगित करती हैं जो अगले दिन या पिछले दिन से ले जाया जाता है। राउंड तीन के बाद के सभी बाद के राउंड राउंड राउंड तीन के समान आगे बढ़ते हैं, राउंड पांच को छोड़कर जहां कोई फेज इनपुट तैयारी आवश्यक नहीं है जब तक कि अधिक राउंड नहीं किए जा रहे हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3. एक फेज प्रदर्शन प्रयोग की स्थापना के लिए labware और लेबल का सुझाव दिया. प्रोटोकॉल में उद्देश्य और प्रासंगिक चरणों को इंगित किया गया है। आर: दौर; मैं: इनपुट; ओ: आउटपुट. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4. फेज प्रदर्शन प्रक्रिया के दौरान सामना किए गए विशिष्ट छर्रों की उपस्थिति। फेज लाइब्रेरी गोली ट्यूब के पक्ष में एक लकीर के रूप में प्रस्तुत करता है और ट्यूब के नीचे गोली को केंद्रित करने के लिए रिस्ट्रीफ्यूज किया जा सकता है। फेज इनपुट छर्रों और मलबे छर्रों अधिक विशिष्ट दिखाई देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पायथन लिपियों. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

जैसा कि चरण 2.1 (प्रोटीन तैयारी) में उल्लेख किया गया है, प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, और प्रत्येक में फेज डिस्प्ले के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट लक्ष्य प्रोटीन के आधार पर अद्वितीय लाभ और कमियां होंगी। लोकप्रिय तरीकों के लिए विस्तृत विवरण और प्रोटोकॉल का एक स्रोत पहले प्रदान किया गया है11.

फेज डिस्प्ले के पिछले दौर द्वारा बनाए रखे गए फेज का उपयोग करके बाद के दौर के लिए इनपुट धीरे-धीरे बाइंडर्स को हटाकर अच्छे बाइंडर्स को समृद्ध करता है जो कमजोर, क्षणिक रूप से, या संयोग से बाध्य होते हैं। राउंड चार और पांच तक आदर्श रूप से पेप्टाइड अनुक्रमों के एक छोटे और विशिष्ट सेट की ओर एक स्पष्ट पूर्वाग्रह होगा, जो लक्ष्य प्रोटीन की बाध्यकारी प्राथमिकताओं का प्रदर्शन करता है।

इस प्रोटोकॉल को एक UbV लाइब्रेरी के साथ उपयोग के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है। हालांकि ये चरण आम तौर पर अन्य प्रकार के पुस्तकालयों (जैसे, पेप्टाइड, एंटीबॉडी, आदि) के लिए लागू हो सकते हैं, उन्हें इस तरह के गैर-यूबीवी पुस्तकालयों को समायोजित करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। जैसा कि चरण 4.3.1 में उल्लेख किया गया है, फेज डिस्प्ले के साथ आगे बढ़ने से पहले पुस्तकालय विविधता और एकाग्रता को जाना जाना चाहिए। इन लायब्रेरी विशेषताओं को कैसे निर्धारित किया जाता है, इस बारे में अधिक जानकारी के लिए, कृपया इस प्रक्रिया में उपयोग किए गए UbV लायब्रेरीज़ बनाने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल देखें12.

फेज प्रदर्शन परिणाम बहुत स्पष्ट कटौती हो सकते हैं और आगे के लक्षण वर्णन को आगे बढ़ाने के लिए स्पष्ट उम्मीदवार बाइंडर पेश कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, बाइंडर जो दोनों अत्यधिक लगातार होते हैं और एलिसा द्वारा मापा जाता है, काफी अधिक बाध्यकारी होते हैं, आगे के अध्ययन के लिए स्पष्ट उम्मीदवार हैं। हालांकि, जब किसी विशेष बाइंडर की आवृत्ति एलिसा डेटा के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबंधित नहीं होती है, तो यह दिलचस्प बाइंडर्स को एकल करने के तरीके के रूप में कुछ भ्रम पेश कर सकता है। प्रदान किए गए उदाहरण (चित्रा 1) में, सबसे आम बाइंडर्स का एक संयोजन चुनने की सिफारिश की जाएगी, भले ही उनके पास कम बाध्यकारी आत्मीयता हो, और उच्च बाध्यकारी आत्मीयता वाले लोग, भले ही वे कभी-कभी दिखाई देते हों। फेज डिस्प्ले के दौरान अस्थिरता के कारण उच्च एलिसा स्कोर वाले अक्सर बाइंडर्स उतने आम नहीं हो सकते हैं, जो इस अंतिम डेटा में उनके प्रसार को नकारात्मक रूप से प्रभावित करेंगे। जैसे, ये अत्यधिक लगातार बाइंडर्स के रूप में ज्यादा जांच के लायक हैं।

पृथक फेज समाधान आसानी से दूषित हो सकते हैं। प्राइमरों का उपयोग करके जितनी जल्दी हो सके डीएनए अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ने की सिफारिश की जाती है जो विविध पेप्टाइड के क्षेत्र को फ्लैंक करते हैं। एक अन्य विशिष्ट पोस्ट-डिस्प्ले विश्लेषण उनके लक्ष्य प्रोटीन के साथ बाइंडर्स के ELISAs प्रदर्शन करना है। इसके अतिरिक्त, ELISAs को बाइंडर्स और उनके लक्षित प्रोटीन के उत्परिवर्तित / कटे हुए संस्करणों के साथ किया जा सकता है, जो उनके संभावित बाध्यकारी मोड का एक मोटा विचार दे सकता है। यह ध्यान रखना बहुत महत्वपूर्ण है कि किसी भी प्रयोग में उपयोग करने से पहले फेज समाधानों को अच्छी तरह से मिलाया जाना चाहिए यदि वे थोड़ी देर के लिए बैठे हैं। फेज ट्यूब की दीवारों को adsorb कर सकता है या समाधान से बाहर निकल सकता है और झूठी नकारात्मक का उत्पादन कर सकता है।

इस प्रक्रिया को पूरा करने का सबसे समय-कुशल तरीका चित्र 2 में चित्रित किया गया है। अगले दिन बाद के दौर के लिए फेज इनपुट को बढ़ाने के लिए आवश्यक जीवाणु संस्कृति तैयार करने के साथ हर दौर शुरू करें। जबकि यह संस्कृति बढ़ रही है, लेपित प्लेटों को अवरुद्ध किया जा सकता है। जबकि प्लेटों को अवरुद्ध किया जा रहा है, पुस्तकालय को तैयार किया जा सकता है (राउंड वन के लिए) या फेज इनपुट तैयार किया जा सकता है (बाद के दौर के लिए)। राउंड चार के दिन बीज संस्कृति तैयार करने की कोई आवश्यकता नहीं होती है और इस प्रकार राउंड पांच के दिन अगले दौर के फेज इनपुट के लिए कोई तैयारी करने की आवश्यकता नहीं होती है जब तक कि कोई चयन के पांच से अधिक दौर करने का इरादा नहीं रखता है। समय को और अधिक कम करने के लिए, एक सुझाया गया लैबवेयर सेटअप भी प्रदान किया गया है (चित्रा 3)। इसके अतिरिक्त, फेज छर्रों हमेशा अलग नहीं होते हैं, इसलिए इस प्रक्रिया के दौरान सामना किए गए विशिष्ट पैलेट दिखावे की तस्वीरें प्रदान की गई हैं (चित्रा 4)।

यदि बाद के दौर के लिए इनपुट की तैयारी के दौरान फेज को पैलेट करने के साथ कोई समस्या है, तो प्रयोग को एक दिन के लिए रोकने की आवश्यकता हो सकती है जबकि नए फेज उगाए जाते हैं। ये उस दौर के लिए इनपुट के लिए ट्यूबों में सहेजे गए फेज पर वापस जाकर पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यदि प्रदर्शन के तीसरे दौर के लिए आवश्यक फेज को किसी कारण से गोली नहीं लगाई जा सकती है, तो आप "R3I" ट्यूब पर वापस आ सकते हैं जिसमें राउंड तीन के लिए फेज इनपुट का 400 μL होता है। यह केवल एक बार दोहराया जा सकता है यदि 100 μL के साथ चार कुओं को कोटिंग करें।

चार से पांच राउंड के लिए आउटपुट फेज का टिटर आमतौर पर 106 से 108 पीएफयू / एमएल की सीमा में होता है। यदि टिटरिंग ब्याज का नहीं है, तो बस 96 ट्यूब मिनी संस्कृति बॉक्स को भरने के लिए पर्याप्त उपनिवेश मौजूद होने से फेज विविधता का सटीक प्रतिनिधित्व प्रदान करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए और टिटर जरूरी नहीं है। हालांकि, यदि आउटपुट फेज का टिटर कम है और अधिक उपनिवेश वांछित हैं, तो फेज को चरण 5.3 को दोहराकर पुन: प्रवर्धित किया जा सकता है। अनिवार्य रूप से, फेज को वांछित चयन दौर के लिए आउटपुट लेने, मध्य-लॉग चरण कोशिकाओं को टीका लगाने, सहायक फेज और कार्बेनिसिलिन को जोड़कर, रातभर संस्कृति को बढ़ाकर, और पीईजी वर्षा के माध्यम से फेज की कटाई करके फिर से बढ़ाया जा सकता है जैसा कि पहले वर्णित है।

अन्य प्रदर्शन विधियां मौजूद हैं, और प्रत्येक के पास फेज डिस्प्ले के सापेक्ष अपने फायदे और कमियां हैं। विवो प्रदर्शन विधियों में, जैसे कि सेल-सतह प्रदर्शन, उचित प्रोटीन तह की संभावना को बढ़ा सकता है और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को होने की अनुमति भी दे सकता है; हालांकि, इन विधियों को काफी छोटे पुस्तकालय आकार 13 का उपयोग करने और प्रोटीन polyvalently व्यक्त करने के लिए होने से विवश कर रहे हैं। Polyvalent अभिव्यक्ति avidity प्रभाव है कि के साथ हस्तक्षेप और पेप्टाइड के आंतरिक आत्मीयता, जो अधिक से अधिक ब्याज की है जब उपन्यास बाइंडर्स उत्पन्न करने के लिए मुखौटा का परिचय देता है. फेज डिस्प्ले इस मुद्दे को बाईपास करता है क्योंकि इसे मोनोवैलेंट डिस्प्ले के लिए अनुकूलित किया गया है, जिससे वास्तव में बेहतर संबंधों के साथ बाइंडर्स के चयन की सुविधा मिलती है14,15,16। अन्य इन विट्रो डिस्प्ले विधियों को इसी तरह इन विवो डिस्प्ले विधियों की सीमाओं से बाधित नहीं किया जाता है, लेकिन अपनी अनूठी चुनौतियों को प्रस्तुत करते हैं। उदाहरण के लिए, राइबोसोम डिस्प्ले का उपयोग बड़े पुस्तकालयों (1013-14)17 की जांच करने के लिए किया जा सकता है, हालांकि, चयन का आउटपुट एमआरएनए अणुओं के रूप में होता है जो फेज डिस्प्ले 18 के फेज-एनकैप्सुलेटेड डीएनए आउटपुट की तुलना में स्वाभाविक रूप से कम स्थिर होते हैं। अन्य इन विट्रो डिस्प्ले विधियों, जैसे कि mRNA / cDNA डिस्प्ले, सीआईएस गतिविधि-आधारित डिस्प्ले (सीआईएस) और सहसंयोजक एंटीबॉडी डिस्प्ले (सीएडी) ने दक्षता, स्थिरता और असंगतता 19,20,21,22,23 के साथ समस्याओं का प्रदर्शन किया है।

फेज प्रदर्शन स्वयं पुस्तकालय के आकार द्वारा सीमित है जो जीवाणु परिवर्तन की दक्षता द्वारा प्रतिबंधित किया जा रहा है और फेज / बैक्टीरियल विकास के साथ हस्तक्षेप करने वाले अनुक्रमों के साथ पुस्तकालयों की अनुमति नहीं देकर 16, लेकिन आम तौर पर, ये सीमाएं नगण्य हैं, और फेज प्रदर्शन लक्ष्य प्रोटीन के अत्यधिक विशिष्ट और शक्तिशाली बाइंडर्स का उत्पादन करने में सफल रहा है2,5,10,24, २५ । इसका उपयोग न केवल चिकित्सा अनुसंधान में नए चिकित्सीय विकसित करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि प्रोटीन और एंजाइम विशेषताओं को स्पष्ट करने और महत्वपूर्ण जैविक मार्गों में शामिल प्रोटीन इंटरैक्शन के बारे में अधिक जानने के लिए भी किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यूबिकिटिन वेरिएंट तकनीक को डॉ सचदेव सिद्धू (टोरंटो विश्वविद्यालय) की प्रयोगशाला में तैयार किया गया था। WZ वर्तमान में मनुष्यों और माइक्रोबायोम कार्यक्रम में एक CIFAR Azrieli ग्लोबल स्कॉलर है। इस शोध को NSERC डिस्कवरी ग्रांट्स द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो WZ (RGPIN-2019-05721) को दिया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

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References

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