Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Использование фагового дисплея для разработки модуляторов вариантов убиквитина для лигазов E3

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

Убиквитинация является критической посттрансляционной модификацией белка, дисрегуляция которой была вовлечена в многочисленные заболевания человека. Этот протокол подробно описывает, как фаговый дисплей может быть использован для выделения новых вариантов убиквитина, которые могут связывать и модулировать активность лигазов E3, которые контролируют специфичность, эффективность и паттерны убиквитинирования.

Abstract

Убиквитин представляет собой небольшой белок 8,6 кДа, который является основным компонентом системы убиквитин-протеасома. Следовательно, он может связываться с разнообразным массивом белков с высокой специфичностью, но низкой аффинностью. С помощью фагового дисплея варианты убиквитина (UbV) могут быть спроектированы таким образом, что они демонстрируют улучшенное сродство к убиквитину дикого типа и сохраняют специфичность связывания с целевыми белками. Фаговый дисплей использует библиотеку фагемидов, в соответствии с которой белок оболочки pIII нитевидного бактериофага M13 (выбранный потому, что он отображается снаружи на поверхности фага) сливается с UbVs. Специфические остатки убиквитина дикого типа человека мягкие и рандомизированные (т.е. существует уклон в сторону нативной последовательности диких типов) для генерации UbV, чтобы избежать вредных изменений в конформации белка при одновременном введении разнообразия, необходимого для содействия новым взаимодействиям с целевым белком. Во время процесса отображения фагов эти UbV экспрессируются и отображаются на белках фаговой оболочки и сравниваются с интересующим белком. UbV, которые демонстрируют благоприятные связывающие взаимодействия с целевым белком, сохраняются, в то время как плохие связующие смываются и удаляются из библиотечного пула. Сохраненные UbV, которые присоединены к фаговой частице, содержащей соответствующий фагемид UbV, элюируют, усиливают и концентрируют таким образом, чтобы их можно было панорамировать против того же целевого белка в другом раунде фагового дисплея. Как правило, выполняется до пяти раундов отображения фагов, во время которых сильное давление отбора накладывается на UbV, которые связываются слабо и / или беспорядочно, так что те, у кого более высокое сродство, концентрируются и обогащаются. В конечном счете, UbV, которые демонстрируют более высокую специфичность и /или сродство к целевому белку, чем их аналоги дикого типа, выделяются и могут быть охарактеризованы с помощью дальнейших экспериментов.

Introduction

Понимание молекулярных деталей белково-белковых взаимодействий имеет решающее значение для определения механизмов сигнальной трансдукции биологических процессов, особенно тех, которые способствуют клинически важным заболеваниям. В последние годы фаговой дисплей использовался в качестве практичного и доступного метода выделения белков/пептидов с значительно улучшенным связыванием с желаемым целевым белком1,2,3,4, который, в свою очередь, может быть использован в качестве внутриклеточных зондов белково-белковых взаимодействий.

Убиквитинирование представляет собой каскад ферментативной активности (активирующий фермент E1 → конъюгирующий фермент E2 → лигазы E3), которые ковалентно конъюгируют убиквитин (Ub) с белковыми субстратами, чтобы нацелить их на деградацию или опосредовать изменения клеточной сигнализации. Кроме того, деубиквитиназы катализируют удаление убиквитина из белков. Таким образом, в клетках существуют тысячи Ub-зависимых белково-белковых взаимодействий, подавляющее большинство из которых распознают общую поверхность с низким сродством, но высокой специфичностью, чтобы обеспечить слабые взаимодействия через большие и разнообразные поверхности.

Ernst et al. ввели мутации в известные области связывания Ub, чтобы увидеть, могут ли они повысить сродство связывания с интересующим белком, сохраняя при этом высокую селективность5. Была разработана комбинаторная библиотека из более чем 10 миллиардов (7,5 x 1010) вариантов Ub (UbV) с мутациями в положениях по всей поверхности Ub, которые опосредуют известные взаимодействия Ub-белка. Эта библиотека состояла из фагемидов, которые экспрессируют белок оболочки бактериофага PIII M13, слитый с диверсифицированными UbV. Таким образом, отдельные UbV могут отображаться на поверхности фага через белок оболочки при экспрессии. Во время процесса селекции фаг, который отображает UbV со значительными связывающими взаимодействиями с целевым белком, будет сохранен и обогащен в последующих раундах отображения фагов, тогда как фаг, отображающий UbV, которые плохо связываются с целевым белком, смывается и удаляется из фагового пула. Сохраненные фаговые частицы содержат фагемид, соответствующий их отображаемому UbV, что позволяет секвенировать их и дополнительно характеризовать после выделения.

Используя эту стратегию белковой инженерии, ингибиторы UbV были разработаны для человеческих деубиквитиназ5 и вирусных протеаз6. Важно отметить, что мы создали ингибирующие UbV для человеческих лигазов E3 семейства HECT путем захвата сайта связывания E2 и активации UbV, которые занимают Ub-связывающий экзозит на домене HECT7. Мы также можем ингибировать мономерные RING-семейства E3s, нацеливаясь на сайт связывания E2 и индуцируя димеризацию UbV для активации гомодимерного RING E3s8. Для многосубъединичных RING E3s UbV могут достигать ингибирования путем нацеливания на субъединицу RING (например, для комплекса APC/C9) или нарушения образования комплекса (например, для SCF E3s10). В совокупности UbV могут быть использованы для систематического опроса белково-белковых взаимодействий в системе Ub-протеасом (UPS), чтобы мы могли лучше расшифровать биохимические механизмы ферментов UPS, а также идентифицировать и проверить функциональные сайты для терапевтического вмешательства.

Следующий протокол описывает, как использовать ранее сгенерированную фаговую отображаемую библиотеку UbV для нацеливания на интересующий белок и как обогатить связующие вещества UbV, которые взаимодействуют с целевым белком посредством последовательных раундов отображения фагов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов

  1. PBS (фосфатно-буферный физиологический раствор): Смешайте 50 мл 10-кратного раствора PBS с 450 мл сверхчистого H2O. Стерилизуйте фильтрацией и храните при 4 °C или комнатной температуре (~20-25 °C).
  2. 10% BSA (бычий сывороточный альбумин): Медленно добавляйте 1 г BSA к 7 мл сверхчистого H2O и перемешивайте до полного растворения (без сгустков). Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 10 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
  3. Буфер PB (PBS, дополненный 1% BSA): Медленно добавляйте 5 г BSA к 400 мл сверхчистого H2O и 50 мл PBS и перемешивайте до полного растворения (без сгустков). Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 500 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
  4. Буфер PBT (PBS, дополненный 1% BSA и 0,05% Tween 20): Медленно добавьте 5 г BSA к 400 мл сверхчистого H2O и 50 мл PBS и перемешайте до полного растворения (без сгустков). Добавьте 250 мкл Tween 20. Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 500 мл. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
  5. БУФЕР PT (PBS с добавлением 0,05% Tween 20): Смешайте 1 мл Tween 20 с 400 мл PBS. Долить ультрачистым H2O до конечного объема 2 л. Стерилизовать фильтрацией и хранить при температуре 4 °C или комнатной температуре (~20-25 °C).
  6. 2YT бульон: Добавьте 16 г триптона, 10 г дрожжевого экстракта и 5 г NaCl до 800 мл ультрачистого H2O и перемешайте до полного растворения (без комков). Доливать ультрачистым H2O до конечного объема 1 л. Стерилизовать автоклавом и хранить при комнатной температуре (~20-25 °C).
  7. Пластины LB/carb: Добавьте 12,5 г готовой смеси LB и 7,5 г агара до 400 мл H2O. Добавьте ультрачистый H2O до конечного объема 500 мл и стерилизуйте автоклавированием. Убедитесь, что агар полностью растворен, и подождите, пока он остынет до температуры ниже 60 °C. Добавьте 500 мкл 100 мг мг карбенициллина, хорошо перемешайте и разлейте в тарелку. Хранить при температуре 4 °C.
  8. Пластины LB/tet: Добавьте 12,5 г готовой смеси LB и 7,5 г агара в 400 мл сверхчистого H2O. Добавьте ультрачистой H2O до конечного объема 500 мл и стерилизуйте автоклавированием. Убедитесь, что агар полностью растворен, и подождите, пока он остынет до температуры ниже 60 °C. Добавьте 500 мкл 10 мг мл тетрациклина, хорошо перемешайте и вылейте в тарелку. Хранить при температуре 4 °C.
  9. 20% ПЭГ (полиэтиленгликоль)/2,5 М NaCl: Добавьте 50 г ПЭГ-8000 и 36,5 г NaCl к 200 мл сверхчистого H2O. Смешайте до полного растворения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это может занять некоторое время; отопление может помочь. Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 250 мл. Стерилизуют путем фильтрации или автоклавирования.
  10. 0,1 M HCl: Смешайте 20 мл 1 M HCl со 180 мл сверхчистого H2O. Стерилизуйте фильтрацией и храните при комнатной температуре (~20-25 °C).
  11. 1 M Tris (pH 11,0): Добавьте 6,1 г основы Tris к 40 мл сверхчистого H2O. Отрегулируйте pH до 11,0 с HCl и перемешайте до полного растворения Tris. Доливайте ультрачистым H2O до окончательного объема 50 мл. Стерилизовать фильтрацией и хранить при комнатной температуре (~20-25 °C).
  12. 100 мг/мл (1000x) карбенициллина: Добавьте 2 г соли динатрия карбенициллина к 20 мл сверхчистого H2O. Перемешайте до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.
  13. 50 мг/мл (1000x) канамицина: Добавьте 1 г канамицина сульфата к 20 мл сверхчистого H2O. Перемешайте до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.
  14. 10 мг/мл (1000x) тетрациклина: Добавьте 0,2 г тетрациклина гидрохлорида к 20 мл 70% этанола. Перемешать до полного растворения. Стерилизуют фильтрацией и хранят при -20 °C.

2. Белковый препарат

  1. Определяют концентрацию целевого запаса белка в мкМ. Наиболее удобным способом оценки концентрации белка является измерение абсорбции белкового запаса при 280 нм. Если концентрация известна в мг/мл, преобразуйте ее в мкМ, используя молекулярную массу белка-мишени. В зависимости от интересующего белка может быть использован ряд методов; подробности см. в разделе Обсуждение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если белок усечен (специфический белковый домен/мотив) или помечен, не забудьте учесть эти изменения молекулярной массы при преобразовании из мг/мл в мкМ.
  2. Подготовьте три микроцентрифужные трубки с надписями «круглый 1», «круглый 2/3» и «круглый 4/5».
    1. Рассчитайте объем белка, необходимый для разбавления его до 1 мкМ в 800 мкл PBS и аликвотировать этот объем в пробирки без добавления PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если количество доступного целевого белка низкое, концентрация может быть снижена до 0,25 мкМ.

3. Подготовка к первому раунду отбора

  1. Подготовьте посевную культуру для культивирования фагового ввода для второго раунда селекции.
    1. Инокулируют 5 мл 2YT/tet хорошо изолированной колонией Escherichia coli и инкубируют ночью при 37 °C с орбитальным сотрясением 200 об/мин.
  2. Нанесите покрытие на тарелку для первого раунда отбора.
    1. Разбавьте целевой белок в «круглой 1» трубке с соответствующим количеством PBS и аликвотой 100 мкл в восемь лунок 96-луночной связующей пластины (т.е. целевой пластины).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фаговой дисплей может быть выполнен для четырех различных белков одновременно на одной пластине путем покрытия колодцев в углах пластины.
    2. Необязательный контроль: Если целевой белок помечен, например, GST или MBP (мальтозосвязывающий белок), покройте восемь лунок в другой 96-луночной связывающей пластине 100 мкл раствора 1 мкМ, содержащего соответствующую эпитопную метку. Это будет использоваться для удаления нежелательных фагов, которые связываются с тегом неспецифично.
    3. Встряхните пластину (пластины) в течение ночи при 4 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.

4. Первый раунд отбора

  1. Подготовьте вход второго раунда.
    1. Инокулируют 30 мл 2YT/tet 200 мкл семенной культуры со стадии 3.1.
    2. Инкубировать при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин до тех пор, пока бактерии не окажутся в средней фазе (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Это занимает примерно три часа.
  2. Блок целевой пластины.
    1. Снимите раствор покрытия с пластины или с обеих пластин, если была изготовлена контрольная пластина, путем инвертирования и встряхивания раковины. Вытрите насухо на бумажных полотенцах.
    2. Добавьте 300 мкл буфера ПБ к каждому покрытому колодцу.
    3. Удалите буфер PB, как показано на шаге 4.2.1, и добавьте еще 200 мкл буфера PB.
    4. Инкубировать при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
  3. Подготовьте фаговую библиотеку.
    1. Разморозьте библиотеку фагов на льду и разбавьте ее в 100 раз больше библиотечного разнообразия в PBS. Например, если разнообразие библиотек составляет 1 x 1010 , а концентрация библиотеки 1 x 1013, разбавьте библиотеку так, чтобы концентрация составляла 1 x 1012. Для библиотек, используемых здесь, разбавьте их в 10 раз в PBS, объединив 1 мл библиотеки с 9 мл PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Библиотечное разнообразие должно было быть определено во время создания библиотеки и не может быть легко оценено иначе. Концентрацию библиотеки можно определить путем инокуляции клеток кишечной палочки в средней фазе (OD600Equation 1 0,6 - 0,8) и нанесения покрытия на LB/carb.
    2. Добавить 1/5 объема ПЭГ/NaCl. Например, для 10 мл ранее разбавленной библиотеки добавьте 2 мл PEG/NaCl.
    3. Инкубировать на льду в течение 30 мин.
    4. Центрифуга при 11 000 х г в течение 30 мин при 4 °C, отбросьте супернатант и недавняя рифмуга в течение 2 мин, чтобы вытащить оставшийся супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубку в ротор в ту же ориентацию во второй раз, что и в первый раз, чтобы держать гранулу в том же месте, чтобы сделать ее более заметной.
    5. Осторожно повторно суспендировать гранулу фага в 1 мл ПБТ на белок. Для четырех белков повторно суспендируют гранулу в 4 мл ПБТ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не трогать гранулы и не вводите пузырьки воздуха.
  4. Покажите фаг целевому белку (белкам).
    1. Дополнительное управление: Добавьте 100 мкл библиотеки фагов в каждый хорошо покрытый на контрольной пластине. Инкубируют при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин и переносят библиотеку с управляющей пластины на целевую пластину. Пропустите шаг 4.4.2.
    2. Удалите буфер ПБ с целевой пластины, как показано на этапе 4.2.1, и добавьте 100 мкл библиотеки фагов в каждый хорошо покрытый.
    3. Инкубировать при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
  5. Элют вокруг одного фага.
    1. Извлеките библиотеку фагов и четыре раза вымойте покрытые оболочкой колодцы ПТ-буфером. Переверните тарелку и нажмите на бумажное полотенце, чтобы удалить последние капли.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если на одной пластине покрыты несколько белков-мишеней, постарайтесь свести к минимуму поток всех последующих растворов между скважинами.
    2. Добавьте 100 мкл 0,1 М HCl к каждой хорошо покрытой оболочке и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин с орбитальным встряхиванием 300 об/мин.
    3. Нейтрализуют рН, добавляя 12,5 мкл 1 М Трис-HCl (рН 11) к каждому хорошо покрытому.
    4. Объедините элюированный фаг из всех 8 скважин в одну микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Пипетка вверх и вниз во время переноса, чтобы сделать растворы однородными и аспирировать всю жидкость из скважин.
    5. Добавьте 10% BSA к объединенному элюированному фагу до конечной концентрации 1%. Для типичного круглого элюционного объема 950 мкл добавьте 95 мкл 10% BSA. Хранить при температуре 4 °C. Это круглый выход.

5. Подготовка к последующим раундам отбора

  1. Подготовьте посевную культуру для культивирования фагового ввода для следующего раунда отбора, как показано на шаге 3.1.
  2. Покройте пластину для третьего раунда отбора, как на этапе 3.2, с изменениями, указанными ниже.
    1. Только покрывайте четыре лунки на белок в 96-луночной связывающей пластине. Используйте половину содержимого «круглых 2/3» или «круглых 4/5» трубок для соответствующего раунда. Разбавьте содержимое этих пробирок по мере необходимости, чтобы избежать оседания белков из раствора.
  3. Подготовьте фаговые входные данные для следующего раунда отбора.
    1. Используйте половину круглого одного выхода из шага 4.5.5 для прививки 3 мл среднелогарифмических фазовых ячеек с шага 4.1. Для типичного круглого выхода инокулируют 500 мкл выхода.
    2. Инкубировать при 37 °C в течение 30 мин с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    3. Добавьте вспомогательный фаг M13K07 до конечной концентрации 1 x 1010 PFU/мл.
    4. Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    5. Переведите все 3 мл культуры в 30 мл 2YT/углевод/кан. Расти ночью при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    6. На следующий день переложите культуру в центрифужную трубку объемом 50 мл и центрифугу при 11 000 х г в течение 10 мин при 4 °C до осаждения клеток.
    7. Наполнителе в новую 50-литровую центрифужную трубку, смешайте с 8 мл ПЭГ/NaCl и инкубируйте на льду в течение 10 мин.
    8. Центрифуга при 11 000 х г в течение 10 мин при 4 °C, выбросьте супернатант и снова центрифугируйте в течение 2 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубку в ротор в ту же ориентацию во второй раз, что и в первый раз, чтобы держать гранулу в том же месте, чтобы сделать ее более заметной.
    9. Повторно суспендируйте гранулу фага в 800 мкл ПБТ, чтобы она была полностью однородной и не было видно сгустков.
    10. Переложите фаговый раствор в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и центрифугу при 16 200 х г в течение 4 мин при 4 °C в гранулированный мусор.
    11. Перенесите супернатант в новую микроцентрифужную трубку. Это входные данные для следующего раунда отбора.
  4. Дополнительно: Титр входных и выходных решений.
    1. Используйте 500 мкл посева семян E. coli для прививки 5 мл 2YT/тет и инкубации при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин до тех пор, пока бактерии не окажутся в средней фазе (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Это занимает примерно 1 ч.
    2. Разбавляют фаговые входные/выходные растворы до 10-3 - 10-5 в PBS и добавляют 10 мкл каждого разведения к 90 мкл культивируемых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте разбавленные фаговые растворы немедленно, потому что фаг будет адсорбироваться в трубке с течением времени, и превращения могут привести к ложноотрицательным результатам.
    3. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    4. Пластина 5 мкл на отдельных пластинах LB/carb.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество покрытия варьируется в зависимости от предыдущих результатов / личных предпочтений.

6. Последующие раунды отбора

  1. Выполните все последующие раунды вместе с подготовкой, как это было сделано на шагах 3 и 4, соответственно, с различиями, указанными ниже.
    1. Используйте входные данные, полученные в предыдущем раунде, в качестве фагового источника вместо библиотеки. Покрыть 4 лунки на целевой белок 100 мкл фагового входа, полученного из предыдущего раунда. Храните оставшиеся фаговые входы при 4 °C.
    2. Делайте шаг стирки в 4.5.1 более строгим с каждым раундом выбора. Первый раунд требует стирки 4 раза, второй раунд требует 6 раз, третий раунд требует 8 раз, а раунды четыре и пять требуют стирки 10 раз.
    3. Уменьшите некоторые объемы по сравнению с теми, которые используются в первом раунде, потому что последующие раунды покрывают только четыре скважины вместо восьми. Например, на стадии 4.5.5 только 45 мкл 10% BSA добавляют к выходу фага, а на стадии 5.3.1 только 250 мкл фагового выхода используется для инокуляции клеток.

7. Обработка после отбора и выделение фагов

  1. Титруйте входные и выходные решения для четвертого и пятого раундов.
    1. Если это еще не сделано на этапе 5.4, выполните те же шаги, чтобы титровать круги четырех и пяти фаговых выходов, в идеале производя диапазон в 30-300 колоний на нескольких пластинах.
  2. Культивировать и выделять фаги.
    1. Aliquot 450 мкл 2YT/carb/M13K07 в каждую трубку 96 мини-ящика для культуры.
    2. Выберите хорошо изолированные колонии из любой из пластин на этапе 7.1, чтобы привить каждую трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте верхнюю половину коробки для выходов четвертого раунда и нижнюю половину для выходов пятого раунда.
    3. Насиживайте в течение ночи при 37 °C с орбитальным встряхиванием 200 об/мин.
    4. Центрифуга при 1 200 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    5. Перенесите как можно больше супернатанта в новую коробку для культуры mini tube 96, не нарушая гранулу клетки, и выбросьте старую. Хранить при температуре 4 °C.
    6. Из новой коробки переложите 100 мкл из каждой трубки в 96 луночную несвязывающую пластину, содержащую 100 мкл 50% глицерина во всех скважинах. Хорошо перемешайте и храните при -80 °C в качестве резервного запаса.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Связующие вещества, полученные из фагового дисплея, могут быть проверены и проанализированы различными способами. Рекомендуется сначала приступить к секвенированию фага с помощью праймеров, которые обрамляют диверсифицированную вставку в библиотеке фагемид. Идеальный эксперимент с отображением фагов покажет явный уклон в сторону нескольких последовательностей (рисунок 1). Другие последовательности также будут присутствовать, но с меньшим количеством, появляясь больше как фоновый шум. В приведенном примере, где фаговое отображение выполнялось между вариантами убиквитина (UbVs) и диким типом UBE4B, существует особый уклон в сторону последовательностей #1-4. Приведен пример скрипта Python для организации и анализа файлов виртуализации («phageDisplaySeqAnalysis.py»). Чтобы подтвердить значимость связующих веществ, иммуноферментные анализы (ИФА) могут быть использованы в качестве быстрой меры относительного сродства связывания с целевым белком дикого типа, мутированным целевым белком, а также нецелевыми белками (рисунок 1). Различия в сродстве связывания между новыми связующими и связывающим белком дикого типа, на котором были основаны новые связующие вещества, могут быть определены путем нормализации абсорбции ИФА связующих веществ с поглощением белка дикого типа (не показано) или других белков, которые не демонстрируют заметного связывания с целевым белком (рисунок 1). Этот пример демонстрирует тенденцию обогащенных последовательностей иметь более высокое сродство связывания с целевым белком. Приведен пример скрипта Python для организации и анализа файлов виртуализации («phageDisplayElisaAnalysis.py»). Кроме того, был приведен пример скрипта Python специально для анализа результатов UbV («phageDisplayUbvAnalysis.py»). В идеале, более многочисленные связующие последовательности будут обладать более высоким относительным сродством связывания, чем менее многочисленные последовательности, которые, по-видимому, являются фоновым шумом. Возможно, что нестабильные связующие вещества будут малочисленными, но продемонстрируют заметное связывание с помощью ИФА. Эти связующие вещества должны быть дополнительно исследованы, чтобы определить, являются ли баллы ИФА артефактами или они действительно являются связующими, заслуживающими дальнейшей характеристики.

Figure 1
Рисунок 1: Репрезентативные результаты для выбора варианта убиквитина (UbV) против UBE4B. (A) UbV были упорядочены от самой высокой к самой низкой частоте (подсчеты). Последовательности представляют собой диверсифицированную область убиквитина в UbV со всеми рандомизированными остатками (в частности, остатками 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 и 70-78). Все поглощения ИФА были нормализованы по сравнению с 96 средними баллами BSA ELISA и 96 средними баллами GST ELISA. Более темный зеленый цвет представляет собой более сильную относительную привязку. GST был включен в качестве контроля для неспецифического связывания из-за того, что целевой белок помечен GST. (B) Графическое резюме результатов ИФА из панели A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2. Рекомендуемый порядок шагов для выполнения отображения фагов. Пунктирными линиями обозначены процессы, которые переносятся на следующий день или с предыдущего дня. Все последующие раунды после третьего раунда проходят аналогично третьему раунду, за исключением пятого раунда, где нет необходимости в подготовке фагового ввода, если не выполняется больше раундов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3. Рекомендуемая лабораторная посуда и этикетки для настройки эксперимента с отображением фагов. Цель и соответствующие шаги в протоколе указаны. R: круглый; I: ввод; O: выход. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4. Появление типичных гранул, встречающихся во время процедуры отображения фагов. Гранула из фаговой библиотеки представляет собой полосу вдоль боковой стороны трубки и может быть недавно измельчена, чтобы сконцентрировать гранулу в нижней части трубки. Фаговые входные гранулы и гранулы мусора выглядят более типичными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Скрипты Python. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Как упоминалось на этапе 2.1 (получение белка), для оценки концентрации белка могут быть использованы различные методы, и каждый из них будет иметь уникальные преимущества и недостатки, основанные на конкретном целевом белке, используемом для отображения фагов. Источник подробных описаний и протоколов для популярных методов был предоставлен ранее11.

Использование фага, сохраненного предыдущим раундом отображения фагов, в качестве входных данных для последующего раунда обогащает хорошие связующие путем постепенного удаления связующих, которые связываются слабо, временно или случайно. К четвертому и пятому раундам в идеале будет явный уклон в сторону небольшого и специфического набора пептидных последовательностей, демонстрирующих связывающие предпочтения целевого белка.

Этот протокол оптимизирован для использования с библиотекой UbV. Хотя эти этапы могут в целом применяться к другим видам библиотек (например, пептидам, антителам и т.д.), их, вероятно, потребуется адаптировать для размещения таких библиотек, не относящихся к UbV. Как упоминалось на этапе 4.3.1, разнообразие и концентрация библиотек должны быть известны до того, как приступать к отображению фагов. Дополнительные сведения об определении атрибутов этих библиотек см. в разделе Протокол, используемый для создания библиотек UbV, используемых в этой процедуре12.

Результаты отображения фагов могут быть очень четкими и представлять собой очевидные связующие вещества-кандидаты для дальнейшей характеристики. Например, связующие вещества, которые очень часты и имеют значительно более высокое связывание, измеренное С помощью ИФА, являются явными кандидатами для дальнейшего изучения. Однако, когда частота конкретного связующего вещества не коррелирует положительно с данными ИФА, это может представлять некоторую путаницу в отношении того, как выделить интересные связующие. В приведенном примере (рисунок 1) было бы рекомендовано выбрать комбинацию наиболее распространенных связующих, даже если они имеют низкое сродство связывания, и связующих с более высоким сродством связывания, даже если они кажутся нечастыми. Нечастые связующие с высокими показателями ИФА могут быть не так распространены из-за нестабильности во время отображения фагов, что негативно повлияет на их распространенность в этих окончательных данных. Таким образом, их стоит исследовать так же, как и очень частые связующие.

Изолированные фаговые растворы могут быть легко загрязнены. Рекомендуется как можно скорее приступить к секвенированию ДНК с помощью праймеров, которые обрамляют область диверсифицированного пептида. Другим типичным анализом после отображения является выполнение ИФА связующих с их целевым белком. Кроме того, ИФА могут быть выполнены со связующими и мутированными/усеченными версиями их целевых белков, что может дать приблизительное представление об их вероятном режиме связывания. Очень важно отметить, что фаговые растворы следует хорошо смешивать перед использованием в любом эксперименте, если они сидели некоторое время. Фаг может адсорбироваться в стенках трубки или оседать из раствора и может производить ложноотрицательные результаты.

Наиболее эффективный по времени способ проведения этой процедуры проиллюстрирован на рисунке 2. Начинайте каждый раунд с подготовки бактериальной культуры, необходимой для выращивания фагового ввода для последующего раунда на следующий день. Пока эта культура растет, покрытые пластины могут быть заблокированы. Пока пластины блокируются, библиотека может быть подготовлена (для первого раунда) или фаговый вход может быть подготовлен (для последующих раундов). В день четвертого раунда нет необходимости готовить посевную культуру, и, следовательно, в день пятого раунда нет необходимости делать какие-либо приготовления к вводу фагов следующего раунда, если только не предполагается сделать более пяти раундов отбора. Для дальнейшей экономии времени также была предложена настройка лабораторного поттера (рисунок 3). Кроме того, фаговые гранулы не всегда различимы, поэтому были предоставлены изображения типичных проявлений гранул, встречающихся во время этой процедуры (рисунок 4).

Если есть какие-либо проблемы с гранулированием фага во время подготовки входных данных для последующего раунда, эксперимент, возможно, придется остановить на день, пока выращивают новый фаг. Их можно восстановить, вернувшись к фагу, сохраненному в пробирках для ввода для этого раунда. Например, если фаг, необходимый для третьего раунда отображения, по какой-то причине не может быть гранулирован, вы можете вернуться в трубку «R3I», которая содержит 400 мкл фагового входа для третьего раунда. Это может быть повторено только один раз, если покрыть четыре скважины 100 мкл.

Титр выходного фага для раундов от четырех до пяти обычно находится в диапазоне от 106 до 108 ПФУ/мл. Если титрование не представляет интереса, просто наличие достаточного количества колоний для заполнения коробки с 96-трубной мини-культурой должно быть достаточным для обеспечения точного представления разнообразия фагов, и титр не обязательно имеет значение. Однако, если титр выходного фага низкий и требуется больше колоний, фаг может быть повторно усилен путем повторения шага 5.3. По сути, фаг может быть реамплифицирован путем получения выхода для желаемого раунда отбора, инокуляции клеток средней фазы, добавления фага-помощника и карбенициллина, выращивания культуры в течение ночи и сбора фага через осаждение ПЭГ, как описано ранее.

Существуют и другие методы отображения, и каждый из них обладает своими преимуществами и недостатками по сравнению с фаговым отображением. Методы индикации in vivo, такие как отображение на клеточной поверхности, могут увеличить вероятность надлежащего сворачивания белка, а также позволяют происходить посттрансляционные модификации; однако эти методы ограничены необходимостью использования значительно меньших размеров библиотек13 и поливалентной экспрессии белков. Поливалентная экспрессия вводит эффекты авидности, которые мешают и маскируют внутреннее сродство пептида, что представляет больший интерес при создании новых связующих веществ. Фаговый дисплей обходит эту проблему, поскольку он был адаптирован для моновалентного отображения, тем самым облегчая выбор связующих с действительно улучшенными сходствами14,15,16. Другие методы отображения in vitro также не ограничены ограничениями методов отображения in vivo, но представляют свои собственные уникальные проблемы. Например, рибосомный дисплей может быть использован для зондирования более крупных библиотек (1013-14)17, однако выход селекции осуществляется в виде молекул мРНК, которые по своей природе менее стабильны, чем фагово-инкапсулированный выход ДНК фагового дисплея18. Другие методы отображения in vitro, такие как отображение мРНК/кДНК, дисплей на основе цис-активности (CIS) и дисплей ковалентных антител (CAD), продемонстрировали проблемы с эффективностью, стабильностью и несогласованностью19,20,21,22,23.

Сам фаговый дисплей ограничен размерами библиотек, которые ограничены эффективностью бактериальной трансформации и не допускают библиотек с последовательностями, которые мешают росту фагов / бактерий16, но, как правило, эти ограничения незначительны, и фаговый дисплей был успешным в производстве высокоспецифичных и мощных связующих белков-мишеней2,5,10,24, 25. Это может быть использовано не только в медицинских исследованиях для разработки новых терапевтических средств, но и для выяснения характеристик белка и ферментов и получения дополнительной информации о белковых взаимодействиях, участвующих в важных биологических путях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Acknowledgments

Технология убиквитинового варианта была разработана в лаборатории доктора Сачдева Сидху (Университет Торонто). WZ в настоящее время является глобальным ученым CIFAR Azrieli в программе «Люди и микробиом». Это исследование финансировалось грантами NSERC Discovery, присужденными WZ (RGPIN-2019-05721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Tags

Биохимия выпуск 174
Использование фагового дисплея для разработки модуляторов вариантов убиквитина для лигазов E3
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter