Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Bruke Phage Display til å utvikle Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62950
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular and Cellular Biology, College of Biological Science, University of Guelph

Summary

Allestedsnærværende er et kritisk protein post-translasjonell modifikasjon, hvorav dysregulering har vært involvert i mange menneskelige sykdommer. Denne protokollen beskriver hvordan phage display kan brukes til å isolere nye allestedsnærværende varianter som kan binde og modulere aktiviteten til E3 ligaer som styrer spesifisiteten, effektiviteten og mønstrene for allestedsnærværende.

Abstract

Ubiquitin er et lite 8,6 kDa protein som er en kjernekomponent i allestedsnærværende proteasomsystemet. Følgelig kan det binde seg til et mangfoldig utvalg av proteiner med høy spesifisitet, men lav affinitet. Gjennom phage display, allestedsnærværende varianter (UbVs) kan konstrueres slik at de viser forbedret affinitet over wildtype ubiquitin og opprettholde bindende spesifisitet til mål proteiner. Phage display benytter et phagemid bibliotek, hvorved pIII-frakkproteinet til en filamentøs M13 bakteriofage (valgt fordi den vises eksternt på phageoverflaten) er smeltet sammen med UbVs. Spesifikke rester av menneskelig wildtype ubiquitin er myke og randomiserte (dvs. det vil si at det er en skjevhet mot innfødt wildtype-sekvens) for å generere UbVs slik at skadelige endringer i proteinkonformasjon unngås mens du introduserer mangfoldet som er nødvendig for å fremme nye interaksjoner med målproteinet. Under phage display prosessen, disse UbVs uttrykkes og vises på phage frakk proteiner og panorert mot et protein av interesse. UbVs som viser gunstige bindende interaksjoner med målproteinet beholdes, mens dårlige bindemidler vaskes bort og fjernes fra biblioteksbassenget. De beholdte ubvene, som er festet til phage-partikkelen som inneholder UbVs tilsvarende phagemid, blir elutert, forsterket og konsentrert slik at de kan panoreres mot det samme målproteinet i en annen runde med phage-skjerm. Vanligvis utføres opptil fem runder med phage-skjerm, hvor et sterkt utvalgstrykk pålegges ubvs som binder seg svakt og / eller promiskuøst slik at de med høyere affiniteter konsentreres og berikes. Til syvende og sist er UbVs som demonstrerer høyere spesifisitet og / eller affinitet for målproteinet enn deres wildtype-kolleger isolert og kan karakteriseres gjennom ytterligere eksperimenter.

Introduction

Forståelse av molekylære detaljer om proteinproteininteraksjoner er avgjørende for å avgrense signaltransduksjonsmekanismene til biologiske prosesser, spesielt de som bidrar til klinisk viktige sykdommer. De siste årene har phage display blitt brukt som en praktisk og tilgjengelig metode for å isolere proteiner / peptider med mye forbedret binding til et ønsket målprotein1,2,3,4, som igjen kan brukes som intracellulære sonder av proteinproteininteraksjoner.

Allestedsnærværende er en kaskade av enzymatiske aktiviteter (E1 aktiverende enzym → E2 konjugaterende enzym → E3 ligaer) som kovalent konjugerer allestedsnærværende (Ub) til protein substrater for å målrette dem for nedbrytning eller for å megle cellesignalering endringer. I tillegg katalyserer deubiquitinases fjerning av ubiquitin fra proteiner. Derfor, i celler, er det tusenvis av Ub-avhengige proteinproteininteraksjoner, hvorav de aller fleste gjenkjenner en felles overflate med lav affinitet, men høy spesifisitet for å tillate svake interaksjoner gjennom store og forskjellige overflater.

Ernst et al. introduserte mutasjoner i kjente bindende regioner i Ub for å se om de kunne forbedre bindende affinitet for et protein av interesse samtidig som de opprettholder høy selektivitet5. Et kombinatorisk bibliotek med over 10 milliarder (7,5 x 1010) Ub-varianter (UbVs) med mutasjoner i posisjoner over hele Ub-overflaten som formidler de kjente Ub-proteininteraksjonene ble utviklet. Dette biblioteket besto av phagemids som uttrykker M13 bakteriofage pIII frakkprotein smeltet til diversifiserte ubVs. Derfor kan individuelle UbVs vises på phage overflaten via frakkproteinet ved uttrykk. Under utvelgelsesprosessen vil phage som viser UbVs med betydelige bindende interaksjoner med målproteinet bli beholdt og beriket i påfølgende runder med phage display, mens phage viser UbVs som binder dårlig til målproteinet vaskes bort og fjernes fra phage bassenget. De beholdte phagepartiklene inneholder phagemid som tilsvarer deres viste UbV, slik at de kan sekvenseres og ytterligere karakteriseres når de er isolert.

Ved hjelp av denne proteinteknologistrategien ble UbV-hemmere utviklet for humane deubiquitinases5 og virale proteaser6. Viktigst av alt, vi har generert hemmende ubVs for humane HECT-familie E3 ligaer gjennom kapring av E2-bindende nettstedet og aktivere UbVs som opptar en Ub-bindende exosite på HECT-domenet7. Vi kan også hemme monomeriske RING-familie E3-er ved å målrette E2-bindingsstedet og indusere UbV-dimmerisering for å aktivere homodimerisk RING E3s8. For ring E3-er med flere underenheter kan ubVer oppnå hemming ved å målrette mot RING-underenheten (f.eks. for APC/C-kompleks9) eller forstyrre kompleks formasjon (f.eks. for SCF E3s10). Samlet kan ubvs utnyttes til systematisk å forhøre proteinproteininteraksjoner i Ub-proteasome-systemet (UPS) slik at vi bedre kan dechiffrere biokjemiske mekanismer for UPS-enzymer og for å identifisere og validere funksjonelle steder for terapeutisk inngrep.

Følgende protokoll beskriver hvordan du bruker et tidligere generert phage som vises UbV-biblioteket for å målrette mot et protein av interesse og hvordan du beriker UbV-bindemidlene som samhandler med målproteinet gjennom påfølgende runder med phage-visning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Reagens forberedelse

  1. PBS (fosfatbufret saltvann): Bland 50 ml 10x PBS-oppløsning med 450 ml ultrarent H2O. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C eller romtemperatur (~20-25 °C).
  2. 10% BSA (bovint serumalbumin): Tilsett sakte 1 g BSA til 7 ml ultrapure H2O og bland til det er fullstendig oppløst (ingen klumper). Fyll på med ultrapure H2O til det endelige volumet er 10 ml. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C.
  3. PB-buffer (PBS supplert med 1 % BSA): Tilsett langsomt 5 g BSA til 400 ml ultrarent H2O og 50 ml PBS og bland til den er fullstendig oppløst (ingen klumper). Fyll på med ultrapure H2O til det endelige volumet er 500 ml. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C.
  4. PBT-buffer (PBS supplert med 1 % BSA og 0,05 % Tween 20): Tilsett sakte 5 g BSA til 400 ml ultrarent H2O og 50 ml PBS og bland til den er fullstendig oppløst (ingen klumper). Tilsett 250 μL Tween 20. Fyll på med ultrapure H2O til det endelige volumet er 500 ml. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C.
  5. PT-buffer (PBS supplert med 0,05 % Tween 20): Bland 1 ml Tween 20 med 400 ml PBS. Fyll på med ultrapure H2O til det endelige volumet er 2 L. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved 4 °C eller romtemperatur (~20-25 °C).
  6. 2YT buljong: Tilsett 16 g trypton, 10 g gjærekstrakt og 5 g NaCl til 800 ml ultraren H2O og bland til den er fullstendig oppløst (ingen klumper). Fyll på med ultrapure H2O til det endelige volumet er 1 L. Steriliser ved autoklavering og oppbevar ved romtemperatur (~20-25 °C).
  7. LB/karbohydratplater: Tilsett 12,5 g ferdigfremstillet LB-blanding og 7,5 g agar til 400 ml H2O. Fyll på med ultrarent H2O til det endelige volumet er 500 ml og steriliser ved autoklavering. Pass på at agaren er helt oppløst og vent til den avkjøles til under 60 °C. Tilsett 500 μL 100 mg ml carbenicillin, bland godt og hell i tallerkenen. Oppbevars ved 4 °C.
  8. LB/tet plater: Tilsett 12,5 g ferdigfremstillet LB-blanding og 7,5 g agar til 400 ml ultrarent H2O. Fyll på med ultrarent H2O til det endelige volumet er 500 ml og steriliser ved autoklavering. Sørg for at agaren er helt oppløst og vent til den er avkjølt til under 60 °C. Tilsett 500 μL 10 mg ml tetracyklin, bland godt og hell i platen. Oppbevars ved 4 °C.
  9. 20% PEG (polyetylenglykol)/2,5 M NaCl: Tilsett 50 g PEG-8000 og 36,5 g NaCl til 200 ml ultrapure H2O. Bland til den er fullstendig oppløst.
    MERK: Dette kan ta litt tid; oppvarming kan hjelpe. Fyll på med ultrapure H2O til det endelige volumet er 250 ml. Steriliser ved filtrering eller autoklavering.
  10. 0,1 M HCl: Bland 20 ml 1 M HCl med 180 ml ultrarent H2O. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved romtemperatur (~20-25 °C).
  11. 1 M Tris (pH 11.0): Tilsett 6,1 g Tris base til 40 ml ultrapure H2O. Juster pH til 11,0 med HCl og bland til Tris er fullstendig oppløst. Fyll på med ultrapure H2O til det endelige volumet er 50 ml. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved romtemperatur (~20-25 °C).
  12. 100 mg/ml (1000x) carbenicillin: Tilsett 2 g carbenicillin disodiumsalt til 20 ml ultrarent H2O. Bland til det er fullstendig oppløst. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved -20 °C.
  13. 50 mg/ml (1000x) kanamycin: Tilsett 1 g kanamycinsulfat til 20 ml ultrarent H2O. Bland til det er fullstendig oppløst. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved -20 °C.
  14. 10 mg/ml tetracyklin: Tilsett 0,2 g tetracyklinhydroklorid til 20 ml 70 % etanol. Bland til den er fullstendig oppløst. Steriliser ved filtrering og oppbevar ved -20 °C.

2. Proteinpreparat

  1. Bestem konsentrasjonen av målproteinbestanden i μM. Den mest praktiske måten å vurdere proteinkonsentrasjon på er å måle absorbansen av proteinbestanden ved 280 nm. Hvis konsentrasjonen er kjent i mg/ml, konverter den til μM ved hjelp av molekylvekten til målproteinet. En rekke metoder kan brukes avhengig av proteinet av interesse; Se diskusjonsdelen hvis du vil ha mer informasjon.
    MERK: Hvis proteinet avkortes (spesifikt proteindomene/motiv) eller merkes, må du huske å ta hensyn til disse endringene i molekylvekt ved konvertering fra mg/ml til μM.
  2. Forbered tre mikrosenterrør merket "runde 1", "runde 2/3" og "runde 4/5".
    1. Beregn volumet av protein som er nødvendig for å fortynne det til 1 μM i 800 μL PBS og aliquot dette volumet inn i rørene uten å legge til PBS.
      MERK: Hvis mengden målprotein som er tilgjengelig er lav, kan konsentrasjonen senkes til så lite som 0,25 μM.

3. Forberedelse for runde ett av utvalget

  1. Forbered en frøkultur for å dyrke phage-inngangen for runde to av utvalget.
    1. Inokuler 5 ml 2YT/tet med en godt isolert Escherichia coli-koloni og inkuber over natten ved 37 °C med 200 o/min orbital risting.
  2. Belegge platen for første valgrunde.
    1. Fortynn målproteinet i "runde 1"-røret med riktig mengde PBS og aliquot 100 μL i åtte brønner av en 96-brønns bindingsplate (dvs. målplaten).
      MERK: Phage display kan gjøres for fire forskjellige proteiner samtidig på en enkelt plate ved å belegge brønnene i hjørnene av platen.
    2. Valgfri kontroll: Hvis målproteinet er merket, for eksempel med GST eller MBP (maltosebindende protein), frakk åtte brønner i en annen 96-brønns bindingsplate med 100 μL av en 1 μM-løsning som inneholder riktig epitopmerke. Dette vil bli brukt til å fjerne uønsket phage som binder seg til taggen ikke-spesifikt.
    3. Rist plate(er) over natten ved 4 °C med 200 o/min orbital risting.

4. Rund av ett av valgene

  1. Forbered runde to-inngangen.
    1. Inokuler 30 ml 2YT/tet med 200 μL av frøkulturen fra trinn 3.1.
    2. Inkuber ved 37 °C med 200 o/min orbital risting til bakteriene er i midtloggfasen (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Dette tar omtrent tre timer.
  2. Blokker målplaten.
    1. Fjern beleggløsningen fra platen, eller begge platene hvis det er laget en kontrollplate, ved å snu og riste over en vask. Klapp tørt på papirhåndklær.
    2. Tilsett 300 μL PB-buffer til hver belagte brønn.
    3. Fjern PB-bufferen som i trinn 4.2.1, og legg til ytterligere 200 μL PB-buffer.
    4. Inkuber ved romtemperatur (~20-25 °C) i 1 time med 300 o/min orbital risting.
  3. Forbered phage bibliotek.
    1. Tine phage biblioteket på is og fortynne det til 100x biblioteket mangfold i PBS. Hvis for eksempel bibliotekmangfoldet er 1 x 1010 og bibliotekkonsentrasjonen er 1 x 1013, fortynn biblioteket slik at konsentrasjonen er 1 x 1012. For bibliotekene som brukes her, fortynn dem 10 ganger i PBS ved å kombinere 1 ml av biblioteket med 9 ml PBS.
      MERK: Bibliotekmangfoldet burde vært bestemt under bibliotekets opprettelse og kan ikke lett vurderes på annen måte. Bibliotekkonsentrasjonen kan bestemmes ved å inokulere E. coli-celler i midtloggfasen (OD600Equation 1 0,6 - 0,8) og plating på LB / karbohydrat.
    2. Legg til 1/5 volum PEG/NaCl. For eksempel, for 10 ml av det tidligere fortynnede biblioteket, tilsett 2 ml PEG / NaCl.
    3. Inkuber på is i 30 min.
    4. Sentrifuger ved 11 000 x g i 30 minutter ved 4 °C, kast supernatanten og bruk den siste tiden i 2 minutter for å trekke ned den gjenværende supernatanten.
      MERK: Sett røret i rotoren i samme retning andre gang som det var den første som holdt pellet på samme sted, derfor, noe som gjør det lettere å se.
    5. Resuspend phage pellet forsiktig i 1 ml PBT per protein. For fire proteiner, resuspend pellet i 4 ml PBT.
      MERK: Prøv å ikke berøre pelletsen og ikke innfør luftbobler.
  4. Vis phage til målprotein(er).
    1. Valgfri kontroll: Tilsett 100 μL phage bibliotek til hver belagt brønn i kontrollplaten. Inkuber ved romtemperatur (~20-25 °C) i 1 time med 300 o/min orbital risting og overfør biblioteket fra kontrollplaten til målplaten. Hopp over trinn 4.4.2.
    2. Fjern PB-bufferen fra målplaten som i trinn 4.2.1 og tilsett 100 μL av phagebiblioteket til hver belagte brønn.
    3. Inkuber ved romtemperatur (~20-25 °C) i 1 time med 300 o/min orbital risting.
  5. Elute runde en phage.
    1. Fjern phage-biblioteket og vask de belagte brønnene fire ganger med PT-buffer. Snu platen og trykk på et papirhåndkle for å fjerne de siste dråpene.
      MERK: Hvis flere målproteiner er belagt på en tallerken, prøv å minimere strømmen av alle etterfølgende løsninger mellom brønnene.
    2. Tilsett 100 μL 0,1 M HCl til hver belagt brønn og inkuber ved romtemperatur i 5 min med 300 rpm orbital risting.
    3. Nøytraliser pH ved å tilsette 12,5 μL 1 M Tris-HCl (pH 11) til hver belagte brønn.
    4. Samle den eluterte phage fra alle 8 brønnene til et enkelt 1,5 ml mikrosenterrør. Pipette opp og ned under overføringen for å gjøre løsninger homogene og aspirere all væske fra brønnene.
    5. Tilsett 10% BSA til den samlede eluted phage til en endelig konsentrasjon på 1%. For et typisk rundt ett elutionvolum på 950 μL, tilsett 95 μL 10% BSA. Oppbevars ved 4 °C. Dette er den runde utgangen.

5. Forberedelse for påfølgende runder med utvelgelse

  1. Forbered en frøkultur for å dyrke phage-inngangen til neste valgrunde som i trinn 3.1.
  2. Belegge platen for tredje valgrunde som i trinn 3.2 med endringene nedenfor.
    1. Bare belegge fire brønner per protein i en 96-brønns bindingsplate. Bruk halvparten av innholdet i "runde 2/3" eller "runde 4/5" rør for riktig runde. Fortynn innholdet i disse rørene etter behov, for å unngå at proteiner legger seg ut av løsningen.
  3. Forbered phage-inngangen for neste valgrunde.
    1. Bruk halvparten av den runde utdataene fra trinn 4.5.5 for å inokulere 3 ml midtloggfaseceller fra trinn 4.1. For en typisk rund en utgang, inokuler med 500 μL av utgangen.
    2. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter med 200 o/min orbital risting.
    3. Tilsett M13K07 hjelper phage til en endelig konsentrasjon på 1 x 1010 PFU / ml.
    4. Inkuber ved 37 °C i 1 time med 200 o/min orbital risting.
    5. Overfør hele 3 ml kultur til 30 ml 2YT/karbohydrat/kan. Vokse over natten ved 37 °C med 200 o/min orbital risting.
    6. Neste dag, overfør kulturen til et 50 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 11 000 x g i 10 minutter ved 4 °C for å utfelle celler.
    7. Dekanter supernatanten i et nytt 50 ml sentrifugerør og bland med 8 ml PEG/NaCl og inkuber på is i 10 minutter.
    8. Sentrifuge ved 11.000 x g i 10 min ved 4 °C, kast supernatanten og sentrifuger igjen i 2 minutter.
      MERK: Sett røret i rotoren i samme retning andre gang som det var den første som holdt pellet på samme sted, derfor, noe som gjør det lettere å se.
    9. Resuspend phage pellet i 800 μL PBT slik at den er helt homogen og ingen klumper er synlige.
    10. Overfør phage-løsningen til et 1,5 ml mikrosenterrør og sentrifuger ved 16 200 x g i 4 minutter ved 4 °C til pelletsrester.
    11. Overfør supernatanten til et nytt mikrosenterrør. Dette er inndataene for neste valgrunde.
  4. Valgfritt: Titer inngangs- og utgangsløsningene.
    1. Bruk 500 μL av en E. coli frøkultur for å inokulere 5 ml 2YT/tet og inkubere ved 37 °C med 200 o/min orbital risting til bakterier er i midtloggfasen (OD600Equation 1 0,6 - 0,8). Dette tar ca 1 time.
    2. Fortynn phage input / output løsninger til 10-3 - 10-5 i PBS og tilsett 10 μL av hver fortynning til 90 μL av dyrkede celler.
      MERK: Bruk fortynnede phage-løsninger umiddelbart fordi phage vil adsorbere til røret over tid, og transformasjoner kan gi falske negativer.
    3. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter med 200 o/min orbital risting.
    4. Plate 5 μL på separate LB/karbohydratplater.
      MERK: Mengden som er belagt er variabel, avhenger av tidligere resultater/personlige preferanser.

6. Påfølgende runder med utvelgelse

  1. Utfør alle påfølgende runder sammen med preparatet som gjort i henholdsvis trinn 3 og 4, med forskjeller nevnt nedenfor.
    1. Bruk inndataene som ble produsert i forrige runde som phage-kilde i stedet for et bibliotek. Frakk 4 brønner per målprotein med 100 μL av phage-inngangen ervervet fra forrige runde. Oppbevar gjenværende phage-innganger ved 4 °C.
    2. Gjør vasketrinnet i 4.5.1 strengere med hver valgrunde. Runde en krever vask 4 ganger, runde to krever 6 ganger, runde tre krever 8 ganger, og runder fire og fem krever begge vask 10 ganger.
    3. Reduser noen volumer sammenlignet med de som brukes i første runde fordi påfølgende runder bare dekker fire brønner i stedet for åtte. For eksempel legges i trinn 4.5.5 bare 45 μL av 10% BSA til phage-utgangen, og i trinn 5.3.1 brukes bare 250 μL av fôrutgangen til å inokulere celler.

7. Ettervalgsbehandling og phage Isolation

  1. Titer inngangs- og utgangsløsningene for runde fire og fem.
    1. Hvis ikke allerede gjort i trinn 5.4, følg de samme trinnene for å titer runder fire og fem phage utganger, ideelt produsere en rekkevidde på 30-300 kolonier over noen få plater.
  2. Kultur og isolere phage.
    1. Aliquot 450 μL 2YT/carb/M13K07 inn i hvert rør i en 96 mini tube kulturboks.
    2. Velg godt isolerte kolonier fra noen av platene fra trinn 7.1 for å inokulere hvert rør.
      MERK: Bruk den øverste halvdelen av esken til runde fire utganger og den nederste halvdelen for runde fem utganger.
    3. Inkuber over natten ved 37 °C med 200 o/min orbital risting.
    4. Sentrifuge ved 1200 x g i 10 min ved 4 °C.
    5. Overfør så mye supernatant som mulig til en ny 96 mini tube kulturboks uten å forstyrre cellepellet og kaste den gamle. Oppbevars ved 4 °C.
    6. Fra den nye esken overfører du 100 μL fra hvert rør til en 96 brønn ikke-bindende plate som inneholder 100 μL 50% glyserol i alle brønner. Bland godt og oppbevar ved -80 °C som reservelager.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dokumentordnere produsert fra phage display kan verifiseres og analyseres på mange måter. Det anbefales først å fortsette med sekvensering av phage med primere som flankerer den diversifiserte innsatsen i phagemid-biblioteket. Et ideelt phage display eksperiment vil vise en klar skjevhet mot flere sekvenser (figur 1). Andre sekvenser vil også være til stede, men med en lavere telling, som vises mer som bakgrunnsstøy. I eksemplet som ble gitt, hvor phage display ble utført mellom allestedsnærværende varianter (UbVs) og wildtype UBE4B, er det en spesiell skjevhet mot sekvenser #1-4. Et eksempel på et Python-skript for organisering og analyse av sekvenseringsfiler er gitt ("phageDisplaySeqAnalysis.py"). For å bekrefte betydningen av bindemidlene kan enzymbundne immunosorbente analyser (ELISA) brukes som et raskt mål på relativ bindende affinitet til wildtype-målproteinet, mutert målprotein, samt off-target proteiner (figur 1). Forskjeller i bindende affiniteter mellom de nye bindemidlene og wildtype bindingsproteinet, som de nye bindemidlene var basert på, kan bestemmes ved å normalisere ELISA-absorbansen av bindemidlene til wildtypeproteinet (ikke vist) eller andre proteiner som ikke viser noen merkbar binding med målproteinet (figur 1). Dette eksemplet viser tendensen til at de berikede sekvensene har høyere bindende affinitet for målproteinet. Et eksempel på et Python-skript for organisering og analyse av sekvenseringsfiler er gitt ("phageDisplayElisaAnalysis.py"). I tillegg er et eksempel Python-skript spesielt for å analysere UbV-resultater gitt ("phageDisplayUbvAnalysis.py"). Ideelt sett vil bindeordnersekvenser som er mer tallrike, ha høyere relativ bindingsaffinitet enn mindre mange sekvenser, som antagelig er bakgrunnsstøy. Det er mulig at ustabile dokumentordnere vil være lave i antall, men vise merkbar binding gjennom ELISAer. Disse dokumentordnerne bør undersøkes nærmere for å avgjøre om ELISA-poengsummene er artefakter, eller om de faktisk er bindemidler som er verdige til ytterligere karakterisering.

Figure 1
Figur 1: Representative resultater for et ubiquitin variant (UbV) utvalg mot UBE4B. (A) UbVs ble bestilt fra høyeste til laveste frekvens (teller). Sekvenser representerer den diversifiserte allestedsnærværende regionen i UbV med alle randomiserte rester (spesielt rester 2, 4, 6, 8-12, 14, 42, 44, 46-49, 62-64, 66, 68 og 70-78). Alle ELISA-absorbanser ble normalisert mot 96 gjennomsnittlige BSA ELISA-score og 96 gjennomsnittlige GST ELISA-score. Mørkere grønt representerer sterkere relativ binding. GST ble inkludert som en kontroll for ikke-spesifikk binding på grunn av at målproteinet er GST-merket. (B) Grafisk oppsummering av ELISA-resultatene fra panel A. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Foreslått rekkefølge av trinn for å utføre phage display. Stiplede linjer angir prosesser som overføres til neste dag eller fra forrige dag. Alle påfølgende runder etter runde tre fortsetter på samme måte som runde tre, unntatt runde fem der det ikke er nødvendig med phage input preparation med mindre flere runder blir utført. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Foreslått labware og etiketter for å sette opp et phage display eksperiment. Formål og relevante trinn i protokollen er angitt. R: rund; I: innspill; O: utgang. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Utseende av typiske pellets som oppstår under phage display prosedyren. Phage biblioteket pellet presenterer som en strek langs siden av røret og kan nylig tilpasses for å konsentrere pellet i bunnen av røret. Phage input pellets og rusk pellets vises mer typisk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Python-skript. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som nevnt i trinn 2.1 (proteinpreparat), kan en rekke metoder brukes til å vurdere proteinkonsentrasjonen, og hver vil ha unike fordeler og ulemper basert på det spesifikke målproteinet som brukes til phage display. En kilde til detaljerte beskrivelser og protokoller for populære metoder har blitt gitt tidligere11.

Ved å bruke phage beholdt av en tidligere runde av phage display som inngang for en etterfølgende runde beriker de gode bindemidler ved gradvis å fjerne bindemidler som bundet svakt, forbigående, eller ved en tilfeldighet. Ved runde fire og fem vil det ideelt sett være en klar skjevhet mot et lite og spesifikt sett med peptidsekvenser, som demonstrerer bindingspreferanser av målproteinet.

Denne protokollen er optimalisert for bruk med et UbV-bibliotek. Selv om disse trinnene generelt kan gjelde for andre typer biblioteker (f.eks. peptid, antistoff, etc.), må de sannsynligvis tilpasses for å imøtekomme slike ikke-UbV-biblioteker. Som nevnt i trinn 4.3.1, bør bibliotekmangfold og konsentrasjon være kjent før du fortsetter med phage display. Hvis du vil ha mer informasjon om hvordan disse bibliotekattributtene bestemmes, kan du se protokollen som brukes til å opprette UbV-bibliotekene som brukes i denne prosedyren12.

Phage display resultater kan være svært tydelig kuttet og presentere åpenbare kandidat permer å forfølge videre karakterisering. For eksempel er permer som både er svært hyppige og har betydelig høyere binding, målt ved ELISA, klare kandidater for videre studier. Men når frekvensen av en bestemt dokumentordner ikke positivt korrelerer med ELISA-dataene, kan dette utgjøre en viss forvirring om hvordan man skiller ut interessante bindemidler. I eksemplet (figur 1) anbefales det å velge en kombinasjon av de vanligste dokumentordnerne, selv om de har en lav bindende affinitet, og de med høyere bindende affinitet, selv om de virker sjeldne. Sjeldne bindemidler med høye ELISA-score er kanskje ikke like vanlige på grunn av ustabilitet under phage-visning, noe som vil påvirke utbredelsen i disse endelige dataene negativt. Som sådan er disse verdt å undersøke så mye som de svært hyppige permene er.

Isolerte phage løsninger kan enkelt forurenses. Det anbefales å fortsette med DNA-sekvensering så snart som mulig ved hjelp av primere som flankerer regionen av det diversifiserte peptidet. En annen typisk post-display analyse er å utføre ELISAer av bindemidler med deres målprotein. I tillegg kan ELISAer utføres med bindemidler og muterte / avkortede versjoner av deres målproteiner, noe som kan gi en grov ide om deres sannsynlige bindingsmodus. Det er svært viktig å merke seg at phage-løsninger bør blandes godt før bruk i et eksperiment hvis de har sittet en stund. Phage kan adsorbere til veggene i røret eller slå seg ut av løsningen og kan produsere falske negativer.

Den mest tidseffektive måten å utføre denne prosedyren på, er illustrert i figur 2. Begynn hver runde med å forberede bakteriekulturen som er nødvendig for å dyrke phage-inngangen for den påfølgende runden neste dag. Mens denne kulturen vokser, kan belagte plater blokkeres. Mens platene er blokkert, kan biblioteket utarbeides (for runde en) eller phage-inngangen kan utarbeides (for etterfølgende runder). På dagen for runde fire er det ikke nødvendig å forberede en frøkultur, og på dagen for runde fem er det ikke nødvendig å gjøre noen forberedelser til neste rundes phage-innspill med mindre man har til hensikt å gjøre mer enn fem runder med utvelgelse. For å øke tiden ytterligere, er det også gitt et foreslått labware-oppsett (figur 3). I tillegg er phage pellets ikke alltid distinkte, så bilder av typiske pelletsutseender som oppstår under denne prosedyren, er gitt (figur 4).

Hvis det er noen problemer med pelleting av phage under utarbeidelsen av innspillene til en påfølgende runde, kan eksperimentet måtte stoppes for en dag mens ny phage vokser. Disse kan gjenopprettes ved å gå tilbake til phage lagret i rørene for inngangen for den runden. For eksempel, hvis phage som er nødvendig for tredje runde av skjermen ikke kan pelleteres av en eller annen grunn, kan du gå tilbake til "R3I" -røret som inneholder 400 μL phage-inngang for runde tre. Dette kan bare gjentas én gang hvis det belegges fire brønner med 100 μL.

Titeret av utgangs phage for runder fire til fem er vanligvis i området 106 til 108 PFU / ml. Hvis titering ikke er av interesse, bør det ikke nødvendigvis være tilstrekkelig å ha nok kolonier til stede for å fylle opp en 96 tube minikulturboks for å gi en nøyaktig representasjon av phage-mangfoldet og titeret. Men hvis titeret av utgangs phage er lavt og flere kolonier er ønsket, kan phage reamplifiseres ved å gjenta trinn 5.3. I hovedsak kan phage reamplifiseres ved å ta utgangen for ønsket utvalgsrunde, inokulere midtloggfaseceller, legge til hjelper phage og carbenicillin, vokse kulturen over natten og høste phage via PEG-nedbør som tidligere beskrevet.

Andre visningsmetoder eksisterer, og hver har sine egne fordeler og ulemper i forhold til phage display. In vivo-visningsmetoder, for eksempel celleoverflatevisning, kan øke sannsynligheten for riktig proteinfolding og også tillate at post-translasjonelle modifikasjoner oppstår; Imidlertid er disse metodene begrenset ved å måtte bruke betydelig mindre bibliotekstørrelser13 og uttrykke proteiner polyvalent. Polyvalent uttrykk introduserer aviditetseffekter som forstyrrer og maskerer peptidets iboende affinitet, noe som er av større interesse når man genererer nye bindemidler. Phage display omgår dette problemet fordi det har blitt tilpasset for monovalent skjerm, og dermed letter valget av bindemidler med genuint forbedrede affiniteter14,15,16. Andre in vitro-visningsmetoder hindres på samme måte ikke av begrensningene i in vivo-visningsmetoder, men presenterer sine egne unike utfordringer. For eksempel kan ribosomvisning brukes til å sondere større biblioteker (1013-14)17, men utgangen av valgene er i form av mRNA-molekyler som i seg selv er mindre stabile enn phage-innkapslet DNA-utgang av phage display18. Andre in vitro-visningsmetoder, for eksempel mRNA/cDNA-skjerm, cis aktivitetsbasert skjerm (CIS) og kovalente antistoffskjermer (CAD), har vist problemer med effektivitet, stabilitet og inkonsekvens19,20,21,22,23.

Phage-skjermen i seg selv er begrenset av bibliotekstørrelser som begrenses av effektiviteten av bakteriell transformasjon og ved ikke å tillate biblioteker med sekvenser som forstyrrer phage / bakterievekst16, men generelt er disse begrensningene ubetydelige, og phage-skjermen har vært vellykket med å produsere svært spesifikke og potente bindemidler av målproteiner2,5,10,24, 25. Dette kan ikke bare brukes i medisinsk forskning for å utvikle nye terapeutiske behandlinger, men også for å belyse protein- og enzymegenskaper og lære mer om proteininteraksjoner involvert i viktige biologiske veier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Ubiquitin-variantteknologien ble utviklet i laboratoriet til Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto). WZ er for tiden CIFAR Azrieli Global Scholar in the Humans &The Microbiome Program. Denne forskningen ble finansiert av NSERC Discovery Grants tildelt WZ (RGPIN-2019-05721).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) Fisher Scientific 14-222-198 Culturing phage outputs after phage display.
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) Fisher Scientific DF0446-17-3 Preparing plates for titering.
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V BioShop Canada ALB001 Buffer component.
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous Millipore-Sigma C1389-5G Culturing phagemid-infected cells.
Compact Digital Microplate Shaker Fisher Scientific 11-676-337 Shaking plates during incubation with the phage library.
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape Fisher Scientific 07-200-684 Sealing phage glycerol stocks.
Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-01-0 Preparing plates for titering.
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer DeNovix DS-11 FX+ Protein concentration measurement.
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate Fisher Scientific 7000133 Storing phage glycerol stocks.
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500 Phage elution.
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C854003 Bacterial strain for phage infection.
Kanamycin Sulfate Fisher Scientific AAJ1792406 Culturing M13K07 helper phage-infected cells.
M13KO7 Helper Phage New England Biolabs  N0315S Permit phagemid packing and secretion.
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker Fisher Scientific 11-676-076 Bacterial cell culture.
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom Life Technologies 44-2404-21 Immobilizing proteins.
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution Fisher Scientific BP3994 Buffer component/phage resuspension medium.
Polyester Films for ELISA and Incubation VWR 60941-120 Covering the microplates during incubation.
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) Fisher Scientific BP233-1 Phage precipitation.
Sodium chloride Millipore-Sigma S3014 Phage precipitation.
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene Fisher Scientific 14-956-1D Culturing phage inputs.
Tetracycline Hydrochloride Fisher Scientific BP912-100 Culturing E. coli OmniMax cells.
Tris Base Fisher Scientific BP1525 Neutralizing eluted phage solution.
Tryptone Powder Fisher Scientific BP1421-2 Cell growth media component.
Tween 20 Fisher Scientific BP337500 Buffer component.
Yeast Extract Fisher Scientific BP1422-2 Cell growth media component.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
  2. Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
  3. Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
  4. Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
  5. Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
  6. Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
  7. Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
  8. Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
  9. Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
  10. Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
  11. Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
  12. Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
  13. Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
  14. Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
  15. Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Biochemistry. 30 (45), 1-7 (1991).
  16. Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
  17. Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
  18. Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
  19. Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
  20. Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
  21. Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
  22. Reiersen, H., et al. Covalent antibody display--an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
  23. Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
  24. Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
  25. Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).

Tags

Biokjemi utgave 174
Bruke Phage Display til å utvikle Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage… More

Roscow, O., Zhang, W. Using Phage Display to Develop Ubiquitin Variant Modulators for E3 Ligases. J. Vis. Exp. (174), e62950, doi:10.3791/62950 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter